JPS61219400A - 核酸の測定方法 - Google Patents
核酸の測定方法Info
- Publication number
- JPS61219400A JPS61219400A JP6089085A JP6089085A JPS61219400A JP S61219400 A JPS61219400 A JP S61219400A JP 6089085 A JP6089085 A JP 6089085A JP 6089085 A JP6089085 A JP 6089085A JP S61219400 A JPS61219400 A JP S61219400A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- avidin
- galactosidase
- measured
- well
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野コ
本発明は特定の配列をもつ一本鎖ポリヌクレオチドすな
わちＤＮＡあるいはＲＮＡフラグメントの存在を、非放
射性物質標識法によ’＋Ｎ定する方法に関する。
わちＤＮＡあるいはＲＮＡフラグメントの存在を、非放
射性物質標識法によ’＋Ｎ定する方法に関する。
［従来技術］
核酸の中から特定の配列をもつＤＮＡフラグメントを検
出する代表的方法の一つにサザン・プロット法がある。
出する代表的方法の一つにサザン・プロット法がある。
この方法の概要は、分離したＤＮＡフラグメントをアル
カリ処理等によって一本鎖ＤＮＡとし、これを固定相と
してのニトロセルロース・メンプラン上等へ移した後、
放射性同位元素（主として Ｐ）で標識した特定のＤＮ
Ａプローブを含む溶液で処理することによりハイブリッ
ドを形成させ、未反応のＤＮＡプローブを洗浄除去後、
通常約−７０℃でＸ線フィルムに数日間感光させ、フィ
ルムの感光パターンにより、ハイブリッドを形成したＤ
ＮＡフラグメントを同定する方法である。
カリ処理等によって一本鎖ＤＮＡとし、これを固定相と
してのニトロセルロース・メンプラン上等へ移した後、
放射性同位元素（主として Ｐ）で標識した特定のＤＮ
Ａプローブを含む溶液で処理することによりハイブリッ
ドを形成させ、未反応のＤＮＡプローブを洗浄除去後、
通常約−７０℃でＸ線フィルムに数日間感光させ、フィ
ルムの感光パターンにより、ハイブリッドを形成したＤ
ＮＡフラグメントを同定する方法である。
一方、放射性同位元素を用いない方法もいくっ ′
か提案されている。例えば特開昭５４−１４３２９７号
公報には、ＤＮＡをチトクロムＣ等で化学修飾したプロ
ーブを用い、ビオチン及びアビジンを介してβ−ガラク
トシターゼを結合させる、いわゆる酵素抗体法の技術が
開発されている。
か提案されている。例えば特開昭５４−１４３２９７号
公報には、ＤＮＡをチトクロムＣ等で化学修飾したプロ
ーブを用い、ビオチン及びアビジンを介してβ−ガラク
トシターゼを結合させる、いわゆる酵素抗体法の技術が
開発されている。
また、Ｄ、 Ｃ，Ｗａｒｄら（Ｐｒｏｅ、 Ｎｕｔ １
． Ａｃａｄ、 Ｓｅ ｉ、 ＵＳＡ７８巻６６３３頁
（１９８１年）、同誌８０巻４０４５頁（１９８３年）
、特開昭５７−２０９２９７号公報など）も別の方法を
開示している。この方法の要点は、ニックトランスレー
ションによりビオチン化したｄＵＴＰを標識したＤＮＡ
プローブを用い検出対象の一本鎖ＤＮＡフラグメントと
ハイブリッドさせ、アビジンを先ず反応させたのちビオ
チン化アルカリフォスファターゼなどを反応させて、こ
の反応量を呈色反応などによって求め、特定のＤＮＡフ
ラグメントを検出する方法である。
． Ａｃａｄ、 Ｓｅ ｉ、 ＵＳＡ７８巻６６３３頁
（１９８１年）、同誌８０巻４０４５頁（１９８３年）
、特開昭５７−２０９２９７号公報など）も別の方法を
開示している。この方法の要点は、ニックトランスレー
ションによりビオチン化したｄＵＴＰを標識したＤＮＡ
プローブを用い検出対象の一本鎖ＤＮＡフラグメントと
ハイブリッドさせ、アビジンを先ず反応させたのちビオ
