JPS6114795B2 - - Google Patents
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- JPS6114795B2 JPS6114795B2 JP57042959A JP4295982A JPS6114795B2 JP S6114795 B2 JPS6114795 B2 JP S6114795B2 JP 57042959 A JP57042959 A JP 57042959A JP 4295982 A JP4295982 A JP 4295982A JP S6114795 B2 JPS6114795 B2 JP S6114795B2
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は動植物の遺伝形質を変換する方法に関
する。
する。
動植物の育種や品種改良を行なつたり、有用な
生産物を効率的に生産させる目的で動植物の細胞
の遺伝形質を変換せしめる試みがなされている。
動植物の遺伝形質変換方法の１つとして、赤血球
ゴースト内にDNAを取り込ませ、該赤血球ゴー
ストを動物細胞と融合させる方法が知られている
（たとえば、International Review of
Cytology、vol.62、26〜67頁参照）。この方法で
は、赤血球懸濁液の浸透圧を変化させることによ
つてDNAを赤血球ゴースト内に取り込ませるの
であるが、実際にはDNAはほとんど取り込まれ
ず、また取り込まれる場合でも低分子のDNAの
みが取り込まれるにすぎない。そのため、目的と
する動植物細胞の遺伝形質の変換を満足し得る程
度に行なうことは出来なかつた。
生産物を効率的に生産させる目的で動植物の細胞
の遺伝形質を変換せしめる試みがなされている。
動植物の遺伝形質変換方法の１つとして、赤血球
ゴースト内にDNAを取り込ませ、該赤血球ゴー
ストを動物細胞と融合させる方法が知られている
（たとえば、International Review of
Cytology、vol.62、26〜67頁参照）。この方法で
は、赤血球懸濁液の浸透圧を変化させることによ
つてDNAを赤血球ゴースト内に取り込ませるの
であるが、実際にはDNAはほとんど取り込まれ
ず、また取り込まれる場合でも低分子のDNAの
みが取り込まれるにすぎない。そのため、目的と
する動植物細胞の遺伝形質の変換を満足し得る程
度に行なうことは出来なかつた。
本発明者は、赤血球にDNAを効率よく取り込
ませる方法について研究を重ねた結果、DNAを
含む溶液に赤血球を懸濁し、この懸濁液を急速に
凍結したのち解凍することによりDNAが赤血球
内に封入されることを知見し、しかもこの場合に
封入されるDNA量は従来法よりも多いことを見
出した。さらに、赤血球内に取り込まれるDNA
はその分子量を問わず、高分子量のものでも封入
される。したがつて、このようにして得られた
DNAを封入した赤血球ゴーストを動植物細胞と
融合せしめれば、多量のDNAが、しかもその分
子量の制約を受けることなく該細胞内に導入され
ることとなる。本発明はかかる知見に基づいて完
成されたものである。
ませる方法について研究を重ねた結果、DNAを
含む溶液に赤血球を懸濁し、この懸濁液を急速に
凍結したのち解凍することによりDNAが赤血球
内に封入されることを知見し、しかもこの場合に
封入されるDNA量は従来法よりも多いことを見
出した。さらに、赤血球内に取り込まれるDNA
はその分子量を問わず、高分子量のものでも封入
される。したがつて、このようにして得られた
DNAを封入した赤血球ゴーストを動植物細胞と
融合せしめれば、多量のDNAが、しかもその分
子量の制約を受けることなく該細胞内に導入され
ることとなる。本発明はかかる知見に基づいて完
成されたものである。
本発明はDNAを含む等張水溶液に赤血球を懸
濁した懸濁液を急速に凍結せしめた後解凍して得
たDNAを封入している赤血球ゴーストと、動物
細胞またはプロトプラスト化した植物細胞とを融
合せしめることにより、動物細胞または植物細胞
にDNAを取り込ませることを特徴とする動植物
細胞の遺伝形質変換方法である。
濁した懸濁液を急速に凍結せしめた後解凍して得
たDNAを封入している赤血球ゴーストと、動物
細胞またはプロトプラスト化した植物細胞とを融
合せしめることにより、動物細胞または植物細胞
にDNAを取り込ませることを特徴とする動植物
細胞の遺伝形質変換方法である。
本発明に用いる赤血球は特に制限されないが、
赤血球内にDNAが含まれていない哺乳類の赤血
球が好ましい。赤血球の採取は普通の方法、たと
えば抗凝血剤の入つた注射器で採血したのち、等
張燐酸緩衝液（PBS、PH7.2）で洗浄し、遠心分
離により白血球と血清を除くことによつて得られ
