JPS60501488A - ハイブリダイゼ−ション反応を実施する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ハイブリダイゼーション反応を実施する方法本発明はハイブリダイゼーションの 方法及び該方法に適した検出剤に関する。

ハイブリダイゼーションは２本の異なるポリヌクレオチド鎖についての塩基配列 の同一性の確認のための手段である。２本のＤＮＡ鎖は相補性塩基配列とともに 溶液状態で〜却すると互いに２重らせん構造を形成し、一本のＤＮＡ鎖及び一本 のＲＮＡ鎖は相補性構造とぴったり合体してＤＮＡ−１１ＮＡハイブリツドを形 成する。それ故ハイブリダイゼーションによりヌクレオチド化学の多くの問題、 たとえば特定の遺伝子または遺伝子断片の発見と単離、遺伝子配列の図をかくこ と等が解決される。

特に遺伝子工学の分野で特定の必要な遺伝子の発見は最終的で決定的な役割を演 じ、・・イブリダイゼーンヨンを可能にする。

ハイブリダイゼーションを実施するためには、必要とされる核酸に対する相補性 構造を有する核酸鎖がこの目的に使用されるが、その際再ひ見出すだめの適当な 方法で該構造に標識しておく。通常この標識は、この研究の行なわれてきた。こ の方法の重大な不利な点は、放射性物質によって研究する必要があり、広大な安 全対策と高ゝ性同位元素による標識を他の標識に変換する試みがすてになされて きた。

最近、ビオチンをピリミジンまたはプリン現ニ共有結合させたヌクレオチド同族 体が合成された。これらのヌクレオチド誘導体はＲＮＳ−およびＤＮＳ−ポリメ ラーゼの基質であって、これらの酵素の作用の下で形成されたポリヌクレオチド はそれらの相補性配列と特異的にハイブリッドを形成する。これらのプローブは 、放射性標識核酸の代替物として、親和性物質（たとえばアビジン−ペルオキシ ダーゼ）あるいは免疫学的（たとえばもう１つのペルオキシダーゼ担持抗体と結 合しているビオチン−抗体）指示系と結合させて使用される。同様にビオチン残 基はチトクロームＣ上でｌｌＮ５と結合し、ハイブリタイセルジョンは電子顕微 鏡的にはアビジン−指示系によって限定される。（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ／Ｂｅ ｒ１．５３．１０７−１１７Ｃ１９７５））。

この方法はいまだに比較的高くつき、さらに多くの合成工程を必要とする。従っ て相変らず、まりｍ）単なハイブリダイゼーションの方法、及びハイ７リダイセ ーシヨンの試薬であって、プローブとして適し、簡単につくれてハイブリダイゼ ーションの技術の感受閉を高めるものに対する必要性が存在する。

よって、本発明の課題はそのような方法及び試薬を提供することである。

この課題はポリヌクレオチドと特定の物質との複合体を形成し、このようにして 形成された複合体を・・イブリダイゼーション反応のために使用することによる ノ・イブリダイゼーション反応な実施する方法であって、一本領ポリヌクレオチ ド及び正に荷電した、核酸と結合している証明し得る蛋白質またはポリアミンを 溶液中で反応させ、生成した複合体を交叉結合剤で共有結合させ、得られたボυ ヌクレオチド化合物を未知のポリヌクレオチドの相補性配列の探索の際のノ・イ ブリダイゼーション実験において標識として使用することを特徴とする方法の発 明により解決する。

本発明の分野で正に荷電した蛋白質またはポリアミンとは、本来上のようガ特性 を有しているものかあるし・は、もしそれが負に荷電または中性てあったならば 対応する正に荷電した蛋白質またはポリアミンによって修飾されるものを意味す る。

従って、本発明は犬ぎな蛋白質分子をも標識として導入できる簡単なノ・イブリ ダイゼーンヨンのプローブの製造方法を提供する。この方法は正に荷電した蛋白 質まだはポリアミンは静電気的相互作用（（よってより低し・イオン強度の核酸 と結合し、それ故核酸と蛋白質重たＧまボＩＪアミンどの間の交叉結合を可能に するという事災にもとついている。特に一本領ＤＮＳ及びリジン一種々のＩ）Ｎ Ｓ−１結合した染色体の蛋白質、たとえばヒストンＨ１力Ｓ使用さジＬる。その ようなリジン含量の高℃・蛋白質（１２つの要求を光す。

