JPS61282080A - 新規なシグナルアミノ酸配列をコ−ドするdnaを有するプラスミド - Google Patents
新規なシグナルアミノ酸配列をコ−ドするdnaを有するプラスミドInfo
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- JPS61282080A JPS61282080A JP60122675A JP12267585A JPS61282080A JP S61282080 A JPS61282080 A JP S61282080A JP 60122675 A JP60122675 A JP 60122675A JP 12267585 A JP12267585 A JP 12267585A JP S61282080 A JPS61282080 A JP S61282080A
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- amino acid
- dna
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は遺伝子産物の細胞外へ分泌を促進する新規なプ
ラスミドに関する。
ラスミドに関する。
(従来の技術)
近年、遺伝子操作の研究が進み、インシュリン、インタ
ーフェロン、インターロイキン−2などの有用物質を微
生物で生産する・ことが可能になってきた。かかる遺伝
子操作の場合、宿主として一般に大腸菌が用いられてい
るが、ダラム陰性菌に属する大腸菌は内膜、外膜の二重
の膜構造を有するため、産生じた有用物質が菌体外に分
泌せず、その分離精製が困難になるという問題があった
。
ーフェロン、インターロイキン−2などの有用物質を微
生物で生産する・ことが可能になってきた。かかる遺伝
子操作の場合、宿主として一般に大腸菌が用いられてい
るが、ダラム陰性菌に属する大腸菌は内膜、外膜の二重
の膜構造を有するため、産生じた有用物質が菌体外に分
泌せず、その分離精製が困難になるという問題があった
。
この問題点を解決する方法として、大腸菌のペリプラズ
ム酵素であるアルカリ性フオスファファターゼ遺伝子の
シグナル配列を利用してペリプラズムに生成、蓄積せし
める方法(例えば、特開昭58−69897号、同59
−39899号)や大腸菌の外膜タンパクであるomp
F遺伝子を利用して外膜を通して分泌せしめる方法(
特開昭59−88092号)などが提案されている。
ム酵素であるアルカリ性フオスファファターゼ遺伝子の
シグナル配列を利用してペリプラズムに生成、蓄積せし
める方法(例えば、特開昭58−69897号、同59
−39899号)や大腸菌の外膜タンパクであるomp
F遺伝子を利用して外膜を通して分泌せしめる方法(
特開昭59−88092号)などが提案されている。
しかしながらこのような手法は未だ数が少なく、また前
者の方法ではべりプラズムへの分泌にとどまるといった
問題があり、より優れた方法の開発が望まれていた。
者の方法ではべりプラズムへの分泌にとどまるといった
問題があり、より優れた方法の開発が望まれていた。
(発明が解決しようとする問題点)
そこで本発明者らは、大腸菌に菌体外産生能を付与する
手法を開発すべく鋭意検討の結果、大腸菌と同じダラム
陰性菌でありながらタフパフ質を分泌する性質を有する
セラチア属細菌の菌体外タンパクのシグナルアミノ酸配
列を利用すると、意外なことに大腸菌に菌体外産生能を
付与しうろことを見い出し、本発明を完成するに到った
。
手法を開発すべく鋭意検討の結果、大腸菌と同じダラム
陰性菌でありながらタフパフ質を分泌する性質を有する
セラチア属細菌の菌体外タンパクのシグナルアミノ酸配
列を利用すると、意外なことに大腸菌に菌体外産生能を
付与しうろことを見い出し、本発明を完成するに到った
。
(問題点を解決するための手段)
かくして本発明によれば、セラチア属の菌体外タンパク
のシグナルアミノ酸配列をコードするDNAを含有する
ハイブリットプラスミドが提供される。
のシグナルアミノ酸配列をコードするDNAを含有する
ハイブリットプラスミドが提供される。
本発明のハイブリッドプラスミドは、宿主中で、 複製
可能なプラスミドにセラチア属細菌の菌体外タンパクの
シグナルアミノ酸配列をコードするDNAを組み込んだ
ものである。セラチア属細菌の菌体外タンパクとは、セ
