JPS61272656A - 分析物成分の検出方法および検出用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の要約］ 増大しうる信号成分によって分析物（ａｎａｌｙｔｅ　
）成分を検出する方法および組成物につき開示する。

信号成分は分析物成分／分析物特異成分の複合体に結合
させても、させなくてもよい。信号成分は生存可能であ
っても、生存しえなくてもよい。本明細書に開示する方
法は、広範囲の種々異なる分析物成分を検出するための
鋭敏な分析法を提供する。

［産業上の利用分野］ 　４　一 本発明は、信号成分によって特に増大しまたは増大され
うる信号成分によって分析物成分を検出する方法に関す
るものである。

［従来の技術］ 生物医学上興味ある分析物成分を検出するだめの分析方
式か長年にわたって知られている。これらの方式は、た
とえば免疫拡散、免疫電気泳動、凝集反応および免疫蛍
光などを包含する。これらの方式は、それぞれ便利さ、
感度、試料調製の容易さ、自動化に対する適性、および
各種の特異分析物成分に対する適用性などに限界がある
。

放射線免疫分析（ＲＩＡ）は、便利で敏感な融通性のあ
る容易に自動化しうる検出方法である。

このＲＩＡ検出方式の欠点は、ＲＩＡ分析に際し信号を
発生する放射線同位元素を使用することに伴う固有の問
題である。これらの問題は、それぞれ放射線標識した試
薬の高価格および短い貯蔵寿命、信号を検出するための
特殊装置の要求、作業員に対する健康上の危険、並びに
放射性廃棄物を処分するための経費および不便さを含む
。

近年、放射性同位元素の使用を必要としない鋭敏かつ便
利な検出方法が開発された。この酵素結合免疫収着分析
（ＥＬＩＳＡ〉は、信号成分として酵素を使用する。Ｅ
ＬＩＳＡの感度は、使用する分析物特異成分に結合しう
る酵素分子の（因数により部分的に制約される。

分析物成分が増殖しうる場合（たとえば細菌類）これを
生体内または試験管内で増殖させて検出の仕事をより容
易にするのかしばしば有用である。

増殖の後、分析物成分をたとえばその物理的もしくは代
謝的特性、その細胞もしくはコロニーの形態、栄養要求
、代謝生産物、染色特性または病原可能性のいずれかを
観察して検出することができる。このようにして僅か１
個の生存しうる細菌類細胞を検出することができる。

増殖する細菌類の能力は、他の成分を検出するための有
用な信号成分となる。細菌類の増殖能力が分析物成分に
依存する場合（たとえば細菌類が分析物成分に対し栄養
要求性である場合〉、細菌類の増殖を使用して分析物成
分の存在を検出することができる。細菌類の増殖は、分
析物成分の存在量に化学量論上関連する。勿論、この種
の生物分析は、特異信号成分−分析物成分の対に制限さ
れる。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明の目的は、増大（増殖、複製、繁殖、伸長もしく
は重合〉しうる信号成分による分析物成分の検出方法を
提供するにある。

ざらに、本発明の目的は、分析物成分の鋭敏な検出方法
を提供するにある。

本発明の他の目的は、１種の分析物成分の検出を可能に
する方法を提供するにある。

さらに本発明の他の目的は、分析物成分から独立して増
大しうる分析物成分／分析物特異成分の複合体に結合し
ていない信号成分によって分析物成分の存在を検出しつ
る方法を提供するにある。

さらに本発明の他の目的は、増大しつる信号成分によっ
て分析物成分を検出しうるキットを提供するにある。

［問題点を解決するための手段］ 　　７一 本発明によれば、分析物成分の検出方法が提供される。

この方法は幾つかの実施態様を含む。第１の実施態様に
よれば、分析物成分を分析物特異成分に複合化させる。

分析物成分も分析物特異成分も共に増大しうる信号成分
でなければ、或いはいずれか一方のみが増大しうるがこ
の能力の利用が望ましくなければ、増大しうる信号成分
を分析物成分または分析物特異成分のいずれかに結合さ
せる。信号成分は生存可能であってもなくてもよい。

第２の実施態様においては、信号成分を分析物成分／分
析物特異成分の複合体に結合させない。

この信号成分は増大させるための栄養物或いは信号を発
生させるための栄養物に依存する。栄養物は触媒によっ
て供給される。分析物成分も分析物特異成分も共に適当
な触媒でなれけば、或いはいずれか一方が触媒であるが
触媒としてのその使用が望ましくなければ、触媒を分析
物成分または分析物特異成分のいずれかに結合させる。

この触媒は先駆体から栄養物を生ぜしめ、この栄養物は
生存しうる信号成分が増大しまたは信号を発生すること
を可能にし、或いは前記触媒は生存しえない信号成分を
増大させうる遊離基を発生する。代案として、栄養物は
たとえばリポソームのような栄養物を含有するキャリヤ
によって生存可能な信号成分に供給し、分析物成分／分
析物特異成分複合体に結合させることもできる。

■、定礪 本発明においては次の用語を使用する：分析物成分二分
析物成分は検出すべきまたは定量化すべき物質である。

分析物特異成分：これは分析物成分の成る情報部分を識
別することにより特定分析物成分に複合化しうる成分で
ある。

架橋成分：これは２種の成分を結合する成分である。

信号成分特異性の成分：これは信号成分の成る情報部分
を識別することにより特定信号成分に複合化しうる成分
である。

信号成分：これは使用者により検出される成分であって
、生存可能であっても生存できなくてもよい。

生号：これは分析において検出されるものである。

信号の存在は信号成分の存在を示す。

生存可能な信号成分：これは増殖、複製および／または
繁殖しうる信号成分である。これら成分は全て核酸を含
み、宿主とは無関係にまたは宿主によって核酸のコピー
を生産する能力を有する。