Ｌ　核酸に対する非常に緊密な結合が得られ、それ故に短い反応時間内でたとえ ばグルタルアルデヒドのような交叉結合剤の低濃度のものによって非常に強力な 交叉結合を可能とする。そのようにして生成した蛋白質−核酸−化合物（プロー ブ）は蛋白質で標識された一本鎖ＤＮＳではないが、蛋白質：ＤＮｓ−質量比約 １の共有結合した一水銀−ＤＮＳ−蛋白質一単位を生成する。ハイブリダイゼー ション後、蛋白質をしらべることによって（ｆ？：。

とえば抗体によって）相補性配列’ｔｆｆ−ｏることがてきる。

２　蛋白質またはポリアミンは化学的に容易に修飾され得る。最上のヒストンＨ １の場合に、たとえばリジン残基のアミノ基に修飾が生じる。その際、標識基ま たは標識化合物は直接またはたとえば環状Ｎ−サクシンイミドエステルのような 架橋形成化合物によってアミノ基に固′定化され得る。リジン−アミノ基の標識 はわずか万影智を蛋白質の核酸結合特性に及はずだけであるのて、強力な核酸− 蛋白相互作用のためのりジン残基はかならずしも必要としない。この方法によっ て多くのヒス１−ンＨ１−分子（今や標識されている）を一本領−ＤＮＳで交叉 結合し、標識物を多数の標識をつける方法で得ろことかできる。これはハイブリ ダイゼーション後化学親和力系指示基型たは免疫学的指示系Ｇでよって容易に法 定されろ。

プロットハイブリダイゼーション実験に２いて、同一の反応条件下に標識をつけ られた本発明の方法のプローブは、高い特異性を以ってそれらの相補性配列と反 応し、ニック翻訳された又は末端標識されたプローブと相違しないことが示され る。

本発明の分野では、基本的にすべての正の電荷を有するアミノ酸ポリマーおよび オリゴマー、すなわちたとえばボＩＪ　ＩＪレジンヒストンを含む染色体上の蛋 白質、Ｇｅｎ−３２＝蛋白質のような一本鎖特異的結合蛋白質の如き天然換型た は合成されたものが、核酸結合蛋白質とともに正の電荷を有するものとして適当 である。同様に、ポリアミンも適している。スペルミジン、スペルミン、プトレ ンン等の天然で生成したいわゆる゛ポリアミン”が好ましく、これらは部分的に 固有のオリコ゛アミンを生成する。

一本鎖ポリヌクレオチドも天然のものまたは合成したものでよいが、ＤＮＳ寸た はｌン△ｒＳが取扱いよ奸才しい。

ハイブリダイゼーション反応の相手としてＤ　Ｎ　、Ｓ’および１１　、ｊＶ　 Ｓを問題にするならば、ＤＮＳとＩ）ＮＳ、ＤＮＳとＲＮ　Ｓおよび１１　Ｎ　 ＳとＥＭＳのハイブリダイゼーションを行うことができる。

−“本領ポリヌクレオチドおよび正の電荷を有する核酸結合蛋白質重たはポリア ミンから形成した複合体の交叉結合は通常の交叉結合剤によって生じる。該結合 剤は蛋白質の官能基をポリ核酸の官能基と結合させることがてぎろ。°特に適し ているのは、ジアルデヒド、たとえばグルタールアルブヒド、ジエボキシドおよ び、水溶液中でアルキル化するに適した２つの官能基を有する一般的化合物の如 き２つの官能基７有する又又結合剤である。従来からの適当な典型的基は、酸タ ロリド、酸プロミド、無水酸、隣接する二重結合によって活性化さｇた・・ロゲ ン原子等の活性化カルボキシル基である。

ハイブリダイゼーションによる生成物を証明するために、ここに包含される蛋白 質はたとえば標識によって決定されなければならない。

蛋白質またはポリアミンの標識はすでに複合体形成反応の実施によって行うか、 すでに形成さ粁、必要ならすてに交叉結合された複合体によって行うことができ る。

標識をつけることは蛋白質化学の従来からの公知の方法であって、当業者に周知 であって今さらここで明示する必要のない方法によって行われる。標識をつける 系としては放射性同位元素によって標識をつけることと同様に色素、色素成分ま たは生物活性蛋白質（たとえば酵素）によって標識をつけることを考慮に入れる 。