チン化アルカリフォスファターゼなどを反応させて、こ
の反応量を呈色反応などによって求め、特定のＤＮＡフ
ラグメントを検出する方法である。
［発明が解決しようとする問題点］
サザン・プロット法は、放射性同位元素を使用している
ことによる試薬の長期安定性や安全性に問題があると共
に、操作の繁雑さや所要時間の長さ等にも問題があった
。
ことによる試薬の長期安定性や安全性に問題があると共
に、操作の繁雑さや所要時間の長さ等にも問題があった
。
一方、特開昭５４−１４３２９７号公報記載の方法は、
測定感度が不充分で有効な方法とはいえず、またＷａｒ
ｄらの方法は操作が繁雑であり、感度の点でも向上が望
まれていた。
測定感度が不充分で有効な方法とはいえず、またＷａｒ
ｄらの方法は操作が繁雑であり、感度の点でも向上が望
まれていた。
これら従来の方法は、殊に操作の安全性と迅速性、およ
び高感度を要求される臨床検査分野では一般化されるに
至っていない。
び高感度を要求される臨床検査分野では一般化されるに
至っていない。
本発明の目的はかかる問題点を解決することにある。
［問題点を解決するための手段及び作用コ本発明は測定
対象である一本鎖ポリヌクレオチドを固定相に吸着させ
、該−末鎖ポリヌクレオチドとハイブリッドを形成しう
るビオチン標識−末鎖ポリヌクレオチドと接触させる方
法において、検出用酵素系としてアビジンおよびビオチ
ン化β−ガラクトシダーゼの複合体を用いかつその構成
比（ビオチン化β−ガラクトシダーゼ／アビジンのモル
比）を０．０３〜０２とすることを特徴とする核酸の測
定方法である。
対象である一本鎖ポリヌクレオチドを固定相に吸着させ
、該−末鎖ポリヌクレオチドとハイブリッドを形成しう
るビオチン標識−末鎖ポリヌクレオチドと接触させる方
法において、検出用酵素系としてアビジンおよびビオチ
ン化β−ガラクトシダーゼの複合体を用いかつその構成
比（ビオチン化β−ガラクトシダーゼ／アビジンのモル
比）を０．０３〜０２とすることを特徴とする核酸の測
定方法である。
本発明方法によりいわゆるＤＮＡプローブ検出、°（酵
素系としてアビジンおよびビオチン化β−ガラクトシダ
ーゼの複合体を用いかつその構成比を制限された範囲で
選択することにより大幅な感度向上がもたらされ、かつ
その結果マイクロ・プレート法が適用可能となり、高感
度にして簡便かつ迅速な測定が可能となるのである。
素系としてアビジンおよびビオチン化β−ガラクトシダ
ーゼの複合体を用いかつその構成比を制限された範囲で
選択することにより大幅な感度向上がもたらされ、かつ
その結果マイクロ・プレート法が適用可能となり、高感
度にして簡便かつ迅速な測定が可能となるのである。
従来同様の目的で、例えばアビジンとビオチン化パーオ
キシターゼ系を用いる例が知られているが、この系では
目的とするＤＮＡフラグメント量の検出限界は１００〜
２００９ｇに止どまる。
キシターゼ系を用いる例が知られているが、この系では
目的とするＤＮＡフラグメント量の検出限界は１００〜
２００９ｇに止どまる。
一方、β−ガラクトシダーゼを用いると、一般にニトロ
セルロース・メンプラン上では非特異的挙動のため、バ
ックグラウンドが高めとなり、好ましい結果がえられな
い場合が多く、感度も十分ではない。このため、該酵素
系の複合体を用いることによって改善することが期待さ
れるが、否定的見解（例えば、フナコシ技術レポート１
９号。
セルロース・メンプラン上では非特異的挙動のため、バ
ックグラウンドが高めとなり、好ましい結果がえられな
い場合が多く、感度も十分ではない。このため、該酵素
系の複合体を用いることによって改善することが期待さ
れるが、否定的見解（例えば、フナコシ技術レポート１
９号。
９頁）もあり、また、殊に通常のニトロセルロース・メ
ンプランを固定相として市販の複合体（アマジャム社製
）を用いると、確かにパックグラウンドが高く、約２０
０９ｇ以上のＤＮＡ量を検出定量化できる程度である。
ンプランを固定相として市販の複合体（アマジャム社製
）を用いると、確かにパックグラウンドが高く、約２０