生存しえない信号成分：これは伸長もしくは重合を受け
うる信号成分である。

分析物成分／分析物特異成分の複合体：これは分析物特
異成分が分析物成分の情報を識別して、この分析物成分
に結合する際形成される実体である。

信号−分析物一実体：この用語は、少なくとも分析物成
分と分析物特異成分と信号成分とがらなる実体を示すべ
く使用される。信号成分は分析物成分または分析物特異
成分とすることができる。

精澄ニームが他方に共有的（直接的または間接的〉或い
は非共有的（直接的または間接的）に結合される場合、
一つの成分が他の成分に結合されることを意味する。

直接的結合：これは中間成分なしに一つの成分か仙の成
分に結合する際に生ずる。

間接的結合：これは一つの成分が他の成分へ中間成分を
介して結合する際に生する。

滑入：これは重量、寸法、容量、信号成分の分子量の増
大を意味し、この増大は他の同様なまたは類似しない成
分に信号成分が結合した結果生じうる。

独立的増大：この用語は、信号成分が分析物成分でなけ
れば、増大のために分析物成分に直接依存しないことを
意味する。しかしながら、分析物成分の存在は増大のた
め信号成分により必要とされる栄養物の供給を間接的に
もたらしうる。

１：これは、分析物特異成分が識別しうる分析物成分の
部分である。

識別：これは、分析物特異成分が分析物成分に結合する
際に生ずる。

栄養物：これは、増大のため或いは信号の発生のため信
号成分により必要とされる分子である。

先駆体：これは、増大のため或いは信号を発生するため
生存しうる信号成分により利用されうる栄養物まで触媒
によって変換される物質である。

本発明によれば、分析物成分と分析物特異成分との間の
複合体を形成させかつ独立して増大しうる信号成分によ
って分析物成分を検出することによる分析物成分の検出
方法か提供される。独立的増大は、信号成分が増大用の
分析物成分自身には直接に依存しないことを意味する。

分析物成分が信号成分である実施形態においては、各信
号成分は増大用の他の分析物成分の存在に依存しない。

信号成分は分析物成分／分析物特異成分の複合体に直接
的もしくは間接的に結合しても、或いは全く結合しなく
てもよい。各実施態様につき以下に説明する。

生存可能な信号成分 増大しうる生存可能な信号成分は、適切な栄養物を供給
した際に適する環境で増殖、複製もしく“　は繁殖しう
る成分である。栄養物は信号成分の全代謝要求を含み、
完全細胞を包含しうる。増大し−１２＝ うる信号成分を使用する利点は、より多量の信号成分の
生成茶可能にしてより多くの信号を発生しうろことであ
る。生存可能な信号成分、たとえばファージ、ウィルス
、細菌、プロミルシア、リケッチャ、真菌類、酵母、藻
類、微生物、原核細胞、真核細胞、腫瘍細胞、植物細胞
および動物細胞を包含する。好適な生存しうる信号成分
はファージ、ウィルス、細菌および酵母である。特に好
適なものは細菌およびび酵母である。

生存可能な信号成分は、実際の成分自身或いはこれら成
分により産生された代謝物を観察して検出することがで
きる。信号成分が細菌自身であれば、これらはたとえば
固体栄養プレートにおけるコロニーの存在、或いは液体
培地における濁りによって観察することができる。特殊
条件（たとえば高温度または低ｐＨ）にて増殖しうる細
菌または他の生存可能な信号成分（たとえば明確な形態
もしくは着色を有するコロニーを形成するもの）から容
易に識別しうる細菌は、これら条件下で増殖しえない他
の信号成分の存在下に或いはこれらの明確な特性を示さ
ないと信号成分の存在下に観察しうるという利点をさら
に有する。明確なコロニーを形成する細菌菌種の例はセ
ラチア・マルセツセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　　ｍａｒ
ｓｅｓｃｅｎｓ＞であって、赤色コロニーを形成する。

生存可能な信号成分は、信号成分の存在を証明するため
検出しうる代謝物を産生する。これらは、殆んどの細胞
産生物もしくはウィルス産生物および成分を包含する。

たとえば、これらは蛋白質、ホルモン、抗体、酵素、エ
ピトープ、坑原、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、
核酸、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド
、塩基類、炭水化物、糖類、澱粉、脂質、脂肪酸エステ
ル、グリセロール、脂肪酸、グリコ蛋白質、リポ蛋白質
、ビタミン、ステロイド、薬物、フラボン、抗生物質、
テルペン、プリンおよびピリミジンを包含する。好適代
謝物は蛋白質、ポリヌクレオチドおよび多糖類である。

特に好適なものはエビ１〜−プ、坑原、酵素およびポリ
ヌクレオチドである。

たとえば、酵素はヒドラーゼ、エステラーゼ、ホスファ
ターゼ、ベルオキシタ゛−ゼ、カタラーゼ、グリコシダ
ーゼ、オキシドレダクターゼ、プロテアーゼ、リパーゼ
およびヌクレアーゼを包含する。

特に、好適なものはホスファターゼ、ベルオキシダーし
およびオキシドレダクターゼである。

代謝物の検出は各種の手段によって行なうことができる
。代謝物は物理的性質または化学的性質によって検出す
ることができる。物理的性質はたとえば蛍光放出、紫外
線吸収、分子量、電気泳動の移動性およびクロマトグラ
フ挙動などの仝ゆる特性を包含する。化学的性質は、代
謝物を他の物質と反応させ、相互作用させまたは結合さ
せうる仝ゆる特性を包含する。化学的性質は、代謝物を
検出可能な化合物に変換しうるちの、代謝物により物質
を検出可能な生成物に変換させうるちの、或いは代謝物
を検出可能な物質に結合させうるちのとすることができ
る。