ラチア属細菌(例えばセラチア・アルセッセンスエF○
3046)が細胞外に分泌するタンパンを意味し、その
具体例として1例えばメタルプロテアーゼ、セリンプロ
テアーゼ5sP−1、チオールプロテアーゼ、デオキシ
リボ核酸分解酵素などが例示される。
可能なプラスミドにセラチア属細菌の菌体外タンパクの
シグナルアミノ酸配列をコードするDNAを組み込んだ
ものである。セラチア属細菌の菌体外タンパクとは、セ
ラチア属細菌(例えばセラチア・アルセッセンスエF○
3046)が細胞外に分泌するタンパンを意味し、その
具体例として1例えばメタルプロテアーゼ、セリンプロ
テアーゼ5sP−1、チオールプロテアーゼ、デオキシ
リボ核酸分解酵素などが例示される。
このうちセリンプロテアーゼ5sp−iは本発明者らが
発見した新規な酵素であり、以下のごとき理化学的性質
を有するものである。
発見した新規な酵素であり、以下のごとき理化学的性質
を有するものである。
■、 作用:カゼイン等のタンパク質を基質とし、どれ
を加水分解する。
を加水分解する。
2、至適PI(: pH9,0付近でカゼインに対する
作用が至適である。
作用が至適である。
3、 pH安定性=37℃30分処理した場合、pH
5,5〜ρ旧1.0においてカゼインを基質とした場合
90%以上の残存活性を示す。
5,5〜ρ旧1.0においてカゼインを基質とした場合
90%以上の残存活性を示す。
4、至適温度: pH7,5において、カゼインを基質
とした場合45℃付近にある。
とした場合45℃付近にある。
5゜温度安定性:p)17.5ニおいて、40℃1o分
処理で95%以上 安定であり、45℃10分処理で約
90%の残存活性がある。
処理で95%以上 安定であり、45℃10分処理で約
90%の残存活性がある。
6、 阻害剤の影響: 1mM PMSF (フェニ
ルメタンスルホニルフルオリド)と37℃30分前処理
することにより完全に失活する。10mHのEDTAと
37℃30分前処理しても活性に変化はみられない。
ルメタンスルホニルフルオリド)と37℃30分前処理
することにより完全に失活する。10mHのEDTAと
37℃30分前処理しても活性に変化はみられない。
7、分子量:約65; 000 (SOSポリアクリル
アミドゲル電気動泳法) 8、活性中心:活性中心にセリンをもつセリンプロテア
ーゼに属する。
アミドゲル電気動泳法) 8、活性中心:活性中心にセリンをもつセリンプロテア
ーゼに属する。
また本発明のシグナルアミノ酸配列は、かかる菌体外タ
ンパクを産生ずる能力を有するセラチア属細菌の染色体
DNAから該菌体外タンパクをコードする遺伝子部分を
プラスミドベクターに連結し、得られたハイブリッドプ
ラスミドをエシェリヒア・コリに形質転換し、該菌体外
タンパク産生株を選択し、その菌体中に存在するハイブ
リッドプラスミドのDNA配列と菌体外タンパクのN末
端アミノ酸配列を対比することによって決定することが
できる。
ンパクを産生ずる能力を有するセラチア属細菌の染色体
DNAから該菌体外タンパクをコードする遺伝子部分を
プラスミドベクターに連結し、得られたハイブリッドプ
ラスミドをエシェリヒア・コリに形質転換し、該菌体外
タンパク産生株を選択し、その菌体中に存在するハイブ
リッドプラスミドのDNA配列と菌体外タンパクのN末
端アミノ酸配列を対比することによって決定することが
できる。
本発明のハイブリッドプラスミドの調製に用いられる原
料プラスミドは、遺伝子操作の分野で一般に用いられて
いるものであればいずれでもよく。
料プラスミドは、遺伝子操作の分野で一般に用いられて
いるものであればいずれでもよく。
その具体例としてpBR322,ρBR325、PAC
YC184、PYEJOOIなどが挙げられる。
YC184、PYEJOOIなどが挙げられる。
本発明のハイブリッドプラスミドは、常方に従って原料
プラスミドの適当な制限サイトに前記のごときシグナル
配り11を含むDNA断片を挿入することによって得る
ことができる。
プラスミドの適当な制限サイトに前記のごときシグナル
配り11を含むDNA断片を挿入することによって得る
ことができる。
この際、シグナルアミノ酸配列をコードするDNAの上
流には、リポゾーム結合部位(SD配列)及びプロモー
ターが存在するように配慮する必要がある。
流には、リポゾーム結合部位(SD配列)及びプロモー
ターが存在するように配慮する必要がある。
