JPS6128512A - 多孔性電気泳動ゲル生成物およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、バイオ有機分子の分離に有用な、調整された
架橋密度をもっ１１Ｌ気泳動ゲル生成物およびその製造
のための光重合方法に関する。゛背景技術 電気泳動は、荷電された分子あるいは物質は電場に置か
れると泳動するという原理に基づいている。蛋白質およ
びその他のバイオポリマー（例えば−ＤＮＡ％ＲＮＡＪ
Ｉ累および炭水化物）は、荷電されるので、これらは、
これらの等電点以外の御飯で泳動する。泳動の速度は、
と多わけ蛋白質またはバイオポリマーの荷１を密度と電
気泳動のマトリックス■殉束注（ｒｅｓｔｒｉｃｔｌｖ
ｅ　ｐｒｏ−ｐｅｒｔｉｅｓ）によって決まる。質瀘に
対する荷電の比が大きければ大きいＩまど分子はよル速
く泳動するものでりる。

電気泳動用の多くの支持媒体が慣用されている。歳もボ
ビラーなものは、紙またはセルローズアセテート、シリ
カゲル、アガロース、殿粉、およびポリアクリルアミド
袈のシートである。

紙、セルローズアセテート、および薄ノーシリカ、の三
吻質は、比較的不活性であシ、生に支持体用としてかつ
対流を厳小眼にするのに役立つ。

これらの９勿ＸＷ用いる蛋白質の分離は、選択したーに
おける蛋白質？荷＊＊度に王として基づくもので１概し
て両分ｊＩＩ能の分離をもたらさない。

、　　　他方、殿粉、アガｐ−ス、およびポリアクリル
アミドゲルの三物質は、対流と拡散を最／１１限゛にす
るのみならず、分離プロセスに活発に関与する。これら
の物質は、多孔ａ媒体を提供し、その孔の寸法は調整し
て分離する蛋白質分子の寸法に近づけることができる。

こうすれば、分子のふるい分けが起）％荷電密度と分子
の寸法の両方に基づく分離をもたらす。

分子のふるい分けの限度は、ゲルの孔の寸法を泳動粒子
の寸法にいかに近づけられるかによって決まると考えら
れる。アガロースゲルの孔の寸法は大きすぎるので、蛋
白質の大部分の分子の分子ふるい分けはごくわずかでア
シ、分離は荷＊＊度に主として基づく。対照的に、ポリ
アクリルアミドゲルは、蛋白質分子の寸法によル近づい
た孔なもっことができるので一分子ふるい効果に寄与す
る。ポリアクリルアミド／ｆｉ１尚就に純粋にした状態
に製造できる合成ポリマーであるというさらにいっそう
の利点をもつ。

ゲル孔の寸法の変ＩＪＪＪ馳囲の広いものを作シ出し−
かつゲル内に孔の寸法の勾配（グラジェント、ｇｒａｃ
ｌｉｅｎｔ）乞形成する能力は、ポリアクリルアミドの
追加された利点である。孔の寸法の真整は、混合物を分
子の寸法に基づいてふるい分けることを可能にし、かつ
、分子量測定を実行ＨＪ能にする。これらの測定は、分
子の荷電の効果を中和するナトリウムドデシルサルフエ
ー）　（ＳＤＳ）のような洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ
）で蛋白質を被覆するならば、特に正確になる。この技
術は、ニスディーニス−ビーエージ−イー（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＦｔ）電気泳動と言う。しかしながらｓ　　ＢＤｓ
電気泳動ゲルを製造するための先行妖術中に示される諸
技術は、外視性の尚い生成物をもたらさない。

孔勾配ゲル ポリアクリルアミドゲルは、アクリルアミドの濃度が勾
配状に増加し、それに応じて孔の寸法が勾配状に小さく
なるように製造し得る。これらのゲルは、試料の蛋白質
混合物の分析−および蛋白質を均一な荷電環境中に溶か
す変性剤としてＳＤＳを使用する分子量測定の二つの目
的のため、単一濃度のゲルの代）に、今日、広範囲に用
いられている。勾配ゲルを製造するために使用する慣用
的技術は、高価で−かつ−める程度外税可能な勾配を保
証するには多大の注意を必賛とする。

異なった濃度の複数のゲルが鳳なって層になった段階状
勾配（ｓｔｅｐ　ｇｒａｄｉθｎｔ）がこれ葦で使用さ
れてきた。不運にも、これらは、蛋白質混合物の測定に
不正確さを生じさせる人工的な多成分帝（ｂａｎｄ　）
をｌ−間の界面にもたらす傾向がある。今日で祉、ポリ
アクリルアミドの連続的な勾配を使用するのが普通でら
る。通常の限度は、ＩｊＸ線状または非直線状の勾配に
なった３〜３０％のアクリルアミドであシ、分別ずべき
蛋白質の寸法によって選ぶ特別な範囲をともなう。勾配
ゲル中での電気泳動の際、次第に小さくなっていく孔が
それ以上の前進を妨げるまで蛋白質は泳動する。この「
孔の限、界」に一度達すると、蛋白質のバンディングパ
ターン（ｂａｎｄｉｎｇ　ｐａｔｔｅｒｎ）は、たとえ
泳動が完全に停止しなくても、時間が経つにつれて容易
に感知できる程に変化しない。

勾配ゲルによる電気＃、動の生な利点の一つは、泳動し
ている蛋白質が１次第に小さくなった孔寸法をもつゲル
゛の領域に絶え間なく進入し、蛋白質の泳動しているゾ
ーンの前進４部が恢尾喝部よりも強く阻止され、蛋白質
の帯（ｂａｎｄ　）の顕著な鮮明化を生じることである
。加えて１孔の寸法の勾配は、一つのケ゛ルで同時に分
別することのできる分子量の範囲を広げる。それ故、勾
配ゲルは、均一な孔寸法をもつゲルによって通常可能な
ものよシもよシ鮮明な？１Ｆ　（ｂａｎｄ　）に複雑な
蛋白質混合物を分別するのみならず、殆んど全ての成分
の分子量測定をも可能にする。

孔勾配をもつゲルは、ゲルのモールド中にアクリルアミ
ドの濃度勾配を作シ出すために、高濃度および低磯度の
モノマー溶液を混合するととＫよって通常製造する。こ
れらの技術は、所望の勾配を保証するために多大の注Ｘ
乞もって操作しなけれがならない綿密なポンプ操作計画
を含む。また、これらの技術は、時間がかがシ、かつ高
価で、さらに再視注のある生産技術として役に立たない
。

アクリルアミドの濃度勾配に加えて、サッカロースまた
はグリセロールのＷ！度勾配は、重合の熱によって引き
起こされる対流的乱れによって混合がしばしば最小限に
なる。一部の研究者・・は、重合が最初にゲルの頂部で
生じ、次に底部に進行するのを保証するために、ＩＬ合
用触媒を勾配状に含有させることによって後者の問題を
回避している。これらの方法のいづれ力為によって製造
された勾配ゲルは、一般に再現性が乏しい。

そのように映逅されたポリアクリルアミドゲルは、Ｎ、
Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミド（ＢＩＳ）のよ
うな二官能化合物によるアクリルアミドの重合およびそ
れと同時のポリマーの架橋の結果として生じる。産金の
反応開始の敢も広くゆきわたった方法は、ナトリウムま
たはアンモニウムの過硫酸塩および反応促進剤のＮ、Ｎ
、Ｎ”、Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＦ：
ＭｌｆｌＤ）を使用するものである。アクリルアミドの
産金はｔリボフラビンを使用して光化学的にも実行でき
る。しかしながら、リボフンピンによって開始する重合
は、強烈な紫外線（ＵＶ）綜または可視光線源を必要と
し、これを光源の強度および波長しだいで３０分ないし
数時間の間印加しなければならない。さらに、リボフラ
ビンの使用の障害になるものは、それが、急速な光退色
反応を受け、この反応は、リボフラビンの濃度を低下さ
せ、かつリボフラビンを反応開始を起こさない状態に変
化させ、結果的にモノマーのポリマーへの高率の転換な
困難にするという事笑である。

リボフラビンによる光反応開始の特徴は非再現性である
。これは、完全に重合したかどうか不確実なので１必要
とされる露光の時間が長くなることおよびリボフラビン
の化学的不安定さという両方の理由による。先行技術中
に記載されているような重合の光反応開始は、異なった
濃度のモノマー液体馨混合することによって孔ｌｌ；Ｊ
配ゲル？作る際の問題を解消しない。実際、リボフラビ
ンによる重合の速度の運さおよび強烈な光源による長時
間の露光は、孔の勾配のデザインと再現性をだめにする
対流的混合の影響を過大にするように思われるだけであ
る。

ニー・タラムバツハ（Ａ、ｃｈｒａｍｂａｃｈ）とディ
ー・ロッドバード（Ｌ）、Ｒｏｄｂａｒｄ）（Ｓｅｐ、
Ｓｃｉ、Ｌ、６６３〜７［１３＊１９７２）は、反応促
進剤ＴＥＭＩＤの添加によるリボフラビン光反応開始重
合の加速について旨及している。反応の良好な制御のた
めには、しかしながら、このシステムもまた過硫酸塩を
存在させることが必要でめった。このシステムは、リボ
フラビン単独の場合と同じく、異なった凝度のモノマー
を混合することによって孔勾配ゲルを作る際の問題を解
消しない。リボフラビン単独または添加した反応促進沖
１　（Ｔｆ＋ｊＭｋｉＤ）と過硫酸塩をもつ場合の両方
とも、酸素がラジカル重合を抑制するので、モノマー混
合物は反応開始前に脱ガスしなけれにならない。

