JPS61219398A - 過酸化水素定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は過酸化水素、特に酵素反応によって生成する過
酸化水素の新規定着法に関する。

〔発明の背景〕

過酸化水素の検出、定量は化学実験上、工業上の重要性
だけでなく、特に臨床検査の分野に於ては酵素反応によ
り生成する過酸化水素を定量することにより生体成分の
定量を行う方法が広く普及しており極めてセ要である０
例えば、血液中のコレステロール、トリグリセライド、
グルコース、尿酸、リン脂質、胆汁酸、コリンエステラ
ーゼ。

モノアミンオキシダーゼ、グアナーゼなどを測定する方
法として、それぞれの系で最終的に生成する過酸化水素
を定量することにより目的物を測定する方法が開発され
ており、疾病の診断上役立っていることは周知の通りで
ある。

過酸化水素の定量法として現在最も広く行われている方
法は、これをペルオキシダーゼ、及び発色成分である被
酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、その呈色を比色
定量することにより間接的にその定量を行なう方法であ
る。この方法に於て用いられる発色成分である被酸化性
呈色試薬の代表的なものとしては、４−７ミノアンチピ
リン（４−ＡＡ）と、フェノール系化合物又はＮ。

Ｎ−ジ置換アニリン系化合物とを組合せた被酸化性呈色
試薬、３−メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢ
ＴＨ）とアニリン系化合物との組合せ試薬、２．２′−
７ジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン亭−６−スル
ホン酸）（ＡＢＴＳ）。

トリフェニルメタン系ロイコ色素、ベンジジン誘導体、
ジフェニルアミン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導
体等が挙げられる。

しかしながら、これらの被酸化性呈色試薬はいずれも夫
々一長一短があり、例えば呈色時の極大吸収波長（入□
、）が５００〜ｂ 血清、尿等生体試料中の微量成分の測定に於ては、共存
する有色物質（例えば血清中のビリルビン、ヘモグロビ
ン等）の影響を受は易いもの、呈色時の入、ａ！は８０
０ｎ＋ｓ以上と比較的長波長側にあるが感度が低いもの
、或は、呈色時の入□、が長波長側にあり感度も高いが
１色原体の安定性が悪く試薬盲検（ブランク）が高くで
るもの等々であって、全ての条件を満足した優れた被酸
化性呈色試薬は未だ現われていない。

一方、フェニレンジアミン誘導体は、これをアニリン系
化合物、フェノール系化合物又はナフトール系化合物と
酸化縮合させると８（１０〜８００　ｎｍに極大吸収波
長を有し、感度も例えば４−ＡＡとフェノールとの組合
せ試薬の場合の２〜１０倍の感度を示す色素を生成する
ことが知られている。しかしながら、フェニレンジアミ
ン誘導体は一般に溶液中では非常に不安定で自動酸化さ
れやすく、アニリン系化合物、フェノール系化合物又は
ナフトール系化合物と共存させると試薬盲検の上昇が大
きくなるため、過酸化水素の定量用発色剤とじて用いる
ことは実際と不可能であった。従って、発色剤として用
いた場合、呈色波長、呈色感度に特に優れた特徴を有す
る色素を生成し得るフェニレンジアミン誘導体を色原体
として安定化させて、過酸化水素の測定に利用すること
ができれば、斯界に益すること甚だ大である。

〔発明の目的〕

本発明は上記した如き状況に鑑みなされたちので、フェ
ニレンジアミン誘導体を色原体として安定化させる方法
と、安定化されたフェニレンジアミン誘導体を用いる過
酸化水素の高感度、高精度の定量法を提供することをそ
の目的とする。

〔発明の構成〕

本発明は、被検試料中の過酸化水素を定量するに際し、
加水分解酵素と該加水分解酵素の作用を受けてフェニし
ンジアミン誘導体を遊離する該加水分解酵素の基質と、
該フェニレンジアミン誘導体と酸化縮合して色素を生成
するカップラーと、ペルオキシダーゼとを用い、加水分
解酵素の作用を受けて遊離したフェニレンジアミン誘導
体がペルオキシダーゼの存在下、被検試料中の過酸化水
素の作用によりカップラーと酸化縮合して生ずる色素の
呈色度を測定することにより過酸化水素の測定を行なう
ことを特徴とする、過酸化水素の定量法である。