０９ｇ以上のＤＮＡ量を検出定量化できる程度である。
これに対し、本発明者等の検討の結果、該酵素系の複合
体を用いその構成比をビオチン化β−ガラクトシダーゼ
／アビジンのモル比（ビオチン化β−ガラクトシダーゼ
の分子量をｓｏｏ、 ｏｏｏダルトン、アビジンの分子
量を６８．０００ダルトンとした場合のモル比）で０．
０３〜０．２の範囲に設定した場合には感度が従来の知
見に比し大幅に向上することが判明した。特に上記構成
比が０．０４〜０１５．更には０、０７〜０１２の場合
にはその効果は一層顕著である。
体を用いその構成比をビオチン化β−ガラクトシダーゼ
／アビジンのモル比（ビオチン化β−ガラクトシダーゼ
の分子量をｓｏｏ、 ｏｏｏダルトン、アビジンの分子
量を６８．０００ダルトンとした場合のモル比）で０．
０３〜０．２の範囲に設定した場合には感度が従来の知
見に比し大幅に向上することが判明した。特に上記構成
比が０．０４〜０１５．更には０、０７〜０１２の場合
にはその効果は一層顕著である。
以上のように高感度の測定系を確立したことにより、固
定相をニトロセルロース・メンプランとするときはもと
より、新たにマイクロ・プレートを固定相とする迅速な
測定法が可能となった。マイクロ・プレート法は、測定
対象である一本鎖ＤＮＡをマイクロ・プレートのウェル
に吸着させ、これとハイブリッドを形成しうるビオチン
標識の一本鎖ＤＮＡ （ＤＮＡプローブ）と接触させる
ことにより、目的のＤＮＡフラグメントを同定する方法
である。
定相をニトロセルロース・メンプランとするときはもと
より、新たにマイクロ・プレートを固定相とする迅速な
測定法が可能となった。マイクロ・プレート法は、測定
対象である一本鎖ＤＮＡをマイクロ・プレートのウェル
に吸着させ、これとハイブリッドを形成しうるビオチン
標識の一本鎖ＤＮＡ （ＤＮＡプローブ）と接触させる
ことにより、目的のＤＮＡフラグメントを同定する方法
である。
とこで用いるマイクロ・プレートは、少なくともウェル
壁面が一本鎖ＤＮＡを吸着しうる材質を有するものであ
り、ポリスチレンもその一つであるが、−末鎖ＤＮＡに
対し親和性を有する物質をコーティングしてもよい。し
かし、β−ガラクトシダーゼなどを非特異的に吸着する
材質は適当ではない。また、ウェル壁面に一本鎖ＤＮＡ
の吸着量を増大させるために、溶液への塩化Ｍｇなとの
添加によって、溶液のイオン強度を増ことも好ましい。
壁面が一本鎖ＤＮＡを吸着しうる材質を有するものであ
り、ポリスチレンもその一つであるが、−末鎖ＤＮＡに
対し親和性を有する物質をコーティングしてもよい。し
かし、β−ガラクトシダーゼなどを非特異的に吸着する
材質は適当ではない。また、ウェル壁面に一本鎖ＤＮＡ
の吸着量を増大させるために、溶液への塩化Ｍｇなとの
添加によって、溶液のイオン強度を増ことも好ましい。
市販のマイクロ・プレートを用いる場合でも、ウェル中
に加えるＤＮＡ量が約０５μｇを越えない限り、加える
ＤＮＡ量の約８５〜９０％がほぼ定量的にウェル表面に
吸着されるので、定量性が保たれる。定性的判定のみの
ときにはこの吸着率を余り配慮する必要がないことは当
然である。
に加えるＤＮＡ量が約０５μｇを越えない限り、加える
ＤＮＡ量の約８５〜９０％がほぼ定量的にウェル表面に
吸着されるので、定量性が保たれる。定性的判定のみの
ときにはこの吸着率を余り配慮する必要がないことは当
然である。
このように被測定物である一本鎖ＤＮＡを吸着させ、洗
浄したウェルに、ビオチン標識のＤＮＡプローブを加え
ハイブリッドを形成させる。形成したハイブリッドの検
出はアビジンとビオチン化β−ガラクトシダーゼ複合体
を反応させ、未反応のβ−ガラクトシダーゼ活性を、例
えばよく知られた酵素免疫測定技術によって測定すれば
よい。
浄したウェルに、ビオチン標識のＤＮＡプローブを加え
ハイブリッドを形成させる。形成したハイブリッドの検
出はアビジンとビオチン化β−ガラクトシダーゼ複合体
を反応させ、未反応のβ−ガラクトシダーゼ活性を、例
えばよく知られた酵素免疫測定技術によって測定すれば
よい。
ここで用いるアビジンとビオチン化β−ガラクトシダー