電気泳動用のこのようなゲルの製造および使用の詳細は
、ビー・ディー・バーメス（Ｂ、Ｄ、Ｈａｍｅｓ）とデ
ィー・リックウッド（Ｄ、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ廟の「蛋白
質のゲル眠気原動Ｊ　ｐｐ−１〜８９１アイアールエル
プンス（ＩＨＬ　Ｆｒｅｅθン、ワシントン７、ティ１
拳シー（ＷａｓｈｉｎｇｔＯｎ、Ｄ、Ｏ，）（１９８１
）’Ｐで、ビー・ディー・バーメスが一般的に、かつ包
括的に概説している。

州勾配ゲル（工ＭＦ） 両性ｖｌ質（低分子Ｊｌ−１ＩｆｉＩ注電解液〕をゲル
調合物に添加できる。重合に続いて、両ｔｉ゛Ｋｐｓ猷
吻質は−そＣすｐ工（婚定点）・に従って電場中を泳動
し、それらの等′電点の順番に各ゾーンで停止する。ｐ
Ｈ勾配がこのようにしてゲル中に１乍られる。

■ＩＦ分＃准のなおいっそりの詳細は、ビー・ディｍ−
バーメス（Ｂ、Ｄ、ＨａｍθＧ）とディー・リックウッ
ド（Ｄ、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ）の「蛋白質のゲル′也気泳
細ＰＰ、１５７〜１８６、アイアールエルブーレス（工
ＲＬＰｒｅｓｓ）、ワシントン、ディー・シー（Ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎｓＤ、Ｏ，）（１９８１）中に、ビー・
アンプルラン（Ｂ。

Ａｎ　ｄｅｒ　Ｌａｎ）とニー・クラムパッペＡ、Ｏｈ
ｒａｍｂａａｈ）が６Ｃ戦している。

一般文献の多数が、厚み５００μｍから１５００μｍの
ケ゛ルについて記述していることに注意ぼれたい。しか
しながら、選ばれたいくつかの著作が、厚み２０μｍか
ら５００μｍの範囲の薄いゲルおよび超薄のゲルについ
て記述している。ビー・ジー・ラド；＞　（Ｂ、Ｊ、Ｒ
ａｄｏｌａ］ｌｉ　ｒ　１１気泳＃　’７９Ｊ、ウオル
ター・ド・グライタ−（Ｗａｌｔｅｒ　Ｄｅ　Ｇｒｕｙ
ｔｅｒ）　ｓニューヨーク（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）（１９
８０）、ＰＰ、７９〜９４中で、ビー・ジエー・ラドン
２よびぞの甲の参。

照文献が、シラン化したガラスまたはポリエステルのシ
ート上にキャスティングすることによって製造した５０
〜１００μｍのポリアクリルアミドゲル（勾配なし〕中
の超薄層等電フォー力スイングについて論じている。ア
ール・シー・アレン（Ｒ，０，Ａ１１ｅｎ）とビー・ア
ーナクド（Ｐ　、Ａｒｎａｕｄ）編「電気＃＃’８１Ｊ
、ウオルター・ド・グライタ−（ｆａｌｔｅｒ　Ｄｅ　
Ｇｒｕｙｔｅｒ）　％　ニューヨーク（ＮｅｗＹｏｒｋ
）　（１９８１）、ＰＰ−１８１〜１８９中で、ビー・
ジエー・ラドン、ニー・キンツコファ−（Ａ。

Ｋｉｎｚｋｏｆｅｒ　）＆およびエム・フライ（Ｍ、Ｆ
ｒｅｙ）は、超薄ノｉｇ（２０〜５０μｍ）ポリアクリ
ルアミドゲル中の′４砿フォー刀スイング（ｆｏｃｕｓ
ｉｎｇ）についてｉｄ戦している。ゲルの製造について
は１円ら講じられＣいない。同書のＰＰ、２５９〜２７
０中でｔニー・ゴルノ（Ａ、Ｇｏｒｇ）、ダブりニー・
ボステ颯Ｗ。

Ｐｏ５ｔｅｌ）、アー／ｌ／−ウェスタマイヤ−（Ｒ，
Ｗｅｓｔｅｒ−ｍｅｉｅｒ）、イー・ギアナッツア（ｌ
ｊ、ＧｉａｎｆＬＺＺａ）ｓおよびビー・ジー・リゲッ
ティ（Ｐ、　Ｇ、ｆｔｉｇｈｅｔｔｉ）もまた、厚み２
４０〜５６０μｍのポリアクリルアミドゲル中の等電フ
オー力スイングと勾配電気泳動について記載してい、る
。ゲルは、勾配混合によって一度に垂直に注入され、孔
の寸法に勾配を形成する。超薄ゲルの利点が論じられて
いる。

孔の寸法の勾配は、先行技術の方法を用いて薄いゲルな
得る多大の困難さの後にのみ得られる。

結果として、薄いゲルの有利な特性は先行技術では広く
は使用ちれていない。

上記の諸方法のどれかＫよって製造されたゲルは、ポリ
アクリルアミドケ゛ル奄気泳動（ＰＡＧＥンおよび等電
フオーカスイング（工ＥＦ）におけるこれらの有用性を
落とすいくらかの不利を受ける傾向がある。存在してい
る不反応の重合反応開始剤は、生体分子と反応でき、ひ
ずんだ分離または試料の分解を引き起こす。現在の、極
性をもつ無機反応開始剤（過億飯塩／　ＴｊＣＭＩＤ　
）は、パラフグ２クンドの着色を増加する傾向があシ、
それ故、パックグラウンド対試料スポットとのコントラ
ストを低下させる。本文書中に記載した反応開始剤物質
は、生体分子と反応あるいは結合しない点で有益である
。その生な理由は、不均一反応開始剤については、それ
らが完全に有機物であシ、易溶性でないからである。こ
れらの反応開始剤は、ゲルの着色および脱色についても
何の問題もない。

一般に、幾多の先行技術の方法を用いて製造した電気泳
動ゲルは、多くの不利を招く。なかでも、ゲル中の樵々
の反応開始剤の存在は、反店開始剤と遊離上ツマー緩衝
剤、あるいはアクリルアミドとの不規則な反応をしばし
ば引き起こした。さらに、無機反応開始剤またはその副
産物は、蛋白員の試料それ自体と反応することもあシ、
それによって電気泳動の結果をゆがめて１まう。反応物
の効果のない機械的混合および制御のできない反応の故
に、先行技術によって製造したゲルは正確でもなく高度
に再現性の娶るものでもない。先行技術が遭遇する他の
問題は、熱対流、振動、混合、および毛管現象作用の故
に、薄いゲル、すなわち厚み５００μｍ以下のゲルの製
造が比較的に困難でめることである。さらに、これらの
先行技術は、これらがパッチタイプの操作でるシ労働業
約的なものであるから比較的に扁くつく順向にある。

′Ａ明の袂約 本発明によれば、′喝気木勤分離ＫＭ用な多孔性ゲルが
得られる。この生成物は、光反応開始剤または水素ドナ
ーの存在を％徴とし、安定で１再現性があシ、かつ電気
泳動に適する―整筋れた多孔夏をもつ。重合は１水浴性
のＭ後光反応開始剤を使用する均−系光皿合あるいは九
皿合水溶液中に有機反応開始剤を懸濁または分散し　”
た不均一系光重合により開始し、所望の孔勾配を作るよ
う脚整する。ゲル生成物は、本質的にポリアクリルアミ
ドと水からなるが、アクリルアミド、アガロース、ビス
−アクリルアミド、およびその他のモノマーまたはポリ
マーをざらに含有してもよい。緩衝剤、両性電屏敦、洗
浄剤、および溶質もさらに調合？Ｉ：Ｐに含有してよい
。調合物は、特定の使用のために％数理的に規定し得る
規定した方法で重合および架欄する。

ゲル生成物は％５０μｍないし２　ｒｍ　（Ｄ　Ｉ＃Ｉ
Ｊで厚みを変動させてもよいが、１００ないし３００μ
ｍの範囲が最も好ましい。

好ましくは、ゲル生成物は、重合し架橋したアクリルア
ミドモノマーから形成した水で膨張した多孔性マトリッ
クスからなる。ゲルを製造する溶液中のアクリルアミド
モノマーの濃度は、本質的に約３　ｗ／ｖ　％　Ｃ重ｔ
／容量％）ないし約３　Ｄ　ｗ／ｖ％で、かつ、光反応
開始物質の水溶性または水分散性成分は、約０，３〜１
．２’　ｗ／ｖ％である。ゲル生成物は、長さ、幅、お
よび厚みの各ディメンションをもってもよく、ゲルの孔
の寸法は勾配状になってよい。この勾配は、これらの三
つのどのディメンションにそって変化してもよく、かつ
、直線状でも孔寸法の複雑な関数でもよい。

この発明の方法によれば、バイオ有機分子の試料をゲル
生成物の薄いプレート上に置く工程、生成物の一つのデ
ィメンションを横切って電圧を印加する工程によって、
荷電したバイオ有機分子をゲル生成物を用いて電気泳動
的に分離する。このゲル生成りもま鹸、長さ、幅、およ
び厚みの各ディメンションをもち、かつ、各デイメンシ
ヨンの一つに沿って多孔度の勾配をもつ。

