SU1521775A1

SU1521775A1 - Способ получени иммобилизованной галактозооксидазы

Info

Publication number: SU1521775A1
Application number: SU874288226A
Authority: SU
Inventors: Людмила Владимировна Кондакова; Валентин Анатольевич Тертых; Виктор Васильевич Янишпольский; Татьяна Трифоновна Буглова; Ольга Владимировна Скоробогатько
Original assignee: Институт Химии Поверхности Ан Усср
Priority date: 1987-07-21
Filing date: 1987-07-21
Publication date: 1989-11-15

Abstract

Изобретение относитс к биотехнологии, а именно к способам иммобилизации ферментов на неорганических носител х, и может быть использовано дл определени галактозосодержащих углеводов в пищевой промышленности и медицине. Цель изобретени - упрощение способа и увеличение активности иммобилизованной галактозооксидазы. Способ заключаетс в смешивании буферного раствора галактозооксидазы с кремнеземом, содержащим аминопропильные группы, в присутствии 0,9-2,88 г галактозы на 1 г носител , при этом галактоза окисл етс ферментом до 2,4-галактогексодиальдозы, котора обеспечивает сшивку фермента с носителем. Положительный эффект достигаетс при добавлении 80-115 ед. активности фермента на 1 г носител . Использование способа упрощает процесс иммобилизации и увеличивает активность целевого продукта. 1 табл.

Description

Изобретение относитс к биотехнологии , в частности к способам иммобилизации ферментов на неорганическом носителе , и может быть использовано дл определени галактозрсодержащих углеводов в пищевой промьшшенности (молочной, сахарной, спиртовой) и медицине .

. Цель изобретени - упрощение способа и увеличение активности иммобилизованной галактозооксидазы.

Способ заключаетс ь смешивании галактозооксидазы , кремнезема, содержащего аминопропиловые группы, и галактозы при соотношении компонентов: на 1 г носител 0,9-2,88 г галактозы и 80-120 международных единиц фермента. После инкубации трех компонентов в буферном растворе в течение 2-х ч при комнатной температуре целевой продукт отмывали буфером от несв зывающегос белка. Веро тно, в этих услови х происходит превращение галактозы под действием фермента в 2,4-галактогексоди- альдозу, котора выступает в роли стк- вающего реагента и обеспечивает св зыСП

ьо

«vl СП

вание фермента с аминокремнеземом. Полученные препараты обладают повышенной активностью, а сам способ значительно упрощаетс за счет проведени иммобилизации в одну стадию (вместо предварительной активации носител и последующей иммобилизации), а также исключени стадии обработки хлористым циануром.

П р и м е р 1. 1 г аминоорганокрем иезема инкубируют с 50 мл буферного раствора галактозооксидазы, содержащего 46 ед. активности, и с 50 мл буферного раствора галактозы, содержащего О,.36 г галактозы. Дл 1 г носител обычно готов т 100 мл смеси. Инкубацию провод т в течение 2 ч при комнатной температуре. Количество буферного раствора не имеет существенного значени .. Декантацией раствор удал ют а после того носитель отмывают от несв зывающегос фермента небольшим количеством 0,05 М фосфатного буфе

ра (рН 7,0). Активность иммобилизован

ной галактозооксидазы определ ют , как описано ниже. Активность полученного иммобилизованного препарата составл ет 9 ед/г носител .

Прим еры 2- 13. Все опрера- ции провод т в соответствии с предла гаемым способом дашобилизации галактозооксидазы при соотношени компонентов , указанных, в таблице.

.Из данных, приведенных в таблице,. видно, что активность иммобилизованно го препарата зависит от соотношени вз тых компонентов. В результате взаимодействи носител , галактозооксидазы и субстрата (галактозы), образуетс иммобилизованный фермент, так как активность иммобилизованного фермента сохран етс в течение 2 мес в услови х проточного реактора (при пропускании 50 л буфера и 1000-кратного объе -

1.Способ получени иммобилизованной галактозооксидазы, включающий взаимодействие галактозооксидазы, кремнезема, содержащего на поверхности аминопропиловые группы, и вещества , инициирующего св зывание фермента с кремнеземом, в буферном растворе и промывку препарата дл удалени несв зывающегос фермента, о т л и ма субстрата). Стабильность препара- 45 чающийс тем, что, с целью та не отличаетс от стабильности фермента , иммобилизованного ковалентно известным способом. Без добавлени галактозы наблюдаетс десорбци фермента при промывании 2 объемами 0,05N50 мом, используют продукты превращени фосфатного буфера (рН 7,0). Актив- Субстрата галактозооксидазы - галак- ность иммобилизованной галактозооксидазы определ ют следующим образом. В термостатированную при 25°С чейку с

упрощени способа и увеличени активности иммобилизованной галактозооксидазы , в качестве вещества инициирующего св зывание фермента с кремнезетозы , устанавлива соотношение галактоза: кремнезем (0,9-2,88) : 1 fno массе 2. Способ по п.1, о т л и ч а ю кислородным электродом Кларка, содер- щ и и с тем, что на 1 г кремнезема жашую 5,5 мл 100 мМ раствора галакто- добавл ют 80- 115 Е фермента.

0

зы со 100 мкМ феррицианида кали и 1 мМ Na ЭДТА в 0,05 М фосфатном буфере (рН 7,0), внос т 0,01 г иммобилизованного фермента и регистрируют на ленте самописца кинетику потреблени кислорода (1 ед.активности соответствует количеству фермента, катализирующего окисление 1 мкмоль субстрата за 1 мин).

Анализ данных, приведенных в таблице ,, показывает, что повышение активности наблюдаетс при добавлении 0,9-2,88 г галактозы на 1 г носител . 11овьш1ение концентрации галактозы до 3,24 г не приводит к увеличению активности целевого продукта, а снижение концентрации галактозы до 0,18 и 0,36 г вызывает уменьшение активности фермента. Увеличение активности иммобилизованной галактозооксидазы наблюдаетс при указанной концентрации галактозы и при добавлении 80- 115 ед активности фермента на 1 г

Таким образом, предлагаемый способ позвол ет упростить процесс получени иммобилизованной галактозооксидазы за счет исключени р да стадий , а также увеличить активность це- 30 левого продукта от 59-75 до 75-89 ед. 1 г (в зависимости от количества использованного фермента).

Claims

1.Способ получени иммобилизованной галактозооксидазы, включающий взаимодействие галактозооксидазы, кремнезема, содержащего на поверхности аминопропиловые группы, и вещества , инициирующего св зывание фермента с кремнеземом, в буферном растворе и промывку препарата дл удалени несв зывающегос фермента, о т л и чающийс тем, что, с целью мом, используют продукты превращени Субстрата галактозооксидазы - галак-

чающийс тем, что, с целью мом, используют продукты превращени Субстрата галактозооксидазы - галак-

упрощени способа и увеличени активности иммобилизованной галактозооксидазы , в качестве вещества инициирующего св зывание фермента с кремнезечающийс тем, что, с целью мом, используют продукты превращени Субстрата галактозооксидазы - галак-

тозы, устанавлива соотношение галактоза: кремнезем (0,9-2,88) : 1 fno массе).

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю Примечание . По примереам 1Д-18 иммобилизаци по известному способу.