JPS61282080A - 新規なシグナルアミノ酸配列をコ−ドするｄｎａを有するプラスミド - Google Patents
新規なシグナルアミノ酸配列をコ−ドするｄｎａを有するプラスミドInfo
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- JPS61282080A JPS61282080A JP60122675A JP12267585A JPS61282080A JP S61282080 A JPS61282080 A JP S61282080A JP 60122675 A JP60122675 A JP 60122675A JP 12267585 A JP12267585 A JP 12267585A JP S61282080 A JPS61282080 A JP S61282080A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は遺伝子産物の細胞外へ分泌を促進する新規なプ
ラスミドに関する。
ラスミドに関する。
（従来の技術）
近年、遺伝子操作の研究が進み、インシュリン、インタ
ーフェロン、インターロイキン−２などの有用物質を微
生物で生産する・ことが可能になってきた。かかる遺伝
子操作の場合、宿主として一般に大腸菌が用いられてい
るが、ダラム陰性菌に属する大腸菌は内膜、外膜の二重
の膜構造を有するため、産生じた有用物質が菌体外に分
泌せず、その分離精製が困難になるという問題があった
。
ーフェロン、インターロイキン−２などの有用物質を微
生物で生産する・ことが可能になってきた。かかる遺伝
子操作の場合、宿主として一般に大腸菌が用いられてい
るが、ダラム陰性菌に属する大腸菌は内膜、外膜の二重
の膜構造を有するため、産生じた有用物質が菌体外に分
泌せず、その分離精製が困難になるという問題があった
。
この問題点を解決する方法として、大腸菌のペリプラズ
ム酵素であるアルカリ性フオスファファターゼ遺伝子の
シグナル配列を利用してペリプラズムに生成、蓄積せし
める方法（例えば、特開昭５８−６９８９７号、同５９
−３９８９９号）や大腸菌の外膜タンパクであるｏｍｐ
Ｆ遺伝子を利用して外膜を通して分泌せしめる方法（
特開昭５９−８８０９２号）などが提案されている。
ム酵素であるアルカリ性フオスファファターゼ遺伝子の
シグナル配列を利用してペリプラズムに生成、蓄積せし
める方法（例えば、特開昭５８−６９８９７号、同５９
−３９８９９号）や大腸菌の外膜タンパクであるｏｍｐ
Ｆ遺伝子を利用して外膜を通して分泌せしめる方法（
特開昭５９−８８０９２号）などが提案されている。
しかしながらこのような手法は未だ数が少なく、また前
者の方法ではべりプラズムへの分泌にとどまるといった
問題があり、より優れた方法の開発が望まれていた。
者の方法ではべりプラズムへの分泌にとどまるといった
問題があり、より優れた方法の開発が望まれていた。
（発明が解決しようとする問題点）
そこで本発明者らは、大腸菌に菌体外産生能を付与する
手法を開発すべく鋭意検討の結果、大腸菌と同じダラム
陰性菌でありながらタフパフ質を分泌する性質を有する
セラチア属細菌の菌体外タンパクのシグナルアミノ酸配
列を利用すると、意外なことに大腸菌に菌体外産生能を
付与しうろことを見い出し、本発明を完成するに到った
。
手法を開発すべく鋭意検討の結果、大腸菌と同じダラム
陰性菌でありながらタフパフ質を分泌する性質を有する
セラチア属細菌の菌体外タンパクのシグナルアミノ酸配
列を利用すると、意外なことに大腸菌に菌体外産生能を
付与しうろことを見い出し、本発明を完成するに到った
。
（問題点を解決するための手段）
かくして本発明によれば、セラチア属の菌体外タンパク
のシグナルアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有する
ハイブリットプラスミドが提供される。
のシグナルアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有する
ハイブリットプラスミドが提供される。
本発明のハイブリッドプラスミドは、宿主中で、 複製
可能なプラスミドにセラチア属細菌の菌体外タンパクの
シグナルアミノ酸配列をコードするＤＮＡを組み込んだ
ものである。セラチア属細菌の菌体外タンパクとは、セ
ラチア属細菌（例えばセラチア・アルセッセンスエＦ○
３０４６）が細胞外に分泌するタンパンを意味し、その
具体例として１例えばメタルプロテアーゼ、セリンプロ
テアーゼ５ｓＰ−１、チオールプロテアーゼ、デオキシ
リボ核酸分解酵素などが例示される。
可能なプラスミドにセラチア属細菌の菌体外タンパクの
シグナルアミノ酸配列をコードするＤＮＡを組み込んだ
ものである。セラチア属細菌の菌体外タンパクとは、セ
ラチア属細菌（例えばセラチア・アルセッセンスエＦ○
３０４６）が細胞外に分泌するタンパンを意味し、その
具体例として１例えばメタルプロテアーゼ、セリンプロ
テアーゼ５ｓＰ−１、チオールプロテアーゼ、デオキシ
リボ核酸分解酵素などが例示される。
このうちセリンプロテアーゼ５ｓｐ−ｉは本発明者らが
発見した新規な酵素であり、以下のごとき理化学的性質
を有するものである。
発見した新規な酵素であり、以下のごとき理化学的性質
を有するものである。
■、 作用：カゼイン等のタンパク質を基質とし、どれ
を加水分解する。
を加水分解する。
２、至適ＰＩ（： ｐＨ９，０付近でカゼインに対する
作用が至適である。
作用が至適である。
３、 ｐＨ安定性＝３７℃３０分処理した場合、ｐＨ
５，５〜ρ旧１．０においてカゼインを基質とした場合
９０％以上の残存活性を示す。
５，５〜ρ旧１．０においてカゼインを基質とした場合
９０％以上の残存活性を示す。
４、至適温度： ｐＨ７，５において、カゼインを基質
とした場合４５℃付近にある。
とした場合４５℃付近にある。
５゜温度安定性：ｐ）１７．５ニおいて、４０℃１ｏ分
処理で９５％以上 安定であり、４５℃１０分処理で約
９０％の残存活性がある。
処理で９５％以上 安定であり、４５℃１０分処理で約
９０％の残存活性がある。
６、 阻害剤の影響： １ｍＭ ＰＭＳＦ （フェニ
ルメタンスルホニルフルオリド）と３７℃３０分前処理
することにより完全に失活する。１０ｍＨのＥＤＴＡと
３７℃３０分前処理しても活性に変化はみられない。
ルメタンスルホニルフルオリド）と３７℃３０分前処理
することにより完全に失活する。１０ｍＨのＥＤＴＡと
３７℃３０分前処理しても活性に変化はみられない。
７、分子量：約６５； ０００ （ＳＯＳポリアクリル
アミドゲル電気動泳法） ８、活性中心：活性中心にセリンをもつセリンプロテア
ーゼに属する。
アミドゲル電気動泳法） ８、活性中心：活性中心にセリンをもつセリンプロテア
ーゼに属する。
また本発明のシグナルアミノ酸配列は、かかる菌体外タ
ンパクを産生ずる能力を有するセラチア属細菌の染色体
ＤＮＡから該菌体外タンパクをコードする遺伝子部分を
プラスミドベクターに連結し、得られたハイブリッドプ
ラスミドをエシェリヒア・コリに形質転換し、該菌体外
タンパク産生株を選択し、その菌体中に存在するハイブ
リッドプラスミドのＤＮＡ配列と菌体外タンパクのＮ末
端アミノ酸配列を対比することによって決定することが
できる。
ンパクを産生ずる能力を有するセラチア属細菌の染色体
ＤＮＡから該菌体外タンパクをコードする遺伝子部分を
プラスミドベクターに連結し、得られたハイブリッドプ
ラスミドをエシェリヒア・コリに形質転換し、該菌体外
タンパク産生株を選択し、その菌体中に存在するハイブ
リッドプラスミドのＤＮＡ配列と菌体外タンパクのＮ末
端アミノ酸配列を対比することによって決定することが
できる。
本発明のハイブリッドプラスミドの調製に用いられる原
料プラスミドは、遺伝子操作の分野で一般に用いられて
いるものであればいずれでもよく。
料プラスミドは、遺伝子操作の分野で一般に用いられて
いるものであればいずれでもよく。