挿入されるDNA断片は化学的に合成したものであって
もよく、またセラチア属細菌(例えばセラチア・マルセ
ッセンスIF○3046)の染色体様DNAを切断して
得たものであってもよい。
もよく、またセラチア属細菌(例えばセラチア・マルセ
ッセンスIF○3046)の染色体様DNAを切断して
得たものであってもよい。
このようなハイブリッドプラスミドを創製する方法の一
例を以下に示す。
例を以下に示す。
(セラチアプロテアーゼSSP−1のシグナル配列を有
するハイブリッドプラスミドの創製) セラチアプロテアーゼSSP−1生産能を有するセラチ
ア属菌、例えばセラチア・マルセッセンスIF0304
6の染色体DNAからセラチアプロテアーゼ5sp−1
生産性DNA断片を分離し、これを常法に従って原料プ
ラスミド(例えばpBR322)に挿入することによっ
て目的とするハイブリッドプラスミドを創製することが
できる。
するハイブリッドプラスミドの創製) セラチアプロテアーゼSSP−1生産能を有するセラチ
ア属菌、例えばセラチア・マルセッセンスIF0304
6の染色体DNAからセラチアプロテアーゼ5sp−1
生産性DNA断片を分離し、これを常法に従って原料プ
ラスミド(例えばpBR322)に挿入することによっ
て目的とするハイブリッドプラスミドを創製することが
できる。
まずセラチア・マルセッセンスIFO3046は大量の
菌体を得るために適宜培養し集菌し、得られた菌体から
染色体DNAを抽出分離する。得られた染色体DNAは
Sau 3AIによって部分的に分解し、分解物をアガ
ロース電気泳動にかけ、分子量1kb以上のDNA断片
を取得する。
菌体を得るために適宜培養し集菌し、得られた菌体から
染色体DNAを抽出分離する。得られた染色体DNAは
Sau 3AIによって部分的に分解し、分解物をアガ
ロース電気泳動にかけ、分子量1kb以上のDNA断片
を取得する。
一方、市販のプラスミドpBR322をBam)IIで
分解し、分解物をBAPase (バクチリアルアルカ
リンホスファターゼ)で処理した後、これに前記DNA
断片を加え、 T4 DNAリガーゼを添加して、連結
反応を行なわせる。
分解し、分解物をBAPase (バクチリアルアルカ
リンホスファターゼ)で処理した後、これに前記DNA
断片を加え、 T4 DNAリガーゼを添加して、連結
反応を行なわせる。
得られた連結反応物を常法に従ってエシェリヒア・コリ
C600(r−、m−)(プロシーディング・オブ・ナ
チュラル・アカデミイ・オブ・サイエンス)(Proc
eeding of Natural Academy
of 5ciance)■、 4579〜45811
.1974年)に対して形質転換処理を行う。
C600(r−、m−)(プロシーディング・オブ・ナ
チュラル・アカデミイ・オブ・サイエンス)(Proc
eeding of Natural Academy
of 5ciance)■、 4579〜45811
.1974年)に対して形質転換処理を行う。
形質転換処理菌体はスキムミルクを含有する平板培地で
培養し、白濁環(タービット・ゾーン)を生成した菌株
を単離することによって、セラチアプロテアーゼSSP
−1を菌体外に分泌生産する菌株を得ることができる。
培養し、白濁環(タービット・ゾーン)を生成した菌株
を単離することによって、セラチアプロテアーゼSSP
−1を菌体外に分泌生産する菌株を得ることができる。
ここに得られる一例示形質転換体をエシェリヒア・コリ
C600(psPll)と命名した。また、エシェリヒ
ア・コリC600(psPll)の培養菌体がら単離さ
れるハイブリッドプラスミドをプラスミドpsP11と
命名した。 psPllの制限酵素開裂地図は第1図に
示される。
C600(psPll)と命名した。また、エシェリヒ
ア・コリC600(psPll)の培養菌体がら単離さ
れるハイブリッドプラスミドをプラスミドpsP11と
命名した。 psPllの制限酵素開裂地図は第1図に
示される。
このようにして得られたPSPIIの塩基配列を後記の
メッシング(Messing)らの方法に従って分析し
たところ、 psPllの一部に第2図に示すごとき配
列を有することが確認された。
メッシング(Messing)らの方法に従って分析し
たところ、 psPllの一部に第2図に示すごとき配
列を有することが確認された。
