JPS61112097A

JPS61112097A - 新規なトリペプチド類およびそれらの使用

Info

Publication number: JPS61112097A
Application number: JP60178692A
Authority: JP
Inventors: ピエール・ジヨル; ダニエル・ミグリオル―サムール; フアビアンヌ・パルケル
Original assignee: Rhone Poulenc Sante SA
Current assignee: Rhone Poulenc Sante SA
Priority date: 1984-08-16
Filing date: 1985-08-15
Publication date: 1986-05-30
Also published as: FR2569111A1; EP0174245B1; FR2569111B1; US4716151A; ATE31418T1; EP0174245A1; DE3561201D1; CA1253072A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は免疫刺激剤類および七れらの使用に関するもの
である。

米国特許番号４４６２９９０および日本特許出願番号８
１１５０３１９２に対応するヨーロッパ特許ＥＰＯＯ４
９６６６（ＩＮＳＥＲＭ、１９８２年４月１４日公告）
中には、入間のカゼインの酵素氷解物（ｅｎｚｙｍｅ　
　ｈｙｄｏｒｏｌｙｓａｔｅｓ）の分別により１すられ
る生物学的に活性な物質類およびそれらを含有している
組成物類が記されている。

特に、脱脂され可溶性にされた人１１ｊのカゼインを３
７℃において２４時間にわたりトリプシンで処理するこ
とにより生じた水溶性留分をセファデックス（Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ）Ｇ−５０カラム上で分別すると、「物質類■
、■および■」と称されている３種の生物学的に活性な
留分類が生成し。

特に「物質Ｖ」はＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラ
ム上で精製したときには８の範囲内のＰＨの緩衝溶液を
用いて溶出するとｒＭＪＨ２４Ｊとして知られている中
性物質を生成し、そして次に３．５の範囲内のｐＨの緩
衝溶液を用いて溶出するとｒＭＪＨ６３ＪおよびｒＭＪ
Ｈ６５Ｊとして知られている酸性物質を生成する。

セファデックスＧ−１５上での謹過および脱塩（ｄｅｓ
ａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）後に高速液体グロマトグラフ
ィ（ＰＨＬＣ）によりｒＭＪＨ６５」物質を精製すると
、トリペプチドを単離でき、そしてそれの構造はＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　（Ｉ）の順序に相当している。

式ＣＩ）のトリペプチドの構造は、 −１１０℃における１８時間にわたる６Ｎ塩酸を用いる
完全な加水分解により、 −Ｎ−末端アミノ酸の性質を測定するためのダンシレ−
シ、ン（ｄａｎｓｙｌａｔ　１ｏｎ）により、一力ルポキシベプチダーゼＡの作用により。

−ベックマン順序モデル８９０Ｃを用いる自動的デグラ
デーションにより、測定された。

式（Ｉ）のドーリペプチド並びにペプチド化学で使用さ
れている一般的な方法の適用により（例えばフランス特
許ＦＲＩ、４９７，５３６中に記されている方法に従い
）容易に合成ｕｆ　ｉｌｉ、な３種のアミノ酸類すなわ
ちグリシン、ロイシンおよびフェニルアラニンまたはチ
ロシンの組み合わせである同様なトリペプチド類は、顕
著な免疫刺激性を有する。新規なトリペプチド類では、
３種のアミノ酸残基のうちの１種または２種はグリシン
またはロイシンから誘導され、そして３種の残基のうち
の２種は同じアミノ酸から誘導することもできる特に、
式（Ｉ）のトリペプチドおよび上記の同様なトリペプチ
ド類は、Ｊ、ミッチェル（Ｍｉｃｈｌ）他のジャーナル
・オプ・エクスペリメンタル・メゾシン（Ｊ、ｅｘｐ、
Ｍｅｄ、）、工Ａ１．１４６５　（１９７６）の技術に
従う大食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ　　ｍａｃｒｏｐ
ｈａｇｅｓ）数増加試験において１０−５〜１０−７Ｍ
の濃度において活性であることが示されている。