即ち、本発明は、フェニレンジアミン誘導体の溶液中で
の安定性を向上させるべく未発明者らが鋭意研究を重ね
た結果、これにアミノ酸、オリゴペプチド又はアシル基
を酸アミド結合させることによりその目的が達せられる
ことを見出し完成した発明であり、これを過酸化水素の
定量に於ける発色剤（デベロッパー）として用いる場合
には、丘記酸アミド結合に作用する加水分解酵素を適宜
選択して併用することにより、安定化されたフェニレン
ジアミン誘導体からフェニレンジアミン誘導体が徐々に
遊離してくるから、そこにカップラーとペルオキシダー
ゼを共存させておけば、被検試料中の過酸化水素量に応
じてデベロッパー−であるフェニレンジアミン誘導体と
カップラーとが酸化縮合して色素を生成する。該色素は
極大吸収波長が８００〜８００ｎｍと長波長側にあり、
感度も高いので、該色素の呈色を比色定量することによ
り過酸化水素の高感度、高精度の定量が可能となる。

本発明に於て、加水分解酵素の作用を受けてフェニレン
ジアミン誘導体を遊離する基質としては１例えば、下記
一般式（ｒ）で示されるアミド化合物が挙げられる。

（式中、　　Ｒ’、　Ｒ２，Ｒ３，Ｒ’はそれぞれ独立
して水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハ
ロゲン原子、カルボキシル基又はスルホン基ヲ表わし、
Ｒ５，Ｒ６は夫々独立して低級アルキル基又は置換低級
アルキル基を表わすか、或は、Ｒ５，Ｒ６とＮとでピロ
リジノ基、ピペリジノ基又はモルホリノ基の如き環を成
していてもよく、また、Ｘｌは修飾基を有していてもよ
いアミノ酸残基、修飾基を有していてもよいオリゴペプ
チド残基又はアシル基を表わす、） 一般式ＣＩ）で示されるアミド化合物に於て、Ｒ１，Ｒ
２，Ｒ３，Ｒ４で表わされる低級アルキル基としては１
例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、
ペンチル基等、炭素数１〜５の低級アルキル基が挙げら
れ、直鎖状１分枝状いずれにてもよく、低級アルコキシ
基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポ
キシ基、フトキシ基等、炭素数１〜４の低級アルコキシ
基が挙げられ、直鎖状１分枝状いずれにてもよく、ハロ
ゲンとしては、塩素、臭素、沃素、弗素等が挙げられる
。また、Ｒ５，Ｒ６で表わされる低級アルキル基として
は、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル
基、ペンチル基等、炭素数１〜５の低級アルキル基が挙
げられ、直鎖状１分枝状いずれにてもよく、置換低級ア
ルキル基としては１例えば−〇２Ｈ４０Ｍ、　−（：３
Ｈ（ＢＯＨ，−Ｃ２Ｈ４ＮＩＳＯ２ＣＨ３−Ｃ２Ｈ４Ｎ
ＨＣＯＣＨ３，−Ｇ２Ｈ４５Ｏ３Ｈ（又は−Ｃ２Ｈ４Ｓ
Ｏ３Ｎａ）　。

−［：３Ｈ６ＳＯ３Ｈ（又は−Ｃ３Ｈ６ＳＯ３Ｎａ）、
　−ＣＨ２９Ｈ（：Ｈ２−Ｈ とＮとでピロリシフ基の如き５員環やピペリジノ基１モ
ルホリフ基の如き６員環を形成していてもよい　ｘｌで
表わされるアミノ酸残基としては、該アミノ酸残基とフ
ェニレンジアミン誘導体とのアミド結合に作用する加水
分解酵素が存在するものであれば、いずれのアミノ酸残
基でもよく、例えば、Ｌ−ロイシル基、Ｌ−グルタミル
基、Ｌ−リジル基等が挙げられるが、これらに限定され
るものではない。また、これらのアミノ酸残基は例えば
ベンゾイル基、Ｅ−ブトキシカルボニル基の如き修飾基
を有していてもよいことはいうまでもない、オリゴペプ
チド残基としては、上記アミノ酸残基を末端に有するオ
リゴペプチド残基（修飾基を有していてもよい、）は全
て使用可能である。

また、ｘｌで表わされるアシル基としては１例えばアセ
チル基、プロピオニル基、ブタメイル基等が挙げられる
が、これらに限定されるものではなく、アリルアシルア
ミダーゼが作用し得るアシル基であればいずれにてもか
まわない。