この配列のうちシグナルアミノ酸配列に相当する部分は
第2図中の1〜81にあたる81塩基対であると判定し
た。その根拠は以下のとうりである61、 開始コドン
(ATG)の6塩基対上流にSD配列に相当する部分が
存在する。
第2図中の1〜81にあたる81塩基対であると判定し
た。その根拠は以下のとうりである61、 開始コドン
(ATG)の6塩基対上流にSD配列に相当する部分が
存在する。
2、疎水性アミ 酸に富む典型的なシグナル配列の傾向
を有する。
を有する。
3、セラチアプロテアーゼSSP−1のN末端アミノ酸
配列8個と82〜105のDNA配列が完全に一致する
。
配列8個と82〜105のDNA配列が完全に一致する
。
かくして得られる本発明のハイブリッドプラス 〜ミド
は、大腸菌に対して目的とする有用なタンパク質やペプ
チドの菌体外産生能を付与することができる。例えばシ
グナル配列の下流に読みとり枠を合わせてタンパク質や
ペプチドの構造遺伝子が位置するように挿入構築するこ
とによって、融合タンパクまたは成熟タンパクの形で目
的の有用物質を菌体外に分泌させることができる。
は、大腸菌に対して目的とする有用なタンパク質やペプ
チドの菌体外産生能を付与することができる。例えばシ
グナル配列の下流に読みとり枠を合わせてタンパク質や
ペプチドの構造遺伝子が位置するように挿入構築するこ
とによって、融合タンパクまたは成熟タンパクの形で目
的の有用物質を菌体外に分泌させることができる。
次に本発明の実施例を示す。
実施例1
(psPll及び形質転換株の創製)
セラチア・マルセッセンスIFO3046をLB培地[
(g/Q)バタトトリプトン10.0、イーストイクス
トラクト5.0、NaCf15.0、グ)Ll’:J
−ス1.0をHCIIでpH7,2に調製したもの]中
26.5℃で7時間振盪培養を行ない、対数増殖後期の
菌体を集菌後、フェノール法(バイオケム・バイオフィ
ズ・アクタ) (Biocham。
(g/Q)バタトトリプトン10.0、イーストイクス
トラクト5.0、NaCf15.0、グ)Ll’:J
−ス1.0をHCIIでpH7,2に調製したもの]中
26.5℃で7時間振盪培養を行ない、対数増殖後期の
菌体を集菌後、フェノール法(バイオケム・バイオフィ
ズ・アクタ) (Biocham。
Biophys、 Acta) 72.619〜.19
63年)により染色体DNAを抽出し精製した。
63年)により染色体DNAを抽出し精製した。
得られた染色体DNA 10μgをとり、制限エンドヌ
クレアーゼSau 3AIを加え、37℃、25分間反
応させて部分分解し、次いで反応物をアガロースゲル電
気泳動にかけ、lkbから3oにbのDNA断片を回収
した。
クレアーゼSau 3AIを加え、37℃、25分間反
応させて部分分解し、次いで反応物をアガロースゲル電
気泳動にかけ、lkbから3oにbのDNA断片を回収
した。
一方、市販のプラスミドPBR322(全酒造製)を制
限エンドヌクレアーゼBawl(Iで完全分解後BAP
age(バクチリアルアルカリンホスファターゼ)で処
理した。これを先のDNA断片とを混合し、T4DNA
IJガーゼにより16℃、14時間DNA鎖の連結反応
を行なった。
限エンドヌクレアーゼBawl(Iで完全分解後BAP
age(バクチリアルアルカリンホスファターゼ)で処
理した。これを先のDNA断片とを混合し、T4DNA
IJガーゼにより16℃、14時間DNA鎖の連結反応
を行なった。
別に、エシェリヒア・コリC600(r−、m−)の培
養菌を許容(コンピテント)細胞とし、これに上記T4
DNAリガーゼによる連結反応物を加え、形質転換し、
LB培地中で1時間培養したのち、アンピシリン(Ap
) 50μg/mQ、スキムミルク1%を含むLB寒天
培地でアンピシリン抵抗性(Apr)株を選択した。
養菌を許容(コンピテント)細胞とし、これに上記T4
DNAリガーゼによる連結反応物を加え、形質転換し、
LB培地中で1時間培養したのち、アンピシリン(Ap
) 50μg/mQ、スキムミルク1%を含むLB寒天
培地でアンピシリン抵抗性(Apr)株を選択した。
形質転換はマンデル(Mandsl)とヒガ(Higa
)の方法[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジ′(J、 Mo1. Biol、)、 54.159