上記方法により検出されうる代謝物の例は、ＵＶスペク
トルによる補因子、ＨＰＩ　Ｃ上での滞留時間によるペ
プチド、オルシノールによるリポヌクレオチド、ｐｌ−
１指示薬によるカルボン酸、臭化エチジウムによる核酸
、蛍光性成分に結合した抗体によるエピトープ、プラー
クによるリゾチーム、およびたとえばｐ−ニトロフェニ
ル燐酸などの発色性物質によるホスファターセ酵素を包
含する。

増大しうる生存可能な信号成分は、２つの実施態様に適
用することができる。第１の実施態様において、供給さ
れる信号成分は分析物−信号−実体の１部である。信号
成分は分析物成分、分析物特異成分或いは分析物成分も
しくは分析物特異成分のいずかに結合した他の成分とす
ることができる。

第２の実施態様において、供給される信号成分は分析物
成分でも分析物特異成分でもなく、或いは分析物成分／
分析物特異成分の複合体に結合したものでもない。信号
成分は別の実体として供給される。この信号成分は増大
用或いは信号発生用の栄養物に依存する。栄養物は、た
とえば栄養物を含有するリポソームのようなキャリヤに
よって、或いは先駆体から栄養物を生ずる触媒によって
供給される。キ【・リヤもしくは触媒は分析物成分、分
析物特異成分または分析物／分析物特異成分の複合体に
結合した他の成分のいずれであってもよい。

第１の実施態様において、信号−分析物−実体は４種の
形態で適用することができる。第１の形態において生存
可能な信号成分は分析物成分でおり、第２の形態におい
て生存可能な信号成分は分析物特異成分であり、第３の
形態において生存可能な信号成分は分析物成分に直接的
にまたは間接的に結合した別の成分であり、また第４の
形態において生存可能な信号成分は析分物特異成分に直
接的にまたは間接的に結合した別の成分である。

分析物成分でもある生存可能な信号成分の例は、セラチ
ア・マルセッセンスに対する抗体が固定化した分析物特
異成分でありかつセラチア・マルセッセンスが分析物成
分となる場合である。この場合、セラチア・マルセツセ
ンスは増大しうる生存可能な信号成分にもなりうる（実
施例Ｔ）。

分析物特異成分でもある生存可能な信号成分の例は、■
ΩＧ抗体か固定化した分析物成分でありかつスタフィロ
コッカス・アウレウス（５ｔａｐｈｙ　ｌ　０−ｃｏｃ
ｃｕｓ　　ａｕｒｅｕｓ）が分析物特異成分となる場合
である。この場合、スタフィロコッカス・アウレウスは
増大しうる生存可能な信号成分にもなる（実施例■）。

分析物成分に結合する生存可能な信号成分の例は、ヤギ
坑−ウザギＩｑＧ　（Ｆａｂ’　、２＞が固定化した分
析物特異成分でありかつウサギＩＣＩＧか分析物成分と
なる場合である。スタフィロコッカス・アウレウスは増
大しうる生存可能な信号成分として作用し、分析物成分
に直接に結合する（実施例■）。

分析物特異成分に結合する生存可能な信号成分の例は、
ビオチニル化した牛血清アルブミンが固定化した分析物
成分であり、アビジンが分析物特異成分でありかつセラ
チア・マルセツセンスが増大しうる生存可能な信号成分
となる場合である。

セラチア・マルセツセンスに対するビオチニル化された
抗体は架橋成分であって、これにより信号成分は分析物
特異成分に結合する（実施例ＩＶ　）。

全ての栄養物は予備生成された信号成分に供給すること
ができ、或いは１種もしくはそれ以上の所要の栄養物を
先駆体として供給し、これを１種もしくはそれ以上の触
媒によって栄養物に変換することもできる。触媒は分析
物−信号−実体の１部とすることができ、或いは別の未
結合実体とすることもできる。

上記４種の形態の方法は一般に、限定はしないが、分析
物成分または分析物特異成分のいずれかを支持体に固定
化させ、かつこの支持体を分析物−信号−実体からなる
いずれの成分も支持体に非特異的に結合するのを防止す
るよう処理することがらなっている。次いで、最初に固
定化したものとは別の成分を支持体と順次にまたは一緒
に接触させることにより、分析物−信号−実体を支持体
上に作成する。分析物−信号−実体の成分は、支持体と
の接触前に部分的に組立てても或いは組立てなくてもよ
い。支持体に特異的に結合していない成分は、たとえば
支持体を洗浄することにより除去される。

分析物もしくは分析物特異成分以外の成分が信号成分で
ある場合、これは分析物成分もしくは分析物特異成分の
いすかに結合される。この結合は、共有結合手段または
非共有結合手段にＪ：って行なうことができる。信号成
分は分析物成分もしくは分析物特異成分のいずれかに直
接的に或いは分析物成分もしくは分析物特異成分のいず
れかに間接的に信号成分特異性の成分によってかつ／ま
たは１種もしくはそれ以上の架橋成分によって結合させ
ることができる。信号成分は、分析物成分／分析物特異
成分の複合体か形成される前に分析物成分もしくは分析
物特異成分のいずれかに結合させることができ、或いは
分析物成分／分析物特異成分の複合体か生成された後に
分析物成分もしくは分析物特異成分のいずれかに結合さ
せることもてきる。同様に、架橋成分および／または信
号成分特異性の成分か関与する場合、これは分析物成分
もしくは分析物特異成分のいずれかに結合される前に信
号成分に結合させることができ、或いは分析物成分もし
くは分析物特異成分に結合された後に結合させることも
できる。