電気泳動分＃に有用な多孔性ゲル生成りの製法は、次の
各工程からなる。

アクリルアミドモノマー約３　ｗ／ｖ％ないし約５０　
ｗ／ｖ％および架橋剤からなる混合物の水溶液または水
分散液を形成する。架橋剤は、全モノマーの約２　ｗ／
ｖ％ないし約１５　ｗ／ｖ％からなる。；光を吸収し、
モノマーの重合を開始する遊離ラジカル発生物質を添加
する。；浴液を所望のゲル生成物の形状に成歩する。；
成形した溶液を光照射にさらし、モノマー溶液を重合さ
せ、かつ、架橋させる。

遊離ンジカル発生物質（光反応開始ＩｍＸ）は、水溶性
または水分散性化合物から本質的になる。

これらの化合物は、〔−）およびジカルボニル化合物、
ミヒラーの（Ｍｉｃｈｌｅｒ　’　ｓ）ケトン（’４．
４′−ビス（ジメナルアミノ）ベンゾフェノン〕、４−
カルボキシベンン゛フェノン、インシフエノン、９．１
０−フェナントレンキノン６−スルホネートカリウム塩
、１．２−ナフトキノン−２−スルホネートカリウム塩
、１，４−ナフトキノン−２−スルホネートカリウム塩
、４−トリクロロメチル−４−メチル−２，５−シクロ
ヘキサジエノンおよびその他の芳香族水浴性または水分
散性モノおよびジカルボニル化合物；ヘンジインメチル
エーテルのようなベンゾインエーテルその他のベンｌイ
ンおよびメチレンブルーと新規メチレンブルーのような
染料である。

モノおよびジカルボニル化合物および染料は、下記のも
のからなる水素ドナーとともに使用する。

Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ安息香酸 Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノエタノール Ｎ−メチルジェタノールアミン ナトリウムｐ−トルエンスルクイナートトリエタノール
アミン 架橋剤は、Ｎ＃Ｎ’−（Ｌ２−ジヒドロキシ−エチレン
）−ビス−アクリルアミド、　Ｎ、Ｎ’−メチレン−ビ
ス−アクリルアミド（ＢＩＳ）　、ｎ　ｅ　Ｈ’−ジア
リルタルドラミド（ＤＡＴＤ）、エチレンジアクリレー
トおよびＮ、Ｎ’−ビス−アクリルシスタミンおよびそ
の他の架橋用モノマーである。

ある決まった組成に対して、多孔度を変えるために、モ
ノマーの溶液に印加する光の強さを調整する工程を本発
明の方法は含む。光の強さは、写真の結像技術（ｉｍａ
ｇｉｎｇ）に共通の技術であるアレイを用いて調整する
。固定したシート状ゲルに対しては、コンピュータおよ
びマイクロプロセッサ−プログラムした走行シャッター
によって光束（ｆｌｕｘ）を調整してよい。代シに、連
続製造に対しては、光の強さを調整する勾配濃度フィル
ター（ｎｅｕｔｒａｌ　ｄｅｎ、５ｉｔｙ　ｆｉｌｔｅ
ｒ）、グリッド、または様々の形状をしたア／ぞ−チャ
ーの下部を個々のゲルモールドまたは連続したすなわち
分割していないゲル組成物を搬送または走行させること
によって光速を加減することができる。

上記した方法で装造したゲル生成物は、多くの利点をも
つが、なかでも電気泳動性が向上した。例えば、勾配は
融通をもってプログラムでき、かつｔ写真結像技術によ
って正確に１信頼をもって９堝できる。さらに、勾配混
合段階が避けられるので、本発明の方法を用いて％あつ
らえもののゲル、すなわち、所望のいかなるパターンの
多孔度プ四フィルをももち得るゲルのみならず、より薄
いゲルを容易に製造できる。

本発明の方法によって、連続的なプロセスが可能となる
ので、一般に安価なゲルが製造される。

このゲルは、よシ安全であ夛、ユーザーはパッケージし
たゲルのみで、毒性のあるアクリルアミドを堆扱う必要
がない。さらに、本発明によって製造したゲルは、よル
高い′電圧の印加とそれにともなうよル速い泳動時間を
可能にする。

加えて１本発明のゲル生成物は、ゲル調合物のイオン性
含有物の減少によって、内方浸透（ｅｎｄｏθｍＯθｉ
ｓ）流を減少させた。

先行技術で経験された多くの出麹を克服した本発明の方
法は、ゲルの重合の度合を既知の再現性のある多孔度プ
０フィルに調整することを可能にする。無機反応開始剤
は、ろる檀の生体分子の分離を妨げることが先行技術中
に示されてきた。゛これは、無機反応促進剤の高度の極
性のためでめる。本発明は、完全に有機物であシｔその
ために極性が乏しく、生体分子への妨害が少ない反応開
始剤を利用する。本＠明は、ゲル溶液中のラジカル反応
開始−これは次にゲルの重合をもたらす−の手段として
光照射を利用する。ある次ったモノマー調合物の重合と
架橋の程度は、電気泳動ゲル中の蛋白質分離のかぎ（Ｋ
ｅｙ）でめる電気泳動ゲルの分離特性を規定する。この
光産金技術は、全てのタイプのポリアクリルアミド電気
泳動ゲルの製造を可能にする。

この技術は、生じるゲル物質の多孔度と電気泳動％性會
これまで得られなかった程度までＢ１４整司能にする。

このアプローチ法を用いれば、分子ｍ御ｊ足用の孔勾目
ごゲルおよび分子の荷電と等電点に基づく分離用の一勾
配ゲルを首め、分析への広範な応用のために異なるタイ
プの電気泳動ゲルをうまく開発することができる。

第１図に、光反応開始剤の存在を特徴とする電気泳動ゲ
ル生成物の製造に使用する本発明の方法の各ステップを
示す。このゲル生成物は、光照射によって生成し゛たラ
ジカルによって重合が反応開始したところの重合した架
橋したモノマーから形成された水で膨張した多孔性マト
リッ□クスから本質的になる。第゛１図中、ステップ２
０から６０は、ある決まったゲル組成物の多孔度をプロ
グラミングする際の特有のアプローチ法を一体となって
提供する基本的要件を明示する。各ステップを次に記載
する。

第一に、ゲルは、ステップ２０で、ゲル成分を選択する
ことによって調合する。このゲル成分は、選択した組成
物しだいであるか、ゲル物質が重合し架橋して所望のゲ
ル多孔度を生じる能力に影響し、かつ、その他の分離特
性にも影響する。ある決まったゲル調合物に対する露光
パラメーターを確立するために１光源３０の照射特性を
測定することが必要である。いったん１これを測定する
と一勾配ゲルを製造するために光源はマスクまたは機械
的シャッターの手段により調整４０する。この手段は、
強さを加減する手段を提供し、それによって複雑なゲル
多孔度パターンの確立を可能にする。

光照射の関数としてゲルの多孔度を調整するというこの
能力は、連続的製造工程に容易に適用し得る安定で正確
かつ再現性のある勾配を作る。したがって、生産条件の
考ｍ５０をなしうることか保証される。上記各ステップ
の全ては、本発明の生成物６０へつながる。

本発明に従って、光照射を介した′電気泳動ゲルの製造
を考慮する際に、化学成分の考慮（ステップ２０）は、
所望の多孔度プロフィルを得るために１安である。例え
ば、ゲル物質の選択は、蛋白質の１＃異または非特異結
合あるいは電気浸透（ｅｌｃ＋ｃｔｒｏ　ｅｎｄｏａｍ
ｏｓｉｓ）のようなゲルの諸特注に影響を与える。

アクリルアミドはゲルの製６造に用いる好ましい、かつ
、主要なモノマーである。しかしながら、ラジカルによ
って反応開始する重合を受けることのできるその他の水
溶性モノマーを使用できる。その他の水浴性モノマーを
所望の多孔度を得るためにアクリルアミドと共重合させ
てもよい。開示したプロセスに従って、ゲル生成物を形
成するために、ある種の水溶性ポリマーも上述のモノマ
ーと共同して、あるいはじかに使用できる。

当初のゲル調合物および最終のケ゛ル生成Ｗ中の上述し
たモノマーの濃度は、約３　ｗ／ｖ％から約３０　ｗ／
ｖ％の間で変動してもよい。この範囲は、ケ゛ルの安が
注、強度、および多孔性マドＩｔックスの谷理由から好
ましい。アクリルアミドの濃度の低いゲルは、最も多孔
性でめシ、大きな分子を容易に通す。これは、分子に対
しての制約がないことが望まれるところの工Ｆ＋Ｆ　Ｋ
’　ｓ　または大きなりＮＡ　７ラグメントの分離に有
用である。