(1970) ]に準じて行なった。得られたApr株
25 、000株のうち、コロニーの回りに白濁環(タ
ービットゾーン)を形成する株を2株得た。これら2株
の所有するプラスミドを常法に従って単離し、制限酵素
による切断パターンを比較したところ、冷く同一のパタ
ーンを有していた。このプラスミドをpsPllと命名
し、その制限地図を第1図に示した。またpsPllを
含有する菌をエシェリヒア・コリC600(psPll
)と命名する。
)の方法[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジ′(J、 Mo1. Biol、)、 54.159
(1970) ]に準じて行なった。得られたApr株
25 、000株のうち、コロニーの回りに白濁環(タ
ービットゾーン)を形成する株を2株得た。これら2株
の所有するプラスミドを常法に従って単離し、制限酵素
による切断パターンを比較したところ、冷く同一のパタ
ーンを有していた。このプラスミドをpsPllと命名
し、その制限地図を第1図に示した。またpsPllを
含有する菌をエシェリヒア・コリC600(psPll
)と命名する。
(DNA塩基配列の決定)
PSPIIを2種の制限酵素(Hindm、EcoRI
)で二重消化し、セラチアプロテアーゼSSP−1遺伝
子のシグナル配列を含む790塩基対(bρ)の大きさ
の断片(第1図中の→に相当する部分)を単離し1M1
3フアージを用いたメッシング(Massing)らの
方法0ツシング・エトアル(Messing J、 e
t al)ジーン(Gene)19269−276(1
982)、サンガー、エフ、サイエンス(Scienc
e)214.1205−1210(1981)によりE
c。
)で二重消化し、セラチアプロテアーゼSSP−1遺伝
子のシグナル配列を含む790塩基対(bρ)の大きさ
の断片(第1図中の→に相当する部分)を単離し1M1
3フアージを用いたメッシング(Massing)らの
方法0ツシング・エトアル(Messing J、 e
t al)ジーン(Gene)19269−276(1
982)、サンガー、エフ、サイエンス(Scienc
e)214.1205−1210(1981)によりE
c。
RI切断サイト側から塩基配列を決定した。このDNA
断片には、シャイン・ダルガノ(SD)配列の直後に開
始コドンATGで始まる読始取り枠が存在し、N末端近
傍には2つのリジンと1つのアルギニンが存在し、その
後に疎水性アミノ酸が続く、いわゆるシグナル配列が存
在していた。第2図には、S[)配列より下流の塩基配
列を示しである。
断片には、シャイン・ダルガノ(SD)配列の直後に開
始コドンATGで始まる読始取り枠が存在し、N末端近
傍には2つのリジンと1つのアルギニンが存在し、その
後に疎水性アミノ酸が続く、いわゆるシグナル配列が存
在していた。第2図には、S[)配列より下流の塩基配
列を示しである。
また、後記の方法で得たセラチアプロテアーゼ5sp−
iについて、エドマン分解法により、そのN末端アミノ
酸配列を決定したところ、塩基配列から予想されるアミ
ノ酸配列の28番目のアラニンから35番目のロイシン
までの8アミノ酸が双方で一致した。
iについて、エドマン分解法により、そのN末端アミノ
酸配列を決定したところ、塩基配列から予想されるアミ
ノ酸配列の28番目のアラニンから35番目のロイシン
までの8アミノ酸が双方で一致した。
(セラチアプロテアーゼSSP−1の発現)上記のPS
PIIを保有する形質転換株、エシェリヒア・コリC6
00(psPll)をL8培地に植菌し、37℃8時間
培養し、遠心により上滑を集めた。この上清に硫酸アン
モニウムを60%飽和となるよう加え、4℃で12時間
攪拌後、遠心により沈5殿を得た。この沈澱を110f
f1トリスヒドロキシメ士ルアミンPH7,9に溶解し
、同波に対して3回透析した。この透析物を、同一の緩
衝液で平置化したアルギニンセファロース4B(ファル
マシア社製)に通じて精製セラチアプロテアーゼSSP
−1を得た。
PIIを保有する形質転換株、エシェリヒア・コリC6
00(psPll)をL8培地に植菌し、37℃8時間
培養し、遠心により上滑を集めた。この上清に硫酸アン
モニウムを60%飽和となるよう加え、4℃で12時間
攪拌後、遠心により沈5殿を得た。この沈澱を110f
f1トリスヒドロキシメ士ルアミンPH7,9に溶解し