ゼのモル比（ビオチン化β−ガラクトシダーゼ／アビジ
ン）ば前記した構成比に合わせ、所望の感度に応じ選択
することが好ましい。ゲル濾過法等により複合体の構成
比を調整してもよい。
ゼのモル比（ビオチン化β−ガラクトシダーゼ／アビジ
ン）ば前記した構成比に合わせ、所望の感度に応じ選択
することが好ましい。ゲル濾過法等により複合体の構成
比を調整してもよい。
全く同様なことはＲＮＡに対しても適合する。
［発明の効果］
本発明の測定方法は、極めて高感度であり、またマイク
ロ・プレート法と併用することにより、多数検体を簡便
かつ迅速に検定できる実用上有意義なものである。
ロ・プレート法と併用することにより、多数検体を簡便
かつ迅速に検定できる実用上有意義なものである。
［実施例コ
実施例 １゜
検出に用いる酵素系複合体の構成比をかえハイブリッド
形成によるＤＮＡ量の定量をおこないその検出限界を求
めたものである。被測定試料例として、λ−ＤＮＡ溶液
を用いた。固定相としてマイクロ・プレートを使用した
場合は、各種濃度のλ−ＤＮＡ溶液をマイクロ・プレー
トのウェルに２５μ／添加し、Ｉ Ｎ ＮａＯＨ溶液２
５μｌを加えて１０分間室温で一本鎖に変性した後、ｌ
Ｉ衝液で中和し、６０℃ｌｈｒでＤＮＡを固定化する。
形成によるＤＮＡ量の定量をおこないその検出限界を求
めたものである。被測定試料例として、λ−ＤＮＡ溶液
を用いた。固定相としてマイクロ・プレートを使用した
場合は、各種濃度のλ−ＤＮＡ溶液をマイクロ・プレー
トのウェルに２５μ／添加し、Ｉ Ｎ ＮａＯＨ溶液２
５μｌを加えて１０分間室温で一本鎖に変性した後、ｌ
Ｉ衝液で中和し、６０℃ｌｈｒでＤＮＡを固定化する。
ウェルに吸着”するＤＮＡ量は、少なくとも０．５μｇ
以下であれば、吸着率は約８５〜９０％と一定であった
。ＢＳＡ溶液で十分洗浄後、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液２ｏ
ｏμｌ加え、６５℃で２ｈｒ加熱する。乙のウェルに、
ビオチン標識のλ−ＤＮＡプローブ溶液１００μｌ加え
、ｌｈｒないしは、作業手順によっては一夜６５℃でハ
イブリッドを形成させる。次いで、洗浄をくり返し、各
種組成の卵白からのアビジン［アビジンＤＮ（ベクター
社製）］と］ビオチン化β−ガラクトシダーの複合体溶
液１００μｌを加え、３７℃でｌｈｒ反応させた後、未
反応物を洗浄除去し、７．５Ｘ １０−’Ｍ４−メチル
ウンベリフェリルーβ−Ｄ−ガラクトシド（４−ＭＵ
Ｆ）の５０μｌを性別し、３０℃で２ｈｒ反応させた。
以下であれば、吸着率は約８５〜９０％と一定であった
。ＢＳＡ溶液で十分洗浄後、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液２ｏ
ｏμｌ加え、６５℃で２ｈｒ加熱する。乙のウェルに、
ビオチン標識のλ−ＤＮＡプローブ溶液１００μｌ加え
、ｌｈｒないしは、作業手順によっては一夜６５℃でハ
イブリッドを形成させる。次いで、洗浄をくり返し、各
種組成の卵白からのアビジン［アビジンＤＮ（ベクター
社製）］と］ビオチン化β−ガラクトシダーの複合体溶
液１００μｌを加え、３７℃でｌｈｒ反応させた後、未
反応物を洗浄除去し、７．５Ｘ １０−’Ｍ４−メチル
ウンベリフェリルーβ−Ｄ−ガラクトシド（４−ＭＵ
Ｆ）の５０μｌを性別し、３０℃で２ｈｒ反応させた。
さらに０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，
３）を加え、酵素反応を停止させ、マイクロ・プレート
用蛍光強度計で蛍光強度を測定した。
３）を加え、酵素反応を停止させ、マイクロ・プレート
用蛍光強度計で蛍光強度を測定した。
一方、固定相としてニトロセルロース・メンプランを用
いた場合は、被測定試料例であるλ−ＤＮＡ溶液を５０
μｉ試験管にとり、Ｉ Ｎ ＮａＯＨ溶液５０μＩを加
え一本鎖ＤＮＡに変性し、この溶液２００μＩをニトロ
セルロース・メンプラン上に滴下しスポットを形成させ
た。メンプランを洗浄後、８０℃で２ｈｒ加熱し、Ｄｅ
ｎｈａｒｄｔ溶液を加えるが、それ以降の手順はマイク