アクリルアミドの製置の高いゲルは、多孔性が小さく、
低分子量物質のよシ高度の分離のための拘束的通路とな
る。

化学的架橋は、適当なポリ未飽和の、官能性アクリル酸
化合物またはアリール酸化合物の存在によってゲル中に
発生し得る。

適当な架橋剤として作用する化合物は、例えば、　Ｎ、
Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミド（ＢＩＩＦ）　
、Ｎ、Ｎ’−ジアジｋ　タｋ　ト：＞ミド（ＤＡＴＤ）
、エチレンジアクリレ−１”％ＮＩＮ’−ビスーアクリ
ルシスタミン％　Ｎ、Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエ
チレン）ビス−アクリルアミド、およびＴＪＩＩｉＯＴ
Ａ（ポリオキシエチルトリメチロールプロパントリアシ
レート）である。Ｂ工Ｓは、反応性、安定度、および溶
解性の各理由から好ましいが、その他の架橋剤をＢ工Ｅ
Ｉに加えてもよく、あるいはＢｆｆＳＯ代少傾使用して
もよい。これらは、当初のゲル調合物に合計モノマー濃
度の約ＯＷ／Ｗ％〜約１０　ｗ／ｗ％添加するが、実際
の量は、ゲル中に要求される架橋の程度によって決定さ
れるものであシ、経験的に決定してよい。好ましい＠囲
は、約２〜７ｑｂである。もし、これらのコモノマーが
最初のアクリルアミド成分に加えられるなら、アクリル
アミドの濃度は、合計のモノマー濃度の約５０％よ一多
少なくなくてもよい。

当初の調合物（架橋剤を含有する）の合計モノマー両度
は、　ｗ／ｖ　％ベースで係Ｔとして表現する。架橋モ
ノマーのｓｌは、合計モノマー濃度のｗ／ｗ％として衣
現し、％Ｃと呼ぶ。

ゲル調合物は、−気原動分喘技術に適合したポリマー物
質の添加によって改質してもよい。

このような化合物は、アガロース、寒天、およびポリア
クリルアミド（分子量が一様でないもの）であるが、こ
れらに限らない。化合物ケ粘性、多孔度およびゲルの強
度を改書するために加えてもよい。これらは、約Ｑ　ｗ
／ｖ％ないし約２０Ｗ／ｖ％の範囲の濃度で調合物にガ
Ｕえることができる。好ましい範囲は、個々のゲル生成
物ごとに経験的に決定する。

ゲル調合物中で個々に、りるいは共同成分として有用で
ある水溶性ポリマーには、ポリアクリルアミド、ポリビ
ニルピロリドン、ポリエチレンオキサイド、ポリメチル
ビニルエーテル、ポリビニ′ルアルコールおよびアガロ
ースである。

当初のゲル調合物および最終のゲルそれ自体は一様でな
い濃度の緩衝剤、洗浄剤、変性剤、両性電解質、および
溶質の添加によってざらに改質してもよい。使用する緩
衝１１＋１！７ｘは、ゲル生成物の最終用途忙よって決
める。水性系で使用する個々の緩衝剤の典型的例には、
トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲ１Ｓ
）塩酸、りエン酸、リン酸水累ナトリウム、硼酸塩な含
む。

緩衝剤は１個々に、あるいは光音な緩衝能力およびイオ
ンｇｉ度をＮ夾にするために組み合わせて使用してもよ
い。このような＃＆備系に使用する濃度および混合物は
、最終用途によう″′Ｃ選択し、この技術の当業者にと
っては自明である。

詳細は、たとえにバーメス（ＨａｍθＢ）およびリック
フッド（Ｒｌｃｋｗｏｏｄ）などの一般的一考図誓中に
示されている。

洗浄剤をゲル調合物に、あるいは分離すべきバイオ有機
試料に直接加えてよい。両方のタースとも、洗浄剤を試
料の可溶化のため、または試料を単に寸法に基づいて分
離するように均一な亀荷対質斌比を維持するために加え
る。洗浄剤およびそれらの凝縮物は、ゲル生成物の最終
用途に基づいて、および分離すべき試料の型に基づいて
経験的に選択する。使用してもよい洗浄剤は、例えば、
セチルトリメチルアンモニウムプロミド、セチルピリジ
ニウムクロリド、デオキシコレート、ナトリウムドデシ
ルサルフェート（ＳＤＳ）　、ポリエチレンオキサイド
ソルビタンモノオレート、およびエトキシレート化オク
チルフェノールである。バーメス（Ｈａｍｅｓ）　オｊ
ひリックウッド（Ｒｌｃｋｗｏｏｄ）などの一般的参考
図書は、このような洸＃刑の使用を詳細に論じている。

ゲル生成物を工ＨＦ分離に利用しようとするなら、両性
電解質をゲル調合物に加えねばならない。両性電解液は
、工ｊｃＦゲルに加えられて、工ＦｉＦ分離に必要な声
勾配を形属１“−る両性的電解液のことである。市販さ
れているｊＩ７１性電解液は、一般に多塩基アミンと多
酸の被合混合物でめる。

本発明では、ゲル生成物に加える両性′電解液のタイプ
または改度に関する制約条件はない。ノ１−メス（Ｈａ
ｍｅｓ）およびリンクウッド（Ｒｉｃｋｗｏｏｄ）々ど
の参考１誓は、すべてのゲル混合物が本来有している両
性電解液の制約条件馨明記している。

本発明の当初のゲル調合物は、俗解した酵素を取除くた
めにキャスティングの前に不活性ガス（屋素、アルゴ゛
ン、ヘリウム婚）パージングによって脱ガスしてもよく
しなくてもよい。重合のためのＳ１強度の光照射の使用
は尚いレベルの２ジカルな発生し、溶解した酸素を急速
に激減させるので、試料の、８整および露光条件が一定
不変のま＼である幽シは、通常心太な当初のゲル調合物
からの酸素の厳格な排除は必要でなくなる。しかしなが
ら、露光中に大気中のｒ！Ｉ累−これは拡散により急速
に補給され得る−に起因する重合の抑制を防止するため
にカバーシートが必要である。

いったん混合すると、当初のゲル−合物は、所望により
さらに別の添加剤により改質してもよく、そし℃、次に
、キャスティングモールド中かただ単に二枚のカバー７
−トの間に入れる。

キャスティングの詳細は、生産の有余５０の項で俊述す
る。

優れた分離性能と脱色（ｄｅｓｔａｉｎ）性能をもつゲ
ルを生成することを峙敵とするいくつかの光反応開始剤
、すなわち遊離ラジカル発生物買を第１表に示す。

第１表 １　　・４−カルボキシベンゾ７１４５〜α９０（１１
１２５エノン ・トリエタノールアミン　　　　２〜４　　０．５〜１
．０２　　・４−カルボキシベンゾ７　　　０．４５　
　　　ａｌｌ　　　３５〜５０エノン ・４−ジメチルアミノ先払　　　２〜４０．５〜１．０
香酸 ６　　・４−カルボキシベンシフ　　　０．４５　　　
０．１１　　２０〜９０エノン ・Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノエ　　２〜４　０．５〜１．
０タノール ４　　・４−カルボキシベンシフ　　　０．４５　　　
０．１１　　２０〜６０エノン ・Ｎ−メチルジェタノール　　２〜４　０．５〜１．０
アミン ５　　・４−カルボキシベンシフ　　　０．４５　　　
０．１１　　　　１５エノン ・Ｎａパラトルエンスルフ　　　　４　　　　　１０イ
ナート ″　６　　・９，１０−フェナントレン　　　０．４　
　　　０．１　　　　６０キノン−２−スルホネー トカリウ４ ７　　・９，１０−７エナントレン　　　０．４　　　
　　α１　　２５キノン−２−スルホネー トカリウム塩 ・トリエタノールアミン　　　　４．０　　　　１．０
８　　・９，１０−７エナントレン　　　０．４　　　
　０．１　　　２５キノン−２−ヌＪレホネー トカリウム塩 ・Ｎａパラトルエンスルフ　　　４．０　　　　１．０
イナート ９　　　＠９，１Ｏ−７−ｒ−ｆントレン０．４　　　
　　０．１　　　　６０キノン−６−スルホネー トカリウム埴 ・Ｎａパラトルエンスルフ　　　４．０　　　　１．０
　　　１０イテート １０　　　＠１，２−ナフトキノンー４　　　　０．４
　　　　　ｕ、１５０−スルホネートカリウム 檜 ・Ｎａノセフトルエンスルノ　　　　４．０　　　　　
１．０　　　　１１イナート １１　　・１，４−ナフトキノン−２０，４０，１４０
−スルホネートカリウム 塚 ・Ｎａパラトルエンスルフ イナート ・エタノール　　　　　　　　　２０　　　　５１５　
　・砦携超メチレンブルー　　　　　　０．１　　　　
　α０２５　　　５０（ｌ・Ｎａパ２トルエンスルフィ
　　４゜０１．。

ナート １４　　　＠ｉｆレンプルー　　　　　　　　０．１　
　　０．０２５　　　１５ｄ・Ｈａパ２トルエンスルフ
ィ　　４．０　　　　１．０ナート 記号説明 ａａｓ成分のｇｍｅ　／溶液１００ｍ１ｂ　ｍ　７７７
％％ゲル溶液 ｃ−ｎｍ光したｗ／２ｋｗ水銀ホトポリマー＃（バーキ
イアｘ＝ｒ−社５ｅｒｋｅｙ　Ａ３００ｒ　Ｏｏ、）ゲ
ル時間、は均一ゲルに対するもの ｄ＝熱的に不安定なゲル；光なしで座台したもの；勾配
ゲルとして不通 上表から、２ｋｗの水銀ホトポリマー光源？使用すれば
、使用した反応開始剤と水素ドナーの組合わせしだいで
１５秒はどの短時間の露光でゲルを生成できることがわ
かる。

