JPS58225355A - 免疫分析法およびこれに用いる反応容器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は免疫分析法およびこれに用いる反応容器に関す
るものである。 抗原−抗体反応は、特定の抗原と抗体との間に起る特異
的な反応であり、これを利用して測定した１１１

【液あ
るいは体液中の微量抗ｗ、（抗体）量は、診断や治療に
供されている。この抗原−抗体反応による分析法には、
測定対象の抗原または抗体を定量する際に用いる標識物
質の種類から、放射性同位元素を用いるラジオイムノア
ッセイ、酵素を用いるエンザイムイムノアッ七イ、螢光
物質を用いるフローイムノアッセイがあり、なかでもラ
ジオイムノアッセイは高感度な分析法として知られてい
る。いずれの分析法においても測定対象である抗原（抗
体）を定量する際にその抗原（抗体）および標識抗体（
抗原）の結合物と、遊離標識抗原（抗原）とのいわゆる
Ｂ−ｆ分離が必要となり、例えばラジオイムノアッセイ
による免疫分析装置として、流入口と流出口とを有し、
測定対象の抗原または抗体と特異的に反応する抗体また
は抗原を固相化した反応容器（ｃｈａｍｂｅｒ　）を用
いてＢ・ｆ分離を行なうようにした貫流形のものが知ら
れている。この装置においては、例えばサンプル中の所
定の抗原を定量する場合は、反応容器として測定抗原に
反応する抗体を固相化したものを用い、先ずこの反応容
Ｈ（ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｃｈａｍｂｅｒ　）　ノ流入［
Ｊに連結されたチューブ内で第１図Ａに示すようにサン
プルと放射性同位元素で標識された抗原とを混合して、
第１図Ｂに示す測定対象の抗原に対応する固相化した抗
体を有する反応容器に送り、ここで第１図０に示すよう
にサンプル内の抗原と標識抗原とを競合させて固相化抗
体に結合させ、同相化抗体に捕捉されなかった遊離抗原
は、反応容器の流出口を経てシンチレーションカウンタ
に送って遊離標識抗原をその放射能によって計数する。 次に、反応容器内の固相化抗体に捕捉された結合抗原を
溶離緩衝液により固定化抗体から溶離させ、この溶離し
た抗原を第１図りに示すように反応容器の流出口を経て
シンチレーションカウンタに送って標識抗原をその放射
能によって計数する。このようにして、第２図に示すよ
うな放射能特性を得、その両ピーク値すなわち固相化抗
体に捕捉されなかった遊離標識抗原の計数値のピーク値
と、捕捉されて溶離された標識抗原の計数値のピーク値
との比較に基いてサンプル中の所定の抗原を定量する。 しかし、かかる分析装置は、貫流形で、固相化抗体を有
する反応容器を繰返し再生して使用するため、同時に多
数のサンプルの処理ができない欠点があると共に順次の
サンプルの分析においてコンタミネーションを起したり
、固相化抗体の活性が低ドして精度よく分析することが
内鍵となる欠点がある。また、サンプルと標識抗原とを
反応容器の流入口に連結したチューブ内で混合するため
、比較的長いチューブが必要となり、コンタミネーショ
ンだけでなく混合液を反応容器に送るのに時間がかかる
欠点もある。更に、放射性同位元素で標識した化合物は
通常不安定であるため、標識物質を再三調整する必要が
ある。更にまた、放射性同位元素は人体に危険であり、
環境汚染の立場からその廃棄が内部であると共に、その
取扱いには一定の資格と一定の基準で認可された高価な
施設を必要とし、また測定機器も高価となる等の欠点が
ある。 以上の観点から最近では、放射性同位元素を酵素に置き
換えて標識したエンザイムイムノアツセイや螢光物質を
用いたフローイムノアッセイが、ラジオイムノアッセイ
に匹敵し得る感度と精度を持ち、安全に実施できる優れ
た分析法として採用されている。 一方、上記ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノア
ツセイ、フローイムノアッセイにおける抗原−抗体反応
のステップには比較的長い反応時間を必要とし、この反
応時間を短縮するためには、高濃度での均一な抗原−抗
体反応の反応系が必要となる。このような均一な反応系
を得るために、例えばエンザイムイムノアッセイにおい
て、微細なセルロース粒子を固相担体として用い、抗原
−抗体反応の場である反応液と、固相担体表面との界面
を増大させ、かつ均一に同相担体粒子を浮遊させるよう