次に、本発明に係る一般式（Ｉ）で表わされるアミド化
合物の具体例を数例挙げるが、本発明で用いられるアミ
ド化合物はこれらに限定されるものでないことはいうま
でもない。

また、これらアミド化合物及びフェニレンジアミン、Ｊ
ｉ誘導体色原体としての安定性を比較した結果を表１に
示す。

ソン酢夜引液（Ｒ８７，０）を使用。

本発明に用いられる一般式ＣＩ）のアミド化合きる。

（式中、Ａ−Ｃは一般式（Ｉ）のｘｌに相当する。）本
発明で用いられる加水分解酵素は、一般式［１１のＸｌ
に対する基質特異性により選択され、エキソ型及びエン
ド型いずれの型の加水分解酵素も使用６Ｔ能である０例
えば、リシルエンドペプチダーゼ、ロイシン７ミノペプ
チダーゼ、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、カル
ボキシペプチダーゼＡ及びＢ、アリルアシルアミダーゼ
等が挙げられるが、本発明の範囲はこれらの加水分解酵
素のみに限定されるものでないことはいうまでもない。

表２に１本発明に於て発色剤として用いられるアミド化
合物と、そのアミド化合物を加水分解する加水分解酵素
の好ましい組み合わせの例を数例示す。

＞１．千夕藝 表　　　　　２ 本発明に於て用いられる、加水分解酵素の作用を受けて
遊離したフェニレンジアミン誘導体と醜化絢合するカッ
プラーとしては、特に制約はなく、フェニレンジアミン
誘導体と酸化縮合して色素を生成するカップラーであれ
ばいずれにてもよいが１通常は下記一般式（ＩＩ）〜（
ＴＶ）で示される化合物がより好ましく用いられる。

（式中、　Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、ＲＩＯは夫々独立して水
素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン
原子、カルボキシル基、又はスルホン基を表わし、Ｒ７
とＲ８又はＲ８とＲ１０とで炭素環を形成しいて −ｆ」 てもよい、また、Ｒ１１，Ｒ１２は夫々独立して低級ア
ルキル基又は置換低級アルキル基を表わすか、或は、Ｒ
１１，Ｒ１２とＮとでピロリジノ基、ピペリジノ基又は
モルホリノ基の如き環を成していてもよく、また、ｘ２
は水素原子、・・ロゲン原子又はその楠７ニナ′７シ１
で［１８鎗１瓜ス北ル婁似＋　）（式中　Ｒ７’　、　
Ｒ８°　Ｒ９°、Ｒｔｏ’は夫々独立して水素原子、低
級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子、カル
ボキシル基、スルホン基、カルバモイル基、置換カルバ
モイル基、スルファモイル基、置換スルファモイル基又
はアシルアミノ基を表わす、また　Ｒ７°とＲ８°又は
Ｒ９’とＲ１０°とで、炭素環を形成していてもよい、
また、ｘ３は水素原子、ハロゲン原子又はその他アニオ
ンとして脱離し得る基を表わす、） Ｈ−（ニーＸ″（１７） （式中、ｗ、ｙは、炭素に結合している水素を活性化す
る基を表わす、また、ｘ４は水素原子、）・ロゲン原子
又はその他アニオンとして脱離し得る基を表わす、） 一般式（ＩＩ　）で示されるアニリ７木化合物に於てＲ
７，Ｒ８，Ｒａ、　Ｒ１０で表わされる低級アルキル基
としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、
ブチル基、ペンチル基等炭素数１〜５の低級フルキル基
が挙げられ、直鎖状１分枝状いずれにてもよく、低級ア
ルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基
、プロポキシ基、ブトキシ基等炭素数１〜４の低級アル
コキシ基が挙げられ、直鎖状、分枝状いずれにてもよく
、ハロゲンとしては、塩素、臭素、沃素、弗素等が挙げ
られる。また　Ｒ７とＲ８又はＲ９とＲ１０とで炭素環
を形成する場合の例としては、一般式（ＩＩ　）で示さ
れる化合物がナフチルアミン誘導体である場合が挙げら
れる。また、Ｒ１１，Ｒ１２で表わされる低級アルキル
基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基
、ブチル基、ペンチル基等炭素数１〜５の低級アルキル
基が挙げられ、直鎖状、分枝状いずれにてもよく、置換
低級アルキル基としては、例えば、−Ｃ２Ｈ４０Ｈ，−
Ｃ３Ｈ６０Ｈ，−Ｇ２Ｈ４ＮＨ９Ｏ２（８３゜−Ｃ２Ｈ
４ＮＨＣＯＣＨ３，−Ｃ２Ｈ４ＳＯ３Ｈ（又は−Ｃ２Ｈ
４ＳＯ３Ｎａ）　。