その具体例としてｐＢＲ３２２，ρＢＲ３２５、ＰＡＣ
ＹＣ１８４、ＰＹＥＪＯＯＩなどが挙げられる。
ＹＣ１８４、ＰＹＥＪＯＯＩなどが挙げられる。
本発明のハイブリッドプラスミドは、常方に従って原料
プラスミドの適当な制限サイトに前記のごときシグナル
配り１１を含むＤＮＡ断片を挿入することによって得る
ことができる。
プラスミドの適当な制限サイトに前記のごときシグナル
配り１１を含むＤＮＡ断片を挿入することによって得る
ことができる。
この際、シグナルアミノ酸配列をコードするＤＮＡの上
流には、リポゾーム結合部位（ＳＤ配列）及びプロモー
ターが存在するように配慮する必要がある。
流には、リポゾーム結合部位（ＳＤ配列）及びプロモー
ターが存在するように配慮する必要がある。
挿入されるＤＮＡ断片は化学的に合成したものであって
もよく、またセラチア属細菌（例えばセラチア・マルセ
ッセンスＩＦ○３０４６）の染色体様ＤＮＡを切断して
得たものであってもよい。
もよく、またセラチア属細菌（例えばセラチア・マルセ
ッセンスＩＦ○３０４６）の染色体様ＤＮＡを切断して
得たものであってもよい。
このようなハイブリッドプラスミドを創製する方法の一
例を以下に示す。
例を以下に示す。
（セラチアプロテアーゼＳＳＰ−１のシグナル配列を有
するハイブリッドプラスミドの創製） セラチアプロテアーゼＳＳＰ−１生産能を有するセラチ
ア属菌、例えばセラチア・マルセッセンスＩＦ０３０４
６の染色体ＤＮＡからセラチアプロテアーゼ５ｓｐ−１
生産性ＤＮＡ断片を分離し、これを常法に従って原料プ
ラスミド（例えばｐＢＲ３２２）に挿入することによっ
て目的とするハイブリッドプラスミドを創製することが
できる。
するハイブリッドプラスミドの創製） セラチアプロテアーゼＳＳＰ−１生産能を有するセラチ
ア属菌、例えばセラチア・マルセッセンスＩＦ０３０４
６の染色体ＤＮＡからセラチアプロテアーゼ５ｓｐ−１
生産性ＤＮＡ断片を分離し、これを常法に従って原料プ
ラスミド（例えばｐＢＲ３２２）に挿入することによっ
て目的とするハイブリッドプラスミドを創製することが
できる。
まずセラチア・マルセッセンスＩＦＯ３０４６は大量の
菌体を得るために適宜培養し集菌し、得られた菌体から
染色体ＤＮＡを抽出分離する。得られた染色体ＤＮＡは
Ｓａｕ ３ＡＩによって部分的に分解し、分解物をアガ
ロース電気泳動にかけ、分子量１ｋｂ以上のＤＮＡ断片
を取得する。
菌体を得るために適宜培養し集菌し、得られた菌体から
染色体ＤＮＡを抽出分離する。得られた染色体ＤＮＡは
Ｓａｕ ３ＡＩによって部分的に分解し、分解物をアガ
ロース電気泳動にかけ、分子量１ｋｂ以上のＤＮＡ断片
を取得する。
一方、市販のプラスミドｐＢＲ３２２をＢａｍ）ＩＩで
分解し、分解物をＢＡＰａｓｅ （バクチリアルアルカ
リンホスファターゼ）で処理した後、これに前記ＤＮＡ
断片を加え、 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを添加して、連結
反応を行なわせる。
分解し、分解物をＢＡＰａｓｅ （バクチリアルアルカ
リンホスファターゼ）で処理した後、これに前記ＤＮＡ
断片を加え、 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを添加して、連結
反応を行なわせる。
得られた連結反応物を常法に従ってエシェリヒア・コリ
Ｃ６００（ｒ−、ｍ−）（プロシーディング・オブ・ナ
チュラル・アカデミイ・オブ・サイエンス）（Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ ５ｃｉａｎｃｅ）■、 ４５７９〜４５８１１
．１９７４年）に対して形質転換処理を行う。
Ｃ６００（ｒ−、ｍ−）（プロシーディング・オブ・ナ
チュラル・アカデミイ・オブ・サイエンス）（Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ ５ｃｉａｎｃｅ）■、 ４５７９〜４５８１１