電気泳動ゲル生成物の一方から他方側への多孔度をうま
く調整するために、結果として生ずる照射されたパター
ンの均一性を知らねばならない。

このパターンは、スリット、濃度フィルターまたはシャ
ッタープログラムをデザインして非均一性を補整する際
に考慮しなければならない。

上記の１％性を確立するために使用する技術は公知であ
る。例えば、ス堅りトルラジオメーターのような装置は
、露光分布情報を定められたＸ％Ｙ座標の関数として果
めるのに使用できる。

本発明では、好ましい光源唸６００〜４００　ｎｍの出
力ｒもの紫外線である。これは、好ましい光反応開始納
と破もよく相関する。実際には、反応開始剤を活性化さ
せて重合を起こさせるいかなる光源も使用できる。好ま
しい照射源はｔコールパーマーインスッルメント（Ｃｏ
ｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ工ｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ａ）ｉ製の
２個の１５ワツト自己フイルタ一作用黒色−ライトブル
ー管からなる長波ＵＶ２ンプであった。これは、１０８
’のビームと光のおおい（ｈｏｕｓｉｎｇ）から０．５
１の所の代表的強度が１１００μｙ７ｅｍ２の３６５ｎ
ｍ光をもたらす。ゲル溶液の重合に首尾よく使用された
他の光源は５００〜６００　ｏｎの出力をもつ２ｋｗア
ダラックス（Ａｄｄａｌｕｘ）水声ホトポリマーランプ
でめった。

後者の光源の場合は、ゲルはランプおおＬ（ｂｏｕｓ−
１ｎｇ）から４インチ（約１０（！ＩＬ）離れて配置し
た。

この光源に対するゲルタイムは１５秒であった。

黒−プル−ランプを用いるゲルタイムは３０秒である（
Ｈｇホトポリマー源のそれの２倍）。第２の光源はかな
シの赤外出力を有しておシ、３分板上の連続露光は重合
中にゲルの冷却な必要とする。

いったん、光源の特性が決オると強度を調整してゲルの
多孔度を変動させることができる。

調整は、光束（ワット／α２）をゲルの長さ、幅および
厚みの関数として調整することによってなされる。光束
は固定シート状ゲルに対しては、プログラムされたシャ
ッターあるいは走行コンベヤによって加減してもよい。

搬送されるウェブ状、または定行するシート状ゲルの製
造工程が望ましい場合は、一度フイルター、グリツ、ド
、′または椋々の形状をしたアパーチャーのような器具
を光束をｄａするのに用いてもよい。固定式ゲル製造工
程に、コンピュータ駆動シャッター、製度フィルター、
またはグリッドを取シ入れることもできる。これらθ器
具のよシ詳細な説明は、露光勾配の形成に関、連するセ
クションで述べる。

ポリアクリルアミド電気泳動ゲルは、水中に通常合計５
〜６０％のアクリルアミドを含有する＃液の重合によっ
て形成された架橋したポリマーの網状組織である。通常
、モノマーの２〜７％）；ｊ、　Ｎ、ｊＪ’−メチレン
−ビス−アクリルアミド（ＢｌＢ）である。これは、マ
トリックスに架橋部をもたらすために加える。通常、モ
ノマーは１確準の過懺酸塩反応開始化合物を用いて化学
的に、あるいはリボフラビンを用いて光化学的に重合す
る。ゲルの拘束性は、ポリマー密度および架橋の程度を
媒介して合計上ツマ−の％（％ＴＪと存在する架儒剤の
童に関係する。

文献の取決めは、ゲルの拘束性をゲル中に嵐会した３％
の［８を官有する合計モノ！−の％に換算して定義して
いる。例えば、′２０％Ｔ多孔就１をもつグルは１合計
アクリルアミド２゜慢の溶液に３％のＢＩｓを力ｎえた
ものを重合することＫよって形成したゲルの拘束性を示
す。したがって、ゲルを組成しだいで、１０．１５．２
０％Ｔの多孔度をもつものという風に呼ぶ。

この上述の取決めは、重合が完全になされると仮定して
いる故にケ゛ル調合物の電気泳動応答性に関してはよく
機能する。本発明では、電気泳動応答性は、アクリルア
ミドの含４Ｔｔすなわち％ＴＫ匣成関遅づけることはで
さない。これは、１合プロセスの程度と性質の両方を、
照射露光によって、Ａ贅するからである。例、ｔＵ、光
反応開始した照ＩＦＪ虚＆登用いれば、Ｎ光の範囲を変
えることによって、ある決まった当初の調合物ＶＣろる
範囲の多孔度馨作ることができる。

光反応開始で１腫したゲルの等価多孔震は、等価有効ｑ
ｂＴと呼ぶことができ１本開示中ではＴと表示する。

電気泳動ダルの性能と関連する厳も一般的な事項として
この技術で用いられるものは、分子量対距離と多孔度対
距離の両プロフィルである。

正確さ−これにより多孔度なゲルの一方から他方への距
離の関数として調整できるーは、所望の性能関連事項に
よって決まるプログラム可能なプｏフィルを考慮する際
の唯一のものである。

本発明に従えば、多孔度に光反応開始を媒介してＤＩ整
し、ゲルは個別の研究者の特別のニーズに合うように製
造できる。

多孔度勾配の形成には、固定式ゲルと搬送または走行式
ゲルの両方とも、照射光束の加減手段がいる。この光束
加減手段は％走行シャッター、スクリーン、グリッド、
まｆｃは禄々な形状をしたアＡ−チャーの形をしている
。多孔度勾配の製造に用いる典型的なスリットを第２図
に示す。スリットの形しだいで、決まった多孔度プロフ
ィルが得られる。例えば、光源の下を走行するコンベヤ
で運ばれるゲルの上部に配７Ｍするマスク１０８として
、階段状の露光形態をしたスリットを用いれば、ゲルに
同いて開いているマスクの領域においてのみ光源はゲル
１１２を重合させることになる。もし、ゲルをマスクお
よび光源に対して相対的に走行するか搬送するなら１ゲ
ルのめる饋＠は、よシ長い時間路光（すなわちよυ多量
の露光）されることになる。

露光は重合と架橋に比例し、それが順番に多孔度に比例
するので、孔勾配ゲルが製造できることになる。

例えは％第２図、第６図で、段階状のスリット１１０を
用いて露光した電気泳動ゲル１１２は、レーン１１６か
ら１２６までの段階状の形の多孔度勾配をもつことにな
る。レーン１１６は重合の程度が縦面で、対応して孔の
寸法１２８はよル小さくなる。なぜなら、レーン１１６
の縦のスリット長さ１３０はマスク中最大だからである
。レーン１２６はゲルの最低度の蔗合部分に当シ、よシ
大きな孔寸法１１４に対応することになる。露光勾配の
異なるマスクの他の例は、第４図ａｓ　ｂ％Ｃ％ｄに１
例えば直線状のパター　ン１３０、多項式（Ｐｏｌｙｎ
ｏｍｉａｌ）パターン１３２、指数関数パターン１６４
．めるいは段階状パターン１３６などを示した。

固足式または静止式のゲル露光では、予じめ決めた速度
でゲルの一方から他方へ走行するプログ２ム可能なシャ
ッターアセンブリを使用して多孔度勾配を形成できる。

決められた頻ざを与えるためにゲルの一方から他方へ走
行するシャッターの速度およびケ゛ルの組成が多孔板プ
ロフィルを決定する。シャッター露光システムの詳＃は
、連続的ゲル製造プロセスとあわせて生産の考察５０を
１己連したセクションで説明する。

生産条件の考慮５０ 既に開示した説明に従って最適化したシステムによれば
、パッチモードか連続的な製造工程を使用して、ある決
まった多孔度プロフィルをもつゲルを製造することが完
全に実現可能である。

本発明に従えは、第５図、第６図、ｉ７図、および第８
図に最もよく示すように、ゲル調合物は、ポリスチレン
製のトレイ１１２とゲル支持体として機能するポリエス
テル製のカバーシート１ａ４＊ｔつ二つの主要部分から
なるモールド申で繕光子る。うまくいった実験で使用し
たトレイ１１２は、胡ざ１２ミル（３００μｍ〕で、４
．５　”　Ｘ５　”の洩いトレイであった。これは１ゲ
ルの長さの約％に及んでおシ、ゲルを８つのレーン忙分
割する列になったｌａ長い隆起部を有していた。トレイ
１１２は、サーバファインバイオケミカ（８ｅｒｖａ　
ＦｅｉｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃａＮｆから入手できる厚さ
７ミルの”Ｇｅｌ　Ｆｉｘ’　（商標）ポリエステルフ
ィルム１０４で被覆する。ポリエステルフィルムは、完
成された゛電気泳動ゲル用の可撓性支持体となる。特別
な２−Ｄ集積ゲルへの応用のためには、′ｆｔｍを支持
体フィルム上に印刷する。