る。このようにして得た赤血球は生理食塩水に懸
濁して保存する。
赤血球内にDNAが含まれていない哺乳類の赤血
球が好ましい。赤血球の採取は普通の方法、たと
えば抗凝血剤の入つた注射器で採血したのち、等
張燐酸緩衝液（PBS、PH7.2）で洗浄し、遠心分
離により白血球と血清を除くことによつて得られ
る。このようにして得た赤血球は生理食塩水に懸
濁して保存する。
また、DNAを溶解する等張水溶液についても
任意のものを使用できるが、通常はPHを中性付近
に保つために適したPBSなどのバツフアーを用い
る。赤血球内に封入されるべきDNAについては
分子量の制約がなく、低分子量のものから高分子
量のものまで可能であり、目的に応じて適切な
DNAを選択すればよい。たとえばホルモン、酵
素などの有用物質の生産を司るDNA、高等動植
物の育種、品種改良に有用なDNAなどを適宜選
択することができる。等張液中のDNA濃度につ
いては任意であるが、低濃度であれば赤血球内に
取り込まれる量も当然に少なくなる。しかし、
DNAを高濃度に存在させても一部は利用されず
に懸濁液に残存するので無駄がある。
任意のものを使用できるが、通常はPHを中性付近
に保つために適したPBSなどのバツフアーを用い
る。赤血球内に封入されるべきDNAについては
分子量の制約がなく、低分子量のものから高分子
量のものまで可能であり、目的に応じて適切な
DNAを選択すればよい。たとえばホルモン、酵
素などの有用物質の生産を司るDNA、高等動植
物の育種、品種改良に有用なDNAなどを適宜選
択することができる。等張液中のDNA濃度につ
いては任意であるが、低濃度であれば赤血球内に
取り込まれる量も当然に少なくなる。しかし、
DNAを高濃度に存在させても一部は利用されず
に懸濁液に残存するので無駄がある。
一方、DNAを含む等張液に懸濁する赤血球の
量については、一般的には赤血球１（packed
volume）に対して液体４以上となるようにする
ことが望ましい。
量については、一般的には赤血球１（packed
volume）に対して液体４以上となるようにする
ことが望ましい。
上記懸濁液を凍結する場合、−10℃以下の温度
とすることが望ましく、冷媒としては冷凍アルコ
ール、ドライアイス・アセトン、液体窒素などの
既知のものの中から適当なものを選択すればよ
い。本発明では懸濁液を急速に凍結（１分〜30分
程度）させることが必要であり、そのためには、
たとえば上記冷媒中で懸濁液をゆつくり撹拌しな
がら凍結させるとよい。
とすることが望ましく、冷媒としては冷凍アルコ
ール、ドライアイス・アセトン、液体窒素などの
既知のものの中から適当なものを選択すればよ
い。本発明では懸濁液を急速に凍結（１分〜30分
程度）させることが必要であり、そのためには、
たとえば上記冷媒中で懸濁液をゆつくり撹拌しな
がら凍結させるとよい。
次に、凍結した懸濁液を解凍して用いるが、解
凍は室温に放置すればよい。かくしてDNAが封
入された赤血球ゴーストが得られる。
凍は室温に放置すればよい。かくしてDNAが封
入された赤血球ゴーストが得られる。
動植物細胞についても目的に応じて適切なもの
を選択すればよく、育種や品種改良を目的とする
ときは高等動植物の細胞を用いる。一方、有用な
物質の生産に利用するときは動植物の培養細胞を
用いる。もちろん、下等動植物細胞であつてもよ
い。しかし、細胞の大きさが小さすぎるものは適
当でない。なお、植物細胞については予めプロト
プラスト化しておく必要がある。プロトプラスト
化は既知の手法によつて行なうことができ、たと
えば植物細胞にβ−１・３−グルカナーゼを作用
させて細胞壁を溶解、除去する方法が適用でき
る。
を選択すればよく、育種や品種改良を目的とする
ときは高等動植物の細胞を用いる。一方、有用な
物質の生産に利用するときは動植物の培養細胞を
用いる。もちろん、下等動植物細胞であつてもよ
い。しかし、細胞の大きさが小さすぎるものは適
当でない。なお、植物細胞については予めプロト
プラスト化しておく必要がある。プロトプラスト
化は既知の手法によつて行なうことができ、たと
えば植物細胞にβ−１・３−グルカナーゼを作用
させて細胞壁を溶解、除去する方法が適用でき
る。
動物細胞とDNAの封入された赤血球ゴースト
を融合させる方法は、センダイウイルス（HVJ）
を用いる方法やポリエチレングリコールまたはポ
リビニルアルコールを用いる方法が知られてい
る。また、植物細胞のプロトプラストとゴースト
との融合にはポリエチレングリコールまたはポリ
ビニルアルコールが用いられる。たとえば次の方
法により行なうことができる。タバコ
（Nicotiana tabacum L.cv Samsun）の12〜15葉
期の中葉を取り、裏表皮をピンセツトで剥離し、
