JPS61183226A - ランゲルハンス島の単離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発明は、復い１）藏（膵臓）がらインシ」−リン産生
性組織を・甲ｄ田る方法に関する、。

［発明の背景ｄ３よび゛戦要〕 すい臓のインシー１゜リン産生性組織（ランゲルハンス
島〉（Ｊｌ、−リ−い臓の金体の約′Ｉ〜２パーセンｉ
−を占めてｄ３す、実験ｉＪ５よび移１１〜のためにこ
のランゲルハンス島を単離することが望まれている。ラ
ンゲルハンス島の移１ｉ１ｉ　ｌＪ、）入り開店を治療
する可能性があるものと考えられている。無傷−（ｉｎ
ｔａｃｔ）のすい臓またｌＪ、その断片を移植する代り
にランゲルハンス島を移１ｉｉ’ｉすること（、Ｊ、幾
つかの利点があり、例えば、ランゲルハンス島の移１１
１１により、移植が容易どなり、インビト［１の処理が
可能どなり、免疫抑制を起こすことなく拒絶反応を防ぐ
ことができ、すいＩＩＩＴｉｉの外分泌作用（宿主組織
からの消化物質の分泌）を除１クシ、また、後の用途に
供するために冷凍保存を行なうことかでき、さらに（、
−１２、異種移植が可能となる。

ランゲルハンス島の分Ｈの進歩と現状につい′Ｃは１１
１０１’　ｌ（Ｉ　ＪＯＩＪｒｌｌｉｌｌ　ｏｆ　５ｔ
ｌｒ（ｌｅｌ’）ｔ、第ε３巻、第２号＜１９８１年１
月）に訂−ｊホされでｃｔ５す、参イのために該文献を
３１用してｉｌ”ｉ　（。また、Ｊ（ｌｌｌ’ｌ’ｌａ
ｌ　０ｆｔ−ｈｅ　　八ｎ１ＯＩ”：Ｃａｌ’ｌ　　ｌ
）：Ｅｌｌ）ＯＬＯＳ　　八５ＳＯＣ：ｎｔ：Ｏｌｌ　
　、　第１６巻、第１号、３５・−３９頁のラシー（ｔ
ａｃｖ＞等による［ラッｌ＝のりい１識から無傷ランゲ
ルハンス島を単離Ｊ−る方法（ｔｉｅｌｈｏｄ　ｆｏｒ
　ｔｈｅ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆＪｌｌ［１１（Ｊ
　　ｌ５ｌｅＬＳ　　ｏｒ　　１−ｉ１１１ｉＪｅｒｌ
’ｌａｌ’ｌｓ　　ｆｒ’ｏｎｌ　　ｔｌｌｅ　　Ｒａ
ＬＰａｃｒｅａｓｓ）　Ｊという論文に１．、＋：、ラ
ッ１へのＪい臓からランゲルハンス島を分団１する従来
の成果が報告されている。ランゲルハンス島を分離する
初期の方法（埋在も使用されている〉において１．Ｊ２
、細かく切断したりい臓の断片を］ラゲナーＬと混合し
３３７°Ｃにｄ３いて培養してできるたり多量のランゲ
ルハンス島をｉＭ　Ｉｆさけでいる。この］ラゲナーＵ
（Ｊｌ、づ−い臓の組織を分解すなわら消化してランゲ
ルハンス島を遊離さｌる。コラブナ−ｃ　ｉａ、、さら
に、ランゲルハンス島に作用し、この結果、反応の初期
に遊回１シｌこランゲルハンス島は単一の細胞群に分解
される。初期に遊離しているランゲルハンス島を保護す
る１、Ｔめに反応を停止さＶるど、多くのランゲルハン
ス島がすい臓の断片中に保護される。かくし−で、この
方法によれば無傷ランゲルハンス島の一一部のみが遊回
１される。また、この方法は、人間、大また（よ１啄な
どの人望動物のすい１戯からランゲルハンス島を単凹目
−るのに特に非効果的である１、 噛１顯（げつし・〉動物の勺い１１硯を物理的に膨張さ
せると、すい臓絹織からのランゲルハンス島の物理的分
画ｌか起こることにより該島の収率が増加づ−ることが
艶出されたことによって、実験的なランゲルハンス島の
ｇｓ　２１１が非゛帛′に向上し・た。しかしながら、
■１様の効果は、人間や犬や豚のような大ぎい動物には
認められてい／よい。膨張後、すい臓は、」ラゲナーレ
による消化に供づ−るために細かく切断される。この操
作ｌは、現在、（Ｊｊ、さみを用いて手で行な、１つれ
ており、大量の処理には適してあらず、伯方、機械力を
用いる細片化装置Ｉ、ｉ、ランゲルハンス島を過度に分
解することか兇ｊ−１１されている。

ランゲルハンス島の一１ラグナーレ単矧の別の方法は、
切断されたすい臓細片を酵素溶液を用いてスクリーン（
、Ｓ・るい）に通して洗浄することである。この操作に
より、遊前ランゲルハンス島はスクリーンを通過し一’
Ｃ’ｙ、ｚンゲルハンス島がさらに酵素の作用を受り４
工いＪ、うに保話すされる媒体の中に入る。

さらに別の技術１．：ｌｌ、Ｖｅｌｃｒｏ（商品名）繊
維を用いで繊糾冒のＪい臓組織を保持しながら、」ラゲ
ノ−−１により該粗織を消化してランゲルハンス島を遊
間１ざμること℃必る。

ランゲルハンス島を単＋ＭＩ−ｖ−る現在の技術１；ｌ
：、スカーブ（ＳＣ１１旧゛１））による「ランゲルハ
ンス島絹械の単離を移＄１（４（Ｉ３０１ａｉ：Ｏ１’
ｌ　ａｎｄ　Ｔ−ｒａｌｌｓｐｌａｎＩａｔ：０１１ｏ
ｆ　　ｌ５ｌｅｔ　　Ｔｉ５ｓｕｅ　　）　　Ｊ　　し
！Ｏ１’ｌ（Ｉ　　ＪＯＩＩｒ’１ｌｉｌｌ　　ｏｆ　
　Ｓｉｌ　ｒ（Ｊｅｒ　ｙ。

第８巻、１／１３へ・１ｊ５１貫（１９８４）にまとめ
られているが、それらの技術はいずれも、ランゲルハン
ス島の単離、特に、大型動物のすい臓から単ｔｉｌｌづ
−るのに満足リーベきものではない。それらの技術は、
生成物の回収率と純度にｄ３いて完全で（′Ａ。

ない。それらの手法は、大量生産するに目、不適であり
、また、紳Ｉ哀を必要とする移植やその他の用）■にＩ
Ｊ：適し、でいイｆい。

本発明（′Ａ１、りい臓か１うインシートリン産牛１）
Ｕの組織を車前する♀Ｊｉ規なブ）法に関する０１本発
明の方法におい−Ｃは、＝１ラゲノーーｔを倉有りる溶
液を用い’Ｃ７Ｊ−い１戯をりい管を介しＣ膨張さμ、
ざらに、ランゲルハンス島の充分な分離が認められるま
でほぼ体温において（３７°Ｃ）該すい臓を培養づる。

しかる復、−りい臓は四′つに分りられ浸軟（ｍａｃｅ
ｒａＬｉｏｒｌに供される。浸軟後のすい臓は、段階的
に小さくイγる複数のスクリーンに通過さμられて、遊
回１のランゲルハンス島からすい臓組織が濾過される。

しかる後、ランゲルハンス島を］１１Ｖ成する物質は、
１跡瀾分）７１１機（ｅｌｕｔｒｉａｔｏｒ）やその伯
の濾過手段を用いて精製することができる。得られる生
成物は、生存し得る仝ランゲルハンス、１帛に加えて、
ランゲルハンス島の断片やすい臓の粒子を含有している
が、ランゲルハンス島含有用は移）１ｂに対する要求を
満た一す−に足るほど充分である。

