JPS61256259A - 免疫学的分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、サンプル中の複数種類の被検物質を同時に定
量分析する免疫学的分析方法に関するものである。

〔従来技術〕

免疫学的反応を利用して各種生体成分を定量分析する方
法が実用化され、生体成分の分析結果は各種疾患の早期
診断や薬物投与計画の作成に役立っている。

一方、各種疾患の診断には複数の生体成分の分析結果を
利用する場合がある。例えば糖尿病の診断ではブドウ糖
負荷前後におけるインシュリンの変化量へインシュリン
及びグルコースの変化量Δグルコースとを共に測定し、
Δインシュリン、／Δグルコース値を求め、このΔイン
レユリン／Δグルコース値を利用して診断を行なってい
る。また、肝臓病疾患の診断においては血清中のα−フ
ェ１−プロテインロ及びＧＰＴｌ、ＧＯＴＩを検出して
診断を行なっている。従って、サンプル中の複数の被検
物質を同時に定量分析できる免疫学的分析方法の開発が
強く要請されている。

サンプル中に含まれる複数種類の生体成分を同時に定量
する方法として、サンプル中の特定の被検物質と特異的
に抗原抗体反応を起す複数種類の抗原又は抗体を不溶性
担体にそれぞれ固相化し、複数種類の抗原抗体反応を同
時に進行させ、Ｂ・Ｆ分離した後各被検物質をそれぞれ
別々に定量分析する方法が提案されている。しかし、こ
の分析方法は、特異的な抗原抗体反応をおこす複数種類
の被検物質を分析する場合だけに適用され、グルコース
、ＧＯＴ、ＧＰＴのように生化学反応に基いて分析され
る生体成分を同時に定量分析することは不可能である。

〔発明が解決しようとする問題点］ 上述したように糖尿病の診断では、血液中に含まれるイ
ンシュリン及びグルコースをそれぞれ定量分析し、これ
らの分析結果を用いて診断を行なっている。しかし、血
液中に含まれるインシュリンは抗原抗体反応を利用して
定温分析され、グルコースは酵素を融媒とする生化学反
応に基いて定量分析されるため従来の分析装置ではサン
プル中のインシュリン及びグルコースを同時に定量分析
することが不可能であった。このため免疫学的分析装置
及び生化学分析装置の２台の分析装置を用いてインシュ
リン及びグリコースをそれぞれ別々に定量分析しなけれ
ばならず、分析操作が煩雑になり、検体や分析結果を取
り達えたりする種々のトラブルを発生する欠点があった
。更に２台の分析装置を用いるため、装置のコストが高
価になると共に２台分のスペースを必要とする欠点もあ
った。特にグルコースは数分〜数十分で分析結果が得ら
れるのに対し、インシュリンは数時間〜数十時間を要す
るので上述したトラブルが発生し易くなっている。

従って、本発明の目的は上述した欠点を除去し、１台の
分析装置でサンプル中の免疫学的反応によって定員され
る被検物質と生化学反応によって定量される被検物質と
を同時に定量分析できる免疫学的分析方法を提供するも
のである。

（問題点を解決するための手段） 本発明による免疫学的分析方法は、サンプル中に含まれ
る複数の被検物質を同時に分析するにあたり、免疫学的
反応に基いて定量される第１の被検物と特異的に抗原抗
体反応を起こす抗体又は抗原を固相化した不溶性担体と
、非免疫学的反応に基いて定量される第２の被検物質に
作用する試薬とを共存させて反応試薬とし、この反応試
薬とサンプルとを反応させて得られる反応液に基いてサ
ンプル中の第２被検物質を定量すると共に、前記担体に
結合した第１被検物質を定量して第１被検物質を定ｍす
ることを特徴とするものである。

〔作　用〕

本発明では、サンプル中に含まれる免疫学的反応に基い
て定量される第１の被検物質と特異的に抗原抗体反応を
起す抗体又は抗原を固相化した不溶性担体と、サンプル
中に含まれる生化学反応に基いて定量される第２の被検
物質に特異的に作用する発色試薬とを共存させて反応試
薬とする。そして、反応容器内でサンプルと反応試薬と
を反応させ、免疫学的反応と生化学反応とを同時に進行
させる。反応終了後に反応液を比色測定して第２の被検
物質を定ｌする。次に洗浄によってＢ−Ｆ分離打ない担
体に結合した第１被検物質を定量してサンプル中の第１
被検物質の量を求める。このように構成することにより
、免疫学反応と生化学反応とを同時に進行させると共に
サンプル中の第１及び第２の被検物質をそれぞれ別々に
取り出して定量するため、第１及び第２の被検物質を同
時且つ正確に定量分析することができる。