．１９７４年）に対して形質転換処理を行う。
形質転換処理菌体はスキムミルクを含有する平板培地で
培養し、白濁環（タービット・ゾーン）を生成した菌株
を単離することによって、セラチアプロテアーゼＳＳＰ
−１を菌体外に分泌生産する菌株を得ることができる。
培養し、白濁環（タービット・ゾーン）を生成した菌株
を単離することによって、セラチアプロテアーゼＳＳＰ
−１を菌体外に分泌生産する菌株を得ることができる。
ここに得られる一例示形質転換体をエシェリヒア・コリ
Ｃ６００（ｐｓＰｌｌ）と命名した。また、エシェリヒ
ア・コリＣ６００（ｐｓＰｌｌ）の培養菌体がら単離さ
れるハイブリッドプラスミドをプラスミドｐｓＰ１１と
命名した。 ｐｓＰｌｌの制限酵素開裂地図は第１図に
示される。
Ｃ６００（ｐｓＰｌｌ）と命名した。また、エシェリヒ
ア・コリＣ６００（ｐｓＰｌｌ）の培養菌体がら単離さ
れるハイブリッドプラスミドをプラスミドｐｓＰ１１と
命名した。 ｐｓＰｌｌの制限酵素開裂地図は第１図に
示される。
このようにして得られたＰＳＰＩＩの塩基配列を後記の
メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）らの方法に従って分析し
たところ、 ｐｓＰｌｌの一部に第２図に示すごとき配
列を有することが確認された。
メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）らの方法に従って分析し
たところ、 ｐｓＰｌｌの一部に第２図に示すごとき配
列を有することが確認された。
この配列のうちシグナルアミノ酸配列に相当する部分は
第２図中の１〜８１にあたる８１塩基対であると判定し
た。その根拠は以下のとうりである６１、 開始コドン
（ＡＴＧ）の６塩基対上流にＳＤ配列に相当する部分が
存在する。
第２図中の１〜８１にあたる８１塩基対であると判定し
た。その根拠は以下のとうりである６１、 開始コドン
（ＡＴＧ）の６塩基対上流にＳＤ配列に相当する部分が
存在する。
２、疎水性アミ 酸に富む典型的なシグナル配列の傾向
を有する。
を有する。
３、セラチアプロテアーゼＳＳＰ−１のＮ末端アミノ酸
配列８個と８２〜１０５のＤＮＡ配列が完全に一致する
。
配列８個と８２〜１０５のＤＮＡ配列が完全に一致する
。
かくして得られる本発明のハイブリッドプラス 〜ミド
は、大腸菌に対して目的とする有用なタンパク質やペプ
チドの菌体外産生能を付与することができる。例えばシ
グナル配列の下流に読みとり枠を合わせてタンパク質や
ペプチドの構造遺伝子が位置するように挿入構築するこ
とによって、融合タンパクまたは成熟タンパクの形で目
的の有用物質を菌体外に分泌させることができる。
は、大腸菌に対して目的とする有用なタンパク質やペプ
チドの菌体外産生能を付与することができる。例えばシ
グナル配列の下流に読みとり枠を合わせてタンパク質や
ペプチドの構造遺伝子が位置するように挿入構築するこ
とによって、融合タンパクまたは成熟タンパクの形で目
的の有用物質を菌体外に分泌させることができる。
次に本発明の実施例を示す。
実施例１
（ｐｓＰｌｌ及び形質転換株の創製）
セラチア・マルセッセンスＩＦＯ３０４６をＬＢ培地［
（ｇ／Ｑ）バタトトリプトン１０．０、イーストイクス
トラクト５．０、ＮａＣｆ１５．０、グ）Ｌｌ’：Ｊ
−ス１．０をＨＣＩＩでｐＨ７，２に調製したもの］中
２６．５℃で７時間振盪培養を行ない、対数増殖後期の
菌体を集菌後、フェノール法（バイオケム・バイオフィ
ズ・アクタ） （Ｂｉｏｃｈａｍ。
（ｇ／Ｑ）バタトトリプトン１０．０、イーストイクス
トラクト５．０、ＮａＣｆ１５．０、グ）Ｌｌ’：Ｊ
−ス１．０をＨＣＩＩでｐＨ７，２に調製したもの］中
２６．５℃で７時間振盪培養を行ない、対数増殖後期の
菌体を集菌後、フェノール法（バイオケム・バイオフィ
ズ・アクタ） （Ｂｉｏｃｈａｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ） ７２．６１９〜．１９