剥離面を酵素液〔１％ Cellulase Onozuka Ｒ
−10、0.05％ Macerozyme Onozuka Ｒ−10
（Kinki Yakult Co.）0.5Mマンニツト、PHは薄い
KOHで5.8に調製〕に浮かべ26℃で３時間時々か
き混ぜながら培養する。培養後、４層のガーゼで
濾過し、未分解の組織等を除く。プロトプラスト
懸濁液を700rpm、２分間の遠心分離を行ない、
プロトプラストを集める。このペレツトに0.5M
マンニツトを加え３回遠心洗浄を行なう。次に、
10ｍＭ CaCl2、20％ポリエチレングリコール、
0.7Mマンニツトを含む10ｍＭ Tris−HCl、PH
7.6を２mlワツセルマンに入れ、約108個／mlの赤
血球ゴースト35μとプロトプラストのペレツト
50μを同時に加え素早く混合する。37℃で15分
間培養したのち10ｍＭ CaCl2を含む0.7Mマンニ
ツトを８ml加えよく混ぜ合わせる。
を融合させる方法は、センダイウイルス（HVJ）
を用いる方法やポリエチレングリコールまたはポ
リビニルアルコールを用いる方法が知られてい
る。また、植物細胞のプロトプラストとゴースト
との融合にはポリエチレングリコールまたはポリ
ビニルアルコールが用いられる。たとえば次の方
法により行なうことができる。タバコ
（Nicotiana tabacum L.cv Samsun）の12〜15葉
期の中葉を取り、裏表皮をピンセツトで剥離し、
剥離面を酵素液〔１％ Cellulase Onozuka Ｒ
−10、0.05％ Macerozyme Onozuka Ｒ−10
（Kinki Yakult Co.）0.5Mマンニツト、PHは薄い
KOHで5.8に調製〕に浮かべ26℃で３時間時々か
き混ぜながら培養する。培養後、４層のガーゼで
濾過し、未分解の組織等を除く。プロトプラスト
懸濁液を700rpm、２分間の遠心分離を行ない、
プロトプラストを集める。このペレツトに0.5M
マンニツトを加え３回遠心洗浄を行なう。次に、
10ｍＭ CaCl2、20％ポリエチレングリコール、
0.7Mマンニツトを含む10ｍＭ Tris−HCl、PH
7.6を２mlワツセルマンに入れ、約108個／mlの赤
血球ゴースト35μとプロトプラストのペレツト
50μを同時に加え素早く混合する。37℃で15分
間培養したのち10ｍＭ CaCl2を含む0.7Mマンニ
ツトを８ml加えよく混ぜ合わせる。
かくして、DNAが取り込まれた動植物細胞が
得られる。この場合、動植物細胞に融合する赤血
球ゴーストは１個のみのときもあるが、複数個の
赤血球ゴーストが融合することもある。このよう
なときには、DNAが取り込まれる量も多くな
る。
得られる。この場合、動植物細胞に融合する赤血
球ゴーストは１個のみのときもあるが、複数個の
赤血球ゴーストが融合することもある。このよう
なときには、DNAが取り込まれる量も多くな
る。
このように、本発明によればDNAの種類が制
約されずに、しかも多量に動植物の細胞の細胞質
へDNAを直接導入することができるので、宿主
細胞の遺伝形質が変換される確率は従来のリン酸
カルシウム法に比べて非常に高いものとなる。さ
らに本発明の特徴は同時に多量の細胞にDNAを
導入できることであり、標的細胞の数には制限は
ないことである。
約されずに、しかも多量に動植物の細胞の細胞質
へDNAを直接導入することができるので、宿主
細胞の遺伝形質が変換される確率は従来のリン酸
カルシウム法に比べて非常に高いものとなる。さ
らに本発明の特徴は同時に多量の細胞にDNAを
導入できることであり、標的細胞の数には制限は
ないことである。
次に、本発明を実施例により説明する。
実施例 １
DNAとしてプラスミドpBR322に単純ヘルペス
ウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子を組込ん
だものを用い、このDNAをPBS（リン酸緩衝生
理食塩水、PH7.2）に１mg/mlとなるように溶解
し、これにヒト赤血球（２×109程度の個数）0.2
ml（packed volume）を加えた。次に、これを
冷媒ドライアイス−アルコール（−80℃）にゆる
く振とうしながら浸漬して凍結させた。凍結した
のち取り出し、室温下で解凍せしめた。解凍した
ヒト赤血球をPBSにて5000rpm、５分の条件で洗
浄した。このようにして得られた赤血球の中には
ヘモグロビンの代りにDNAが封入されている。
ウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子を組込ん
だものを用い、このDNAをPBS（リン酸緩衝生
理食塩水、PH7.2）に１mg/mlとなるように溶解
し、これにヒト赤血球（２×109程度の個数）0.2