本発明は、本発明に従う少なくとも１種のトリペプチド
を、相容性でありそして製薬学的に許容可能な１種以上
の希釈剤または賦形薬と組み合わせて含有している。製
薬学的組成物類も提供する。これらの組成物類は感染剤
（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　　ａｇｅｎｔｓ）の除去を促
進および増加させるために使用できる。感染に対する免
疫を促進する非−特異性免疫刺激剤として、本発明に従
うトリペプチド類を０．１−１００ｍｇ／ｋｇの間の投
与量で非経口的に（静脈内、皮膚または筋肉内に）、ｆ
＃内に、経口的にまたは直腸内に、適用できる。

経口的投与用の固体組成物類としては、錠剤類、丸薬類
、粉剤類または顆粒類を使用できる。

これらの組成物類中では、活性生成物を例えば庶糖、乳
糖または澱粉の如き１種以上の希釈剤類と混合する。こ
れらの組成物類は希釈剤以外の物質類、例えばステアリ
ン酸マグネシウムの如き潤滑剤類、も含有できる。

経口的投与用の液体組成物類としては、例えば水または
液体パラフィンの如き不活性希釈剤類を含有している製
薬学的に許容可能な乳化液類、溶液類、ｆｉｐｉ液類、
シロップ類またはエリキシル類を使用できる。これらの
組成物類は希釈剤以外の物質類、例えば湿潤剤、甘味剤
または香味生成物類を含有できる。

非経口的投芋用の組成物類は殺菌性水溶液類であること
ができ、または懸濁液もしくは乳化液であることもでき
る。賦形薬としては、ポリエチレングリコール、ポリプ
ロピレングリコール、植物油類、特にオリーブ油、およ
び注射用有機エステル類、例えばオレイン酸エチル、を
使用できる。

これらの組成物類はまた佐薬類、特に湿潤剤類、乳化剤
類または分散剤類１、も含有できる。

殺菌は数種の方法で実施でき１例えば殺菌性フイルター
により１組成物中への殺菌剤の添加により、または加熱
により、実施できる。それらはまた例えば照射殺菌され
た固体組成物の形で製造することもでき、それらを任意
に使用時に殺菌水中に溶解させるかまたは他の注射用殺
菌性媒体中に分散させることができる。

鼻内投与用の組成物は殺菌性水溶液であることもでき、
または懸濁液もしくは乳化液であることもでき、それら
を任意に相容性の抛射剤と組み合わせることもできる。

直腸内投与用の組成物類は生薬であり、それらは活性生
成物の他に例えばココアバターまたは半合成グリセリド
の如き賦形薬類を含有できる。

下記の実施例は式Ｉのトリペプチドの単離およびそれを
含有している組°酸物類を説明するものである。

実施例１単離に関してヨーロッパ特許ＥＰＯＯ４９６６６の実施
例２中に記されているような物質ｒＭＪＨ６５］をセフ
ァデックスＧ−１５カラム上での濾過により精製した。

高さが１２０ｃｍで１０径が１．２ｃｍのカラムを使用
した。１０％強度酢酸を使用して溶出し、０．６ｃｃ留
分を９　ｃ　ｃ　／　ＩＩ！「間の流速で集めた。

溶出図を第１図に示し、そこでは留分番号が横座標とし
てプロットされており、そして２８０ｎｍにおける吸収
が縦座標としてプロットされている。

８１．６および８８．８ｃｃの間（留分類１３６〜１４
８）で溶出された留分子ＭＪＨ２１０」並びに８８．９
および１１４ｃｃの間（留分類１４９〜１９０）で溶出
された留分子ＭＪＨ２１１」がこのようにして集められ
た。

留分子ＭＪＨ２１０」を高さが１４ｃｍでそして直径が
１．４ｃｍのダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）５０Ｘ４カラ
ムで脱塩（ｄｅｓａｌｉｆｉｅ　　　　　　　　　　　
［ｄ）した。