〈実施例） 本例では第１の種類の被検物質であるインシュリン及び
第２の種類の被検物質であるグルコースを同時に定量分
析する場合について説明５゛る。インシュリンは特異的
な抗原抗体反応を利用、１゛るヘテロジニアス酵素免疫
分析法により定量し、グルコースは酵素触媒の存在下に
お【プる発色作用を利用した生化学反応により定ｍを行
なう。

第１図はインシュリンを定量するためのへテロジニアス
酵素免疫分析法の過程を示す線図である。

不溶性担体１にサンプル中のインシュリン（抗原）と特
異的に抗原抗体反応を起す抗体を予め固相化し、この担
体１とサンプル中のインシュリン２により抗原抗体反応
を行なわせてサンプル中のインシュリン２を担体１に結
合させる。次に１回目のＢ−Ｆ分離を行なって反応によ
り担体１に結合したインシュリンと未反応のインシュリ
ンとを分離する。次に担体１をインシュリン２と抗原抗
体反応を起す物質を酵素で標識した標識試薬３と作用さ
せて抗原抗体反応を行なわせ、その後第２回目のＢ−Ｆ
分離を行なってから結合した酵素標識試薬３と反応する
発色試薬を加えて反応させた後、その反応液を比色測定
して標識酵素の酵素活性を求めてインシュリン２を定量
する。尚、担体１とサンプル中のインシュリン２とを反
応させるに際し、リン酸塩等によりｐ　）−１７，０前
後の中性付近に緩衝化した溶液にアルブミン等の蛋白質
や塩化ナトリウム等の塩類を含ませた緩衝液を用い、こ
の緩衝液のもとで担体１とサンプル中のインシュリンと
を反応させる。

次にグルコースの定量について説明する。グルコースの
定量原理は次式に基く。

ＧＯＤ グルコース＋０２　＋Ｈ２０→ グルコン酸十８２０２ Ｈ２０２＋４・アミノアンチピリン＋ ＯＤ フェノール−酸化縮合体＋Ｈ２０ リン酸塩等によりｐ　Ｈ７，０前後の中性付近に緩衝化
された溶液にグルコース酸化酵素（ＧＯＤ）とペルオキ
シダーゼ（ＰＯＤ＞の２種類の酵素、４−アミノアンチ
ピリン及び色原体であるフェノールを含むグルコース測
定試薬にサンプルを加えて反応させる。反応により酸化
縮合体が生成され、生成した酸化縮合体とフェノールと
により発色が生ずるので、比色測定により酸化縮合体の
生成量を求め、グルコース量を定量する。尚、触媒酵素
としてヘキソキナーゼ（ＨＫ）とグルコース−６−リン
酸脱水素酵素（Ｇ−６−ＰＤＩ−１）との２種類の酵素
の組合せでもよい。

本発明では固相化担体、緩衝液及びグルコース測定試薬
を共存させて反応試薬とし、この反応試薬とサンプルと
を反応させて１回目の反応を行なわせる。担体１に固相
化した抗体は特異的にサンプル中のインシュリンとだけ
抗原抗体反応を起こすからグルコース測定試薬に含まれ
る酵素と反応することなく共存でき、グルコース測定試
薬に含まれる酵素もインシュリンに対して作用すること
がなく共存できる。従って、反応中においてサンプル中
のインシュリンは担体１と抗原抗体反応を起こし、グル
コースは上述した過程を経て酸化縮合体を生成し発色現
象を呈する。反応後、反応液を比色測定してグルコース
を定理する。次にＢ・Ｆ分離を行なってから、２回目の
抗原抗体反応を行ない担体１に結合したインシュリンと
標識試薬３とを反応させる。次に２回目のＢ−Ｆ分離を
行なった後発色試薬を加えて反応させ、その反応液を比
色測定してサンプル中のインシュリンを定量する。

次に免疫学的自動分析装置を用いて本発明の詳細な説明
する。本例では以下の成分の反応試薬液を用いる。

１０ｍ　Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，０）牛アルブミン
　　：１０ｎ＋ａ／ｌぶ 塩化ナトリューム：　　８ｍｇ／ｍぶ ＰＯＤ：　　０，８Ｕ／ｎ＋２ ＧＯＤ　　：　　１０Ｕ／ｍ　　ｎ ４−アミノアンチピリン：　４８ｍ（１／ｍ℃７ｘノー
ル：　　８５Ｑｍ（］／Ｉｎ　！Ｑ。