本発明のブ）法１３１１、人間のすい臓および他の動物
のすい臓から生きたいｔｉａｂｌｅ）精製ランゲルハン
ス島を１１１前する１１本発明のｈ法ｌＪ１、！７！種
移植を可ｊ］ヒにし１、人間に対し・−（他の動物から
のランゲルハンス島の移植を１１１能にりる１、この理
由（Ｊｌ、本発明の方法にＪ５り他のりい臓組織の多く
が除去され、これにＪ、す、移（１［１による拒絶陵応
が減少するからである。実験（１３Ｊ、び移植に人数で
きる健康へ人間のすい臓には限りがあるので、異種移植
ｕ、　４ｇｊに重要である、。

本発明省は、［啄のすい臓は人間のずい繊にき４っめて
似ていることを見出している。本発明の方法は、豚のす
い臓から生きたランゲルハンス島を単離して実験ヤ）人
聞への移）１６に利用することかできる。

（好ましい実施例の説明〕 従来の方法では人間のランゲルハンス島を多量に単離づ
−ることは困釘１であったが、本発明の方法は、人間の
ランゲルハンス島を単離するのに特に適している３、も
ちろん、本発明の方法はすい臓を必要とする。このすい
臓は通常の臓器調達ルー１−から得られる。該臓器は、
死亡した提供者から除去された後に、ユーロ］リンズ溶
液（Ｅｕｒｏｃｏｌｌｉ＋１ｓ　５ｏｌｕ［ｉｏ＋１ｓ
　）に入れて４°○で貯蔵される。このような方法です
い臓は、ランゲルハンス島を単離１刃る前に、２４時間
まで貯蔵されることができる。

第１図には本発明の方法が図示されでいる。先Ｊ゛、す
いｌｌ１ｉＬに、１８ゲージの血管カテーテルをずい管
（ＰａｎＣｒｅａ［ｌＣｄＬＩ（Ｊ　）に挿入すること
によりカニユーレ挿入処理に供され、結紮（けっさつ）
される。次に、１０体積パーセントのウシ胎県血清と０
．２パーはン１への］ラゲナー１を含有するハンクス液
（ｌＩａｌ）ｋ’ｓ　５ＯＩＬＩｔ：Ｏｆｆ　）を用い
て部分的に膨張される。なお、前記のバーセン１へ４Ｊ
、臨界的なものでなく、それよりも多量また少量を用い
ても良好な結果か得・られる。すい臓の漏出部（リーク
）を検査して縫合によって修正する。次いで、すい臓は
、全量で約１５０〜約２００ｄの液体を用いて充分に膨
張さＵられる。すい臓を膨張（ｉｎｆｌａシｉｏｎまた
４Ｊ、（Ｉ　ｉ　５ｔｅｌｌｔ　ｌ　０１１　）するこ
とにより、外分泌組織が物理的におる程度分解されたり
外分−Ｌ４．− 泌組織からのランゲルハンス島の部分的分前が起こり、
後のニー１ラゲリ−−レによる消化か容易になるものど
とえられる。このりい職の物理的分解１，１１、ランゲ
ルハン、丸１ａ−単離にどって重ばである。。

用いられるハンクス）皮ｔ−１１、充分＠　（Ｉ）小１
美醗す１〜リウムを添加−リ−ることｌこより緩性１さ
れてｐｌ−１７，４にし・た標〆１（的な頃類溶液であ
り、室温空気（２０°（Ｃ）下にＧＯ２で気）夜畢衡に
達ｌられる。

この溶液は、シグンクーミカル社（Ｓ　ｌ　（１ｍａ　
Ｃ１１ｅｌｌ　：　Ｃａ　ＩＣｏ、）から人ｊ−で゛き
、その１９８４年版カタログノ８５８１Ｎ、ニーバンク
２（１’）平ＵＭ類（ｔ−１−８２６２＞として掲記さ
れでいる１、非緩衝ハンクス液ＩＪ２、シグマケミカル
老１のカタＩ］グ番’ｊ”ｉ　ｌ−ｌ　　６１３６とし
て人→−できる。また、前）ホしたウシ胎児血清は加熱
不活化した血清であり、これも標７（（的なものであり
１．−ｔりはりシタ゛マグミカル榎の１９８４年版力り
（］グの８１５９員に掲記され−Ｃいるウシ胎児血清Ｆ
−２７６０として同社から入数づ−ることかできる。ウ
シ胎児血清（、Ｊｌ、非加熱不活化状態のものとしてシ
グマク−ミカル社からカタログ番号］ニー４８８　／Ｉ
どし・で人士できる。また、ｊ箇当１．５　＝＋ラゲノ
ーーし酵素の）パ択（Ｊ、経験的に決められる。多くの
＝１ラゲノーレ１貝品か適りるものとべえられる３、シ
グマラミカル社から入今−でき１ｒｌｉｊ召の−１９８
４年版力タロ’）　（１）　２７７　Ｄｒ　ｌ、二Ｃ−
３２８０、タイツ′Ｖとじて掲記されたものか効果的で
あることが見出されている。この酵素に類似するものと
しては、やはりシグマク−ミカル礼から入すできるＣ−
９２６３Ｊ３Ｊ、びＣ−〇７７３かある。それらの違い
は糸上度である３、酵メ処０−３２ε３０　Ｉま、糸上
１豆がＣ−９２６３よりも高いがＣ−０７７３よりは低
い。

Ｃ−９２６３１ｊ、、本明細書で配り−ような適当なス
クリーン処理をイ“」なえば、効果的にイｊるらのと考
えられる。、これらのｖＩ￥−木調１異物（酵素言付製
品〉は、Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉａ　ｈｙｓｔｏｌｙｔｉｃ
ｕｍバクテリアの醗酵生成物である。本明細書においで
揚げる酵素製品り、Ｊｌ、］］ラゲノーーレＩ−リブシ
ンおよび各種のタンパク分解’ｆＪ’ｔ−素の混合物を
含有する。バクテリア醗酵法の性質により、所！ｊのバ
ッチから回収される酵素のノＪ１１ＩＴｌは種々に変化
する。したがって、上述したＺ１ラゲノ−−Ｃ製品のり
一ベてか同じように効果的で゛あると（３ｊ、かぎらな
い。かくして、効果的な「−１ツ１へを児つ（Ｊるため
には、幾つかσ月］１ツｌ〜のリーンプルについで本明
細書で記すような試験的イｊ消化！Ｉ２１理を実施して
ｊ−ス１−を行ない、ぞれらがすい臓組織を効果的に消
化づるか盃かを決める。勿論、効果的な［二１ツＩ〜を
一度決定すれば、それ以上のテス１−を行なうことなく
該ロット全体を使用することができる。

現在のところ、酵素調製物（酵素製品）中の何が該製品
を効果的にしでいるのか正確には理解されていない１．
シかしながら、高度に精製した］ラゲナーＬ製晶１．に
非効果的であることが見出されている。

膨張処理後のりい臓【よ、１０体積％のウシ胎児血清お
よび０．２重量％の］ラゲナービを含有するハンクス液
の）？ｉに浸漬され、３７°Ｃにおいて培養（インキコ
ーベー１〜〉される。約３０ｕ３１つのリーンプルにヌ
・１して１５分の時間を採用づ−る。鉗子を用いてリン
プルを細片にしくｔｅａｓｉ＋１ｇ　＞　、位相差顕微
鏡でシングルハンス島分間１の状態を調べる。培養を行
イーＺつている間は、ランゲルハンス島の分離が最大に
なっていることが認められるまで、１５分間隔てｊスト
−操作を続りる。分離が最大になっ）こ時点におい゛て
、リンゾルの細片化（ｔｃａｓｉ＋１ｇ）により多数の
ｆ（（（傷ランゲルハンス島が遊離８れる。一般に、こ
の時点は、約４５分間から約９０分の培養で得られる。

