JPS6058069A - Νａｄ（ｐ）ｈオキシダ−ゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は、新規な、安定で、かつＮＡＤＨおよびＮＡＤ
ＰＨのいずれをも酸化する活性を有するｒｙｈｎ（ｐ）
ｕす番・ンぶ−ゼの一浩古辻ｆ間ナス＆のである。

〔発明の背景〕

近年、生体におけるすぐれた、化学反応触媒である酵素
を化学工業をはじめとする諸産業へ利用することが、検
討されている。これらの中で、エネルギーの供給系や酸
化還元系などを含む複合的な酵素反応を利用するバイオ
リアクター（生体反応装置ンの開発が試みられているが
、そのためには補酵素の効率的転換を行う酵素が必要と
される。

酸化還元系においてはＮＡＤ　にコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド。以下同じ。）あるいはＮＡＤＰ　にコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸。以下同じ。

）が、しばしば用いられ、これらは酵素反応で基質によ
りＮＡＩＪＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド。以下同じ。）あるいはＮＡＤＰＨ（還元型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸。以下同じ。

）に還元されるが、バイオリアクターの効果的運転のた
めには、これらＮＡＩ）ＨあるいはＮＡＤＰＨを他の酵
素によシ酸化し、ＮＡＤあるいはＮＡＩ）Ｐに効率よく
再生することが不可欠である。またＮＡＤあるいはＮＡ
ＤＰの還元に伴う酵素反応を測定するための副酵素系と
してもこのような酵素の開発が望まれる。

この際、種々の基質の還元と共役させて、ＮＡＤＨある
いはＮ　Ａ　］）　Ｐ　Ｈを酸化する酵素は種種存在す
るが、酸素によシ直接ＮＡＤＨあるいはＮＡＩ）ＰＨの
酸化を触媒する活性を有するオキシダーゼは反応の副成
物が水のみであシ、基質の導入、生成物の除去などの前
処理、後処理が簡単となるため、最も望ましい酵素であ
る。またバイオリアクターに組込むためには安定である
ことが望ましい。

本発明者らは、上記の観点から、常温での活性が高く、
かつ安定なＮＡＤ（ＰＩＨオキシダーゼを得るべく鋭意
研究した結果、中等度好熱菌であるバチルス・ステアロ
サーモフィルスよυ、安定であシ、かつＮＡＤＨおよび
Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈのいずれをも酸化しうるＮＡＤ■Ｈ
オキシダーゼを見出し、本発明を完成した。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、特に熱的に安定なＮＡＤ（ト）ｌ（オ
キシダーゼの製造方法を提供することにある。

〔発明の概要〕

本発明におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの製造方法
は、好熱性細菌バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐ旧１ｕｓ
）の培養物からＮＡＤＨ及びＮＡＤＰ）（のいずれをも
酸化し得るＮＡＤ■Ｈオキシダーゼを採取することを特
徴とする 特ニパチルス・ステアロサーモフイルスヲ定常状態まで
生育させ、この菌体を超音波破壊して後カラムクロマト
グラフィーにかけることが望ましい。

本発明において使用する細菌はバチルス・ステアロサー
モフィルスであシ、これに属する各種菌株はいずれも本
酵素を生産する能力を有する。

本菌株の培養は液体培養で行い、培地には微生物の培養
に際して通常用いられる種々の炭化水素。

天然栄養源、ビタミン、無機塩類は全て用いることがで
きる。特に窒素源としてはペプトン、イースト・エキス
、カゼイン、コーン・ステイープリカーなどが好適に利
用され、これら栄養源を炭素源とした培地での培養も可
能であるが、これに少量のブドウ糖を加えることにより
菌の生育が促進される。堵責温度は４５〜６５Ｃ１好ま
しくは５５°〜６０Ｃである。例えば通気攪拌下、温度
６０Ｃ１初発ｐ　）ｌ　７で培養すると通常２〜３時間
で培養は終了する。

用警終了後、培養液よシＮＡＩ）（）’）Ｈオキシダー
ゼを採取するには、一般の採取法を用いることが出来る
が、本酵素は凶体内酵素であるため、菌体を培心分離、
濾過などによシ集め、緩衝液に懸濁後、（ｍ＞音波、高
圧ポモジナイザー、フレンチプレスあるいは機械的磨砕
などによシ菌体を破壊し、酵素を菌体外に排出し、可溶
化させる。この際、タンパク質分解酵素の阻害剤である
フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、＄
るいはジイソプロピルフルオロリン酸（１１ＦＦ）なに
よシ、収量が向上する。この際、少量の金属キレート剤
を加えることによシ、さらに酵素を安定に採取すること
が出来る。この溶液を濾過、遠心分離などによシ菌体の
破壊物を除く。このようにして得られた粗酵素標品を更
に精製するには、セファデクス（ファルマ７ア社の製品
名）、七フアクリル（ファルマシア社の製品名）、バイ
オゲル（バイオラド社の製品名）などによるゲル濾過。