第２図は本発明を実施するため酵素免疫自動分析装置の
一例の構成を示す線図である。

本例では反応ラインをシングルとして単一項目を分析す
る。反応容器は大口部１１ａおよび小口部１１ｂを有す
るＵ字管１１を２４個用い、これらを反応管ディスク１
２の同一円周上に等間隔に保持する。

反応管ディスク１２はＵ字管１１を恒温槽１０（第４図
）に浸しながら水平面内で矢印で示す方向に所定のピッ
チ（例えば１５秒）で間欠的に回動させる。この反応管
ディスク１２の間欠的回動によりＵ字管１１の定位置を
符号８１〜Ｓ２４で示す。本例では停止位置＄１にある
Ｕ字管１１に、サンプル分注装置１３によりサンプラ１
４の所定のサンプル吸引位置にあるサンプルカップ１５
からサンプルを選択的に分注する、なおサンプラ１４は
反応管ディスク１２に保持するＵ字管数と同数の２４個
のサンプルカップを同一円周上に等間隔に保持し、−反
応管ディスク１２の回動と同期して矢印方向に間欠的に
回動する。

また、停止位置Ｓ３にあるＵ字管１１には酵素標識試薬
分注装置１６によりサンプル中のインシュリンと抗原抗
体反応を起こす酵素標識試薬１７を選択的に分注し、停
止位＠Ｓ　４にあるＵ字管１１には発色試薬分注装置１
８により発色試薬１９を選択的に分注する。更に、停止
位置Ｓ１７にあるＵ字管１１にはその大口部１１ａから
担体投入器２０に多数収容されているプラスチック等の
合成樹脂やガラスピーズ等の不溶性の担体２１を１個選
択的に投入する。

なお、担体２１はＵ字管１１の大口部１１ａから容易に
出し入れでき、かつ小口部１１ｂには入らない大きさと
し、その表面には上述したようにサンプル中の被検物質
と抗原抗体反応を起こす抗体または抗原を予め固定化し
ておくと共に、担体投入器２０内においては緩衝液で湿
潤させておく。

また、停止位置８１９にあるＵ字管１１からは、これに
収容されている反応液を比色計２２に選択的に吸引しサ
ンプル中のインシュリン及びグルコースの儂を比色測定
する。更に停止位置８２０にあるＵ字管１１からは、こ
れに収容されている担体２１を担体取出器２３により選
択的に取出して排出する。

更にまた、停止位置Ｓ２２にあるＵ字管１１には洗浄ポ
ンプ２４により、イオン交換水、免疫分析用緩衝液、生
理食塩水等の洗浄液を選択的に注入し、また停止位置８
２４にあるＵ字管には反応試薬液分注装置２５により前
述した成分の反応試薬液２６を選択的に分注する。更に
、停止位置８２〜Ｓ５にある各々のＵ字管１１は、その
小口部１１ｂをそれぞれ共通の攪拌用エアーポンプ２７
に着脱自在に連結し、同様に停止位置８２２および８２
３にある各々のＵ字管１１はその小口部１１ｂをそれぞ
れ共通の排液ポンプ２８に着脱自在に連結する。

次に、第２図に示す酵素免疫自動分析装置の動作を第３
図Ａ−Ｅを参照しながら説明する。

反応管ディスク１２の１回転目においては、先ず停止位
置８１７において第４図Ａに示すように担体投入器２０
から緩衝液で湿潤されている担体２１を順次０字管１１
に、その大口部１１ａから１個ずつ投入する。担体２１
が投入されたＵ字管１１には、停止位置８２２において
洗浄ポンプ２４の作動によりその大口部１１ａから洗浄
液をシャワー状に間欠的に注入すると共に、この洗浄液
を廃液ポンプ２８の作動により小口部１１ｂを経て吸引
排出してＵ字管１１を洗浄し、次の停止位置８２３にお
いて更に小口部１１ｂを経て排液ポンプ２８により吸引
することにより洗浄液をほぼ完全に排出する。このよう
にＵ字管１１を洗浄することにより、予め担体２１に湿
潤した緩衝液を洗い流し、後段の反応試薬分注後のＵ字
管１１内の反応試薬量を一定に保つ。次に、第４図Ｂに
示すように停止位置Ｓ２４において反応試薬液分注装置
２５により反応試薬液２６を大口部１１ａから一定量分
注した後、停止位置Ｓ１においてサンプル分注装置１３
により、サンプラ１４の所定のサンプル分注装置にある
サンプルカップ１５から一定量のサンプルを大口部１１
ａから分注する。停止位置Ｓ１においてサンプルが分注
されたＵ字管１１は、次の停止位置Ｓ２においてその小
口部１１ｂを攪拌用エアーポンプ２７に連結し、該エア
ーポンプにより小口部１１ｂを経てエアーを噴出させる
ことによりＵ字管１１内に収容された担体２１、反応試
薬液２６およびサンプルを攪拌して１回目の抗原抗体反
応を開始させる。この攪拌は停止位置８３゜Ｓ４および
Ｓ５においても順次行なう。なお、担体投入器２０、反
応試薬液分注装置２５、サンプル分注装置１３およびサ
ンプラ１４は各Ｕ字管に対して１回作動させた後は不作
動にしておく。