ロ・プレート法と同様である。
いた場合は、被測定試料例であるλ−ＤＮＡ溶液を５０
μｉ試験管にとり、Ｉ Ｎ ＮａＯＨ溶液５０μＩを加
え一本鎖ＤＮＡに変性し、この溶液２００μＩをニトロ
セルロース・メンプラン上に滴下しスポットを形成させ
た。メンプランを洗浄後、８０℃で２ｈｒ加熱し、Ｄｅ
ｎｈａｒｄｔ溶液を加えるが、それ以降の手順はマイク
ロ・プレート法と同様である。
ただし、定量化するため、４−ＭＵＦを反応させる前に
、メンプラン上のスポットを切り取り、試験管に移し、
これに４−ＭＵ Ｆ溶液ヲ２００μｍ 加え、マイク
ロ・プレート法と同じく蛍光強度を測定した。
、メンプラン上のスポットを切り取り、試験管に移し、
これに４−ＭＵ Ｆ溶液ヲ２００μｍ 加え、マイク
ロ・プレート法と同じく蛍光強度を測定した。
固定相に固定させるＤＮＡ量をがえることによっテ、拳
法ニヨるＤＮＡ量の検出限界をこえることができる。結
果は第１表のようであった。
法ニヨるＤＮＡ量の検出限界をこえることができる。結
果は第１表のようであった。
第１表
ここでのモル比は、便宜的にアビジンの分子量を６８．
Ｇｏｏダルトン、ビオチン化β−ガラクトシダーゼの
それを６００．０００ダルトンとして算出したものであ
る。
Ｇｏｏダルトン、ビオチン化β−ガラクトシダーゼの
それを６００．０００ダルトンとして算出したものであ
る。
第１表では、固定相としてニトロセルロース・メンプラ
ンとマイクロ・プレートのいずれでも同様の結果を与え
るが、市販の複合体５ｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏ
ｔｉｎｙｌａｔｅｄβ−ｇａｌａｅｔｏｓｉｄａｓｅ
ｃｏｍｐｌｅｘ （アマジャム社製）を用いニトロセ
ルロース・メンプランを固定相とした場合、パックグラ
ウンドが高く、検出限界は約２ｏｏｐ（であった。
ンとマイクロ・プレートのいずれでも同様の結果を与え
るが、市販の複合体５ｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏ
ｔｉｎｙｌａｔｅｄβ−ｇａｌａｅｔｏｓｉｄａｓｅ
ｃｏｍｐｌｅｘ （アマジャム社製）を用いニトロセ
ルロース・メンプランを固定相とした場合、パックグラ
ウンドが高く、検出限界は約２ｏｏｐ（であった。
実施例 ２゜
血清検体中のＤＮＡをＢｅｒｎｉｎｇｅｒらの方法（Ｂ
ｅ−ｒｎｉｎｇｅｒ Ｍ、ｅｔ ａｌ； Ｊ、Ｍｅｄ、
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９巻５７頁１９８２年）に従ってＳ
Ｏ３−プロテアーゼに処理とクロロホルム／フェノール
によす抽出した。
ｅ−ｒｎｉｎｇｅｒ Ｍ、ｅｔ ａｌ； Ｊ、Ｍｅｄ、
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９巻５７頁１９８２年）に従ってＳ
Ｏ３−プロテアーゼに処理とクロロホルム／フェノール
によす抽出した。
このＤＮＡ抽出液に等量のＩ Ｎ ＮａＯＨを加えて室
温で１０分間反応させて二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに
変性させた。これを緩衝液で中和し、直ちにマイクロ・
プレートのウェルに吸着固定サセタ。
温で１０分間反応させて二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに
変性させた。これを緩衝液で中和し、直ちにマイクロ・
プレートのウェルに吸着固定サセタ。
ＨＢＶ ＤＮＡにビオチン化ｄＵＴＰ （エンゾバイオ
ケム社製品）をニックトランスレーション法により導入
し、ヒ−ｔ チン−ＨＢＶ ＤＮＡ （ＤＮＡＮＨ−４
／）ｅ作製した。
ケム社製品）をニックトランスレーション法により導入
し、ヒ−ｔ チン−ＨＢＶ ＤＮＡ （ＤＮＡＮＨ−４
／）ｅ作製した。
先に検体中のＤＮＡを固定したマイクロ・プレートのウ
ェルに、このＤＮＡプローブを含むＤｅｎｈａ−ｒｄｔ
溶液を加え６５〜７０℃でｌｈｒ反応させハイブリダイ