イオン交換セルロース、イオン交換セファデクス（ファ
ルマシア社の製品名）、ノ・イドロキシアバタイトなど
を用いたクロマトグラフィー、あるいは硫安塩析、有機
溶媒沈澱など通常の酵素精製技術も適宜選択し、組合せ
て実施すればよい。

次に本発明によるＮＡＤＱ’）Ｈオキシダーゼの諸性質
について述べる。

■　作用及び基質特異性 ＮＡＤＨ！るいはＮＡＤＰＨのいずれにも作用し、酸素
によシこれらを酸化し、ＮＡＤあるいはＮＡＤＰを生成
する。

噂だ、太′ｆＭ壺！＋層書の什ｈＫ、ジクロロフェノー
ルインドフェノール、メナジオン（ビタミンＫｎ）。

フェリシアン化カリウム、あるいはフェリシアン化ナト
リウムによ、９ＮＡＤ）ｌあるいはＮＡＤＰＨを酸化す
るデヒドロゲナーゼ活性も有する。

■　活性化 、１％Ｘはフジピシアデニンジヌクレオテド（ＦＡＤ）
の添加によシＮＡＤＨを基質とした場合、５〜１０倍活
性化される。ＮＡＤＰＨを基質とした場合、中性および
弱アルカリ性では活性化の効果はなく、ｐ　Ｈ７以下で
は１．５〜３倍の活性化が認められる。

■　至適ｐＨ ＦＡＤ非存在下（無添加時ンではＮＡＤＨを基質とした
場合（第１図の曲＃１）、ｐＨ７〜１１、ＮＡＤＰＨを
基質としたとき（第２図の曲線１１１）、ｐ　ｌ（５，
５〜７．５であシ、ＦＡＤｌ、２ｍＭ添加時においては
、ＮＡＤＨを基質とした場合（第１図の曲ａｒ１＞　ｐ
Ｈｓ、ｓ　〜９、ＮＡＤＰＨを基質とした時（第２図の
曲線ｉＶ　）、ｐＨ５，７〜７である。尚、第１図、第
２図共、ＦＡＤ無添加時における酵素活性の最大値を１
００チとした。

■　作用適温の範囲 第３図、第４図は温度−活性曲線でおシ、第３図はＮ　
Ａ　Ｄ　）ｉを基質とした場合、第４図はＮＡＤＰＨを
基質とした場合である。いずれも５０°Ｃにおける酵素
活性を１００チとした。

ＮＡＤＨを基質とした場合（第３図）及びＮＡＤｐＨを
基質とした場合（第４図）、共に常温よ、！！７５０Ｃ
〜６０Ｃまで温度の上昇とともに活性は増大する。

■　耐熱性 第５図は酵素の熱安定性を示したもので、曲線Ｖは５０
Ｇ加熱における残存活性を示し、曲線ｖ１は７０ｔｒ加
熱における残存活性を示す。いずれにしても基質はＮＡ
ＤＨである。

第５図に示す通ル本酵素は５０Ｃ１２時間の加熱に対し
ては全く活性を失わず、７（１，２時間の加熱に対して
も約５５チの活性を保持する熱安定な酵素である。

■　分子量 ヒファデクスＧ−２００（ファルマシア社製）によるゲ
ル１１７５過の結果から、分子量は１５〜１９万とＪ１
定される。タンパク質分解酵素の阻害剤を用いない場合
は分子量８〜１ｏ万の酵素が得られる。

■　力価測定法 ＮＡＩＪＨｉｐ化においては０．２ｍＭＮＡＤＨを含む
５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）を調製する
。この反応液に適当量のＮＡＤ［Ｆ］Ｉ（オキシダーゼ
を加えることによυＮＡＤＨは溶液中の酸素によシ酸化
されてＮＡＤを生成する。この反応をＮ　Ａ　Ｄ　Ｈの
示す３４（１ｍにおける吸光度の減少の時間変化によシ
カ価を測定する。１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨを
酸化せしめる酵素活性をもって１単位とする。ＦＡＤ添
加時の力価は反応液に０．５　ｎｌ　ＭのＦＡＤを添加
して反応させてめる。酸素以外の物質にょるＮ　Ａ　Ｊ
）　Ｈの酸化反応の力価は通常容器あるいは空気を窒素
に置換した密閉容器中で、帥記の反応液に０．４　ｍ　
ＭのジクロロフェノールλソＬ′７丁ノー１１．　Ｊ　
、Ｊ−’−上１１＋エリシアン化カリウム、あるいはフ
ェリシアン化ナトリウムを添加し、同様の方法によ請求
める。