分析物成分もしくは分析物特異成分のいずれかを結合し
うる支持体、および支持体に対する他の成分の非特異的
結合を防止しうる阻止剤が適している。適する支持体は
ニトロセルロース、ナイロン膜、ガラススライド、ポリ
スチレン、ポリプロピレンまたはポリカーボネートを包
含する。好適支持体はニトロセルロースであり、かつ好
適阻止剤は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）である。一般に
、支持体に対する分析物成分もしくは分析物特異成分の
結合は非共有手段によって行なわれるが、成る場合には
共有結合が望ましい。

第２の実施態様において、増大しうる生存可能な信号成
分は分析物成分／分析物特異成分の複合体に結合されな
い。しかしながら、たとえばリポソームのような触媒も
しくはキャリヤを複合体に結合させる。触媒は先駆体を
栄養物に変換させ、これを信号成分が利用して増大しま
たは信号を発生する。キレリヤは、増大用または信号発
生用に信号成分により必要とされる栄養物を含有する。

それを与えないと信号成分か増大せず或いは特定信号を
発生しないような栄養物を生成じうる触媒かこの実施態
様に使用するのに適しているか、酵素か特に好適である
。先駆体に対する触媒の作用により生成される栄養物か
増大用または信号の発生用として生存可能な信号成分に
より利用される限り、任意の先駆体か適している。たと
えば栄養物はビタミン、アミノ酸、糖類、補醇素、ヌク
レオチド、ヌクレオシド、塩基、脂肪酸、澱粉または補
因子とすることができる。栄養要求性である生存可能な
信号成分を信号成分として使用することができる。触媒
によりキャリヤから栄養物を放出したりまたは先駆体か
ら栄養物を生成させた後、信号成分は増大しまたは信号
を発生ずることができる。

この実施態様において、分析物成分／分析物特異成分の
複合体を形成する方法は、第１の実７Ｉｉ！ｉ態様に記
載したものと同様である。それらの間の主たる相違点は
、信号成分の位置である。第１の実施態様において、信
号成分は分析物成分／分析物特異成分複合体の１部に結
合しまたは１部となる。

この実施態様において、信号成分は分析物成分／分析物
特異成分複合体に結合されない。しかしながら、信号成
分の増大は分析物成分の存在を証明する。何故なら、信
号成分は特定の栄養物なしには増大することができす、
或いは信号を発生しえないからである。

この実施態様の１例は、信号成分としてイー・コリのチ
ミジン要求性の栄養要求菌株を使用する。

分析物成分として作用する固定化した坑原を、ホスファ
タターゼ酵素に結合している特異抗体によって検出する
。この酵素は燐酸をチミジン−５′−モノホスフェート
から開裂させる。次いで、遊離したチミジンを使用して
、栄養要求性イー・コリが接種されているデミジン欠乏
増殖培地に補給する。イー・コリの増殖およびその結果
としての培地Ｆの濁りは分析物成分の存在を示す。

＝　　２３　− 増大しうるか生存しえない信号成分は、適する環境中で
重合しまたは伸長しうる成分である。牛存じえない信号
成分は、たとえば多糖類プライマ・−１二糖類プライマ
ー、ジー、オリゴ−およびポリヌクレオヂトプライマー
、共役ジエン、α、β−不飽和力ルボニル化合物、ビニ
ルエポキシド、ハロゲン化ビニル、ハロゲン化アリル、
塩化アクリリルおよびジカルボン酸を包含する。特に好
適なものはポリヌクレオチドおよび多糖類プライマーで
ある。

信号成分を増大させうる化合物は全ゆる単量体、二量体
および重合体を包含し、これらは信号成分に結合するこ
とができる。たとえば、デオキシヌクレオチド三燐酸、
アミノ酸、ＮＴＰ−糖類、アルケン、少なくとも１個の
共役アルキルジエンを含有するアルキルもしくは芳香族
分子、少なくとも１個のα、β−不飽和不飽和ニルボニ
ルはチオカルボニル基を含有づるアルキルもしくは芳香
族分子、α、β−、β−酸、α、β−不飽和不飽和ニル
ボニルエステルン、二１〜リルを包含する。特に好適な
ものはデオキシヌクレオチド三燐酸およびＮＴＰ−糖類
である。

生存しえない信号成分は一般に次の増大後に検出される
。この検出は、たとえば沈殿物生成、溶液の粘度もしく
は屈折率の変化、ＵＶ吸収の低下、或いは蛍光放出の増
大によって行なうことができる。

沈澱物または粘性溶液の生成による検出は、充分な長さ
および架橋の重合体か生成される場合に行なわれる。Ｕ
Ｖ吸収の低下または蛍光放出の増大による検出は、化合
物か重合の際に損失する発色団を含有する場合（たとえ
ば、共役ジエン〉、或いは化合物が蛍光発色団を含有し
かつ重合の際に化合物数が増加する場合に行なわれる。

１種のみの化合物を使用することができ、或いは数種の
異なる化合物を使用することもできる。反応は水溶液、
水性／有機溶液、或いは有機溶液で行なうことができる
。

増大しうるが生存しえない信号成分も２つの実施態様で
適用することができる。第１の実施態様においで、信号
成分は分析物成分／分析物特異成分複合体の１部である
。信号成分は分析物成分、分析物特異成分または分析物
成分もしくは分析物特異成分のいずれかに結合した他の
成分とすることができる。したがって、分析物の存在は
、分析物成分／分析物特異成分複合体の部分またはこれ
に結合したいずれかの信号成分から誘導される成分によ
って検出される。