この場合は、レーンの細長い隆起部および試料を付着す
るくほみ（ｗｅｌｌ）はモールドから取除く。

ポリエステルフィルム１０４をポリスチレントレイ１１
２ヘシールしてもよいが、これには、ダウコーニング（
ＤＯＷ　Ｏｏｒｎｉｎｇ）社製シリコーン尚真空グリー
スの薄い被膜をモールドの肩部に塗布し、次に、二つの
主要部分を−ｍＫ加圧口−リングする。グリースは水密
な液体シールをもたらす。二つの主要部分は、次に、ゲ
ルの長さのストリップ１２にｖＪｗＲシた紙釆用の町塑
性回夛Ｈ（ｅｄｇｅ　ｍｏｌａｉｎｇ）１１４用ストリ
ツプ（スライドーロンクパインデイングパーズ５ｌｉ（
Ｌθ−Ｌｏｃｋ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｂａｒｅ商標）を用
いて一諸にクランプする。露光後、ゲルはポリエステル
フィルム１０４ｍの支持体Ｋ　［先約に接着し、かつこ
うして二つの主要部分との間の接着力の相違によってモ
ールドから剥離できる。

ポリニスデルフィルム１０１；ｔ、）レイ１１２への取
付は前罠、接涜するのに水を用いてプレー１１０２上に
押しつける。このラミネートを次に前述した／リコーン
グリースと縁部クランプを用いてトレイ１１２に城付け
る。トレイ１１２は、トレイ１１２の相対した渦部に位
置した小δな開孔１０６から充礪する。トレイ１１２は
、″傾けて保持して空気またはアルゴンがモノマー溶液
と入れ替るようにする。開孔１０６は、小姑なゴム膜（
ｓｅｐｔａ）　１０８で蓋をし、アルミニウム板１０２
をフィルム１０４の下の位置に押し込んでゲルの支持体
として像能させる。

ゲル調合物１１０、ポリエステルフィルム１０４、トレ
イ１１２、プレート１０２、および縁回シ１１４からな
るモールドアセンブリーは、コンベヤベルト上に直接載
せる。このデバイスは、ゲル支持体アセンブリ１４４と
呼ひ、選択する製造プロセスのタイプのいかんにかかわ
らず、使用される。

第９図および第１０図に示したものは、バツ゛チタイプ
のモードで露光勾配を製造できるコンピューター駆動の
シャッター４＆置である。プログラム可能なシャッター
１４２は、光源１４０の下の適切な距離に設置する。こ
の距離は一ターゲットに均一な照射分布をもたらす距離
である。ゲルの支持体アセンブリ１４４は、前述したよ
うにモノマーで充填し、次に、支持体アセンブリの上側
に光横用孔１０６がくるように試料ホルダー１４６中に
二つまｆｃは三つ横に並べて置く（第９図に最もよく示
している）。プログラム可能なンヤツタ−１４２は、次
に支持体アセンブリ１４４０直上に位置させる。光源１
４０を次に励起させ、かつ最大ｐＪ！　Ｏ強さにする。

プログラムｇ］「ヒなシャッター１４２を次に作動開始
きせる。シャッターは、所産の露光プロフィルに合った
コンピュータ１５６０ン７トウエアコマンドによって制
御されるネジ伝動体１４８とステップモータ１５０の組
み合わせ装置を介して開放し始める。インテル（Ｉｎｔ
ｅｌ藺標）社製の８２５５Ａブログンム町叱ペリフエラ
ルインターフエース１５４をコンピュータとシャッター
駆動システム間のアナログ対ディジタル制御通イｄ′４
Ｉ：調贅するのに使用した。紫外Ｓ＊射からユーザーを
隔離するために、照射小ヱ壁１５２を７ヤツターシステ
ムと制御層との闇に配置する。この装置の平面は第１０
図に示す。

露光完了と同時に光源は遮断する。

ゲル調合物の露光に用いる第２の装置は、ゲルの連続製
造用のコンベヤシステムである。これは第１１図に示す
。ゲルの支持体アセンブリ１４４は、手作業によりモノ
マーで尤礪し、次にステンレス鋼製コンベヤベルト１６
０上に載せる。こｖ：７ンベヤ、ベルトは、ゲルを光源
１６４に、次に集積領域１８０に運ぶのに使用する。

ゲルの支持体アセンブリ１４４をコンベヤベルト１６０
上に載せた後、光源１６４を励起する。光が安定したと
きコンベヤ１６０は動き出し１ゲルの支持体アセンブリ
１４４は一定の予じめ足めたベルト速度でスリット、グ
リッドｔｉたはスクリーンアセンブリ１６８の下部を通
過する。

典型的なスリット、グリッド、またはスクリー　ン７　
センフリ１６８１）　例ｍ　ヲ１ｊ１４１２１ｍ　（！
：　ａ　１５’図に示す。都合のよいスリットマスク１
９６は、要求される所望の多孔度プロフィルによって選
ぶ。スリット１９６は、ホルダーとシールドを組み合わ
せたアセンブリ１７８と一体になってイル。この組み合
わせアセンブ！ｊ１７８Ｕ、ゲルの支持体アセンブリ１
４４馨欲しない光から保護するとともに都合のよい光フ
ィルターのための保持手段として機能′１−る。光がス
リット１９６を通過できるように１４１９８をスリット
の上部に設ける。スリット１９６は、シールディング４
）１７Ｂに平行に４個のブッシングコンベヤベル）１６
０（第１１図）は、モーター１７０によって駆動する。

モーターは、減速ギヤボックス１７２に連結する。これ
は、ベルト１７４を駆動し、ベルトは順にベルトプーリ
ー１７６ｆ：駆動する。コンベヤ１６０および試料集積
領域１８０の上部に配置したシールディング１７８によ
って、露光中ゲルの支持体アセンブリ１４４を欲しない
、光から保護する。ゲルの支持体アセンブリ１４４がコ
ンベヤ１６０を離れる際に、これらは排出斜面１８２を
試料貯蔵領域１８０へｆｆｉ落する。この貯蔵領域１８
０は水圧スタンド１８４によって垂直に調整できる。

光源は、一定のエネルギーをもつ一定不変の強きを決ま
った童で定められた領域上に与えるので、重合は露光の
時間に比例する。時間はプμグラムされたシャッターの
作動によって、あるいは所望の勾配に対応する寸法にカ
ットされた多様な固定したスリットの下部のコンベヤの
コンスタントな走行によって調整できる。

スリットのディメンション、シャッターの作動、コンベ
ヤのベルト速度、および光の強さの計算は、すべて光重
合を使用した電気泳動ゲルの製造に先立って決足しなけ
ればならないファクターである。潜在的な製造プロセス
と矛循しない改良をコンベヤシステムに加えて試料を連
続的に供給し排出′１−るようにすることができる。

上述の各製造システムの各々を均一多孔度露光レーンご
とに多孔度を変えた露光、および連続勾配露光を形成す
るためにいかにして使用するかを以下に説明する。

均一露光 バッチタイプのシャッターシステム（第９図参照）を用
いて均一露光を得るには１試料１４４をシャッターテー
ブル１４６上に載せ、ゲル１４４の各部を同じ時間長さ
の間露光するようにする。第１１図のコンベヤシステム
でハ、試料１４４は四角形または矩形のスリット１９６
の下部を一定の速さで通過する。これらの二つの製造方
法は、たとえこれらがともに同じく全体的な露光をもた
らすものであるとしても互いに微妙に異なるものである
。シャッターシステムでは、試料１４４は、その全表面
領域にわたって均一な瞬間的な露光を必らず受け、同時
にゲル中の全ての個所において血合が反応開始する。コ
ンベヤシステムでは、露光の前線部がゲル上を通過し、
これに対応する厘合すなわち反応前線部を、それにとも
なう拡散および熱勾配とともに作ル出す。

レーン露光 バッチタイプシステム（第９図および第１０図参照）を
使用して、レーンごとに相違はあるが均一露光部を有す
る個々に分離したレーンをもつゲルを製造するに門、第
２図および第３図に記載したものと同様な露光パターン
で試料をマスクするために、ゲルの長さ方向に一方から
他方へ段階状にシャッター１４２を手操作または自動操
作で動かすことが必要である。ル−ン９ｊＳ光部を製造
する好ましい方法は、第２図に記載したのと同じスリッ
トパターンと一諸にコンベヤ７ステム（第１１図）を使
用Ｊ−るものである。

連続勾配露光 使用する最後の露光の形態は、Ｉｇｒ望の多孔度の特別
の範囲に対応する４光勾配部またはゲルの長さ方向にそ
って電気泳動の方向に分子量の分−亜を規制する露光勾
配部を形成するものであつた。これらの勾配部は、シャ
ゲタおよ゛びコンベヤと組み合わせた様々な固定スリッ
トの両方を用いて製造した。各々の使用法を説明する。

パッチタイプのシャッターシステム（第９図、第１０図
）を使用する場合は、支”持坏アセンブリ１４４を試料
ホルダー１４６に直く。プログラム可能シャッター１４
２は、次に支持体アセンブリ１４４の直上に位置させる
。光源１４０を次に励起し、最大強さにしたときにシャ
ッター１４２に開放して所望の露光プロフィルを作る。

露光の好ましい手段は、勾配を作るためのマスク１６８
を用いるとともに、コンベヤシステム（第１１図）を使
用することでめる。マスク１６８は５分子量または多孔
度対距離の特別なプロフィルを形成するのに必要と姑れ
る露光勾配を作るために要求される特別なパターンにカ
ットする。試料１４４は、゛電気泳動方向をベルトの走
行方向に直角の方向にしてコンベヤ上に載せ、次１ｃ椹
光する。第Ｊａｚｄ図は、所望の電気泳動多孔度応答性
を得るのに役立つ異なった代表的マスクパターンを示す
。