−Ｃ３Ｈ６ＳＯ３Ｈ（又は−Ｃ３Ｈ６ＳＯ３Ｎａ）、　
−Ｃ）１２９Ｈ（Ｈ２Ｓ０３ＨＨ （又は−（）ｆ２ＧＨｃＨ２ｓＯ３Ｎａ）等が挙げられ
るが、これＨ らに限定されるのもではない、また、ＲＩｌ、　Ｒ１２
とＮとでピロリシフ基の如き５員環やピロリシフ基１モ
ルホリフ基の如き６員環を形成していてもよい　ｘ２で
示される基としては、一般に７二オノとして脱離し得る
基ならば全て用いられ得るが、特に水素原子、ハロゲン
原子（塩素、臭素、沃素、弗素等）、低級アルコキシ基
（メトキシ基、エトキシ基等）　、−Ｃ：０Ｎ）ＩＣｌ
３なる基等が好ましく用いられる。

一般式（ＩＩＩ）で示されるフェノール系化合物に於て
Ｒ７’、　Ｒ８°　Ｒ９°、Ｒ１０°で表わされる低級
アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プ
ロピル基、ブチル基、ペンチル基等炭素数１〜５の低級
アルキル基が挙げられ、直鎖状１分枝状、いずれにても
よく、低級アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基
、エトキシ基、プロポキン基、ブトキシ基等炭素数１〜
４の低級アルコキシ基が挙げられ、直鎖状、分枝状いず
れにてもよく、ハロゲンとしては、塩素、臭素、沃素、
弗素等が挙げられる。また、Ｍ換カルバモイル基として
は、例えば、Ｎ−メチルカルバモイル基、Ｎ−エチルカ
ルバモイル基等が挙げられ、置換スルファモイル基とし
ては、例えば、Ｎ−メチルスルファモイル基、　Ｎ、Ｎ
−ジメチルスルファモイル基等が挙げられる。アシルア
ミノ基としては、例えば、アセチルアミ７基、ベンゾイ
ルアミ７基等が挙げられる。Ｒ７′とＲ８’又はＲ８°
とＲ１０°で炭素環を形成する場合の例としては、一般
式（ｍ）で示される化合物がナフトール誘導体である場
合が挙げられる。また、ｘ３で示される基としては、一
般に７ニオンとして脱離し得る基ならば全て用いられ得
るが、特に水素原子、ハロゲン原子（塩素、臭素、沃素
、弗素等）、低級アルコキシ基（メトトキシ基、エトキ
シ基等）　、−ＣＯＮＨＣＨ３なる基等が好ましく用い
られる。

一般式（ＩＶ）で示される活性メチン化合物又は活性メ
チレン化合物に於けるＷ及びＹは、炭素に結合している
水素を活性化する基であればよく、例えばカルボニル基
、イミノ基、シアノ基算が挙げられる　ｘ４で示される
基としては、一般にアニオンとして脱離し得る基ならば
全て用いられ得るが、特に水素原子、ハロゲン原子（塩
素、臭素、沃素、弗素等）、低級アルコキシ基（メトキ
シ基、エトキシ基等）　、−ＣＱＮＨＣＨ３なる基等が
好ましく用いられる。また、５−ピラゾロン系活性メチ
ン化合物、５−ピラゾロン系活性メチレン化合物もカッ
プラーとして使用できる。

本発明の過酸化水素定量法を反応式で示すと次のように
なる。

即ち、例えば、グルコースの測定に於て、グルコースオ
キシダーゼの作用により生成する過酸化水素を測定する
系に本発明の方法を適用した場合を例に示すと、 山 本発明の過酸化水素定量法は、酵素反応により生成した
過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下発色系に導さ、
その呈色を測定することにより行ｒＪ２生体試料中の微
量成分の定量に特に有効に使用し得る。

即ち１本発明の過酸化水素の定量法は、基質、又は酵素
反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ、生成す
る過酸化水素を定量することにより行ηつ生体試料中の
基質又は酵素活性の定量法として特に効果的に使用し得
る。