Ｕ字管１１が停止位置Ｓ１７において担体２１を受けて
から１回転して再び停止位置８１７に移動した後の２回
転目においては、第３図Ｃに示１ように先ず停止位置１
９においてサンプル中のグルコースと反応試薬２６中の
グルコース測定試薬との反応による発色ωを比色測定す
る。比色測定は、Ｕ字管１１内の反応液を比色計２２に
吸引して行なう。比色計２２は、例えば第３図Ｃに示す
ように反応液を通すフローセル２２ａを介して光源２２
ｂおよび検知器２２ｃを配置し、光源２２ｂからの光を
５００ｎｍの波長だけを透過する緩衝フィルタ２２ｄを
介してフローセル２２ａに投射し、該フローセル２２ａ
からの透過光をライトガイド２２ｅを経て検知器２２ｃ
で受光４るように構成する。

次に停止位置Ｓ　２２に移動して第３図Ｃに示すように
Ｕ字管１１内の反応液を小口部１１ｂを経て排液ポンプ
２８により吸引して排出すると共に、大口部１１ａから
洗浄ポンプ２４により洗浄液をシャワー状に間欠的に分
注し、この分注された洗浄液を、該停止位置Ｓ２２およ
び次の停止位置８２３において同様に小口部１１ｂを経
て排液ポンプ２８により吸引して排出することによりＵ
字管１１および担体２１を洗浄して第１回目のＢ−Ｆ分
離を行なう。このＢ−Ｆ分離によりＵ字管１１内には担
体２１及び担体２１に結合したインシュリンだけが存在
する。その後停止位ＭＳ３において第３図りに示すよう
に大口部１１ａから酵素標識試薬分注装置１６により酵
素標識試薬１７を一定量分注すると共に、該停止位置Ｓ
３および次の順次の停止位置８４．８５において小口部
１１ｂから攪拌用エアーポンプ２７によりエアーを噴出
させて担体２１と酵素標識試薬１７とを撹拌し、２回目
の抗原抗体反応を開始させる。

このように、停止位置Ｓ３において酵素標識試薬１７の
分注を受けて第２回目の抗原抗体反応を開始したＵ字管
１１が、停止位置Ｓ＋７に移動して３回転目に入ったら
、停止位置８２２およびＳ２３において上述したと同様
に洗浄ポンプ２４による洗浄液の分注および排液ポンプ
２８によるＵ字管１１内の反応液および分注された洗浄
液の吸引排出を？テなってＵ字管１１および担体２１を
洗浄して第２回目のＢ−Ｆ分離を行なう。次に、停止位
置８４において第３図Ｅを示すように大口部１１ａから
試薬分注装置１８により発色試薬１９を一定量分注する
と共に、該停止位置Ｓ４および次の停止位置Ｓ５におい
て攪拌用エアーポンプ２７によりエアーを噴出させて担
体２１と発色試薬１９とを攪拌して、担体２１に結合し
た酵素標識試薬１７中の標識酵素と発色試薬１９との反
応を開始させる。

発色試薬１９の分注を受けたＵ字管１１が、停止位置８
１７に移動して４回転目に入ったら、先ず停止位置Ｓ’
９においてＵ字管１１内の反応液を比色計２２に吸引し
て比色測定する。比色計２２はグルコースの定量を用い
た比色計を用いるが、干渉フィルタ２２ｄを発色試薬１
９の吸収ピーク波長である４３５ｎｍの波長光を透過さ
せるフィルタに自動的に切り換えて比色測定を行なう。