ゼーションを行った。以下実施例１と同様の手順で、蛍
光強度を測定した。
ェルに、このＤＮＡプローブを含むＤｅｎｈａ−ｒｄｔ
溶液を加え６５〜７０℃でｌｈｒ反応させハイブリダイ
ゼーションを行った。以下実施例１と同様の手順で、蛍
光強度を測定した。
得られた結果を第２表に示す。
第２表
Ｂ型肝疾患 その他の 健常者
蛍光強度 ３２０ ２０ ２０Ｂｏｏ
４ ０ ２ ０ｇ
７０ ７ ５ ５ ５
ｎ １４ １
１ １ １ｘ ８３５．４
５２，７ ３５．０Ｓ
Ｄ ３５４．１ ２６，
０ １５．０実施例 ３゜ 実施例３と同一試料を用い、市販のＤＮＡプローブによ
る公知の測定法との測定効率の比較を行った。
４ ０ ２ ０ｇ
７０ ７ ５ ５ ５
ｎ １４ １
１ １ １ｘ ８３５．４
５２，７ ３５．０Ｓ
Ｄ ３５４．１ ２６，
０ １５．０実施例 ３゜ 実施例３と同一試料を用い、市販のＤＮＡプローブによ
る公知の測定法との測定効率の比較を行った。
公知の方法は、特開昭５７−２０９２９７号公報記載の
方法で、上記ＤＮＡ溶液をニトロセルロース・メンプラ
ンにスポツティングし、ｒ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｂｅ」（エ
ンゾバイオケム社製）溶液を加えた。一方調湿の目的で
、湿潤した濾紙を入れたシャーレに、上記のスポットを
形成したシートを上置し、アルミホイルでカバーした後
、８０℃で１０分間加熱、次いで３７℃で６０分間ハイ
ブリダイゼーションさせた。その後未反応のｒ Ｂｉｏ
−Ｐｒｏｂｅ」を除去し、ビオチン化ホースラディツシ
ュ・パーオキシターゼとアビジンの酵素コンプレックス
ｒ Ｄｅｔｅｋ Ｉ−ｈｒｐ」（エンゾバイオケ五社製
）を加えて３７℃で３０分間加温した。
方法で、上記ＤＮＡ溶液をニトロセルロース・メンプラ
ンにスポツティングし、ｒ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｂｅ」（エ
ンゾバイオケム社製）溶液を加えた。一方調湿の目的で
、湿潤した濾紙を入れたシャーレに、上記のスポットを
形成したシートを上置し、アルミホイルでカバーした後
、８０℃で１０分間加熱、次いで３７℃で６０分間ハイ
ブリダイゼーションさせた。その後未反応のｒ Ｂｉｏ
−Ｐｒｏｂｅ」を除去し、ビオチン化ホースラディツシ
ュ・パーオキシターゼとアビジンの酵素コンプレックス
ｒ Ｄｅｔｅｋ Ｉ−ｈｒｐ」（エンゾバイオケ五社製
）を加えて３７℃で３０分間加温した。
結果の判定は、ニトロセルロース・メンプラン上のスポ
ットを定性的に肉眼観察することにより実施した。当従
来技術によると、定性的判定においても、３６検体を処
理するに要する時間は約１５分であった。これに反し、
本発明の方法によれば、３６検体を定量的に測定するた
めの所要時間は約１分間であった。
ットを定性的に肉眼観察することにより実施した。当従
来技術によると、定性的判定においても、３６検体を処
理するに要する時間は約１５分であった。これに反し、
本発明の方法によれば、３６検体を定量的に測定するた
めの所要時間は約１分間であった。
出願人株式会社 スペシアル レファレンス ラボラ
トリ− こクー一一′二
トリ− こクー一一′二
Claims (2)
- （１）測定対象である一本鎖ポリヌクレオチドを固定相
に吸着させ、該一本鎖ポリヌクレオチドとハイブリッド
を形成しうるビオチン標識一本鎖ポリヌクレオチドと接
触させる方法において、検出用酵素系としてアビジンお
よびビオチン化β−ガラクトシダーゼの複合体を用いか
つその構成比（ビオチン化β−ガラクトシダーゼ／アビ
ジンのモル比）を０．０３〜０．２とすることを特徴と
する核酸の測定方法。 - （２）測定対象である一本鎖ポリヌクレオチドを吸着せ
しめる固定相がマイクロ・プレートのウェルであること