本発明の方法により測定可能な生体試料中の微量成分と
しては、例えば、コレステロール、グルコース、グリセ
リン、トリグリセライド、遊離脂肪酸、尿酸、リン脂質
、胆汁酸、モノアミンオキシダーゼ、グアナーゼ、コリ
ンエステラーゼ等が挙げられるが、これらに限定される
ものではなく、酵素反応により生成する過酸化水素を定
量することによって測定が可能な生体成分は全て定量可
能である。

本発明の方法による生体成分の定量に於て、過酸化水素
を生成させる酵素として用いられる酸化酵素（オキシダ
ーゼ）及びその他の目的で用いられる酵素類並びに酵素
反応に関与する基質及びその他の物質の種類及び使用量
は被酸化性呈色試薬を用いる自体公知の生体成分の定量
法に準じて夫々測定対象となる物質に応じて適宜選択す
ればよい。又、本発明による過酸化水素の定量に於て用
いられるペルオキシダーゼとしては、その起源、由来に
特に限定はなく、植物、動物、微生物起源のペルオキシ
ダーゼ又はペルオキシダーゼ様物質が、いずれも使用し
得るが、通常は西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼが好
ましく用いられる。

本発明の過酸化水素定量法に於て用いられる一般式（Ｉ
ｌのアミド化合物、加水分解酵素、カップラー及びペル
オキシダーゼの使用量は、測定対象物質の種類、量、測
定法の遠い、即ち単位時間当たりの吸光度変化を測定す
るレイトアッセイ法の場合、或いは一定時間後の吸光度
を測定するエン季 トポインド法の場合により夫々異なり、それらに応じて
適宜選択し決定されるものであるが、一般的には、一般
式ＣＩ）のアミド化合物　０．０１〜１ｍ１ｌａｌ／Ｉ
、加水分解酵素　０．０００１〜１０ｔＪ　／　ｌ　、
カップラー０．１−１０＊ｍｏｌ／１．ペルオキシダー
ゼ０．１〜１０Ｕ／ｌの範囲が好ましく用いられる。

本発明の方法による過酸化水素の定量、並びにそれによ
る生体成分の定量はｐＨ４〜９の広範囲のｐＨ域で実施
可能であり、各種被検体中の測定対象物質の至適ｐＨに
合せて測定することができる。

用いられる緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、ホ
ウ酸塩、炭酸塩、トリス緩衝液、グツド（Ｇｏａｄ’ｓ
　）緩衝液などが挙げられるが、特にこれらに限定され
ない。

本発明によれば、発色剤としてフェノールと４−７ミノ
アンチピリンを用いた場合の２〜１０倍の高感度の発色
が得られる０表３に、一般式（１）のアミド化合物に加
水分解酵素を作用させｍ１１１してくるアミノ化合物と
、カップラーとの好ましい組み合わせ、及びその組み合
わせに於ける極大吸収波長と感度を示す。

表　　　３ 以ドに実施例及び参考例を挙げるが１本発明はこれらに
限定されるものではない。

尚、参考例　１．２に示した薄層クロマトグラフィー分
析は、シリカゲル７０ＦＭプレートヮ、−（和光純薬土
業■製）を使用し、クロマトグラフィーの展開溶媒は次
のものを使用した。

Ｒｆｌ　　クロロホルム：メタノール＝９：１Ｒｆ２ｎ
−ブタノール：ピリジン：酢ｉ！！：水＝　　３０　　
：　　２０　　：　　６　　：　　２４また、実施例１
．２．３で用いたりシルエンドペプチダーゼ量はｐＨ９
，５，３０℃での、グルコースオキシダーゼ量はｐＨ７
，５，２５℃での国際単位で夫々示した。

し実施例］ 参考例１゜ Ｎａ−ｔ−ブチフレオキシカルボニル−ベンゾキシ−Ｌ
−リジル−４−（Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエ
チル）アミノ）アニリドの合成 Ｎａ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎ６−カルポベン
ゾキシーＬーリジン・ジシクロヘキシルアミン塩　１１
．２４ｇを酢酸エチル２００１に懸濁し、これに水冷下
、０．２Ｎ硫酸を加えてよく振とうした後，酢酸エチル
層を分取した．水洗、乾燥後、酢酸エチルを留去し、Ｎ
”−ｔ−ブチルオキシカルボニル−ＮＣ−カルボベンゾ
キシ−Ｌ−リジンの油状物を得た．これをクロロホルム
５０會ｌに溶かし、ピリジン　１．６１とＮ−エチルピ
ペリジン２．７５１を加え、−１０℃に冷却した．この
溶液に，塩化ピバロイル２．４５　＋ｓｌをクロロホル
ム２０１に溶かした溶液を、−１０℃で滴下した．滴下
後、−５℃に１０分間保った後，再度−１０℃に冷却し
．４−（Ｎ−エチル−Ｎ−（β−とドロキシエチル）ア
ミン）アニリン　３．６１　ｇをクロロホルム１０１に
溶かした溶液を加え、０℃で１％間，室温で３時間反応
させた。反応液にクロロホルム２００１を加え、水、次
いで飽和重曹水で洗浄した．乾燥後、クロロホルムを留
去し，残留物をカラムクロマトグラフィー　（充填剤シ
リカゲル、溶出液クロロホルム：酢酸エチル＝１：１）
で精製し、Ｎ’　−　ｔ−ブチルオキソカルボニル−Ｎ
′ニーカルボベンゾキシ−Ｌ−リジル−４−（Ｎ−エチ
ル−Ｎ−　（β−ヒドロキシエチル）アミン）アニリド
油状物８．４ｇを得た（収率７７、４％）。