にしたものがある。この分析法は用手法により行なわれ
、例えばサンプル中のα−フェトプロティン（α−ｆｅ
ｔｏｐｒｏｔｅｉｎ　）抗ｉヲ定ｉｔするｓ合には、先
ず第８図Ａに示すように、サンプル１とセルロース粒子
表面に固相化した抗α−フェトプロティン（ａｎｔｉ−
α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ　）抗体を含む試薬２とを
試験管８に分注して抗原−抗体反応を行なわせ、α−フ
ェトプロティンと抗α−フェトプロティンとを結合させ
る。次に、第３図Ｂに示すように、試験管８内に洗浄用
緩衝液４を加えて、ｓ　ｏ　ｏ　ｏ　ｒ、ｐ−ｍ＋８　
ｏ秒遠心分敞した後、上清を吸引除去してセルロース（
ｇ体粒子を試験管８内に残す。その後、第８図Ｃに示す
ように、試験管８内に酵素標識抗体である共役抗α−フ
ェトプロティン（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ−α
−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ　）を含も試薬５を加えて抗
原−抗体反応を行なわせ、抗α−フェトプロティン−α
−フエトブ四ティンー共役抗α−フェトプロティンの結
合物を形成させる。次に、第８図りに示すように、試験
管８内に洗浄用緩衝液４を加えて、８０００　ｒ、ｐ、
ｍ・８０秒遠心分離した後、上清を吸引除去してセルロ
ース担体粒子を試験管８内に残す。この第８図りに示す
洗浄工程を３回繰返すことにより、第８図Ｃにおける抗
原−抗体反応において反応しなかった酵素標識抗体を洗
浄除去してＢ−ｆ分離を行なう。 その後、第８図Ｅに示すように、試験ゞＩＴ８内に酵素
基質液６を加えて、セルロース粒子表面に捕捉された標
識酵素との酵素−基質反応を行なわせ、これにより捕捉
された標識酵素量に比例した量の発色物質を生成する。 この酵素−基質反応を所定時間行なわせた後、試験管８
をａ　ｏ　ｏ　ｏ　ｒ、ｐ、ｍ・８０秒遠心分離して発
色物質を含む上清を、第８　　　　″図Ｆに示すように
比色セルフに吸引吐出して分光光度計８により吸光度を
測定し、この測定値に基いて、既知連環のサンプルから
求めた吸光度とα−フェトプロティン抗原との検量線か
らサンプル１中のα−フェトプロティン抗原を定量する
。 上述したエンザイムイムノアッセイにおいては、固相担
体粒子として通常用いられているビーズ、ボール状のも
のを用いるアッセイ糸に比較して、セルロース粒子を用
いることで、抗原−抗体反応の場である反応液と固相担
体との界面を増大させ、かつ固相押体粒子を均一に浮遊
させることにより均一な反応系を得ている。しかし、こ
の分析法においては、サンプル１と固相化した抗体を有
するセルロース粒子を含む試薬２との抗原−抗体反応後
にセルロース粒子とその反応液を分離するため、セルロ
ース粒子と酵素標識抗体を含む試薬５との抗１９−抗体
反応後にセルロース粒子とその反応液を分離するため、
およびセルロース粒子と酵素基質液６との酵素−基質反
応後に、その反応液（発色物質を含む）を比色セルフに
分離して分取するために、それぞれ遠心分離が必要とな
るため、操作が面倒となる欠点がある。また、遠心分離
後その上清を吸引する際にセルロース粒子も吸引して　
　　　・しまう技術的蛭点もある。 本発明の目的は上述した種々の欠点を除去し、簡単かつ
迅速に測定対象の抗原または抗体を定量でき、特に自動
化に適した免疫分析法を提供しようとするものである。 本発明の免疫分析法は、内壁の少く共一部に測定対象の
抗１ｊｊＬまたは抗体と特異的に反応する固相化した抗
体または抗原を有する反応容器を用い、この反応容器に
サンプルを供給して抗原−抗体反応を行なわせた後該反
応容器を洗浄する工程と、前記反応容器に前記測定対象
の抗原または抗体と特異的に反応する抗体または抗原を
結合させた標識物質を含む第１試薬を供給して抗原−抗
体反応を行なわせた後該反応容器を洗浄する工程と、前
記反応容器にｍｌ前記識物質の存在下で特定の物質を生
成し得る第２試薬を供給して反応を行なわせる工程と、 この反応によって得られる前記特定の物質を比色測定し
て前記サンプル中の測定対象の抗原またＬま抗体の定量
を行なう工程とを順次に行なうことを特徴とするもので
ある。 本発明の他の目的は、上記免疫分析法に用いるに好適な