モールドを使用するキャスティング方法は、純水による
モノマー−合物からゲルを製造するのに使用しなけれは
ならないが、連続的コーチ・イング方法は、ポリアクリ
ルアミドか他の共存し得る水浴性ポリマーのいずれか馨
用いて磯厚にしたｍｌ＆によって使用できる。二つの可
能なコーティング方法ケ説明する。第一はカバーシート
をオリ用し、第二は不活性コーティング反応屋を８＋′
０用するもθである。

もし、ゲル調合ｗＪを光源から遠くの位置でデーティン
グするｌら、１２４１４図に破もよく示すカバーシート
２１ｏを溶媒（水）の蒸発防止と重合のための酸素バリ
ヤーの提供のためにかぶせねばならない。カバーシート
２１０は、さらに印刷した電極およびこれと同様のもの
を宮Ｍしてもよい。また、これらはベースの一部分とし
て含有されていてもよい。均一なゲルの厚さを得るため
にｔスペーサー２１２を使用しなければならない。これ
らのスペーサーはテンプレートとしてのフィルム支持体
２１４上に置く。モノマー−ポリマー組成＠２１８は、
次にノズル２２０を通してフィルム支持体２１４上にポ
ンプで送シ込む。コーティングナイフ２１６を使用して
モノマー−ポリマー調合物２１８を均一なケ゛ルに形成
する。

もし、七ツマ―−ポリマー組成物が十分に物質的な完全
な状態であれば、所遍の浮みの被膜はドクターナイフ２
２２を用いて製造できる。

このドクターナイフは、第１５図に取もよく示づ−よう
に、ゲルの製造中に支持体となるＵ形状のブラケット２
２１中に収容する。第１４図のように、モノマーーボリ
マー岨成物２１８は、ノズル２２０　ｋ　；＋ｊＪｉ　
Ｌでフィルム支持体２１４上にポンプで送る。ゲルは１
次にドクターナイフ２２２によって成形し、次に光源２
２８によって不活性雰囲気２２６申で重合する。温度と
湿度はコーティングおよび照射の間の浴媒損失を防ぐた
めＫｔＡ整しなけれｌ−Ｊ’ならない。上記した方法の
両方とも、ある次まったゲル生成＠　２２４を作るため
、績厚化したモノマー浴液または純粋な水浴性ポリマー
浴液の照射に使用できる。

勾配ゲルお・よび均一ゲル用の典型的な光重合５ＤＳ−
ＰＡＧＥ調合物を実施例１にｔそして工ＥＦゲル用のも
のを実施例２に記載する。

上記の実施例は、均′ＪＫな反応関Ｉｒａ切實を使用す
る光重合ゲルの製造月の５ＤＳ−ＰＡＧＥ寛気泳動ゲル
調合物の製造を例示する。４−カルボキシベンゾフェノ
ンおよび水素ドナーのトリエタノールアミンを含有する
遊能ラジカル発生物質は特に好ましい。

実施例　１ 原料溶液を下記のとおシ製造した。

モノマー浴液 アクリルアミド　　　　　　　　　　８０？ＩＪ、Ｎ’
−メチ・シン−ビス−アクリルアミド２．１ｆ蒸　　留
　　水　　　　　　　　　　　　２００ｍと了る蓋緩衝
浴液 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン　　　１ａ１
？ナトリウムドデシルｍＭ塩　　　　　　　　　　　　
０．４２蒸留′水　　　　　　８０− 声はＨｏｔでａ８に調螢 蒸　　留　　水　　　　　　　　　　　　　１００４と
する麓反応開始剤溶液 ４−カルホ゛キシベンゾフェノン　　　　　　　　０．
９０　Ｆトリエタノールアミン　　　　　　　２．００
ｆ蒸　　留　　水　　　　　　　　　　　　　　　　　
　８５−關はＨＣｊｔまたはＮａＯＨでａ８に調整蒸　
　留　　水　　　　　　　　　　　　　１００−とする
倉ゲル溶液 ゲル溶液は原料溶液を下記のとおシ混合して製造した。

モノマー浴液　　　　　５０％ 緩１［ｉ浴＃Ｉ　　　　　　　　２５％反応開始剤溶液
　　　　２５％ ゲル浴液は上述したような４．５”Ｘ５”で１２ミルの
深さの浅いトレイ中に導入した。光ＪＪｔ後トシトレイ
述のようにポリエステルフィルムで被覆した。

ＳＤＳ　−ＰＡＧＪｉ；　ｄｌ：％　陳勤ゲＡ４ｊ、６
ｏ秒間の露光によ−って先に示したとおシに製造し、均
一露光した試料および勾配露光した試料の両方について
評価した。よル短い露光時間を使用できるがｔ最高の分
離は上記した黒色光源を使用して約６０秒で生じた。こ
れらの試料は下記の成分からなる蛋白質のＢＩＩＲＩ！
準混合物を用いて評価した。

・インシヱリン ・ポビントライ（Ｂｏｖｉｎ　Ｔｒｙ）、インヒビター
・チトクロームＣ ・リソジム ・β−ラクトグロブリン ・α−キモトリプシノーゲン ・オパルブミン 上述した反応開始物質は良好な分離２よび脱色特性をも
つゲルを生じた。上記の蛋白質混合物は均一露光では六
つの成分に、そして勾配露光したゲルについては七つの
成分に分離した。

碗度フィルターを使用した場合は、それを補なうため勾
配ゲルにはよシ長い露光時間を使用した。加えて、勾配
露光したゲルはよシ鋭いバンドを示した。再現性を上述
した調合物を使用して明らかにした。

下記の実施例は、光重合ゲルの製造のための工ＦＦゲル
調合物の製造を例示する。

実施例　２ 次の例は等電フオー力スイング用のゲルの製造への本発
明の組成物の応用可能性を例示する。

原料溶液は下記のとおシ製造した。

原料モノマー＃液 アクリルアミド　　　　　　６．４７ｇｍ５ビス−アク
リルアミド　　　０．２０　ｇｍｓ脱イオン水　　　　
　　　６６．７−とする量両性電ｐｓ沖、科浴欣 ファーマライト（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ　闇標）ＬＩｔ
ｉ３〜１０）　２．５ａｊグリセロール　　　　　　　
　　　４．０ｄ脱イオン水　　　　　　　　　　１０ｍ
とする童反応開始剤原料溶液 ベンゾインメチルエーテル　　　　０．４　ｇｍｓエタ
ノール　　　　　　　　　　　１〇−説イオン水　　　
　　　　　　　５０ｍとする童ｐＨ７，ＯＫ調整 ゲルｍ液 ゲル溶液は原料留液を下記のごとく混合して製造した。

モノマー留液　　　５０％ 両性電解液　　　　２５カ 反応開始剤溶液　　２５％ ゲルは、実施例１と同様に製造した。しかしながら、露
光時間は、官能性ゲルをτ「るのに必要な露光が最低１
０分間でよい、荷電された反応開始種（ｓｐｅｃｉｅｓ
）　ｌｔｔ有するＥＩＤＳ　Ｌｐｍｎゲルの場合よシ長
かった。重合を完全にするために、上述した黒色光源を
使用して２０分間露光した。

しかしながら、よル長い時間の重合は、反応開始剤の非
効率性忙よるのではなく、工ＫＦゲルに要求されるアク
リルアミドモノマーの一度が低イ（ＢＤＦ３−ＰＡＧＢ
ゲル用が７〜３ｏＴ／２〜７％であるのに対し一般に５
〜７Ｔ／２〜ｎｏ）ことによる。

工ＥＦゲルは、田勾配との干渉を避けるために中性の反
応開始成分の使用を必要とする。良好な分離能（ファル
マシア製標準広域ＰＩ計測キット使用）と脱色性をもつ
ゲルは、実施例２に示したとおシに製造した溶液から倚
られた。ベンゾインメチルエーテル（水素ドナーの使用
を必要としない中性反応開始剤）の混入を、共拗浴媒と
してのエタノールの添刀Ｉ］（ゲル溶液中に５幅〕忙よ
って遂行した。エタノールは電気ｖｋｔｓに不利な影響
は４えない。

ゲル生成物６０ 光反応開始を経て電気′ｒｉｋ勤ゲルの爪台な行なわせ
る本発明を用いれば、ゲル生成物の薄いプレート上にバ
イオ有機分子の試料を置く工程、−／Ｖ−トの薄ざ方向
のディメンション以外のディメンションを横切って電圧
を印加する工程によって、すでに開示したゲル生成物６
０を用いてバイオ有機分子を電気泳動的に分離すること
が可能となる。ゲル生成物は、厚みが５０μｍから２園
の間で変動してもよいが、１００〜３００μｍの範囲が
最も好ましい。さらに％賛求迅れる所望の篭気泳動分離
しだいで、ゲルにはゲルの一方から他方への距離に対す
る分子量または多孔度の特定の分布をデザインしてもよ
く、また均一多孔度、レーン多孔度、または勾配多孔度
プロフィルを有してもよい。本発明に従って製造したこ
のような光重合したゲルの諸利点を下記に要約する。

露光、および試料の配置の厳密な制御は、ケ゛ルの製造
の優れた再現性なもたらす。言いかえれは、勾配の形状
と型の再視性が高い。

’；’　Ｉ　−、ｘ　！ＩＩＦ５またはマスクのマイク
ロブーセッサー１ｔｌｔ制御によっていかなるパターン
の多孔度プロフィルにもあつらえられる。例えば、不連
続な勾配および伏雑なプロフィルの勾配な容易に製造で
きる。