次に、停止位置Ｓ２０においてＵ字管１１内に残存する
担体２１を大口部１１ａから担体取出器２３により取出
す。その後、停止位＠８２２において洗浄ポンプ２４に
より洗浄液をシャワー状に間欠的に分注すると共に、こ
の分注された洗浄液を該停止位置３２２および次の停止
位置Ｓ２３において排液ポンプ２８により吸引排出して
ＬＪ　′ｒ−管１１を洗浄し、次のサンプル分析におけ
る担体の投入に備える。

このように、本実施例では免疫学的反応によって定量６
れる第１被検物質と生化学反応よって定量される第２被
検物質とを共に比色測定により定量する構成としている
から、装置全体を小型かつ構成が簡単でしかも安価にで
きる。

尚、本発明は上述した実施例だけに限定されるものでは
なく幾多の変更や変形が可能である。例えば上述した実
施例では血液中のインシュリンとグルコースとを同時に
定量する例を以って説明したが、インシュリン及びグル
コースだけに限定されるものではなく例えば肝臓疾患の
診断に利用される血清中のα〜フェトプロティンとＧＰ
Ｔ、Ｇ○Ｔとを定量分析する場合にも本発明による免疫
学的分析方法を用いることができる。

また、上述した実施例ではサンプル中の免疫学的反応に
より定量される１種類の被検物質と生化学反応によって
定量分析される１種類の被検物質とを同時に定量分析す
る例について説明したが、免疫学的反応によって定」さ
れる被検物質は複数種類の被検物質であってもよい。こ
の場合被検物質と特異的に免疫反応を起す抗原又は抗体
をそれぞれ固相化した複数の担体を用いればよい。

更に、上述した実施例ではサンドウィッチ法によりイン
シュリンを定量する構成としたが、競合法による定量す
ることも可能である。この場合には生化学反応に作用し
ない標識酵素を選択する必要がある。

更に、上述した実施例では、標識物質として標識酵素用
いたが、放射性同位元素、螢光物質等を標識酵素として
用いることもできる。また、生化学反応も酵素反応だけ
に限られるものではない。

〔発明の効果〕

以上説明し°たように本発明によれば、免疫学的反応に
基いて定量される第１の被検物質と特異的に反応する抗
原又は抗体と、生化学反応によって定量される第２の被
検物質に作用する試薬とを共存させて反応試薬としてい
るから、反応容器内で免疫学的反応と生化学反応とを同
時に進行させることができ、しかも反応した第１及び第
２の被検物質をそれぞれ別々に取り出して定量している
から、サンプル中の免疫反応により定量される被検物質
と生化学反応によって定量される被検物質とを同時に正
確に定量分析できる。

この結果、１台の分析装置によって免疫反応によって定
量される被検物質と生化学反応によって定量される被検
物質とを同時に定量分析できるので、分析操作が簡単に
なり、検体の取り違え等のトラブルを回避できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はインシュリンを定量するためのへテロジニアス
酵素免疫分析法の過程を示す線図、第２図は本発明を実
施する酵素免疫自動分析装置の一例の構成を示す絵図、 第３図Ａ−Ｅはその動作を説明するための線図である。 １０・・・恒温槽　　　　　１１・・・Ｕ字管１２・・
・反応管ディスク　１３・・・サンプル分注装置１４・
・・サンプラ　　、１５・・・サンプルカップ１６・・
・酵素標識試薬分注装置 １７・・・酵素標識試薬　　１８・・・発色試薬分注装
置１９・・・発色試薬　　　　２０・・・担体投人器２
１・・・担体　　　　　　２２・・・比色計２３・・・
担体取出器　　　２４・・・洗浄ポンプ２５・・・反応
試薬液分注装装置 ２６・・・反応試薬液　　　２７・・・攪拌用エアーポ
ンプ２８・・・排液ポンプ 第１ （Ｍ原ＭＬんト反央０（４九原１官本反広９図 第３図 Ａ 第３図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、サンプル中に含まれる複数の被検物質を同時に分析
   するにあたり、免疫学的反応に基いて定量される第１の
   被検物と特異的に抗原抗体反応を起こす抗体又は抗原を
   固相化した不溶性担体と、非免疫学的反応に基いて定量
   される第２の被検物質に作用する試薬とを共存させて反
   応試薬とし、この反応試薬とサンプルとを反応させて得
   られる反応液に基いてサンプル中の第２被検物質を定量
   すると共に、前記担体に結合した第１被検物質を定量し
   て第１被検物質を定量することを特徴とする免疫学的分
   析方法。