Ｒｆｌ＝　　０．７５ 元素分析値　Ｃ２９Ｈ４２Ｎ４０Ｇとして計算値（％）
　　：　Ｃ　６４．１８，　Ｈ　７．８０，　Ｎ　１０
．３２実測値（％）　：　Ｃ　６４．００，　Ｈ　７．
９８，　Ｎ　１０．１５参考例２。

Ｎｃｌ−ベンゾイル−Ｌ−リジル−４−（Ｎ−エチル−
Ｎ−　　（β−ヒドロキシエチル）アミノ）アニリドの
合成 Ｎ−ベンゾイル−Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジル−
４−（Ｎ−エチル−Ｎ−　（β−ヒドロキシエチル）ア
ミノ）アニリド２．４６　ｇをメタ／−ル　１５０１に
溶解し、パラジウム黒を触媒として常法通り接触還元を
行なった．触媒を炉別後，枦液を濃縮乾固し，残留物を
セファデックスＬＨ−２０”ゲルろ過カラムクロマトグ
ラフィーに付し精製した．その主溶出分を凍結乾燥して
、Ｎａ−ベンシイルーム−リジル−４−（Ｎ−エチル−
Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アミン）アニリド゛８４
０ｆｆｉｇを得た　（収率４５．３％）。

Ｒｆ２＝　　０．７４ 元素分析値　Ｃ２３Ｈ３２Ｎ４０３−ＣＨ３ＣＯＯＨ−
Ｈ２Ｏとして計算値（％）　　：　Ｃ６１，２０，Ｈ７
，８１，Ｎ　１１．４２実測値（％）　：　Ｃ８１，８
７，Ｈ７，３０，Ｎ　１１．１４実施例１゜ 過酸化水素の定量 〔測定試薬〕 ■試液工 Ｎｏ−ベンゾイル−Ｌ−リジル−４−（Ｎ−エチル−Ｎ
−（β−ヒドロキシエチル）アミノ）アニリド　０．１
■曽ａｌ／Ｉ、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン４ａｎａｌ／
１．ペルオキシダーゼ８Ｕ／■１の濃度になるように、
　５（ｌｓｍｏｌ／ＩＭ　Ｅ　Ｓ　（２−（Ｎ−モルフ
オリ／）エタンスルホン酸）−水酸化ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７，ｏ）に溶解した。

■試液■ リシルエンドペプチダーゼ４Ｕ／■ｌの濃度になるよう
に、　５０厘ｍｏｌ／ＩＭＥｓ−水酸化ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７，０）に溶解した。

〔試料液〕

市販老醜化水素水をイオン交換水で、０．５゜１．０，
１．５．２．０．４．Ｏｍｍｏｌ／ｌの濃度になるよう
希釈した。

〔測定方法〕

試液Ｉ　　１５ｍ１と試液ＩＩ　　１．５ｍｌを混合後
、試料液２０％Ｉ　を加え、３７℃で５分間加温後、７
３５　ｎｍに於ける吸光度を測定した。

第１図に過酸化水素濃度と吸光度との関係を示す、第１
図より明らかな如く、各過酸化水素濃度（ｇａｏｌ／ｌ
）に対してプロットした吸光度を結ぶ検量線は良好な定
量性を示している。