第２の実施例において、信号成分は分析物成分または分
析物特異成分でなく、また分析物成分／分析物特異成分
複合体に結合してもいない。信号成分は別の実体として
供給されるが、遊離基を発生しうる触媒または信号成分
の重合を触媒する成分、或いは分解して遊離基を放出す
る成分を供給して、分析物成分／分析物特異成分複合体
に結合させる。遊離基は生存しえない信号成分の増大を
もたらす。

第１の実施態様において、信号−分析物−実体は４種の
形態で適用することができる。第１の形態において生存
しえない信号成分は分析物成分であり、第２の形態にお
いて生存しえない信号成分は分析物特異成分であり、第
３の形態において生存しえない信号成分は分析物成分に
直接的にまたは間接的に結合した別の成分であり、また
第４の形態において信号成分は分析物特異成分に直接的
にまたは間接的に結合した別の成分である。

分析物成分でもある生存しえない信号成分の例は、特異
性ポリヌクレオチドが分析物成分でありかつ相補的ポリ
ヌクレオチドが分析物特異成分であるような場合である
。分析物特異成分は支持体に結合され、その３′末端は
ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼによって保護さ
れる。

支持体を保護して、他の成分の非特異的な結合を防止す
る。分析物成分を、相補的ポリヌクレオチドの間で特定
ハイブリッドが生成されうるような条件下に支持体と接
触させる。結合した分析物成分はデオキシヌクレオシド
三燐酸および末端トランスフェラーゼによって増大させ
ることができる。分析物成分は反応に対しプライマーと
して作用する。分析物特異成分はそのように作用するこ
とができない。何故なら、３′末端が保護されているか
らである。たとえば放射性もしくはビオチニル化された
デオキシリボヌクレオチド三燐酸を供給すれば、増大し
た分析物成分を容易に検出することができる。

分析物特異成分でもある生存しえない信号成分の例は、
分析物ポリヌクレオチド成分か固定化されておりかつそ
の３′末端が末端燐酸によって保護されている場合でお
る。分析物特異成分を次いで分析物成分にハイブリッド
化させ、かつ上記したように分析物特異成分の３′末端
に端部を生せしめる。かくして、分析物特異成分は増大
することができる。この分析物特異成分を分析物成分に
つき上記したと同様に増大させる。分析物特異成分はこ
の例において保護されておらず、したがって反応のプラ
イマーとして作用する。

分析物成分に結合している生存しえない信号成分の例は
、分析物成分を含有していると思われる試わ１（この場
合、ヒ１〜絨毛ゴナト１ヘロピンの分子）を遊離３′　
ヒドロキシル基を有する活性化ポリスクレオチドプライ
マーと反応させて試わ１中の全蛋白質成分をポリヌクレ
オチドプライマーに結合させる場合である。次いでこの
試料を、じ１へ絨毛ゴナドトロピンに特異性の抗体が固
定化されている保護支持体と接触させる。非特異的に結
合した成分を洗浄除去した後、信号成分となるポリヌク
レオチドプライマーを増大させ、かつ上記と同様に末端
トランスフェラーゼによって検出する。

分析物特異成分に結合している生存しえない信号成分の
例は、坑原（分析物成分）を支持体に固定化させかつポ
リヌクレオチドプライマーに結合している抗体（分析物
特異成分）と複合化させる場合である。この場合、増大
しうるか生存しえない信号成分は分析物特異成分に結合
する。

第２の実ｔｑ態様において、増大しうるか生存しえない
信号成分は分析物成分／分析物特異成分複合体に結合し
ない。しかしながら、分析物成分も分析物特異成分も共
に遊離基を発生させるために使用すべき触媒でない場合
は、この種の触媒を分析物成分／分析物特異成分複合体
に結合させる。

遊離基は、信号成分によって重合体の生成を開始さける
。たとえば、触媒はペルオキシダーゼ酵素および補因子
を包含する。触媒が遊離基を発生ずる反応体は、たとえ
ばペルオキシダーゼ、過硫酸塩、フラボーンおよびアゾ
ニウム化合物を包含する。適する触媒の例は西洋ワザビ
ペルオギシダーゼ酵素およびヘム補因子である。分解し
て）ｎ離基を生成しうる成分の例は過酸化アルキルベン
ゾイルおよびアルキルアゾイソブヂルニ１〜リルである
。

この実施態様における方法も一般に、限定はしないが、
分析物成分もしくは分析物特異成分のいずれかを適当な
支持体に固定化することを含む。

この実ｆＭ態様の方法と第１の実施態様の方法との間に
おける主たる相違点は、この実施態様において信号成分
か分析物成分／分析物特異成分複合体に結合していない
ことでおる。信号成分は、重合を開始しうる任意の単量
体である。

しかしながら、信号成分の増大は分析物成分の存在を証
明する。何故なら、信号成分は分析物成分もしくは分析
物特異成分のいずれかに結合した触媒もしくは成分の存
在に依存するからである。

触媒は所要の遊ｇｔ基を発生して、信号成分を増大させ
る。結合していない生存しない信号成分の検出は、結合
しているが生存しえない信号成分の検出と同様である。

この実施態様の１例は、西洋ワザビペルオキシダーゼ酵
素を抗体（分析物特異成分）に結合させ、これを坑原（
分析物成分〉と複合化させる場合である。次いて、この
複合体を過酸化水素とポリエン単量体とを含有する溶液
に接触させる。西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素は過酸
化水素から遊離基を発生させて、ポリエン単量体の重合
を開始させる。検出は、プラスチックもしくはゲルの生
成により或いは溶液におけるＵＶ吸収の低下によって行
なわれる。ここで、重合を開始する第１単量体は増大す
る信号成分である。