ランゲルハンス島の分前１が最大になっているか否かの
確認は実験的なものであり、経験によって導かれる。培
養の停止が早すぎると、ランゲルハンス島の大部分がす
い臓組織内に捕獲されたままでいる。このようなランゲ
ルハンス島は、後の処理で遊回１されずに分解される。

第２図には、この培養処理に付されランゲルハンス島の
分離が最大になる前のすい臓り′ンブルの光学顕微鏡写
真が示されている。培養処理の停止か遅り−ぎると、培
養の初期に遊離したランゲルハンス島が個々の細胞に分
解される。第３図１．Ｊｌ、この培養処理が施されラン
ゲルハンス島の分前が最大に達してしまった復のづ−い
臓リンプルのソＣ学顕微鏡゛ダ頁である。リ−い臓の培
養か最適の開会にμ、細Ｊ”＋化辺即された３　０　Ｉ
ｎ”のリン７ノ゛ル中に約１００個のランゲルハンス、
１洛が読（めらＩしる３、第４図１．、Ｉ；、ランゲル
ハンス島の分前がはば最大に＜ｊっだ時点にｄ′３ｃＪ
る培養処理後のり−いｌｌｉ哉リシリンプル学顕微鏡写
真である。

ランゲルハンス（帛の９凹状態か最大になつ一〇いるこ
とを確認し／（＝後、りいＩｌｉ哉を培行］程から取り
出し、四分割し、浸軟する、３膨張と酵素消化とを組合
ｌてりい（識を物理的に分解することにより、充分４工
数のランゲルハンス島が）分離され効果的４韮）開度で
回収することかできる。このランゲルハンス島は、後の
冷浸ｄ５よび分前］］程において１４上分解されない。

この点、従来の方法においてはランゲルハンス、瘍を保
持リ−る７ｊめに人手による細片化か必要どされていた
のと対照的である。浸軟ｔＪ１、台所で用いる標（１（
的なグラインダに類似するが、機械的な動〕９手段を備
え終仮に０．３１８ｃｍ（１，／８インチ）の穴〈複数
〉をイｊりる肉挽き機内で行な］つれると効果的である
３゜＝　１９− ０、３１８ｃｍ　（′Ｉ１０インチ）の穴（，１，０，
１５９ｃｍ　（１／　１６−インｙ＞のブ＜：　ｉｌｊ
　Ｊ、び０．６３　！３　ｃｍ（］／／′１インチ）の
穴Ｊ、りらりｆましいことが実験によって一児ｄ−）さ
−れ−Ｃいる１、該肉挽さＩＪ、粗織を浸快し剪断し、
仝ランゲルハンス１Ωの分ｔｌｆｆをできるだしり少な
りシ４工から−りい臓の残部からランゲルハンス島を）
的離さける。

浸軟後のり−いｌｌ１Ｈ１，Ｊ、、次いで、萌述したハ
ンクス液によって洗浄される１、洗浄後の浸軟すい臓は
４°Ｃにおいてビーカーに集め１）れる１、該ずいＩｌ
蔵絹粗織゛は、ハンクス）１夕を用い逐次的に小さくな
るスクリーンに通されて不用の大径粒子が取り除かれる
、。

最初のスクリーンは、１１ｎＩｎのステンレス鋼製スク
リーンが好ましい。第二のスクリーンは０．７ｍｔｎの
ステンレス鋼製スクリーンか好ましい。最後のスクリー
ンは、クイ累を含有する５００ミクロンのステンレス１
閣製スクリーンが好ましい。濾過（約５００　ｍｆ！の
分子ｉｋ体である〉を集めて精製に供する。精製工程は
、細胞レベル以下の毒性粒子１１′３よびすい臓組織断
片を除去するものである。幾つかの精製万θ、が使用可
ｎ目である。

ランゲルハンス、Ωを倉イ了する物質を精製するのに効
果的＜”ｆ、　）ｌ’ｉ’ｉ　’ルｉＪシスフムの一つ
が、第ｊう図に図示されでいる。この）ｌ−、ｊ７　ｊ
歿シスラ１ム１００　Ｌｌ；、弁頭１）１々（ハンクス
）１夕〉の貯蔵、Ｙ４ｊ　−Ｉ　Ｏ２と、該貯蔵器に連
結されデーノ１１ン（商品名）′Ｃ′被覆されに分蘭用
漏斗装置１０　’ｌ　Ｊ−３よびバイパス１０６を含む
。

バイパス１０Ｇと斤ダ１装置１０４はラインー１０８に
速結され、このラインに（ｊ、流量１１１１０とポンプ
１１２か備えられている。ライン］０８（Ｊ、懸濁分団
］装置１１４に導かれている。この懸濁分６’ｌｌ　％
　世ｔＪ、、例えば、ベツクマインイスルメンツ（Ｂｅ
Ｃｋｌｌｌａｌｌ　］Ｓｉｒｊ１ｍｅｌ’１ｔＳ）から
モデルＪＩＥ−１０Ｘとして人数できるものである。該
装置ＩＪ２．２２ミイノロンよりら人きい粒子を抽ｙ（
できるように設計されている。懸濁弁口１装置１１１の
出口はライン１１６に連結され、このラインには、バル
ブ１２０を介して不用物の容器１１８と生成物の容器１
２２が備えられている。ライン１１６は、貯蔵器１０２
に戻るようになっている。

かくしで、前）ホじた方法により得１うれだ約５００　
ｍＲの物質（、］、約５００Ｉｎのハンクス液と）捏合
されて約１０にされ、捕１１ム置１０４．ｔこ移送され
る。バイパス′ｌ　Ｏ（″）を介してシス１ム１００に
循環を開始し・、循ｌ芙か（１１ｒ立されると、漏Ｓ１
装置１０／１をラインに接続し、漏斗装置１０／１から
物質を流出さＶ、ライン１０８、流量計１１０、ポンプ
１１２を通つ−Ｃ懸濁分山り１装買１１４に流入さｌ、
該′３Ａ置に、１３いて、比較的太９Ｌのランゲルハン
ス島粒子が捕ｙ（される。毒性物質、酵素ａ５よび単個
細胞を含む小径の不用生成物（２２ミクロンより小さい
）【ｊｌ、不用物容器にｌｉ）犯される１、精製工程中
、漏斗装置は攪拌されて物質の流れを均質に覆ることが
りｆまし・い。当該物質が完全に濾過されると、不用物
容器１１Ｂに通じるバルブが閉じられ、１Ｍ！、濁分矧
装首１１４が逆洗されて、捕獲されたランゲルハンス、
り粒子を遊離さＵる０、このようにして濃縮されたラン
ゲルハンス島粒子は容器１２２に捕集され、該生成物１
．ｌＪ、ハンクス液によって洗浄され、移植などの用途
に供される。

第６図に１゜ｊｌ、ランゲルハンス、１５を含有υ−る
物質を精ｉシ７リ−るｕ）２のシステムが図示されでい
る１、このシステム２００　Ｐｌ、、ランゲルハンス島
を倉有する物ｖ１を保持りるための容器２０２を右する
。この容器２０２（Ｊｌ、バルブ２０６　ｉｌ＞よびフ
ィルタ２０８を介し・てライン２０４に排気されるよう
になっている３、また、容器２０２１；１．ライン２１
０を介してバルー）２」２に結合されでいる。バルブ２
１２は、ラーイン２１／′１を介して、精製後のランゲ
ルハンス、１ツを回収するための容器２１６に連結され
ている。ま／に、バルフ゛２１２は、ライン２１Ｂを介
し−Ｃ第一のフィルタ２２０に連結され−Ｃいる。この
フィルタ２２０は、ライン２２２を介しでバルブ゛２２
４に連結されている。バルブ２２４はライン２２Ｇを介
して容器２１Ｇに連結されている１□また、バルブ２２
４は、ライン２２Ｂを介して第二のフィルター２３０に
連結されている３、このフィルタ２２０および２３０は
、それらのフィルタを振動さぼるだめの振動テーブルに
連結され一′Ｃいる。