ml（packed volume）を加えた。次に、これを
冷媒ドライアイス−アルコール（−80℃）にゆる
く振とうしながら浸漬して凍結させた。凍結した
のち取り出し、室温下で解凍せしめた。解凍した
ヒト赤血球をPBSにて5000rpm、５分の条件で洗
浄した。このようにして得られた赤血球の中には
ヘモグロビンの代りにDNAが封入されている。
上記の如くして得たヒト赤血球ゴーストをPBS
に10重量％となるように懸濁した。一方、チミジ
ンキナーゼ欠損のマウスＬ細胞を同じPBSに10重
量％となるように懸濁した。これら２種の懸濁液
のそれぞれ0.25mlを40℃の下で混合した。
に10重量％となるように懸濁した。一方、チミジ
ンキナーゼ欠損のマウスＬ細胞を同じPBSに10重
量％となるように懸濁した。これら２種の懸濁液
のそれぞれ0.25mlを40℃の下で混合した。
センダイウイルス1000HAU（赤血球凝集価の
単位）をペトリ皿に入れ、該ペトリ皿の上方20cm
の位置から20Wの紫外線を３分間照射して不活性
化した。このようにして不活性化したセンダイウ
イルス0.5mlを前記の懸濁液混合物0.5mlと混ぜて
４℃で15分間放置したのち、振とうしながら37℃
に昇温した。これにより赤血球と細胞の間で融合
が起こり赤血球中のDNAがＬ細胞内に取込まれ
た。
単位）をペトリ皿に入れ、該ペトリ皿の上方20cm
の位置から20Wの紫外線を３分間照射して不活性
化した。このようにして不活性化したセンダイウ
イルス0.5mlを前記の懸濁液混合物0.5mlと混ぜて
４℃で15分間放置したのち、振とうしながら37℃
に昇温した。これにより赤血球と細胞の間で融合
が起こり赤血球中のDNAがＬ細胞内に取込まれ
た。
この細胞をHAT培地に培養し、分裂した細胞
数（％）を４日後に調べた。さらに、3H−チミ
ジン存在下で２日間培養し、オートラジオグラフ
で3Hの核への取り込みを観察することによつて
チミジンキナーゼ活性を新しい遺伝形質として獲
得して、細胞の遺伝形質が変換されたことを確め
た。
数（％）を４日後に調べた。さらに、3H−チミ
ジン存在下で２日間培養し、オートラジオグラフ
で3Hの核への取り込みを観察することによつて
チミジンキナーゼ活性を新しい遺伝形質として獲
得して、細胞の遺伝形質が変換されたことを確め
た。
Claims (1)
- １ DNAを含む等張水溶液に赤血球を懸濁した
懸濁液を急速に凍結せしめた後解凍して得た
DNAを封入している赤血球ゴーストと、動物細
胞またはプロトプラスト化した植物細胞とを融合
せしめることにより、動物細胞または植物細胞内
にDNAを取り込ませることを特徴とする動植物
細胞の遺伝形質変換方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57042959A JPS58162295A (ja) | 1982-03-19 | 1982-03-19 | 動植物の遺伝形質変換方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57042959A JPS58162295A (ja) | 1982-03-19 | 1982-03-19 | 動植物の遺伝形質変換方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58162295A JPS58162295A (ja) | 1983-09-26 |
| JPS6114795B2 true JPS6114795B2 (ja) | 1986-04-21 |
Family
ID=12650561
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57042959A Granted JPS58162295A (ja) | 1982-03-19 | 1982-03-19 | 動植物の遺伝形質変換方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58162295A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106267421B (zh) * | 2016-07-01 | 2019-01-22 | 翁炳焕 | 母胎血型不合血浆净化器 |
-
1982
- 1982-03-19 JP JP57042959A patent/JPS58162295A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58162295A (ja) | 1983-09-26 |
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