すべての実施態様につき本発明の要件は、信号成分が増
大しうろことである。しかしながら、これは、本発明が
増大を実際に行なう場合のみに限定されることを意味し
ない。成る種の場合、信号＝　　３１　　＝ 成分は、特に多量の分析物成分が存在する場合、全く増
大なしに検出することもできる。他の場合には、検出を
可能にするには成る程度の増大が必要である。また他の
例においては、肉眼で見えるコロニー、プラークまたは
重合体が生成されるまで信号成分が増大する。

本発明の方法は、たとえば１種のみの分析物成分が少な
い場合でさえこれを検出することができる。この方法は
有能かつ極めて迅速であり、簡単な方式であり、基準化
することができかつ市販のキットとして供給しうる試薬
を使用し、かつ多数の試料の迅速なスクリーニングを可
能にする。

他の成分の説明 分析物成分は、その存在を検出すべき実体である。分析
物成分は、分析物特異成分が識別しうる情報部分を持た
ねばならない。分析物成分はたとえば微生物、真菌類、
藻類、植物細胞、動物細胞、腫瘍細胞、リガント、リセ
プタ、抗体、坑原、蛋白質、ホルモン、多糖類、ポリペ
プチド、核酸およびポリヌクレオチドを包含する。分析
物成分は血清、組織抽出物、細・胞断片、尿、唾、糞、
唾液、精子、醗酵液、培地、水溶液、環境試料および食
品から得ることができる。

実験操作は分析物成分の情報部分を分析物特異成分の識
別部位に露出する必要があることを認識すべきである。

ずなわち、細胞成分に到達するには膜を破壊せねばなら
ず、一本鎖領域を生ぜしめるにはポリヌクレオチドを変
性させねばならない。

これらの方法は当業者に周知されている。

分析物特異成分は、分析物成分の情報部分を識別するこ
とにより分析物成分と複合化する成分である。したかっ
て、分析物特異成分は分析物成分に対し選択的である。

一般に、複合体は水素結合、静電気相互作用、疎水性相
互作用またはこれら作用の組合せによって形成される。

分析物特異成分はたとえば微生物、リガンド、リセプタ
、坑原、抗体、蛋白質、ホルモン、ポリヌクレオチド、
アミノ酸、酵素、酵素基質、酵素阻止剤および脂質を包
含する。

信号成分特異性の成分は、特定の信号成分に複合化しう
る成分である。その機能は信号成分を仙の成分に結合さ
げることにある。架橋成分は任意の成分を他の成分に結
合させる。これらの成分は共有的にまたは非共有的に他
の成分に結合することができる。

信号成分特異性の成分はたとえば、抗体、エピトープ、
坑原、リセプタ、ポリヌクレオチド、レクチン、アグル
チニン、多糖類、補酵素および脂質を包含する。架橋成
分はたとえば微生物、重合体、ビオチン、ビオチニル化
化合物、レクチン、アグルチニン、アビジン、抗体、核
酸、蛋白質、脂質、糖類および二官能性有機化合物を包
含する。

信号−分析物−実体からなる成分の個数は変化すること
ができる。実体は２種の成分（分析物成分および分析物
特異成分）或いは多数の成分（分析物成分、分析物特異
成分、架橋（１種もしくはそれ以上）成分、信号成分特
異性の成分および信号成分）を含有することができる。

実際の個数は本発明にとって重要でない。

ざらに本発明は、分析物成分と分析物特異成分と信号成
分とがらなる組成物にも関するものである。たとえば、
スタフィロコッカス・アウレウスが坑原に複合化された
抗体に付着している組成物か知られている。しかしなが
ら、これら組成物の全てにおいて、細菌は増大すること
ができない。

何故なら、固定された細菌を使用するからで市る。

本発明で開示する組成物は生存可能な信号成分と分析物
成分と分析物特異成分とがらなり、この信号成分が増大
しうるので新規である。さらに信号成分特異性の成分お
よび／または架橋成分をも含む組成物もしたがって新規
である。

本発明は有能であり、かつこの方法を実施する試薬をキ
ット中に組込むことができる。これらキットは部分的に
所望の分析物特異成分と信号成分床の信号成分を分析物
特異成分に付着させる手段とを備える。検出すべき分析
物成分自身が増大しうるちのであれば、キットは信号成
分を含む必要はない。

実施例 以下、実施例を参照して本発明をさらに説明する。

以下の物質を使用する： ＰＢＳ　：燐酸緩耐塩水ｐＨ７，４゜ 保護緩衝液：２％の胎児牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と
０．１％のトリトンＸ−１００とを含有するＰＢＳ。

試料緩衝液：１％牛血清アルブミンを含有するＰＢＳ０ ニトロセルロース膜：ニューハンプシャー州、キーン在
、シュライヒヤーおよびシエウル社から購入されたＢＡ
８５０ットＮｏ、４０９８／４゜栄養寒天板：Ｌ−ブロ
スと１５μｑ／ｍｌのテトラサイクリンとを含有する栄
養寒天１．５％を含む直径９０ｍｍのペトリ皿。

セラチア・マルセツセンス：ＡＴＣＣＮｏ　１４７５６
、ＦＤ△菌株ＰＣＩ　　１１０８７゜この菌株の最適増
殖は２６°Ｃである。テトラサイクリン耐性菌株を栄養
寒天板にて選択し、実施例■および■で使用した。