＝　２３− フィルタ２３０１．４．ライン２３２を介し２−Ｃバル
ブ２３／ｌに連結されでいる。このバルブ２３４は、ラ
イン２３Ｇを介し−Ｃ−１不用物を収集覆る容器２３３
Ｂに連結されでいる。ま１Ｊ、バルブ２３４　ｔ、−１
１、ライン２／″ｌ○を介し・−（”貯蔵器２／１２に
連結されている１、このｌ貯蔵：÷：’ｒ　２　’ｉ　
２１Ｊ、、１狡）小りるＪ、−）に、フィルタから送ら
れるランゲルハンス、弓をフラッシング操作するための
ハンクス液およびウシ胎児血清を含イ１づる。

ランゲルハンス１］Ｌ５収集月１容器２１６　ｔ；に、
バルブ２４Ｂをイラするライン２’′１６を介して真空
源２／１４に連結されている。この真空源２４　／Ｉ　
Ｌ、、上、バルブ２５２を右するライン２５０を介して
不用物回収容器２３８　Ｍ連結され、また、ライン２５
／１を介しでバルブ２５６に連結れさ−Ｃいる。バルブ
゛２５６はライン２５８を介して貯蔵器２４２に連結さ
れている。さらに、バルブ２５Ｇは、ライン２６０を介
してフィルター２６２に連結されている。

第６図にポリ−システム２００は、２′つの−し一ド、
−２／ｌ　　− づな４つら、容器２　（”＞　２内の物質が濾過される
フィルタ［−ドど、フィルタ２２０および２３０で捕獲
されにランゲルハンス島が容：咎２１６内に一ノラツシ
ングされる回収″［−トで操作される。

第１の１−トにおいてｌ；に、バルブ２４ε３および２
５（５が閉じら１′シ且つバルブ゛２５２か開放されで
、容器２３８に真Ｙ；■が（”Ｉ　’］される１、濾過
に際しては貯蔵器２４２は使用されり゛、したがって、
ライン２　／１．　Ｏに月し−ＣＣバルブ２３／ｌ開じ
られる。、また、濾過中は収集用容器２１（５も使用さ
れないので、ライン２２Ｇに苅りるバルブ２２４が閉じ
られ且つライン２」４にヌ４リ−るバルブ２１２か閉じ
られる。容器２３８に真空がイ」与されることにより、
容器２０２から物ｖｊか吸引されてフィルタ２２０およ
び２３０を通り、それらのフィルタはランゲルハンス島
を捕獲し且つ濾液を通過させ、該濾液は容器２３Ｂ内に
収集される。容器２０２内の物質のすべてか濾過される
までこの操作が続（ｊられる。排気ライン２０４　ｄづ
よびフィルタ２０８は、容器２０２から物質が吸引され
るのを可能にしている。

次に、システム２００は第２のし一トに切り換えられる
。このどきは、バルブ２５６が開放され、ライン２（５
０およびフィルタ２６２を介して貯蔵器２／４２を排気
りる。バルブ２５２　ｔ；Ｊ：閉じられ、また、バルブ
２／′８は聞かれ、この結果、容器２１６に真空がイ・
」！うされる。リ−′（′に空になっでいる容器２０２
にス４し−Ｃバルブ２　′ｌ　２　ｔＪ、閉じられる１
゜また、不用物容器２３８に夕」するバルブ２３４も閉
じられる。バルブ２１２および２２１はいり゛れも容器
２１６に対し−ｒ　ｔＪ：　ｌ？ｆｌかれてｄ３す、こ
の結果、該容器に付与された自Ｙとにより貯蔵器２４２
から液体が１毀引されてフィルタ２２ｏａ＞よび２３０
を通り、それらのフィルタ２２０および２３０に捕獲さ
れているランゲルハンス島をフラッシングして容器２１
６に入れる。

ランゲルハンス島を含有する物質を精製する第三のシス
テムを第７図に図示する。このシステム３００は、ラン
ゲルハンス島倉イ１物貿を保有する容器３０２を４１し
、この容器３０２　ｔ、Ｊニライン３０　／Ｉを介し・
−Ｃバルブ３０６に連結されでいる。

このバルブ３　Ｃ）　６１Ｊ、う、インａ　（−）ε３
を介し−Ｃフィル’ｌ　ｊ　１０１ｃｍ　＞Ｉ　ｌ！　
ｄ　ｔｔ　−’（’　（１”！、＋　、、　’７　イル
タ、３１Ｃ’、）の好ましい例ＩＪ、　５　Ｑ　（、’
）ミク［１ンのスイ？ツィノメ（ＳＷ　ｌ　ｒｌｅＸ　
）フィルタである。このフ、イルタ３−＋　０１ＪＩ、
ライン３３１２を介してパルレフ゛ａ　］ｉ＋　＋こ連
か占されているｆｌ　ＪＪた、バルブ３０　（５１Ｊ、
バイパスライン３　′Ｉ　Ｃ５を介してバルブ：３１／
ｌに連結されている。

バルブ３　Ｍ　４１；Ｉ；　′ｌ）イン３３１ε３を介
し−Ｃバルーｆ３２　（’）に連結され−（ニーイア、
、Ｊ、　ハ／Ｌｚ）３２０１Ｊ１、−フィン３２　（５
を介して、ランゲルハンス島収集用容器Ｊ３２８に連れ
ｌｌされＣいる。ライン３３０がフィルタ３２　／ｌを
バルブ３：、３２（、二連結し、このバルブａ　３２１
．−１、ライン３３／１を介し・てイルタ３３６に連結
されているｆｌ　ＦＬ　／：Ｚ　、バルブ３３２　ＬＪ
ライン３３Ｂを介して容器３２ε３に連結されている。

ライン：、３／′ＩＣ）がフィルタ３３６をバルブ３４
２に連結し、こ・のバルブ３４２はライン３４４を介し
てフィルタ３／１６に連結されている。３また、バルブ
３４、２１．．４、う・イン３　／Ｉε３を介して容器
３２Ｂに連結されＣいる１、ラインＪ’３５　（’）が
ハイルタ、’３４６をバルフ゛ｙ３　ＥＪ　２　Ｌ二）
！Ｘ！帛−ヨー１パノレブ３５２１；、１ニライン３５
／１を介じＣ−１１−イルタ、’１３５（５に連結され
ている。よｌ、：、バルブ３’　５２１にライン３３５
ε３を介して容器３５８１ご連結されＣいる。−ノイル
タ３２４゜３３６、　：、）　’１６ｉＤＪ、ひ３５　
（５１，、Ｉ５、コ（１）順序−ＣＮ法が減少し−シ１
３す、まｌＪ、これらのフ、イルタはいり゛れちノイル
タ３１０　Ｊ、りら小ざい１．フィルタ３２’１．３３
６．３／′ｌ６ｉ）３よび３５６　＊Ａ１、ぞれぞｈ次
のＪ、うイハＪ’　Ｏｉを右りるスイネックスノイルタ
−（−゛あることが好、ＪＪ　Ｌい：　３２／′ｌ”−
２５０ミク０ン、３３６”−１５０ミクｃｌン、３　／
１　（３−１００ミク。

ン、Ｊ３Ｊ、σ３５６〜”　５　ｘ３ミク１−１ン１．
さらに、フィルター３２’ｌ、３３５’、３４６Ｊ３Ｊ
、び３５Ｇは、それらの−ノイルタを振動させるた（ｙ
）の振動テーブルＪ３５９に連結されて′いる。