反応容器を提供しようとするものである。 本発明の反応容器は、両端に開口を有し、これら開［」
を結ぶ通路を画成する内壁の少く共一部に前記制定対象
の抗原または抗体と特異的に反応する抗体または抗原を
固相化したことを特徴とするものである。 以下図面を参照して本発明の詳細な説明する。 第４図は本発明の反応容器の一例の構成を示す断面図で
ある。この反応容器１１は両端に開口１２および１８を
有し、これら開口１２および１３を結ぶ通路１４の内径
を一方の開口１３の端部においてその先端に向けて細く
形成すると共に、通路１４を画成する内壁の少く共一部
に測定対象の抗原または抗体と特異的に反応する抗体ま
たは抗原を固相化して構成したものである。この反応容
器１１は、例えばガラス製反応管を用い、これを５００
℃、５時間加熱後、２％の８−アミノプロピ／ｌ／）リ
エトキシシ５　＞　（３−ａ＋ｎ１ｎｏｐｒｏｐｙｌｔ
ｒｉｅｔｈａｘｙｓｎａｒｅ　）アセトン溶液中でほに
４５°Ｃ・２４時間反応させて表面をアミノアルキル化
した後、１％グルタルアルデヒドをほぼ２４°Ｃ，１時
間反応させてから０．２５　Ｍリン隣ナトリウム緩衝液
（ｐ１４７．５　）で洗浄し、次に１．０■／−の割合
で測定対象の抗原または抗体と特異的に反応する抗体ま
たは抗＋ａを加えた０、２５　Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液を反応管内壁の少く共一部にＦｆ　ｆｉ　４℃、２４
時間反応させ、その後反応液を除去してから０．２５　
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄することにより、反応
管内壁の少く共一部に抗体または抗原を固相化して得る
ことができる０このようにして得た反応容器】１は０．
Ｉ　Ｍ　Ｎａｐ／　、　０．１　Ｍ　Ｍｇ０Ａ、　、　
０．１　％牛血清アルブミン、０−Ｉ　ＮａＮ３を含む
０．０１　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中に浸し、はぼ４
℃で保存することが１”６°　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　６第５図Ａ−Ｆは第４図に示した
反応容器】１を用いる本発明の免疫分析法の一例の順次
の工程を示す線図である。本例では、先ず第５図Ａに示
すように反応容器１１の開口１２とポンプ２】とをチュ
ーブ２２を介して連結し、ポンプ２１を吸引作動させて
サンプルカップ２８に収容されたサンプル２４を反応客
器１１内に吸引する。反応容器】１内に吸引したサンプ
ルはその表面張力によって反応容器１１内に保持し、こ
の状態でサンプル中の抗原（抗体）と反応容器１１の内
壁に固相化した抗体（抗原）との抗原−抗体反応を室温
または恒温槽内で一定時間行なわせる。 チューブ２２と反応容器１１の開口１２との連結は、例
えば第６図に示すようにチューブ２２の端部をシリコン
ゴム等より成るヘッド２５に固定し、このヘッド２５を
開口１２に着脱自在に装着することにより、チューブ２
２と開口１２とをヘッド２５を介して気密−に連結する
。 一定時間抗原−抗体反応を行なわせた後、第５図Ｂに示
すように、反応容器１１の開口１２に第６図と同様にし
てチューブ２６の一端を気密に連結し、このチューブ２
６を介して空気および洗浄液を反応容器１１内に注入す
ることにより反応容器１１内の反応液を開口１８から排
出して反応容器１１の内壁を洗浄する。チューブ２６の
他端は、三方弁２７、ポンプ２８および二方弁２９を介
して空気中に開放すると共に、三方弁２７、ポンプ８０
および二方弁８１を介して洗浄液８２を収容する洗浄液
タンク８８に連結する。この反応容器１１の洗浄におい
ては、先ず二方弁８１を開、三方弁２７を閉にしてポン
プ８０を吸引作動させて洗浄液８２を吸引し、その後二
方弁８１を閉、三方弁２７を開としてポンプ８０を排出
作動させて吸引した洗浄液８２を反応容器１１内に排出
して反応容器内壁を洗浄する。次に二方弁２９を開とし
てポンプ２８を吸引作勢させて空気を吸引し、この吸引
した空気を二方弁２９を閉、三方弁２７を開としてポン
プ２８を排出作動させることにより反応容器１１内に注
入し、これにより反応容器１１内の洗浄液を開口１８を
経て排出する０なお、この洗浄工程は反応容器１１内へ
の洗浄液の注入途中で反応容器１１内に空気全注入して