、同波に対して3回透析した。この透析物を、同一の緩
衝液で平置化したアルギニンセファロース4B(ファル
マシア社製)に通じて精製セラチアプロテアーゼSSP
−1を得た。
実施例2
実施例1で得たエシェリヒア・コリC600(pSPl
l)を、50μg/mQのアンピシリンを含むLB培地
に接種し、6時間培養後、遠心により集菌し、上清(菌
体外画分)と菌体を分離した。菌体は生理食塩水で2回
洗浄後、高張液(20%シュークロス、30mMトリス
pH8,0)に懸濁後、終濃度1aMのEDTAを加え
、室温で10分間攪拌した。集菌後、菌体を氷冷水中に
加えて懸濁し、0℃で10分間攪拌した。遠心により上
清(ペリプラズム画分)と沈澱に分離した。
l)を、50μg/mQのアンピシリンを含むLB培地
に接種し、6時間培養後、遠心により集菌し、上清(菌
体外画分)と菌体を分離した。菌体は生理食塩水で2回
洗浄後、高張液(20%シュークロス、30mMトリス
pH8,0)に懸濁後、終濃度1aMのEDTAを加え
、室温で10分間攪拌した。集菌後、菌体を氷冷水中に
加えて懸濁し、0℃で10分間攪拌した。遠心により上
清(ペリプラズム画分)と沈澱に分離した。
次いで、沈澱を110Inトリス・バッハ−pH7,5
に懸濁し、音波処理により菌体を破砕し、遠心して上清
(細胞質画分)を得た。
に懸濁し、音波処理により菌体を破砕し、遠心して上清
(細胞質画分)を得た。
このようにして得られた菌体外画分ペリプラズム画分及
び細胞質画分の各々におけるプロテアーゼ活性を測定し
、その結果を第1表に示した。また比較のため、PSP
IIの代りにpBR322を形質転換した転換株エシェ
リヒア・コリC600(pBR322)についても同様
にして実験を行い、その結果を第1表に併記した。
び細胞質画分の各々におけるプロテアーゼ活性を測定し
、その結果を第1表に示した。また比較のため、PSP
IIの代りにpBR322を形質転換した転換株エシェ
リヒア・コリC600(pBR322)についても同様
にして実験を行い、その結果を第1表に併記した。
第1表
傘ΔA0゜10.5h−一培養液37℃で。
プロテアーゼ活性の測定はハンマースティン・カゼイン
を基質としたカニフッ法〔「発酵研究法」第2巻239
頁、朝食書店1956年〕の変法による。詳細は以下の
とうりである。
を基質としたカニフッ法〔「発酵研究法」第2巻239
頁、朝食書店1956年〕の変法による。詳細は以下の
とうりである。
まず5m12の0.6%カゼイン溶液(50mMリン酸
バッファ−pH7,5)を10分間、37℃で放置後、
粗酵素液1mQを加え37℃、30分間反応させ、 5
mQのTCA溶液(0,11Mトリクロル酢酸、0.2
2M酢酸、0.33に酢酸ナトリウム)を加え反応を停
止する。30分間静置後、沈殿を濾過分別し、上清の波
長280nmにおける吸光度を測定する。活性はこの吸
光度と対照の吸光度の差(ΔA、、、)で示される。
バッファ−pH7,5)を10分間、37℃で放置後、
粗酵素液1mQを加え37℃、30分間反応させ、 5
mQのTCA溶液(0,11Mトリクロル酢酸、0.2
2M酢酸、0.33に酢酸ナトリウム)を加え反応を停
止する。30分間静置後、沈殿を濾過分別し、上清の波
長280nmにおける吸光度を測定する。活性はこの吸
光度と対照の吸光度の差(ΔA、、、)で示される。
なお対照としては、粗酵素液1mQにTCA溶液5mM
を加えたのち、0.6%カゼイン溶液を加え、同様に処
理したものを用いる。
を加えたのち、0.6%カゼイン溶液を加え、同様に処
理したものを用いる。
この結果から、エシェリヒア・コリC600(pBR3
22)は菌体外へプロテアーゼを分泌しないのに対し、
エシェリヒア・コリC600(psPll)は多量のプ
ロテアーゼを菌体外に分泌していることがわかる。なお
、菌体外のプロテアーゼ活性は単一のプロテアーゼに起
因するものであり、そのN末端配列の測定によりセラチ
アプロテアーゼSSP−1であることが確認された。
22)は菌体外へプロテアーゼを分泌しないのに対し、
エシェリヒア・コリC600(psPll)は多量のプ
ロテアーゼを菌体外に分泌していることがわかる。なお
、菌体外のプロテアーゼ活性は単一のプロテアーゼに起
因するものであり、そのN末端配列の測定によりセラチ
アプロテアーゼSSP−1であることが確認された。
また培養開始後から経時的に集菌し、プロテアーゼの分