実施例２゜ グルコースの定量 〔測定試薬〕 ■試液エ リシルエンドペプチダーゼ４Ｕ／ｍｌ　、　Ｎ、　Ｎ　
−ジエチルアニリン４ｍ膳ｏｌ／Ｉの濃度になるように
。

５０廊■ｏｆ／ＩＭＥｓ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）に溶解した。

■試液Ｕ Ｎａ−ヘンシイルート−リジル−４−（Ｎ−エチル−Ｎ
−（β−ヒドロキシエチル）アミン）アニリド　　０．
１ｍｍｏｌ／ｌ、ペルオキシダーゼ８Ｕ／ｍｌ、グルコ
ースオキシダーゼ１２０Ｕ　１ｍ　ｌ　、ムタロターゼ
２００Ｕ／鱈の濃度になるように、５０ｍｍｏｌ／ＩＭ
ＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ）１７．０）に溶解
した。

〔試料液〕

グルコース２．Ｏｇをイオン交換水１００ｍ１に溶解し
、２００履ｇ／ｄ　ｌグルコース溶液とした。これをイ
オン交換水で更に希釈し、２５．５０．１００．１５０
ｍｇ／ｄ　ｌグルコース溶液を調製した。

〔測定方法〕

試液Ｉ　　１．５ｍｌに試料液１０．１添加した後、試
液ＩＩ　　１　、５　ｔｓ　ｌを混合、３７℃で５分間
加温した後、　７３５ｎ層に於ける吸光度をＩＭ定した
。

第２図にグルコース濃度と吸光度との関係を示す、第２
図より明らかな如く各グルコース濃度（■ｇ／ｄｉ）に
対してプロットした吸光度を結ぶ検量線は６Ｍ点を通る
直線となり、検量線は良好な定量性を示している。

実施例３゜ グルコースオキシダーゼ活性の測定 〔測定試薬〕 ■試液エ リシルエンドペプチダーゼＩＵ／膳１．Ｎ、Ｎ−ジエチ
ルアニリン４１厘ａ１／１の濃度になるように、５０ｍ
ｍｏｌ／ＩＭ　Ｅ　Ｓ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７，０）に溶解した。

■試液■ Ｌ−リジル−４−（Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシ
エチル）アミン）アニリＦ　Ｏ，５履腸０１／１、ペル
オキシダーゼ８Ｕ／ｍｌ、グルコース５％の濃度になる
ように、５０ｍｍｏｌ／ＩＭ　Ｅ　Ｓ−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解した。

〔試料液〕

グルコースオキシダーゼ５．１０．２０．３０Ｕ　／　
＋＊１の１度になるように、　５０ｍｍｏｌ／ＩＭＥ　
Ｓ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解した
。

〔測定方法〕

試液１　１．５ｍｌに試料液２０ＩＬｌ添加した後、試
液ＩＩを混合後、７３５　ｆｌｍに於ける吸光度の時間
的変化を測定した。

測定結果を第３図に示す。

〔発明の効果〕

以上述べた如く、本発明は、より長波長側に極大吸収波
長を有し、且つ１分子吸光係数も大きい、フェニレンジ
アミン誘導体と種々のカップラーとのカップリング生成
物を比色定量することにより、過酸化水素を定量する方
法を提供するものであり、 （１）ｋ：、記した如き優れた特性を有しながら、それ
自体溶液中では非常に不安定で自動酸化を受は易く、ブ
ランク値が高くなる為、過酸化水素定量用の発色剤とし
ては使用困難であったフェニレンジアミン誘導体を１本
発明の方法により色原体として安定化させて、過酸化水
素定量用発色剤として使用可能とした点。

（２）本発明の過酸化水素定量法により１例えば血清、
血漿等の生体試料中の微量成分を定量する場合に於ては
、ヘモグロビン、ビリルビン等の有色の共存物質の影響
を受けず、しかも高感度で、精度の高い測定を行なうこ
とができる点。