、例えは洗浄液控気−洗浄液−空気の順で洗浄すること
もでき、これにより洗浄効果を上げることもできるＯ反
応容器】１の洗浄後、第５図０に示すように反応容器１
１の開口１２に第６図と同様にしてチューブ８４の一端
を気密に連結し、このチューブ８４を介して反応容器１
１内に測定対象の抗原（抗体）に対する抗体（抗原）に
酵素標識した第１試薬を注入する。チューブ８４の他端
は二方弁８Ｆｉ、Ｍンプ８６および二方弁８フを介して
第１試薬８８を収容する試薬タンク８９に連結し、先ず
二方弁８ｂを閉、二方弁８７を開としてポンプ８６を股
引作動させて第１試薬８８を吸引し、次に二方弁８Ｆｉ
を開、二方弁８７を閉としてポンプ８６を排出作動させ
て吸引した第１試薬を反応容器１１内に注入する。この
ようにして、反応容器】１内に注入された第１試薬は、
その表面張力によって反応容器ｌｌ内に保持し、この状
態で、室温または恒温構内で一定時間抗原一抗体反応を
行なわせ、これにより酵素標識抗体（抗原）−測定抗原
（抗体）−固相化抗体（抗原）を結合させる。 第１試ｌ＃８８の標識酵素としては、例えばマレートデ
ヒド田ゲナーゼ、グルツース・６・リン酸脱水素酵素、
グルコース酸化酵素、ホースラディツシュパーオキシダ
ーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファ
ターゼ、ペルオキシダーゼ、コリコアミラーゼ、リゾチ
ーム、β−Ｄ・ガラクトシダーゼ等の高い活性を有し、
使用される基質が比較的安価でかつ安定な酵素を使用す
ることができる。 上記の抗原−抗体反応後は、第６図Ｂに示すと同様にし
て反応容器１１を洗浄し、その後第５図りに示すように
、反応容器１１の開口１２に第６図と同様にしてチュー
ブ４０の一端を気密に連結し、このチューブ４０を介し
て反応容器１】内に標識酵素に対する基質溶液である第
２試薬を注入する。チューブ４０の他端は二方弁４】（
ポンプ４２および二方弁４８を介して第２試薬４４を収
容する試薬タンク４５に連結し、先ず二方弁４１を閉、
二方弁４８を開としてポンプ４２を吸引作動させて第２
試薬４４を吸引し、次に二方弁４１を開、二方弁４８を
閉としてポンプ４２を排出作動させて吸引した第２試薬
を反応容器１１内に注入する。このようにして、反応容
器１１内に注入１された第２試薬は、その表面張力によ
って反応容器ｌｌ内に保持し、この状態で室温または恒
温構内で一定時間酵素一基質反応を行なわせ、これによ
り発色物質を生成する。この第２試薬４４の基質溶液は
、第１試薬８８の標識酵素がアルカリホスファターゼの
ときはフヱニルリン酸・２・ナトリウムおよび４−アミ
ノアンチピリン、ペルオキシダーゼのときは０−フェニ
レンジアミン、β−Ｄ−ガラクトシダーゼのときは０−
ニトロフェノール・β−Ｄガラクトシド、グルコース酸
化酵素のときはβ−Ｄ−グルコース等を用いることがで
きる。 上記の酵素−基質反応後は、第５図Ｅに示すように、反
応容器１］の開口１２に第６図と同様にしてチューブ４
６の一端を気密に連結し、このチューブ４６の他端をポ
ンプ４７を介して比色セル４８に臨ませ、ポンプ４７を
吸引作動させて反応容器１１内の発色物質を含む反応液
を比色セル４８に吐出する。このようにすれば、反応液
が比色セル４Ｂ内に吐出されることにより酵素と基質と
が分離されて酵素−基質反応が停止するから、酵素反応
停止液が不要となる。 次に、第５図Ｆに示すように、比色セル４８内に収容さ
れた反応液の吸光度を分光光度計４９で測定し、この測
定値に基いて、既知濃度のサンプルから求めた吸光度と
測定抗原（抗体）との検量線からサンプル２４中の測定
抗原（抗体）を定量する。 なお、本発明は上述した例にのみ限定されるものではな
く、幾多の変形または変更が可能である。 例えば、反応容器は外径および／または内径を一様にし
て構成することもできる。また、上述した例では反応液
を比色セルに移して測光するようにしたが、反応容器の
抗体（抗原）を同相化しない部分において直接測光する
こともできる。更に、上述した例では両端に開口を有す
る反応容器を用いたが、カップの内側面に抗体Ｃ抗原）
を同相化した反応容器を用いることもできる。更にまた
、上述した例において反応容器内に注入されたサンプル
、第１および第２試薬は、反応容器の下方の開口を閉塞
して保持するようにすることもできる。 以上実施例で説明したように、本発明に係る免疫分析法
によれば、微量なサンプルおよび試薬で分析を行なうこ