Ｓ・マルセツセンスに対するウサギ坑血清：完成フロイ
ンドアジュバントにおけるホルマリン固定されたＳ・マ
ルセツセンスで免疫化することによ＝　　３６− リ、ニューシーラント白色ウサギで抗血清を生ぜしめた
。

スタフィロコッカス・アウレウス：これはテトラサイク
リン耐性の蛋白質へ陽性コーワン菌株である。

ビオチニル化蛋白質：Ｓ・マルセッセンスおよび′牛血
清アルブミンに対する抗体を、１０％ＤＭＳＯの存在下
にＮＨ３−０７−ビオチンと反応させた。

アビジン：ミス゛ウリ州、セントルイス在、シグマ・ケ
ミカル・カンパニー社から購入した卵白アビジン。

実施例　■： この実施例においては分析物成分（Ｓ・マルセッセンス
）を増大させることができ、かつ信号成分として作用さ
せた。

１、　３・マルセッセンスに対する未改変の抗血清につ
き３種の１彪試料を１：１００でＰＢＳ中に希釈し、こ
れらを４ｘ４ｃｍの乾燥ニトロセルロース膜へ三角形パ
ターンで施こした。この膜を風乾させた。

２、この膜を保護緩衝液中に３７°Ｃにて３０分間浸漬
して、膜に対する蛋白質の非特異的吸着を防止した。

３、膜をＰＢＳで洗浄し、かくしてセラチア・マルセッ
センスを検出する準漸ができた。

４、、ＰＢＳ中のセラチア・マルセツセンスの１跋濁液
（０，Ｄ、！ｌＩＤｎｍ−０．６４５）を１１１０００
にて試料緩衝液中に希釈した。この膜を１威の希釈懸濁
液に対し緩和に１宛拌しながら２０分間露出させｌこ　
。

５、この膜をＰＢＳ中で４回洗浄して未結合の物を除去
し、栄養寒天板の表面に施した。このプレーｉへを倒置
して室温で１＠培養した。

６、三角形のパターンに３個の明確な赤色コロニーがｖ
Ａ察され、各コロニーは特異性抗体を施こした部位に相
当する。

実施例　■： この実施例においては、分析物特異成分（Ｓ・アウレウ
ス）が増大しうる。分析物成分はＩＱＧてあって、これ
に微生物を蛋白質Ａ成分によって結合させる。

１、ＰＢＳ中のウサギＩｑＧの３種の１ｍｆ！試利（１
ｍ（］／威）を４Ｘ４Ｃｍのニトロセルロース膜に三角
形パターンで施こした。この膜を風乾させた。

２、膜を実施例工の工程２と同様に保護した。

３、膜をＰＢＳて３回洗浄し、次いで膜上のＩＦＧを次
のように検出した： ４、ＰＢＳにおけるＳ・アウレウスの！販濁液（０，Ｄ
、ｕｎｍ＝　１．０）を１　：　１０００にて試料緩衝
液中に希釈した。保護した膜を１ｍ！！の希釈懸濁液に
対し間８；ｚ的に緩和に撹拌しながら２０分間露出させ
た。

５、膜を洗浄し、栄養寒天板の表面に施こし、かつ実施
例工における工程５の記載と同様に１晩培養した。

６．３・アウレウスのコロニーが、ＩＣＩＧを施こした
部位に観察された。

実施例　■： この実施例においては、分析物成分（ウサギＩ　ｇＧ）
も分析物特異成分（ヤギ坑つサキＩＣＩＧＦａｂ’　２
＞も増殖することができない。信号成分（Ｓ・アウレウ
ス）を分析物成分に結合させた。

１、　　ＰＢＳにおけるヤギ坑ウサギＴｑＧ（Ｆａｂ’
　　２＞の３種の１ｍｆ！試料を４．Ｘ４Ｃｍのニトロ
セルロース膜に三角形パターンで施こした。この膜を風
乾させた。

２、膜を実施例工の工程２におけると同様に保護した。

３、膜をＰＢＳで３回洗浄し、ウサギＩＣＩＧを次のよ
うに検出した： ４、保護した膜を希釈緩衝液におけるウサギＩｇＧの溶
液（１０μ９／ｍｌ）に対し間歇的に緩和に撹拌しなが
ら２０分間露出させた。

５、膜をＰＢＳで３回洗浄した。

６、ＰＢＳ中の生存しうるＳ・アウレウスの懸濁物を実
施例■の工程４におけると同様に作成した。この膜を上
記の懸濁物に露出させた。

７、膜を実施例■の工程５に記載したと同様に処理した
。

８、工程４における溶液かウサギＩＣＩＧを含有する場
合のみ、Ｓ・アウレウスのコロニーかヤギ坑ウサギ■Ω
Ｇ（Ｆａｂ’　　２＞を施こした部位に観察された。Ｉ
ＱＧが存在しない場合、或いはヤギＩｃ＋Ｇか存在する
場合、コロニーは観察されなかった。

実施例　Ｉｖ： この実施例においては分析物成分（ビオチニル化牛血清
アルブミン）も分析物特異成分（アヒジン）も増殖する
ことができななつだ。Ｓ・マルセッセンスを信号成分と
して作用させた。後者を架橋成分（Ｓ・マルセッセンス
に対するビオチニル化抗体）によって分析物特異成分に
結合させた。

１、ビオチニル化生血清アルブミン（ＰＢＳ中の１．５
ｍＭｍ＞の３種の１μｅ試料を４　ｘ　４　ｃｍの二１
〜ロセルロース膜に三角形パターンで施こした。この膜
を風乾させた。