２４ｃｃ／時の流速で溶出剤として０．０５Ｎ塩酸（ｔ
ｏｏｃｃ）、水（ｌｏＯｃｃ）および次に２Ｎアンモニ
ア溶液を使用して４．３ｃｃ留分を集めて溶出を行った
。

このようにして２Ｍアンモニア溶液を用いて３４．４〜
８１．７ｃｃの間で溶出された留分「３」が集められた
。

この留分「３」を逆転相ＨＰＬＣにより長さが３０ｃｍ
で直径が７．８ｍｍの半一分取予備力ラム（ポンダパッ
クＣｌ８−ＪＡカラム、ウォーターズ）上で精製した。

０．５ｃｃ留分を集め、その際の溶出速度はｌｃｃ／分
であった。

最初に、カラムを０．１％強度トリフルオロ酢酩（溶出
剤Ａ）で緩衝した。

水中にトリフルオロ酸ｉ（０，１容！を一％）およびア
セトニトリル（７０容に％）を含有している溶出剤（溶
出剤Ｂ）を製造した。

下表に従い進行する線状の溶出勾配を使用して溶出を行
った：時１ｉｆｔ　（分）　　溶出剤Ａ溶出剤Ｂｏ　　　　　
　　　　　ｔｏｏ　　　　　　　　　　　　。

溶出は、２８０ｎｍにおいて値を読みとることによりそ
して４９０ｎｍにおけるフルオレスカミンとの反応後の
蛍光により追跡された。

溶出図を第２図に示す。

８３〜８５分の間で溶出された留分番号１５は、式（Ｉ
）の純粋なトリペプチドを含有していた。

式（Ｉ）のトリペプチドの構造は、 −グリシン（Ｇｌｙ）＝１、ロイシｙ（Ｌｅｕ）＝１お
よびフェニルアラニン（Ｐｈｅ）＝１の存在を示す、６
Ｎ塩醸を用いるｔｔｏ’ｃにおける１８時間の完全な加
水分解により、一グリシンであるＮ−末端アミノ酎の性質を測定するた
めのグンシレーションにより、 −（ＨＰＬＣおよび板上の視覚により測定された）アミ
ノ酸フェニルチオヒダントイン誘導体類の特性により異
段階の測定を用いるベックマン順序モデル８９０Ｃ１Ｏ
，１Ｍクアドｏ−ル（Ｑｕａｄｒｏｌ）プログラムでの
分析により、決定された。

実施例２ペプチド化学で使用されている一般的な方法を適用して
、下記のトリペプチド類が製造されたニーＧｌｙ−Ｐｈ
ｅ−Ｌｅｕ −Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｙ−Ｐｈｅ −Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ｃｉｙ −Ｌｅ　ｕ−Ｐｈｅ−Ｇ　ｌ　ｙ −Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ −Ｇ　１　ｙ−Ｔｙ　ｒ−Ｌｅ　ｕ −Ｌｅ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｔｙ　ｒ −Ｔｙ　ｒ−Ｌｅ、ｕ−Ｇ　ｌ　ｙ −Ｌｅ　ｕ−Ｔｙ　ｒ−Ｇ　Ｉ　ｙ −Ｔｙ　ｒ−Ｇ　１　ｙ−Ｌｅ　ｕ −Ｇ　ｌ　ｙ−Ｌｅ　ｕ−Ｔｙ　ｒ −Ｌｅ　ｕ−Ｌｅ　ｕ−Ｔｙ　ｒ実施例３一般的な技術に従い、下記の組成を有する静脈内投与可
能な液体組成物を製造したニ一式（ｒ）のトリペプチドー−−−−５０ｍｇ−注射用
溶媒一−−−−−−−−−−−５ｃｃ。

【図面の簡単な説明】

第１図は１ＭＪＨ６５のセファンデクスＧ−１５カラム
による分離を示す溶出図である。横ｐｐ標は留分番号を
示し、縦座標は２８０ｎｍにおける吸収を示す。第２図は、逆転相ＨＰＬＣによる分離を示す溶出図であ
る。横座標は保持時間を示し、縦座標は蛍光単位を示す
。Ｃ〜　　−一′

Claims

【特許請求の範囲】１、アミノ酸類であるグリシン、ロイシンおよびフェニ
ルアラニンまたはチロシンからなるトリペプチド。２、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅである、特許請求の範囲第
１項記載のトリペプチド。３、脱脂され可溶性にされた人間のカゼインから得られ
た生成物であるＭＪＨ６５を分別し、そして免疫刺激剤
活性を有する留分を単離することを特徴とする特許請求
の範囲第２項記載のトリペプチドの単離方法。４、特許請求の範囲第１または２項記載のトリペプチド
を、相容性のそして製薬学的に許容可能な１種以上の希
釈剤と組み合わせてなる、製薬学的組成物。