６３年）により染色体ＤＮＡを抽出し精製した。
６３年）により染色体ＤＮＡを抽出し精製した。
得られた染色体ＤＮＡ １０μｇをとり、制限エンドヌ
クレアーゼＳａｕ ３ＡＩを加え、３７℃、２５分間反
応させて部分分解し、次いで反応物をアガロースゲル電
気泳動にかけ、ｌｋｂから３ｏにｂのＤＮＡ断片を回収
した。
クレアーゼＳａｕ ３ＡＩを加え、３７℃、２５分間反
応させて部分分解し、次いで反応物をアガロースゲル電
気泳動にかけ、ｌｋｂから３ｏにｂのＤＮＡ断片を回収
した。
一方、市販のプラスミドＰＢＲ３２２（全酒造製）を制
限エンドヌクレアーゼＢａｗｌ（Ｉで完全分解後ＢＡＰ
ａｇｅ（バクチリアルアルカリンホスファターゼ）で処
理した。これを先のＤＮＡ断片とを混合し、Ｔ４ＤＮＡ
ＩＪガーゼにより１６℃、１４時間ＤＮＡ鎖の連結反応
を行なった。
限エンドヌクレアーゼＢａｗｌ（Ｉで完全分解後ＢＡＰ
ａｇｅ（バクチリアルアルカリンホスファターゼ）で処
理した。これを先のＤＮＡ断片とを混合し、Ｔ４ＤＮＡ
ＩＪガーゼにより１６℃、１４時間ＤＮＡ鎖の連結反応
を行なった。
別に、エシェリヒア・コリＣ６００（ｒ−、ｍ−）の培
養菌を許容（コンピテント）細胞とし、これに上記Ｔ４
ＤＮＡリガーゼによる連結反応物を加え、形質転換し、
ＬＢ培地中で１時間培養したのち、アンピシリン（Ａｐ
） ５０μｇ／ｍＱ、スキムミルク１％を含むＬＢ寒天
培地でアンピシリン抵抗性（Ａｐｒ）株を選択した。
養菌を許容（コンピテント）細胞とし、これに上記Ｔ４
ＤＮＡリガーゼによる連結反応物を加え、形質転換し、
ＬＢ培地中で１時間培養したのち、アンピシリン（Ａｐ
） ５０μｇ／ｍＱ、スキムミルク１％を含むＬＢ寒天
培地でアンピシリン抵抗性（Ａｐｒ）株を選択した。
形質転換はマンデル（Ｍａｎｄｓｌ）とヒガ（Ｈｉｇａ
）の方法［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジ′（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、）、 ５４．１５９
（１９７０） ］に準じて行なった。得られたＡｐｒ株
２５ 、０００株のうち、コロニーの回りに白濁環（タ
ービットゾーン）を形成する株を２株得た。これら２株
の所有するプラスミドを常法に従って単離し、制限酵素
による切断パターンを比較したところ、冷く同一のパタ
ーンを有していた。このプラスミドをｐｓＰｌｌと命名
し、その制限地図を第１図に示した。またｐｓＰｌｌを
含有する菌をエシェリヒア・コリＣ６００（ｐｓＰｌｌ
）と命名する。
）の方法［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジ′（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、）、 ５４．１５９
（１９７０） ］に準じて行なった。得られたＡｐｒ株
２５ 、０００株のうち、コロニーの回りに白濁環（タ
ービットゾーン）を形成する株を２株得た。これら２株
の所有するプラスミドを常法に従って単離し、制限酵素
による切断パターンを比較したところ、冷く同一のパタ
ーンを有していた。このプラスミドをｐｓＰｌｌと命名
し、その制限地図を第１図に示した。またｐｓＰｌｌを
含有する菌をエシェリヒア・コリＣ６００（ｐｓＰｌｌ
）と命名する。
（ＤＮＡ塩基配列の決定）
ＰＳＰＩＩを２種の制限酵素（Ｈｉｎｄｍ、ＥｃｏＲＩ
）で二重消化し、セラチアプロテアーゼＳＳＰ−１遺伝
子のシグナル配列を含む７９０塩基対（ｂρ）の大きさ
の断片（第１図中の→に相当する部分）を単離し１Ｍ１
３フアージを用いたメッシング（Ｍａｓｓｉｎｇ）らの
方法０ツシング・エトアル（Ｍｅｓｓｉｎｇ Ｊ、 ｅ
ｔ ａｌ）ジーン（Ｇｅｎｅ）１９２６９−２７６（１
９８２）、サンガー、エフ、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）２１４．１２０５−１２１０（１９８１）によりＥ