泌の状況を観察したところ、対数増殖期の初期から菌体
外への分泌が認められ、ペリプラズムへの滞留はw4察
されなかった。
泌の状況を観察したところ、対数増殖期の初期から菌体
外への分泌が認められ、ペリプラズムへの滞留はw4察
されなかった。
これに対し大腸菌のペリプラズム酵素であるβ−ラクタ
マーゼの活性をマクロヨード法(メソッド・イン・エン
チモロジイ(Method in Enzymolog
y)P、69〜85.1975年)に従がって測定した
ところ、エシェリヒア・コリC600(psptl)、
エシェリヒア・コリC600(pBR322)ともにそ
の殆どがペリプラズムに蓄積されていることが確認され
た。
マーゼの活性をマクロヨード法(メソッド・イン・エン
チモロジイ(Method in Enzymolog
y)P、69〜85.1975年)に従がって測定した
ところ、エシェリヒア・コリC600(psptl)、
エシェリヒア・コリC600(pBR322)ともにそ
の殆どがペリプラズムに蓄積されていることが確認され
た。
第1図はハイブリッドプラスミドpsp 11の制限酵
素開裂地図を示し、第2図は第1図上部に示すpsPl
lの←に相当するDNA断片中、SD配列、シグナル配
列及びセラチアプロテアーゼSSP−1の遺伝子の一部
から成る部分の塩基配列を示す。 代理人 弁理士 戸 1)親 男 第 1 図 第 2 図 □セラチアアロテア−でSSP−1− COR1−
素開裂地図を示し、第2図は第1図上部に示すpsPl
lの←に相当するDNA断片中、SD配列、シグナル配
列及びセラチアプロテアーゼSSP−1の遺伝子の一部
から成る部分の塩基配列を示す。 代理人 弁理士 戸 1)親 男 第 1 図 第 2 図 □セラチアアロテア−でSSP−1− COR1−
Claims (4)
- (1)セラチア属細菌の菌体外タンパクのシグナルアミ
ノ酸配列をコードするDNAを含有するハイブリッドプ
ラスミド。 - (2)菌体外タンパクがセラチアプロテアーゼである特
許請求の範囲第1項記載のプラスミド。 - (3)セラチアプロテアーゼがセラチアプロテアーゼS
SP−1である特許請求の範囲第2項記載のプラスミド
。 - (4)シグナルアミノ酸配列が下記のアミノ酸配列であ
る特許請求の範囲第1項記載のプラスミド。 【アミノ酸配列があります】
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60122675A JPH062066B2 (ja) | 1985-06-07 | 1985-06-07 | 新規なシグナルアミノ酸配列をコ−ドするdnaを有するプラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60122675A JPH062066B2 (ja) | 1985-06-07 | 1985-06-07 | 新規なシグナルアミノ酸配列をコ−ドするdnaを有するプラスミド |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61282080A true JPS61282080A (ja) | 1986-12-12 |
JPH062066B2 JPH062066B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=14841848
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60122675A Expired - Lifetime JPH062066B2 (ja) | 1985-06-07 | 1985-06-07 | 新規なシグナルアミノ酸配列をコ−ドするdnaを有するプラスミド |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH062066B2 (ja) |
-
1985
- 1985-06-07 JP JP60122675A patent/JPH062066B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH062066B2 (ja) | 1994-01-12 |
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