とができ、したがって所要の分析を安価にできる。また
、サンプルおよび試薬の注入・排出および洗浄が簡単に
できるから容易に分析できると共に、洗浄しながら前工
程のサンプルや試薬を排出することができるから分析時
間を短縮することができる。 更に、抗体（抗原）を固相化した反応容器はデイスボー
サブルとすることができ、このようにすれば常に活性な
反応が得られ、精度よく測定を行なうことができると共
に、同時に大赦検体の処理が０■能となり、自動化も容
易にできる。更に、標識。 物質に酵素を使用したことで標識物質の安定性、安全性
を容易に確保できると共に、測定後の反応液の処理も容
易にでき、さらに測定器として安価な分光光度計を使用
することができる、更にまた、抗体（抗原）を同相化し
た反応容器へ※※粉で反応を起こさせることにより、反
応の場である固相担体の表面を増大させ、かつ均一に近
い反応系を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図Ａ−Ｄはラジオイムノアッセイによる。 順次の工程を説明するための線図、 第２図は第１図に示すラジオイムノアッセイによる計数
値の一例を示すＩＩ［ｉＭ、 第８１ＮＡ、Ｆはエンザイムイムノアツセイによる従来
の順次の工程を説明するための線図、第４図は本発明の
反応容器の一例の構成を示す断面図、 第５図Ａ−Ｆは本発明の免疫分析法の一例の順次の工程
を説明するための線図、 第６図は第５図Ａの部分詳細図である。 １］・・・反応容器　　　　１２．１８・・・開口１４
・・・通路　　　　　　！ｉｌｌ、９８，８０，８６゜
４２．４フ・・・ポンプ　　２１ｉ１．ｔｉｌｅ、８４
１４０１　　□４６・・・チューブ　　　　２８・・・
サンプルカップ２４・・・サンプル　　　　２ｂ・・、
ヘッド２７・・・三方弁　　　　　　２９．８１．８に
、８フ１゜４１．４８・・・二方弁　　８２・・・洗浄
液８８・・・洗浄液タンク　　８８・・・第１試薬８９
．４Ｒ・・・試薬タンク４４・・・第２試薬４Ｂ・・・
比色セル　　　　４９・・・分光光度計。 特許出願人　　オリンパス光学工業株式会社第１図 零離＃ｉ衝涜 第；（図 第４図　　　　第（３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　内壁の少く共一部に測定対象の抗原または抗体と特
   異的に反応する固相化した抗体または抗原を有する反応
   容器を用い、 この反応容器にサンプルを供給して抗原−抗体反応を行
   なわせた後膣反応容器を洗浄するＪ二程と、 前記反応容器に前記測定対象の抗原また番」抗体と特異
   的に反応する抗体または抗原を結合させた標識物質を含
   む第１試桑を供給して抗原−抗体反応を行なわせた後膣
   反応容器を洗浄する」−―捏と、 前記反応容器に前記標識物質の存在下で特定の物質を生
   成し得る第２試薬を供給して反応を行なわせる工程と、 この反応によって得られる前記特定の物質を比色測定し
   て前記サンプル中の測定対象ノ抗原または抗体の定量を
   行なう工程とを順次に行なうことを特徴とする免疫外・
   ・析法。 λ　前記第１試薬の＃ｉ識物質として標識＃素を用い、
   前記第２試薬として前記標識酵素に対する基質溶液を用
   いることを特徴とする特許請求の範囲第１ｆｔ４記載の
   免疫分析法。 ８、　測定対象の抗原またはわ１５体と特異的に反応す
   る同相化した抗体または抗原にサンプルを作用させて抗
   原−抗体反応を行なわせた後、前記測定対象の抗Ｗ、ま
   たは抗体と特異的に反応する抗体また（プ抗原を結合さ
   せた本゛、シ識物質を含む第１試薬を作用させて抗原−
   抗体反応を行なわせてからｎｌ）記ｌＩＰ１ｍ物質の存
   在下で特定の物質を生成し得る第２試薬を作用させて反
   応させ、この反応によって得られる前記特定の物質を比
   色測定して前記サンプル中の測定対象の抗原または抗体
   の定量を行なう免疫分析法に用いる反応容器であって、 両端に開口を有し、これら開Ｌ１を結ぶ通路を画成する
   内壁の少く共一部に、前記測定対象の抗原または抗体と
   特異的に反応する抗体または抗原を固相化したことを特
   徴とする反応容器。 ４、　前記通路を一方の開〔１部の内径をその先端に向
   けて糾１＜シたことを特徴とする特許請求の範囲第３項
   記載の反応容器。