フィルタ３５６１；Ｊニライン３６Ｃ）を介してバルブ
３６２に連結されている。このバルブ３６２は、ライン
３６４を介して、不用物を収集するための容器３６６に
連結きれている。ライン３６８がバルブ３３６２を貯蔵
器３７０に連結し、この貯蔵器３７０ＩＪ、、ｊ侶ホリ
゛るように、ノイルターがらランゲルハンス、弓をフラ
ツシングリ−るためのハンクス液どウシｌ１ｔｉ　！ｆ
１！血消を倉イｉりる。

このシステム３（Ｂ月、１１．２つのモート、リーフよ
りら、容器３０２内の物ｖ１が１１Ｗ過されるフィルタ
モートと、ノイルタ３２４’、　３３６．３４　ｅ＞ｒ
ｆ３よび３５６内に１ｉｆｔ　５ｉ’：されたランゲル
ハンス１鴇が容器３３２Ｂ内にフラッシングされる回収
′［−トで操作される、。

第１０王−ドにｉｌｊいては、バルブ゛３０６　Ｊ３よ
び３’　”ｌ　／１は、ハイパ′スライン３１６にλ１
しでのみ閉じられる。また、バルブ３２０　Ｇ、１．ラ
イン３２６にヌ・Ｊ　Ｌ、　”ＵのＪ、　ｆ３ｆＪじら
れる。ざらに、バルブ＄３２ＩＪｌ；ライン３３３ε３
にり・Ｉ　１．−Ｃのみ閉じられ、バルブ、：３４２１
，１．ライン３３／′ｌε３に対し・てのみ閉じられ、
バルブ３５□２１Ｊ、ライン３５Ｂにλｌしてのみ閉じ
られ、且つ、バルブ３６２’ｔ、にライン３６Ｂ（貯蔵
器３７０）に対しでのみｒ、！ｌＪじられでいる。ポン
プを作動し−Ｃランゲルハンス島含有物質を容器３’０
２からシステム３００中を輸）スづ−るか、あるいは、
容器３６６に真空をイリ与して容器３０２から当該物質
を吸引する。ランゲルハンス島含有物質はフィルタ３’
１０内を通過し、さらに、フィルタ３２４．３３６．３
’１６および３５６を次から次に通過し、それらのフィ
ルタはランゲルハンス島をＩｆｌｉ獲し・且つ濾液を通
過さじ、該濾液Ｃａｔ：不用物容器３６６に集められる
。

ランゲルハンス島含イｊ物質の濾過が終了すると、シス
テム３００１．１１第２のモードに１刀り（灸えられる
。

このとき、バルブ３６２１Ｊ、、ライン３６４に対して
は閉じられているがライン３０ε３に対しては聞れてＪ
’＞す、貯蔵器３７０）がラインに接続されることにな
る。また、バルブ３２０　ｔ；１．ライン３′１Ｂに対
して閉じられる、３ポンプを作動して貯蔵器３７０から
液体をポンプ輸送するか、あるいは、容器３２Ｂに真空
を（＝Ｊ与して貯蔵器３７０から液体を吸引する。次に
、フィルタ３５６，３４．６゜３３６および３２４の各
々をｌ１ｉＪ’次フラッシングする。このフラッシング
は、各フィルタの」１方にあるバルブを先ｆ」−’Ｊる
ノｒルタに導かれ−Ｃいるラインにλ・１じＣは閉［じ
容器３つ２ε３に導かれているラインに対しＣ１，１，
聞くことによ−）Ｃ１−１なわれる３、バルブを１１常
状態に戻し、回（，１２にして次に人込イＴフィルタを
フラッシングし、かくして、フィルタ３５６．３’′１
６．３３６ＪｊＪ、ひ３３２４のそれぞれがフラッシン
グされ、ぞれら（こ含イ］されていた物質か容器：、３
２　ｔ３に収集される。

上述し／ｊＪ、う’＋Ｋ　’ｌ’ｊ’Ｊ製処即により１
）Ｉられた生成物１３土、牛さた（＼ｆ：１ｌｌ）１０
）仝ランゲルハンス島に加えて、ランゲルハンス島断ハ
′１゛）ランゲルハンス島の大ささをイＪりるりい臓の
［Ｊ）ｉ　）’＋を含イｊしているか、該生成物（、ｊ
、移植・１゛）実験に適する充分な純度を有づるものと
考えられる。本発明の方法にＪ、れぼ、約４０ソロのラ
ンゲルハンス島か回収される。この値（３上、インタ１
リンを生成Ｊるのに充分”Ｃあると考えられている２０
％という値を大きく超えている。

このＪ、うに、本発明の方法（−↓、移植を行なうのに
充分なランゲルハンス島を−りい職から生成することが
できる３、 ３１一 本発明のジノ法かイｊ効であるか否か（、］１、すい減
ｉ１３よひ゛生成物のインシニＬリンに対りるＲ　Ｉ△
（ラジΔイミノアッはイ）碩を比較りることにＪ、って
評価される１、生成物のインシミ１リン舶ＩＪ、、Ｊい
臓（ＪＡ３１）る当初の値（３］、少量ｆくとら２！、
Ｊ％、好ましり（Ｊ。

少イエくとら約３０　％から約３　ｂ　’７１であるべ
きＣ゛ある。次の表）こｌ；Ｌ、本発明のｊノ法を用い
て人間の−りい臓かランゲルハンスＪｊｌ’ｌを弁頭１
したときのインシコリン生成率を、りい１臓管の膨張を
ｉ）イγ４つ４Ｔい変形法のデスＩ−結果と比較して示
している３、別表−１中に第４番１」に示Ｊのは、すい
１１１＆を除去するどさにＪ−い職質を切ｉ１ｉ　シた
人間の−りい臓について１”１４ｊっだデス１〜の（直
−Ｃある。このどきは、りい臓を膨張ざＵることｆＪ、
で′Ｃ５：なかったので、該りい臓を酵素混合物に浸演
し浦化した後で、ランゲルハンス島を回収した。

生成物の純度１．Ｌ、ｌ−電気泳動チ丸・ンバー（［Ｉ
（ＩＣＬｒＯｐＨ０ｒＱＳＩＳ　ｃｌｌａｌｌｌｂｅｒ
　）　Ｊに閉覆る米国’Ｉ＜ｊ門弟１１　、３　′Ｉ　
Ｏ，４ｎｏｉ；に記載されているＪ、うな電気泳動法を
用いることに１、す、さらに向１−リるらのど貨えられ
る。

本発明のプ）法（，１１、供ち動物からランゲルハンス
島を単頭］するのにし用いることかできる。好ｔｂい動
物の例（、ｊ、１１）（である。この方法（３１１、人
間の１い臓からランゲルハンス島を単離づる場合ど（よ
ぽ同様である。ハンクス）１り、ウシ胎兄面清（１３Ｊ
、び」ラゲノーレ（、ｊｌ、人間のランゲルハンス島の
申出１１に関して−りでに訂述したのど同種の夕〜ｒプ
のｂのである１３ Ｊい臓（。１１．１片を殺した後豚のタヒ体から１５分
以内に取り出りことか好ましい、３該−りい臓は、１０
休槓％のウシ胎兇面Ｗｊを含イｊＪるハンクス液に入れ
られ４°０に組積されて保存される。中間処理に供され
る前（こ、−りい臓はこのような方法で４〜６時間まで
貯藏され得る。りい臓ＩＪ、迅速に実験室に移してラン
ゲルハンス島の単頭１に供りる。

［１１自１］処理ｊノ法１．１．ｕ’；　１図に図示さ
れている。Ｊい臓の頚部を切り尾部を分ｔｅｌづ−るこ
とによリ−りい臓を調製りる１、好Ｊ：ｔ、　＜　ＩＪ
、、すい臓の尾部のみをランゲルハンス（請甲凹１に用
いる。２０ゲージの血管−３３＝ カブ−デルをりい管に挿入してすい減をカニニ１−し挿
入処理に供し結紮りる。該りい臓（４１，二車壁のスー
アンレス鋼製容“器に入れられ、容器の二手壁間に温水
を循原さｌ（後述υるＪ、うにりいｌ＆を培養（インニ
１］−？べ−１へ）−りる。