ｃ。
）で二重消化し、セラチアプロテアーゼＳＳＰ−１遺伝
子のシグナル配列を含む７９０塩基対（ｂρ）の大きさ
の断片（第１図中の→に相当する部分）を単離し１Ｍ１
３フアージを用いたメッシング（Ｍａｓｓｉｎｇ）らの
方法０ツシング・エトアル（Ｍｅｓｓｉｎｇ Ｊ、 ｅ
ｔ ａｌ）ジーン（Ｇｅｎｅ）１９２６９−２７６（１
９８２）、サンガー、エフ、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）２１４．１２０５−１２１０（１９８１）によりＥ
ｃ。
ＲＩ切断サイト側から塩基配列を決定した。このＤＮＡ
断片には、シャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列の直後に開
始コドンＡＴＧで始まる読始取り枠が存在し、Ｎ末端近
傍には２つのリジンと１つのアルギニンが存在し、その
後に疎水性アミノ酸が続く、いわゆるシグナル配列が存
在していた。第２図には、Ｓ［）配列より下流の塩基配
列を示しである。
断片には、シャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列の直後に開
始コドンＡＴＧで始まる読始取り枠が存在し、Ｎ末端近
傍には２つのリジンと１つのアルギニンが存在し、その
後に疎水性アミノ酸が続く、いわゆるシグナル配列が存
在していた。第２図には、Ｓ［）配列より下流の塩基配
列を示しである。
また、後記の方法で得たセラチアプロテアーゼ５ｓｐ−
ｉについて、エドマン分解法により、そのＮ末端アミノ
酸配列を決定したところ、塩基配列から予想されるアミ
ノ酸配列の２８番目のアラニンから３５番目のロイシン
までの８アミノ酸が双方で一致した。
ｉについて、エドマン分解法により、そのＮ末端アミノ
酸配列を決定したところ、塩基配列から予想されるアミ
ノ酸配列の２８番目のアラニンから３５番目のロイシン
までの８アミノ酸が双方で一致した。
（セラチアプロテアーゼＳＳＰ−１の発現）上記のＰＳ
ＰＩＩを保有する形質転換株、エシェリヒア・コリＣ６
００（ｐｓＰｌｌ）をＬ８培地に植菌し、３７℃８時間
培養し、遠心により上滑を集めた。この上清に硫酸アン
モニウムを６０％飽和となるよう加え、４℃で１２時間
攪拌後、遠心により沈５殿を得た。この沈澱を１１０ｆ
ｆ１トリスヒドロキシメ士ルアミンＰＨ７，９に溶解し
、同波に対して３回透析した。この透析物を、同一の緩
衝液で平置化したアルギニンセファロース４Ｂ（ファル
マシア社製）に通じて精製セラチアプロテアーゼＳＳＰ
−１を得た。
ＰＩＩを保有する形質転換株、エシェリヒア・コリＣ６
００（ｐｓＰｌｌ）をＬ８培地に植菌し、３７℃８時間
培養し、遠心により上滑を集めた。この上清に硫酸アン
モニウムを６０％飽和となるよう加え、４℃で１２時間
攪拌後、遠心により沈５殿を得た。この沈澱を１１０ｆ
ｆ１トリスヒドロキシメ士ルアミンＰＨ７，９に溶解し
、同波に対して３回透析した。この透析物を、同一の緩
衝液で平置化したアルギニンセファロース４Ｂ（ファル
マシア社製）に通じて精製セラチアプロテアーゼＳＳＰ
−１を得た。
実施例２
実施例１で得たエシェリヒア・コリＣ６００（ｐＳＰｌ
ｌ）を、５０μｇ／ｍＱのアンピシリンを含むＬＢ培地
に接種し、６時間培養後、遠心により集菌し、上清（菌
体外画分）と菌体を分離した。菌体は生理食塩水で２回
洗浄後、高張液（２０％シュークロス、３０ｍＭトリス
ｐＨ８，０）に懸濁後、終濃度１ａＭのＥＤＴＡを加え
、室温で１０分間攪拌した。集菌後、菌体を氷冷水中に
加えて懸濁し、０℃で１０分間攪拌した。遠心により上
清（ペリプラズム画分）と沈澱に分離した。
ｌ）を、５０μｇ／ｍＱのアンピシリンを含むＬＢ培地
に接種し、６時間培養後、遠心により集菌し、上清（菌
体外画分）と菌体を分離した。菌体は生理食塩水で２回
洗浄後、高張液（２０％シュークロス、３０ｍＭトリス