ＮＡＤＰＨの酸化の力価をめる場合は、０，２ｍＭＮＡ
ＤＰＨを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，
０）の反応液を用い、Ｎ　Ａ　ｌ）　Ｐ　Ｉ−１のもつ
３４　Ｑ　ｎｍの吸光度によｐＮＡＤＩ（の場合と同様
に行う。

〔発明の実施例〕

次に本発明の実施例を示す。

ポリペプトン１％、イースト・エキス０．５％。

塩化ナトリウム０．５　％　、ブドウ糖ｏ、ｉｓからな
るｐＨ７，２に調整した培地１５０−を含む５００　ｍ
ｌ坂ロフラスコにバチルス・ステアロサーモフィルスＩ
ＡＭ１１００４を接種し、６０？？にて振盪培養を行っ
た。約２時間で菌の増殖は定常期に達し、この時点で培
養を終了し集菌した。得られた菌体量は５ｇ／ｌ（湿量
）であった。１体は一２０Ｃで凍結することによシ最低
１年間は安定であった。

一体約２０ｇを２倍量の、０．２　ｍ　ＭのＰＭＳＦ及
び５０ｍＭ塩化カリウムを含む５０ｍＭ）リスー塩酸緩
衝液（ｐＨ７）に懸濁し、超音波破砕器にて３分間、９
回の破砕を行い、遠心分離によ多細胞破砕物を除去し、
ＮＡＤ助Ｈオキシダーゼの粗抽出液を得た。この粗抽出
液には８４単位（ＦＡＤ無添加時）のＮＡＤ（ト）Ｈオ
キシダーゼがあった。

この抽出液に硫安塩析を行い、２０％〜３５チ飽和区分
での沈澱を集め、上記の緩衝液に透析後、あらかじめ同
じ緩衝液で平衡化しであるセファデクスＧ−２００（フ
ァルマシア社製）を用いゲル濾過を行った。最初に溶出
する細胞膜両分に基づ＜ＮＡＤ）Ｉオキシダーゼ画分を
除き、次に溶出するＮＡＤ（ト）Ｈオキシダーゼの活性
画分を集めた。

次に、この両分を、前記緩衝液にてあらかじめ平衡化し
たＤＥＡＥ−セルロースに吸着後回緩衝液を用い５０ｍ
Ｍ〜０．５Ｍの塩化カリウムの直線濃度勾配によシＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを溶出させた。

この酵素液を５１０Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７
，５）に透析後、同緩衝液であらかじめ平衡化したハイ
ドロキシアパタイトカラムに吸着させ５ｍＭから２００
ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５）の直線濃度
勾配にてＮＡＤ（ト）Ｈオキシダーゼを溶出させ、この
活性画分を集めることによＪ、２ｍｇのＮ　Ａ　Ｄ（Ｐ
ｉ　Ｈオキシダーゼを得た。

比活性はｌ　ＩＩＩ　ｇあたり２単位（ＦＡＩ）無添加
時）であった。粗酵素液からの回収率は５％であった。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明によれば特に熱的ニ安定な
ＮＡＤ（ト）Ｈオキシダーゼを得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第５図はいずれも本発明による案１図 ｐＨ 弔２ｍ 第３図 １度（°Ｃ） 弔４図 ０１０２０３０４０５０ 偏７ｔ　（°ｃ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、好熱性細菌バチルス・ステアロサーモフィルスの培
   養物から還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
   及び還元謔ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
   酸のいずれをも酸化し得るＮＡＤ（ト）Ｈオキシダーゼ
   を採取することを特徴とするＮＡＤ［Ｆ］Ｈオキシダー
   ゼの製造方法。 ２、特許請求の範囲第１項記載において、前記バチルス
   ・ステアロサーモフィルスを定常状態まで生育させ、こ
   の菌体を超音波破壊して後カラムクロマトグラフィーに
   かけることを特徴とするＮＡＩ）（ト）Ｈオキシダーゼ
   の製造方法。