ウシ１冶兇而とｉ’ｉ　′ｌ○捧仔１％を含イ１りる２
　０　Ｃ，）　ｍ（！のハンクス）１ｋにｊ内当＜１了
１ラグノーレ（例えば、前）小したシグマウミカルン１
から人数できるＣ　−３２８０、タイ−ｊ）２００ｆｆ
ｌ！Ｊを溶Ｗ１さけることにより二１ラグノーし溶）丙
を調１歿りる。他の）内当４に１ラゲナーレ調製物、例
えば、既述したＪ、う＜ｒ８種のコラゲナーゼ製晶を用
いることしてきる。この−７１ラグノ−−セ溶）１には
約２７′１°Ｃに組積される。上述の比率４Ｊ、　！Ｊ
Ｔましい１１（−ｉて（〜うるが、それＪ、りら多量ま
ｌこｔ３１、少量を用いて良θｒな結果を（ｊ７ること
ｂ−ｃぎる。

コラゲＪ−−シ溶）１夕を汗Ｑｊｌ器を用いてりい管内
に注入し血笛カーｊ−デルによりりい臓を膨張さける３
゜人間のすい職の場合と同様に、刀い臓を膨張さｌるこ
とにＪ、す、タト分泌粗織か幾分か物理的に分前したり
外分泌組織からランゲルハンスＪ：］−か部分的に分前
１し、後の二１ラゲノ−−ｕによる消化か容易になるも
のど考えられる。しずれにしても、Ｊい臓をこのＪ、う
に物即的に分解さけることか、ランゲルハンス島の’ｔ
′）Ｒ１’ｌにとって重要である。外部樹脂、結合組織
（１３よび血管は、りい臓から取り除かれる。

次に、膨張したすい１織は、すい管に注入された］ラグ
ナーし溶液と同様の＝１ラゲナー１溶液の浴に浸漬され
、前述した二重壁スデンレス鋼製容器内で３７°Ｃにｄ
３いて培養される。このとき、約３０ｍｍ３の一つのり
゛ンブルに対して４分間の培養を行なう。１１１１子を
用いてザンブルを細片にし、位相差顕微鏡でランゲルハ
ンス島の分前状態を調べる。培養が続（りられている間
は、ランゲルハンス島の分離が最大になっていること力
綿名められるまで４分゛間隔でテス１へを続行する。分
離か最大になった１１４点にｄ３いては、リーンプルの
細片化（１，ｅａｓｉｎ！Ｊ　）により多数の無傷ラン
ゲルハンス島を遊回１さｌることかできる。一般にこの
時点は約１２分〜約１６分間の培養で到達する。

ランゲルハンス島の分離か最大になっているか＝　３５
− 否かの（１１Ｆ　認は実験的なものであり、経験によっ
て導かれる。１８養の停止が早引ぎると、ランゲルハン
ス島の大部分かすい臓組織内に捕獲されたままでいる。

このＪ、う４ｒランゲルハンス島【ｊ１後の処理にヒ１
３いて’＞Ｉｆｘ　Ｎｉｌされり−に分解されてしまう
。第８図は、培養処理にイ］されランゲルハンス島の分
離が最大になる前のすい臓リーンプルの光学顕微鏡写真
である。他方、培養の停止が遅り−きると、培養の初期
に遊回１されたランゲルハンス島か個々の細胞に消化さ
れてしまう。第１０図は、本ｊ８養処理に（＝Ｊされラ
ンゲルハンス島の分前１か最大値を過ぎた後のすい臓り
°ンブルの光学顕微鏡写真である。ずい臓の培養か最適
になっているときには、細片された３０…ｎ１３のリン
プル当たり約２５〜５０個のランゲルハンス島が観察さ
れる。第９図は、この培養処理を受りランゲルハンス島
の分離が最大になった時点にｄ′３１：Ｊるすい臓の光
学顕微鏡写真である。

ランゲルハンス島の分前］が最大になっていることをＴ
ｉｒ認Ｊると、直らに、１０体積％のウシ胎児＝　３６
− 血清を含イｊするハンクス液３００ｍ１！にすい１臓を
４°Ｃにおいて投入りる。低温液を用いて、すい臓かさ
らに消化されるのを停止する。すい臓を幾つかの大ぎい
断ｊ−１−にリノリ、それらの切片を浸軟する。

浸軟は、人間のすい臓の処理に関連して」ニ述したのと
同じグラインダを用いて良好に行なわれる。

グラインダにより！１織か浸軟され且つ剪断され、すい
臓の残部からランゲルハンス島かＮ　Ｉｌｌされ仝ラン
ゲルハンス島の分解は最少となる。

次いで、濁軟処即後のずい臓は、前述したハンクス）陵
で）先）争される。）先）争１稔のすい職は、４°Ｃの
ハンクス）ｊｌを含イｊするし−カー内に集められる。

このＪい臓組織は、ハンクス液を用い、寸法が順次小さ
くなった複数のスクリーンに通されて、大径の不用粒子
が除去される。第１のスクリーンは１ｍｍ’のステンレ
ス鋼製スクリーンであることが好ましい。第２のスクリ
ーンは０．７ｍｍのステンレス鋼製スクリーンであるこ
とが好ましい。最後のスクリーンは５００ミク１」ンの
ケイ素含有ステンレス鋼製スクリーンであることが好ま
しい。これ＝　３７− らのスクリーン（ｊｌ、前）ホした人間のランゲルハン
ス島の単画１に用いられたスクリーンと同じタイプのも
のである。得られる濾液は、約１０００ｄの分散体（懸
濁体〉であり、集められて精製に供される。豚のすい臓
は希釈されないと迅速に自己消化してしまうので、人間
のすい臓よりも多量のハンクスを用いて分散される。精
製工程にＪ：す、細胞レベル以下の毒性、１．、！′、
子およびＪい臓組織断片が除去される。

本発明者は、動物のず゛い臓を消化することににすｊｑ
られるランゲルハンス島含有波液を精製するのに非常に
適したｌＦｔ製法を開発した。消化後のすい臓組織を含
’ｈする約１　’０００威の濾液を６個の平底（２５０
ｍｊ２）プラスチック製遠心分離管に入れ、約４°Ｃお
いて約５０　Ｏｒｐｍで約２分間遠心分離に供する。上
澄液を流出させて、３０ｄのハン□クス液（１０体積％
のウシ胎児血清を含有）を４°Ｃにおいて名答に添加す
ることによりペレット状の組織を再懸濁し、台管の内容
物を８個の丸底（５０ｍｊ＞ガラス製遠心分離管に等分
割して入れる。ぞれらの電・を約４°ＣＭ　Ｊｊいて約
４００ＸＧで約３０秒間遠心分帥に供Ｊる。再び」二）
σ）１ｋを流出さけて、各遠心分離管ペレッ１〜状絹械
か残るようにする、３ ランゲルハンス島の精製には、リンダール（ｌｉｎｄａ
ｌｌ、Ｉｆ、　）等によるＥｎｄｏｃｒｉ＋１ｏｌｏｇ
ｙ、第８５　巻、２１層頁（１９６９）に記載されてい
るＪ、うなラッ１〜のランゲルハンス島の分離に使用さ
れたＪ、うなフイコール（Ｆ’１ｃｏｌｌ）を用いる密
度匂配遠心分前法を利用覆る。フイコールは、リーツカ
ロースのモノイΔン性合成ポリマーてあり分子ｆ？、　
Ｈ４，約４００．０００である。フイコールは、シグマ
ケミカルｒ１から人数でき、同社の１９８５年版カタロ
グの／１４６頁にはＦ　９３７８と称されている。