ｐＨ８，０）に懸濁後、終濃度１ａＭのＥＤＴＡを加え
、室温で１０分間攪拌した。集菌後、菌体を氷冷水中に
加えて懸濁し、０℃で１０分間攪拌した。遠心により上
清（ペリプラズム画分）と沈澱に分離した。
次いで、沈澱を１１０Ｉｎトリス・バッハ−ｐＨ７，５
に懸濁し、音波処理により菌体を破砕し、遠心して上清
（細胞質画分）を得た。
に懸濁し、音波処理により菌体を破砕し、遠心して上清
（細胞質画分）を得た。
このようにして得られた菌体外画分ペリプラズム画分及
び細胞質画分の各々におけるプロテアーゼ活性を測定し
、その結果を第１表に示した。また比較のため、ＰＳＰ
ＩＩの代りにｐＢＲ３２２を形質転換した転換株エシェ
リヒア・コリＣ６００（ｐＢＲ３２２）についても同様
にして実験を行い、その結果を第１表に併記した。
び細胞質画分の各々におけるプロテアーゼ活性を測定し
、その結果を第１表に示した。また比較のため、ＰＳＰ
ＩＩの代りにｐＢＲ３２２を形質転換した転換株エシェ
リヒア・コリＣ６００（ｐＢＲ３２２）についても同様
にして実験を行い、その結果を第１表に併記した。
第１表
傘ΔＡ０゜１０．５ｈ−一培養液３７℃で。
プロテアーゼ活性の測定はハンマースティン・カゼイン
を基質としたカニフッ法〔「発酵研究法」第２巻２３９
頁、朝食書店１９５６年〕の変法による。詳細は以下の
とうりである。
を基質としたカニフッ法〔「発酵研究法」第２巻２３９
頁、朝食書店１９５６年〕の変法による。詳細は以下の
とうりである。
まず５ｍ１２の０．６％カゼイン溶液（５０ｍＭリン酸
バッファ−ｐＨ７，５）を１０分間、３７℃で放置後、
粗酵素液１ｍＱを加え３７℃、３０分間反応させ、 ５
ｍＱのＴＣＡ溶液（０，１１Ｍトリクロル酢酸、０．２
２Ｍ酢酸、０．３３に酢酸ナトリウム）を加え反応を停
止する。３０分間静置後、沈殿を濾過分別し、上清の波
長２８０ｎｍにおける吸光度を測定する。活性はこの吸
光度と対照の吸光度の差（ΔＡ、、、）で示される。
バッファ−ｐＨ７，５）を１０分間、３７℃で放置後、
粗酵素液１ｍＱを加え３７℃、３０分間反応させ、 ５
ｍＱのＴＣＡ溶液（０，１１Ｍトリクロル酢酸、０．２
２Ｍ酢酸、０．３３に酢酸ナトリウム）を加え反応を停
止する。３０分間静置後、沈殿を濾過分別し、上清の波
長２８０ｎｍにおける吸光度を測定する。活性はこの吸
光度と対照の吸光度の差（ΔＡ、、、）で示される。
なお対照としては、粗酵素液１ｍＱにＴＣＡ溶液５ｍＭ
を加えたのち、０．６％カゼイン溶液を加え、同様に処
理したものを用いる。
を加えたのち、０．６％カゼイン溶液を加え、同様に処
理したものを用いる。
この結果から、エシェリヒア・コリＣ６００（ｐＢＲ３
２２）は菌体外へプロテアーゼを分泌しないのに対し、
エシェリヒア・コリＣ６００（ｐｓＰｌｌ）は多量のプ
ロテアーゼを菌体外に分泌していることがわかる。なお
、菌体外のプロテアーゼ活性は単一のプロテアーゼに起
因するものであり、そのＮ末端配列の測定によりセラチ
アプロテアーゼＳＳＰ−１であることが確認された。
２２）は菌体外へプロテアーゼを分泌しないのに対し、
エシェリヒア・コリＣ６００（ｐｓＰｌｌ）は多量のプ
ロテアーゼを菌体外に分泌していることがわかる。なお
、菌体外のプロテアーゼ活性は単一のプロテアーゼに起
因するものであり、そのＮ末端配列の測定によりセラチ
アプロテアーゼＳＳＰ−１であることが確認された。
また培養開始後から経時的に集菌し、プロテアーゼの分
泌の状況を観察したところ、対数増殖期の初期から菌体
外への分泌が認められ、ペリプラズムへの滞留はｗ４察
されなかった。
泌の状況を観察したところ、対数増殖期の初期から菌体
外への分泌が認められ、ペリプラズムへの滞留はｗ４察
されなかった。
これに対し大腸菌のペリプラズム酵素であるβ−ラクタ
マーゼの活性をマクロヨード法（メソッド・イン・エン
チモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）Ｐ、６９〜８５．１９７５年）に従がって測定した