に顕著な効果を奏する発明であって、斯業に貢献すると
ころ極めて大なるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１．に於て得られた検量線を表わし、
横軸の過酸化水素濃度（■ｍｏｌ／Ｉ）について得られ
た波長７３５１層に於ける吸光度を縦軸に沿ってプロッ
トした点を結んだものである。 第２図は、実施例２．に於て得られた検量線を表わし、
横軸のグルコース濃度（ｍｇ／ｄ　Ｉ）について得られ
た波長７３５ｎｍに於ける吸光度を縦軸に沿ってプロッ
トした点を結んだものである。 第３図は、実施例３．に於いて得られたグルコースオキ
シダーゼ５．１０．２Ｇ、　３０Ｕ／麿ｌの濃度に於け
る経時的吸光度変化を示すタイムコースを表わしたもの
で、横軸は試液■添加後の経過時間（分）を表わし、縦
軸は波長７３５ｎ層に於ける吸光度を表わす。 特許出願人和光純薬工業株式会社 葛　１回 ＡＩＬＩｂ水車２区／Ｌ　　（、％１．）／ｌン１２１
！］ ７°ルコー久儂ＪＬ（−２ヴｄ） １Ｊ３回 時　　　間　　（ケ）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）被検試料中の過酸化水素を定量するに際し、加水
   分解酵素と該加水分解酵素の作用を受けてフェニレンジ
   アミン誘導体を遊離する該加水分解酵素の基質と、該フ
   ェニレンジアミン誘導体と酸化縮合して色素を生成する
   カップラーと、ペルオキシダーゼとを用い、加水分解酵
   素の作用を受けて遊離したフェニレンジアミン誘導体が
   ペルオキシダーゼの存在下、被検試料中の過酸化水素の
   作用によりカップラーと酸化縮合して生ずる色素の呈色
   度を測定することにより過酸化水素の定量を行なうこと
   を特徴とする、過酸化水素の定量法。
2. （２）加水分解酵素の作用を受けてフェニレンジアミン
   誘導体を遊離する基質が、下記一般式〔 I 〕▲数式、
   化学式、表等があります▼〔 I 〕 （式中、Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４は夫々独立し
   て水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロ
   ゲン原子、カルボキシル基又はスルホン基を表わし、Ｒ
   ＾５、Ｒ＾６は夫々独立して低級アルキル基又は置換低
   級アルキル基を表わすか、或は、Ｒ＾５、Ｒ＾６とＮと
   でピロリジノ基、ピペリジノ基又はモルホリノ基の如き
   環を成していてもよく、また、Ｘ＾１は修飾基を有して
   いてもよいアミノ酸残基、修飾基を有していてもよいオ
   リゴペプチド残基又はアシル基を表わす。）で示される
   合成基質である、特許請求の範囲第１項記載の定量法。
3. （３）加水分解酵素が、ペプチダーゼ、プロテアーゼ又
   はアリルアシルアミダーゼである、特許請求の範囲第１
   項又は第２項記載の定量法。
4. （４）カップラーが下記一般式〔II〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔II〕 （式中、Ｒ＾７、Ｒ＾８、Ｒ＾９、Ｒ＾１＾０は夫々独
   立して水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、
   ハロゲン原子、カルボキシル基又はスルホン基を表わし
   、Ｒ＾７、Ｒ＾８又はＲ＾９とＲ＾１＾０とで炭素環を
   形成していてもよい、また、Ｒ＾１＾１、Ｒ＾１＾２は
   夫々独立して低級アルキル基又は置換低級アルキル基を
   表わすか、或は、Ｒ＾１＾１、Ｒ＾１＾２とＮとでピロ
   リジノ基、ピペリジノ基又はモルホリノ基の如き環を成
   していてもよく、また、Ｘ＾２は水素原子、ハロゲン原
   子又はその他アニオンとして脱離し得る基を表わす。）
   で示されるアニリン系化合物である、特許請求の範囲第
   １項〜第３項のいずれかに記載の定量法。
5. （５）カップラーが下記一般式〔III〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔III〕 （式中、Ｒ＾７′、Ｒ＾８′、Ｒ＾９′、Ｒ＾１＾０′
   は夫々独立して水素原子、低級アルキル基、低級アルコ
   キシ基、ハロゲン原子、カルボキシル基、スルホン基、
   カルバモイル基、置換カルバモイル基、スルファモイル
   基、置換スルファモイル基又はアシルアミノ基を表わす
   。また、Ｒ＾７′とＲ＾８′又はＲ＾９′とＲ＾１＾０
   ′とで炭素環を形成していてもよい。また、Ｘ＾３は水
   素原子、ハロゲン原子又はその他アニオンとして脱離し
   得る基を表わす。） で示されるフェノール系化合物である、特許請求の範囲
   第１項〜第３項のいずれかに記載の定量法。
6. （６）カップラーが下記一般式〔IV〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔IV〕 （式中、Ｗ、Ｙは、炭素に結合している水素を活性化す
   る基を表わす。また、Ｘ＾４は水素原子、ハロゲン原子
   又はその他アニオンとして脱離し得る基を表わす。） で示される活性メチン化合物又は活性メチレン化合物で
   ある、特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載
   の定量法。