この方法においては、５０ｍρの遠心分離管の各々にお
いて６ｍの２５％フィ］−ルに前記ペレツ１〜状組織を
懸濁さける。台管の２５％フイ］−ル層の頂部に、潤度
か次第に減少覆る３つのフィコールの層、りなわら、４
ｍρの２３％フィー１−ルの層、４ｍ１１の２０．５ソ
６フィニ１−１１層および４威の１１％フィコール層を
重ねる。密度匂配を右する該フィコールを約４°Ｏにお
いて約８００×Ｇで約１０分間遠心分頗１に供Ｊる。ラ
ンゲルハンス島は、１１％のフィー１−ル層ど２０．５
％のフィコール層との界面に明瞭４【パントを形成し、
また、２０．５％のフィコ１−１１層と２３％のフィコ
ール層との第２の界面に前記ハンドよりは明瞭さの劣る
バンドを形成覆る。ぞれらのハントをピペツ１〜で別々
に取り出し、１０（Ａ積％のウシ胎児血清を含有するハ
ンクス液を用い遠心訪島１１により２回連続して洗浄し
、ノイニ１−ルを除去する。１１％のフィコール層ど２
０．５％のフィコール層との間の第１のバンドは、ラン
ゲルハンス島のほぼ全量を含有する。実験にＪ、れば、
第１のバンドはランゲルハンス島の約８１１１％を含有
し、第２のハントはランゲルハンス島の約１６％のみを
含有していることが見出されている。これらはＪｆｌ１
４Ｍのデータに示されている。別表１１の最後の田に示
されているように、回収率が１００％を超えていること
があるか、これ（５１１、豚のランゲルハンス島が、さ
らに小さい複数の牛きた（Ｖｉａｂｌｅ）ランゲルハン
ス島に分かれるからである。

フィコールを用いる密度勾配置ｌ！ｒｉ製により得られ
るランゲルハンス島は無傷（ｉｎｔａｃｔ）であり、ぞ
のランゲルハンス島純度は９５％であり、残部が小さい
すい管おＪ、び小さい房状細胞群から成る。

実験ににれば、このような分離おＪ：び精製後において
もランゲルハンス島は生きており（Ｖｉａｂｌｅ）且つ
機能性である。別表■に示ずように、分離後のランゲル
ハンス島のインシュリン分泌速度の平均値は、非刺激レ
ベルのグリコースか存在する揚台においては０．９２３
±０．１５μユニツ］へ／ランゲルハンス島／分である
か、グルコースか刺激レベルまで増７Ｊｎ　＝Ｊると２
．２０十０．２５μユニッ１〜／ランゲルハンス島／分
であった。第■表は、本発明の方法により、豚のすい臓
から多数のランゲルハンス島を順次単離することができ
ることを示しており、それらのランゲルハンス島は形態
上および機能土兄のまま（無傷）である。本発明の方法
により単離された豚のすい臓は、インシニリン分泌に関
する基（ひ的ｒＩｌｌ究、インシュリンの産生または抽
出、あるいはランゲルハンス島の移植に使用づ−ること
かでき、さらには、人工膜内にカブゼル化した後、移植
に用いることもできる。

本発明には、当業占には自明な種々の変形−％％）修正
か考えられるか、それらの変形や修正も本発明の範囲に
包含される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に従うランゲルハンス島分印１法の好
ましい実施例を示すフローヂ１−−ｌ〜である。 第２Ａ図および第２Ｂ図は、本発明の方法に従って処理
されランゲルハンス島の分離が最大になる前の人間のす
い臓１ナンブルの表面ＩＩＩ造を示す光学顕微鏡写真で
ある。 第３Ａ図および第３Ｂ図は、本発明の方法に従って処理
されランゲルハンス島の分離が過度に進行した場合の人
間のずい臓の表面ＩＢＭ造を示す光学顕微鏡写真でおる
。 第４Ａ図および第４Ｂ図は、本発明の方法に従って処理
されランゲルハンス島の分離がほぼ最大になっている躬
合の人間のすい臓リーンプルの表面構造を承り光学顕微
＆（トｑすしＣ′おる。 第１５図（３ｊ１、本発明の方法に従って、分聞１され
たランゲルハンス島を１１＾製Ｊる］ｉ＾製シス−ｒム
の一例を図示りるらのである。 第（′５図ＩＪ１１、本発明の方法に従って弁頭１され
たランゲルハンス島を精製づる精製システムの別の例を
図示りるらのである。 第７図は、ホブで明のプｊ法に従って分１ｉｉＩｌされ
たランゲルハンス１１５を）ｌ！ｌｌｊ製りる（：＾製
システムの第三の例を図示りるらのである。 第８図１；１．、本発明の方θ、に従って処理されたラ
ンゲルハンス島の分間１か最大になる前の豚のすい職リ
ンプルの表面１＋ｔ６逍を示す光学顕微鏡写真である。 。 第５）図は、本発明のノｊ法に従って処理されたランゲ
ルハンス島の分離が過度に進行した場合の豚のηい臓リ
ンプルの表面１１１Ｘ造を示Ｊ光学顕微鏡写真である。 第１０図ＬＪ１、本発明の方法に従って処理されたラン
ゲルハンス島の分離かはば最大になっている場合６月１
もりのりいｌｌ＋ｉｉリン−ｆルの表面（１へ１点を承
り光学顕微鏡写真である。 第１１図は、本発明のｙ）法（５１！ｆつでＬｌｉ前、
精製された豚のランゲルハンス島の表面構造を示η光学
顕微鏡写真である１、 別表１ 人間のランゲルハンス島１１！１１１１１結果３０８　
　　　　　　　９３　　　　　　　　　　３’　０％　
　　　　　　６６．０００３１４、　　　　　　　１１
７　　　　　　　　　　３７％　　　　　　　５６．０
００１１．６　　　　　　　　７６　　　　　　　　　
　６６％　　　　　　　１０．０００４５４　　　　　
　　　２３　　　　　　　　　　　５％　　　　　　　
　８．２５０３０６　　　　　　１ε３４　　　　　　
　　　６０％　　　　　　１２０．、０００６０７　　
　　　　　１１３４　　　　　　　　　　３０％　　　
　　　　２６．９５０６７８　　　　　　　１５３　　
　　　　　　　　２３％　　　　　　　７９．５００１
６０　　　　　　　　６４　　　　　　　　　　４．０
％　　　　　　　１５．５２５３９１　　　　　　　１
４４　　　　　　　　　　３７％　　　　　　１１８．
２５０１３２　　　　　　　　４．０　　　　　　　　
　　３０％　　　　　　　２５，０００５２３　　　　
　　　３２８　　　　　、　　　　　　６３％　　　　
　　　９０．ＱＣ）０４２％ ＄　　ト０（０００ Ｏ「■ＯＬ：′ｆ）寸ＯＯの ０へ〔〔０ト囚寸　の ■ト■ＯＣｏ　７Ｉｎ　ＣＤ　　（５ ■Ｏのののｃｏｃｕ側　才 別表Ｉｌｌ 単離された豚りい臓によるインシコリンのインビ１〜口
分泌能７０　　　　　　　　　　０．２Ｅ５　　　　　
　　　　　　　　　　　　　０．６６０．０９ ０．３１　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．６
／１０．２６　　　　　　　　　　　　　　　　　　０
．５８７１　　　　　　　　　０．８５　　　　　　　
　　　　　　　　　　　３．０１０．２１　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１．３５７（、’ｉ、　６
０　　　　　　　　　　　　　２．５８１．７０　　　
　　　　　　　　　　　　　　　２．８２７７　　　　
　　　０、６１２．４．６０．７８　　　　　　　　　
　　　　　　　　　２．５０１．０９　　　　　　　　
　　　　　　　　　　１．７４７’）　　　　　　　　
１．７０　　　　　　　　　　　　　　２．９３１．７
２　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．１０１．
７２　　　　　　　　　　　　　　　　　　３．１５８
０　　　　　　　　　　０．７７　　　　　　　　　　
　　　　　　　　３．１７１．３６　　　　　　　　　
　　　　　　　　　２．１１０．６７　　　　　　　　
　　　　　　　　　　４．３１平均値士標準唾差　　０
．９２３±０．１５　　　　　　　　　　　２．２０±
０．２５Ｐ＜０．００１ Ｙ丁Ｇ２八 ＦＴＧ、２１１ 、−４ す！９和 １−＝ の　　　　　　　　　　　　　　ｄ ｏ　　　　　　　　　　　　　Ｌ