ところ、エシェリヒア・コリＣ６００（ｐｓｐｔｌ）、
エシェリヒア・コリＣ６００（ｐＢＲ３２２）ともにそ
の殆どがペリプラズムに蓄積されていることが確認され
た。
マーゼの活性をマクロヨード法（メソッド・イン・エン
チモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）Ｐ、６９〜８５．１９７５年）に従がって測定した
ところ、エシェリヒア・コリＣ６００（ｐｓｐｔｌ）、
エシェリヒア・コリＣ６００（ｐＢＲ３２２）ともにそ
の殆どがペリプラズムに蓄積されていることが確認され
た。
第１図はハイブリッドプラスミドｐｓｐ １１の制限酵
素開裂地図を示し、第２図は第１図上部に示すｐｓＰｌ
ｌの←に相当するＤＮＡ断片中、ＳＤ配列、シグナル配
列及びセラチアプロテアーゼＳＳＰ−１の遺伝子の一部
から成る部分の塩基配列を示す。 代理人 弁理士 戸 １）親 男 第 １ 図 第 ２ 図 □セラチアアロテア−でＳＳＰ−１− ＣＯＲ１−
素開裂地図を示し、第２図は第１図上部に示すｐｓＰｌ
ｌの←に相当するＤＮＡ断片中、ＳＤ配列、シグナル配
列及びセラチアプロテアーゼＳＳＰ−１の遺伝子の一部
から成る部分の塩基配列を示す。 代理人 弁理士 戸 １）親 男 第 １ 図 第 ２ 図 □セラチアアロテア−でＳＳＰ−１− ＣＯＲ１−
Claims (4)
- （１）セラチア属細菌の菌体外タンパクのシグナルアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するハイブリッドプ
ラスミド。 - （２）菌体外タンパクがセラチアプロテアーゼである特
許請求の範囲第１項記載のプラスミド。 - （３）セラチアプロテアーゼがセラチアプロテアーゼＳ
ＳＰ−１である特許請求の範囲第２項記載のプラスミド
。 - （４）シグナルアミノ酸配列が下記のアミノ酸配列であ
る特許請求の範囲第１項記載のプラスミド。 【アミノ酸配列があります】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60122675A JPH062066B2 (ja) | 1985-06-07 | 1985-06-07 | 新規なシグナルアミノ酸配列をコ−ドするｄｎａを有するプラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60122675A JPH062066B2 (ja) | 1985-06-07 | 1985-06-07 | 新規なシグナルアミノ酸配列をコ−ドするｄｎａを有するプラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61282080A true JPS61282080A (ja) | 1986-12-12 |
| JPH062066B2 JPH062066B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=14841848
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60122675A Expired - Lifetime JPH062066B2 (ja) | 1985-06-07 | 1985-06-07 | 新規なシグナルアミノ酸配列をコ−ドするｄｎａを有するプラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH062066B2 (ja) |
-
1985
- 1985-06-07 JP JP60122675A patent/JPH062066B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH062066B2 (ja) | 1994-01-12 |
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