２、膜を実施例Ｔの抗体２におけると同様に保護した。

３、この膜をＰＢＳ中で洗浄した。ビオチニル牛血清ア
ルフミンを検出するため、次の手順を行なった： ４、最初に、膜をアビジンの溶液（試料緩衝液中１０μ
９／成）に対し間歇的に緩和に撹拌しながら３０分間露
出さ一μた。

５、膜をＰＢＳで４回洗浄して、未結合のアビジンを除
去した。

６、次いで、この膜を１ｄのビオチニル化坑−・マルセ
ッセンス抗体（試料緩衝液中１０μ９／ｍｆりに対し室
温にて間歇的に緩和に撹拌しながら室温で露出させた。

７、膜をＰＢＳ中で４回洗浄して、未結合の抗体を除去
した。

８、最後に膜をＳ・マルセツセンスの懸濁液１ｍ１（試
料緩衝液にお（プる原懸濁液０．Ｄ、ａｎｎｍ−１，０
の１　：　１０００希釈物）に対し室温にて間歇的に緩
和に撹拌り、なから３０分間露出させた。

９、この膜をＰＢＳで４回洗浄して、未結合の微生物を
除去した。これを栄養寒天板の表面に施こした。この寒
天板を倒置しかつ室温にて１晩培養した。

１０、三角形のパターンでＳ・マルセツセンスの３個の
明確な赤色コロニーが、ビオチニル化ＢＳＡを施こした
部位に観察された。

本発明の思想および範囲を逸１１（（することなく多く
の変更、改変をなしうろことが当業者には了解されよう
。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）分析物成分の存在を検出するに際し、（ａ）（ｉ
   ）少なくとも分析物成分もしくは分析物特異成分が独立
   して増大しうるよう な分析物特異成分に複合化された分析物 成分、および （ｉｉ）複合体が、独立して増大しうる第１信号成分、
   先駆体を栄養物に変換しうる 触媒および栄養物を含有するキャリヤよ りなる群から選択され、かつ前記複合体 に結合する実体をさらに備えてなる分析 物特異成分に複合化され分析物成分 よりなる群から選択される複合体を形成し、（ｂ）（ｉ
   ）分析物成分が独立して増大しうるような分析物成分、 （ｉｉ）分析物特異成分が独立して増大し ような分析物特異成分、 （ｉｉｉ）独立して増大しうる第１信号成分、（ｉｖ）
   触媒を先駆体と接触させて栄養物を生ぜしめかつこの栄
   養物をこの栄養物と の接触に際し増大しうる第２信号成分と 接触させる触媒、および （ｖ）キャリヤをこのキャリヤの内容物と の接触に際し増大しうる第３信号成分と 接触させる栄養物を含有するキャリヤ よりなる群から選択される手段によって前記分析物成分
   の存在を検出する ことを特徴とする分析物成分の存在の検出方法。
2. （２）（ａ）分析物成分が独立して増大しうるような分
   析物成分を増大させ、 （ｂ）分析物特異成分が独立して増大しうるような分析
   物特異成分を増大させ、 （ｃ）第１信号成分を増大させ ることよりなる群から選択される手段によって検出工程
   を行なう特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）第１信号成分と第２信号成分と第３信号成分とを
   、生存しうる信号成分および生存しえない信号成分より
   なる群から選択する特許請求の範囲第１項記載の方法。
4. （４）第１信号成分と第２信号成分と第３信号成分とが
   生存可能である特許請求の範囲第３項記載の方法。
5. （５）（ａ）分析物特異成分に複合化した分析物成から
   なる複合体、および 信号成分が独立して増大しうるような前記 複合体に結合した信号成分からなる実体を 形成し、 （ｂ）前記信号成分によって分析物成分の存在を検出す
   る ことを特徴とする分析物成分の存在を確認する方法。
6. （６）独立して増大しうる信号成分を分析物特異成分に
   結合させる特許請求の範囲第５項記載の方法。
7. （７）独立して増大しうる信号成分が生存可能である特
   許請求の範囲第５項記載の方法。
8. （８）生存可能な信号成分を微生物、真菌類、藻類、植
   物細胞および動物細胞よりなる群から選択する特許請求
   の範囲第７項記載の方法。
9. （９）微生物をスタフィロコッカス、ミコプラズマ、イ
   ー・コリ、バチルス、ストレプトミセス、キャンジダ、
   ウィルス、リケッチャおよびファージよりなる群から選
   択する特許請求の範囲第８項記載の方法。
10. （１０）信号成分による分析物成分の検出を前記信号成
    分の増大によって行なう特許請求の範囲第５項記載の方
    法。
11. （１１）独立して増大しうる信号成分を信号成分特異性
    の成分によって複合体に結合させる特許請求の範囲第５
    項記載の方法。
12. （１２）信号成分特異性の成分を蛋白質、抗体、坑原、
    リセプタ、ホルモン、ポリペプチド、リガンド、ハプテ
    ン、ポリヌクレオチドおよび核酸よりなる群から選択す
    る特許請求の範囲第１１項記載の方法。
13. （１３）分析物成分をリガンド、リセプタ、蛋白質、抗
    体、坑原、核酸、ポリヌクレオチド、微生物、ウィルス
    、ファージ、細菌類、真菌類、藻類、アレルゲン、動物
    細胞および植物細胞よりなる群から選択する特許請求の
    範囲第５項記載の方法。
14. （１４）分析物成分がポリヌクレオチドである特許請求
    の範囲第５項記載の方法。