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. （１）すい臓から無傷のランゲルハンス島を回収する方
   法であって、酵素調製物を用いすい臓を消化してすい臓
   の外分泌組織を分解し無傷のランゲルハンス島を遊離さ
   せ、遊離したランゲルハンス島をすい臓の外分泌組織か
   ら分離し、インシュリンを産生することができる無傷の
   ランゲルハンス島を回収することから成ることを特徴と
   する方法。
2. （２）酵素調製物がコラゲナーゼを含有する特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。
3. （３）消化中にすい臓の組織を少なくとも部分的に分解
   する特許請求の範囲第１項に記載の方法。
4. （４）すい臓を消化してすい臓組織からランゲルハンス
   島を充分に弛緩し、その後、すい臓を浸軟してすい臓組
   織からランゲルハンス島の大部分を充分に弛緩すること
   によりすい臓組織からランゲルハンス島を無傷で生の状
   態で遊離させる特許請１の範囲第１項に記載の方法。
5. （５）元のすい臓に存在する無傷ランゲルハンス島の少
   なくとも約２５％〜約４０％を含有しインシュリンを産
   生し得る無傷ランゲルハンス島濃縮物。
6. （６）すい臓からインシュリン産生性組織を単離する方
   法であって、 コラゲナーゼを含有する溶液を用いすい臓をすい管を介
   して膨張させ、且つ、コラゲナーゼを含有する溶液中で
   すい臓を培養してランゲルハンス島を充分に分離する工
   程と、 浸軟したすい臓を大きな断片に切り該断片を浸軟する工
   程と、 浸軟後のすい臓を順次小さくなっている複数のスクリー
   ンに通して、遊離ランゲルハンス島からすい臓を濾過す
   る工程と、 ランゲルハンス島を含有する物質を精製する工程とを含
   むことを特徴とする方法。
7. （７）すい臓から無傷のランゲルハンス島を回収する方
   法であって、ハンクス液とコラゲナーゼを含有する酵素
   調製物０．２重量％を含む１０体積％のウシ胎児血清と
   の混合物を用い無傷のすい臓をすい管を介して膨張させ
   る工程、該すい臓を培養してすい臓の外分泌組織を消化
   する工程、該消化中に一定の間隔ですい臓を観察してラ
   ンゲルハンス島の分離が最大になっていることを確かめ
   る工程を含み、ここで、前記膨張と酵素による前記消化
   とを組合せた物理的分解により、すい臓組織から生きた
   ランゲルハンス島を遊離させつつランゲルハンス島のイ
   ンシュリン産性能を維持するようにし、さらに、残存す
   るすい臓組織および消化生成物から無傷のランゲルハン
   ス島を分離する工程、および、インシュリン産性能を有
   する無傷の該ランゲルハンス島回収する工程を含み、該
   回収工程においては、先ず、消化後のすい臓を切り、物
   理的な破砕により浸軟し、この破砕によってすい臓組織
   の大きさを無傷ランゲルハンス島の大きさ程度にまで小
   さくしつつインシュリン産生能を有するランゲルハンス
   島の数を最大に維持し、次に、濾過と濃縮によりすい臓
   の外分泌組織から無傷のランゲルハンス島を分離し、か
   くして、回収された濃縮物が充分なインシュリン産生能
   を有する無傷ランゲルハンス島を含有するようにするこ
   とを特徴とする方法。
8. （８）濾過および濃縮の工程が、ハンクス液を用い順次
   小さくなる一連のスクリーンに軟浸後のすい臓組織を通
   して約５００ミクロンよりも大きい粒子を除去すること
   から成る特許請求の範囲第７項に記載の方法。
9. （９）濾過および濃縮の工程が、第二の濾過操作を含み
   、該第二の濾過操作においては、既に一度濾過されたす
   い臓組織をハンクス液を用い順次小さくなる一連のスク
   リーン（最も小さいものは約５３ミクロン）に通し、そ
   れらのフィルターをハンクス液とウシ胎児血清によって
   逆洗して濾過後のランゲルハンス島を回収する特許請求
   の範囲第８項に記載の方法。
10. （１０）豚のすい臓を用い、豚の無傷ランゲルハンス島
    を回収する特許請求の範囲第４項に記載の方法。
11. （１１）酵素調製物が、ハンクス液と約１０体積％のウ
    シ胎児血清との混合物であって、約０．２重量％の酵素
    を含有する混合物から成る特許請求の範囲第１項に記載
    の方法。
12. （１２）人間のすい臓を用い、該すい臓を約４５〜９０
    分間消化する特許請求の範囲第７項に記載の方法。
13. （１３）すい臓を約１２〜１６分間消化する特許請求の
    範囲第１０項に記載の方法。
14. （１４）すい臓を約４分間隔で観察して、ランゲルハン
    ス島の分離が最大になっている時点を確める特許請求の
    範囲第１０項に記載の方法。
15. （１５）約３７℃においてすい臓を消化する特許請求の
    範囲第１０項に記載の方法。
16. （１６）酵素による消化中にすい臓を膨張させる特許請
    求の範囲第１項に記載の方法。
17. （１７）酵素による消化中にすい管を介してすい臓を膨
    張させ、また、後の浸軟および分離によりすい臓の外分
    泌組織からランゲルハンス島が生の無傷の状態で且つ充
    分なインシュリン産生能を有して回収され得るような時
    間と温度下に消化を行なう特許請求の範囲第１項に記載
    の方法。
18. （１８）酵素による消化を行なっているときに、ハンク
    ス液とウシ胎児血清の混合物を用いてすい臓をすい管を
    介して膨張させる特許請求の範囲第１７項に記載の方法
    。
19. （１９）すい管を介してすい臓を膨張させるのに用いる
    混合物が、コラゲナーゼを含有する酵素調製物を含む特
    許請求の範囲第１８項に記載の方法。
20. （２０）約１５０〜約２００ｍｌの当該混合物を用いて
    すい臓を膨張させる特許請求の範囲第７項に記載の方法
    。
21. （２１）すい臓を部分的に膨張させ、リーク部を検査し
    、該リーク部を縫合してすい臓を充分に膨張させ、培養
    に供する特許請求の範囲第７項に記載の方法。
22. （２２）人間のすい臓を用い、人間の無傷ランゲルハン
    ス島を回収する特許請求の範囲第４項に記載の方法。
23. （２３）約４５〜約９０分間すい臓を消化する特許請求
    の範囲第２２項に記載の方法。
24. （２４）約１５分間隔で消化を観察して、ランゲルハン
    ス島の分離が最大になっている時点を確かめる特許請求
    の範囲第２２項に記載の方法。
25. （２５）人間の体温とほぼ同じ温度下にすい臓を消化す
    る特許請求の範囲第２２項に記載の方法。
26. （２６）豚のすい臓を用い、該すい臓を約１４〜約１６
    分間消化する特許請求の範囲第７項に記載の方法。
27. （２７）人間のすい臓から特許請求の範囲第１項の方法
    により製造された人間の無傷ランゲルハンス島の濃縮物
    であって、元の人間のすい臓に存在する無傷ランゲルハ
    ンス島の少なくとも約２５％〜約４０％を含有し充分な
    インシュリン産生能を有するランゲルハンス島濃縮物。
28. （２８）酵素調製物が、コロゲナーゼ、トリプシンおよ
    びたんぱく分解酵素を含有する特許請求の範囲第１項に
    記載の方法。