を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6089085A JPS61219400A (ja) | 1985-03-27 | 1985-03-27 | 核酸の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6089085A JPS61219400A (ja) | 1985-03-27 | 1985-03-27 | 核酸の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61219400A true JPS61219400A (ja) | 1986-09-29 |
Family
ID=13155403
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6089085A Pending JPS61219400A (ja) | 1985-03-27 | 1985-03-27 | 核酸の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61219400A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0620439A2 (de) * | 1993-04-16 | 1994-10-19 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zur Bestimmung der Bindung von Transkriptionsfaktoren an Nukleinsäuren |
| US8057989B2 (en) | 2006-02-10 | 2011-11-15 | The University Of Hong Kong | Label-free optical sensing and characterization of biomolecules by d8 or d10 metal complexes |
| US8309304B2 (en) | 2006-02-10 | 2012-11-13 | The University Of Hong Kong | Label-free optical sensing and characterization of biomolecules by d8 or d10 metal complexes |
-
1985
- 1985-03-27 JP JP6089085A patent/JPS61219400A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0620439A2 (de) * | 1993-04-16 | 1994-10-19 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zur Bestimmung der Bindung von Transkriptionsfaktoren an Nukleinsäuren |
| EP0620439A3 (en) * | 1993-04-16 | 1995-10-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method of determining the binding of transcription factors to nucleic acids. |
| US8057989B2 (en) | 2006-02-10 | 2011-11-15 | The University Of Hong Kong | Label-free optical sensing and characterization of biomolecules by d8 or d10 metal complexes |
| US8309304B2 (en) | 2006-02-10 | 2012-11-13 | The University Of Hong Kong | Label-free optical sensing and characterization of biomolecules by d8 or d10 metal complexes |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4994373A (en) | Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes | |
| US6207381B1 (en) | Method for nucleic acid analysis | |
| CA1278257C (en) | Method and kit for performing nucleic acid hybridization assays | |
| US5273882A (en) | Method and kit for performing nucleic acid hybridization assays | |
| US20080139405A1 (en) | Colloidal compositions for solid phase biomolecular analytical, preparative and identification systems | |
| US5641630A (en) | Method and kit for performing nucleic acid hybridization assays | |
| JP2015533282A (ja) | Ｐｃｒ法に基いた生体物質を並列で検出するためのアッセイ | |
| IE61664B1 (en) | Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore | |
| DK3108006T3 (en) | SINGLE-STRENGTHED OIGONUCLEOTIDE PRINCIPLES FOR CHROMOSOME OR RE-COPY COUNTING | |
| JPH03103199A (ja) | 核酸の検出方法 | |
| JP4664373B2 (ja) | バイオチップをベースにした核酸結合タンパク質の試験方法 | |
| JPH0743376B2 (ja) | 核酸配列の検定方法及び分子遺伝子プローブ | |
| KR101862439B1 (ko) | 마이크로rna와 같은 특이적 핵산 서열의 탐지를 위한 면역분석법 | |
| JPH01501339A (ja) | 改良された核酸ハイブリダイゼーション方法及びそれに用いるキット | |
| JPS61219400A (ja) | 核酸の測定方法 | |
| JPS5840099A (ja) | 光−放射ポリヌクレオチドの交雑診断方法 | |
| JPH07508407A (ja) | 分子生物学的診断のための方法およびシステム | |
| US5871906A (en) | Method for detection of amplified nucleic acid products and related diagnostic assays | |
| JPH04503302A (ja) | ターゲット核酸増幅／検出システム | |
| JPH0850130A (ja) | 標的核酸の半定量的検出方法、試験要素および試験キット | |
| EP0406280A1 (en) | Method for amplifying and detecting nucleic acid in a test liquid | |
| RU2193069C2 (ru) | Способ обнаружения мутаций дезоксирибонуклеиновых кислот с помощью рестриктаз и набор для проведения способа | |
| US20050239078A1 (en) | Sequence tag microarray and method for detection of multiple proteins through DNA methods | |
| JPH06113896A (ja) | 核酸の測定方法 | |
| JPH09168400A (ja) | 核酸の定量方法 |