ゲルの連続的製造−一般に睨在はゲルはバッチ式に製造
されている。本件の場合は、連続的な製造ができる。そ
れ故ゲルの一つ一つは再現性のある状態で迅速に製造で
きる。

よシ薄いゲルー光重合プロセスは、従来のプロセスでは
容易に製造されない薄い勾配ゲル　。

（５００μ）の製造を可能にする。薄いゲルは動くのに
より少いパワーしか必要としないので、これらはよシ早
く電気泳動されることができｔかつ取扱いがよシ間単で
ある。これはよシ迅速でエネルギーの節約になる。

ルアミドを取扱わなくてもよく、パッケージしたゲル物
質はよシ安全に取扱うことができる。

安定な勾配−他のシステム中の不反応の反応開始剤は、
遊離モノマーの菖合またはポリマー架橋をゲルの製造が
完了した後に引越起こすことがある。それ故、架橋密度
および勾配の変動は調整できなくなる。ここで説明した
反応開始剤は光がなくては血合を引き起こさず、それ故
、安定した電気泳動ゲルシステムを提供する。

【図面の簡単な説明】

添付図面第１図は紫外＃または町視光栂照射によって電
気泳動ゲルを形成する方法のブロックダイアダラム、第
２図は段階状の露光勾配用スリットの平面図、第３図は
第２図の段階状の露光勾配用スリットによって得たゲル
の多孔度プロフィルを示す図、第４Ａ図〜第４Ｄ図は多
孔度の勾配用に使用する異なった代表的スリットを示す
図、第５図はゲルモールドとフィルム支持体の組み合せ
の平面図、第６図は第５図の６−６１１ｊ！にそって切
断した縦断面図、第７図はゲルモールドとフィルム支持
体アセンブリの底面図、第８図は＃！７図の８−８Ｉ１
１１！にそって切断した縦断面図、第９図Ｉ／ｉ電気泳
動ゲルの製造に使用するシャッターシステムの図、第１
０図は電気泳動ゲルの製造に使用するシャッターシステ
ムの最上部面を示す図、第１１図は電気泳動ゲルの装造
に使用するコンベヤ゛システムの図、第１２図はゲルを
照射する際に使用する代表的なスリットアセンブリを示
す図、第１３図は第１２因に示したスリットの最上部面
を示す図、第１４図はカバーシートを利用する連続コー
ティング方法を示す図、そして第１５図は不活性コーテ
ィング−照射室を利用する連続コーティングと重合方法
を示す図である。 特許出願人　　イー・アイ・デュポン・ド・ネモアース
・アンド・コンパニー 外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）重合しかつ架橋したモノマーから形成された水で膨
   潤した多孔性マトリツクスから本質的になり、光反応開
   始剤の存在を特徴とする安定で再現性があり、調整され
   た多孔度を有する、電気泳動分離に有用な多孔性ゲル生
   成物。 ２）モノマーがアクリルアミドである特許請求の範囲第
   １項に記載したゲル生成物。 ３）重合が水溶性光反応開始剤を用いた均一系光重合ま
   たは反応開始剤が光重合水浴液中に懸濁または分散され
   た不均一系光重合によつて開始するところの特許請求の
   範囲第１項に記載したゲル生成物。 ４）アクリルアミドが約５ｗ／ｖ％である特許請求の範
   囲第３項に記載したゲル生成物。 ５）アクリルアミドモノマーが約３ｗ／ｖ％から約３０
   ｗ／ｖ％の範囲から本質的になる特許請求の範囲第３項
   に記載したゲル生成物。 ６）生成物が３〜３０ｗ／ｖ％のアクリルアミドモノマ
   ーおよび約０．３〜１．２ｗ／ｖ％の水浴性または水分
   散性光反応開始剤系から本質的になる特許請求の範囲第
   １項に記載したゲル生成物。 ７）アクリルアミドモノマーの約２〜１５ｗ／ｖ％が架
   橋可能なモノマーである特許請求の範囲第６項に記載し
   たゲル生成物。 ８）ゲル生成物が長さ、幅、および厚みの各デイメンシ
   ヨンをもち、この各デイメンシヨンの一つにそつた多孔
   度勾配をもつ特許請求の範囲第１項に記載した生成物。 ９）多孔度の勾配が直線状である特許請求の範囲第８項
   に記載した生成物。 １０）多孔度の勾配が対数的である特許請求の範囲第８
   項に記載した生成物。 １１）多孔度の勾配が複雑な特許請求の範囲第８項に記
   載した生成物。 １２）重合しかつ架橋したモノマーから形成された水で
   膨張した多孔性マトリツクスから本質的になり、光反応
   開始剤の存在を特徴とする安定で再現性があり、調整さ
   れた多孔度を有する、電気泳動分離に有用な多孔性ゲル
   生成物を用い、ゲル生成物の薄いプレート上にバイオ有
   機分子の試料を載せる工程、プレートの薄さ方向のデイ
   メンシヨン以外のデイメンシヨンを横切つて電圧を印加
   する工程によつてバイオ有機分子を電気泳動により分離
   する方法。 １３）生成物が３〜３０ｗ／ｖ％のアクリルアミドモノ
   マーおよび約０．３〜１．２ｗ／ｖ％の水溶性または水
   分散性光反応開始物質から本質的になり、アクリルアミ
   ドモノマーの約２〜１５ｗ／ｖ％が架橋可能なモノマー
   である生成物を用いる、特許請求の範囲第１２項に記載
   した方法。 １４）電気泳動分離に有用な多孔性ゲル生成物を下記の
   各工程によつて製造する方法。 イ）約３ｗ／ｖ％から約３０ｗ／ｖ％のアクリルアミド
   モノマーと合計モノマーの約２ｗ／ｖ％ないし約１５ｗ
   ／ｖ％からなる架橋剤の混合物の水溶液または水分散液
   を作る。 ロ）光の照射を吸収し、モノマーの重合を開始する遊離
   ラジカル発生物質を添加する。 ハ）溶液を所望のゲル生成物の形に形成する。 ニ）形成した溶液を光照射してモノマー溶液または分散
   液を重合させ架橋させる。 １５）モノマーがラジカルにより反応開始される重合を
   受けるその他の水溶性モノマーを含有する特許請求の範
   囲第１４項に記載した方法。 １６）架橋剤が、Ｎ，Ｎ′−（１，２−ジヒドロキシエ
   チレン）−ビス−アクリルアミド、Ｎ，Ｎ′−メチレン
   −ビス−アクリルアミド（ＢＩＳ）、Ｎ，Ｎ′−ジアリ
   ルタルトラミド（ＤＡＴＤ）、エチレンジアクリレート
   、Ｎ，Ｎ′−ビス−アクリルシスタミン、およびポリオ
   キシエチルトリメチロールプロパントリアクリレート（
   ＴＥＯＴＡ）である特許請求の範囲第１４項に記載した
   方法。 １７）遊離ラジカル発生物質が、光照射によつて励起さ
   れる遊離ラジカル直接供給する一つまたはそれ以上の化
   合物からなる特許請求の範囲第１４項に記載した方法。 １８）遊離ラジカル発生物質が下記のものを含む水溶性
   または水分散性化合物である特許請求の範囲第１４項に
   記載した方法。 モノおよびジカルボニル化合物、ミヒラ ーのケトン〔４，４′−ビス（ジメチルアミノ）ベンゾ
   フエノン〕、４−カルボキシベンゾフエノン、ベンゾフ
   エノン、９，１０−フエナントレンキノン３−スルホネ
   ートカリウム塩、１，２−ナフトキノン−２−スルホネ
   ートカリウム塩、１，４−ナフトキノン−２−スルホネ
   ートカリウム塩、４−トリクロロメチル−４−メチル−
   ２，５−シクロヘキサジエノン、およびその他の芳香族
   水溶性または水分散性モノおよびジカルボニル化合物：
   ベンゾインメチルエーテルのようなベンゾインエーテル
   とその他のベンゾイン、およびメチレンブルーとニユー
   メチレンブルーのような染料。 １９）モノおよびジカルボニル化合物および染料を下記
   のものから本質的になる水素ドナーと一緒に使用する特
   許請求の範囲第１９項に記載した方法。 Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ安息香酸 Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエタノール Ｎ−メチルジエタノールアミン ナトリウムｐ−トルエンスルフイナート トリエタノールアミン ２０）ゲルの多孔度を変えるためにモノマー溶液に印加
   した光照射を調整する工程を含む特許請求の範囲第１９
   項に記載した方法。 ２１）ゲルの多孔度をゲルの長さ、幅、または厚みの関
   数として変化させる特許請求の範囲第２０項に記載した
   方法。 ２２）照射線量の調整をゲルの長さ、幅、および厚みの
   関数として光束を調整することによつて行なう特許請求
   の範囲第２１項に記載した方法。 ２３）両性電解液を水溶液または水分散液に添加し、遊
   離ラジカル物質がベンゾインメチルエーテルを０．１ｗ
   ／ｖ％より少なく含有する特許請求の範囲第１４項に記
   載した方法。 ２４）溶液を基体にコーテイングすることによつて溶液
   をゲル生成物の形に形成する特許請求の範囲第１４項に
   記載した方法。