複合体形成のために使用されろ正の電荷７有する核酸結合蛋白質捷たはポリアミ ンの条件は、免疫反応の相手が標識をつけられている場合免疫反応８Ｃよって蛋 白質外たはポリアミンが指示できなければならないことあるいは第二の抗体によ って指示されろことである。そのようなものとして定義し得る基は、放射性同位 元素または色素によって標識をつける場合のように直接に決定されるか、あるい は間接的に、たとえば酵素−免疫検定法によって知られる如くそれらの酵素活性 の測定によって決定蛋白質重たはポリアミンと一本鎖ポリヌクレオチドとの間の 複合体形成反応の実施のための溶液は低いイオンの活量を示さなければならない 。好ましくはイオン強度は５０？７１．ｌＶより低くなければならない。

ハイブリダイゼーション反応自体は、従来公知の方法に従って、木兄８ＡＶｃよ って得られる、−重鎖ポリヌクレオチド及び正の電荷を有する核酸が結合した蛋 白質またはポリアミンから得られた共有結合した交叉結合複合体と、所望の相補 性核酸乞含有する溶液とを通常通り混合し、好ましくはいく分高い温度でインキ ュベートすることによって行う。形成した・・イブリッドの可視化および単離は 同じく当業者に公知の方法により行う。

本発明のもう１つの目的は、ハイブリダイゼーション反応の実施のための試楽で あって、これは一本領ポリヌクレオチドと正の電荷乞有する核酸が結合した証明 し得る蛋白質またはポリアミンから得られた交叉共有結合複合体からなるかある いはそれを含むものである。好ましくは、該試薬は蛋白質成分としてヒストンＨ １を含有する。同様に蛋白質対核酸の重量比的１．１が好ましい。

本発明によって、運送のためのハイブリダイゼーション反応の方法と試薬が提供 される。該方法はプローブとして化学合成さ扛た化合物を使用し、該化合物は高 収率で祷られ（９０％以−１−）、何らポリメラーゼを使用して製造する必要が なく、先駆体と最終生成物とを分離することも必要ない。所要時間は非常に短か く、プローブ製造のだめのポリヌクレオチドは高純度状態になくてもよい。プロ ット−ハイブリダイゼーションのためＩＣ当業者に公知の標準的方法がそのまま 利用される。

下記例は、ハイブリダイゼーション反応のだめのプローブとして標識をつけられ たポリヌタレオチドーヒストンＨ１−化合物を使用した本発明の詳細な説明する 。

ヒストンＨＩＣ２１Ｋｄ）は過塩素酸抽出によって子牛胸腺核からＢＢＡ　Ｂａ ｎｄ　６２．５ｅｉｔｅ　６０８−６０９．１９６２にす−Ｃに報告されている ようにして単離された。

凍結乾燥されたヒストンＩＩ　１を水に溶かしく５〜／　ｍｌ　）、−２０℃で 保存した。

Ｂ）　ビオチン標識 ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＢＨ８Ｅ）はＭｅｔｈｏ ｄｓ　Ｅｎｚｙｒｎｏｌｏｇｙ、　Ｂａｎｄ　６２．５ｅｉｔｅ　３０８〜３１ ５．１９７９に記載の如くして製糸された。２５０ｍ９のヒ゛オチン（メルク（ Ｍｅｒｃｋン社製９．２５０μＣｊ（１，４μ）の３Ｂ−ビオチン＜ＮＥＮ社製 ）、１５０１１１９ＯＮ−ヒドロキシサタシンイミド（メルク社製）を３−のジ メチルホルムアミド（Ｄ、ＷＦ）に溶がし２００ｍ９のジシクロへキ／ル力ルホ ジイミドを添加する。この混合物を１６時間２０℃で撹拌する。沈殿夕ｐ去し、 Ｐ液を真空乾燥した。残渣をエーテルで洗い、イソブロパ９ ノールから結晶化し、ビオチンによる標識のために使用するものとした。

別法として、ヒストンＨ１はＢＨ８Ｅの量を増加させることによってビオチン化 した。５μＩのＥＨ８Ｅ（１０μｌのＤＭＦに溶解）、２５μｙのＢＨ８Ｅ（１ ０μｌＯＤＭＦ中）および２５０μｇのＢ１−ｌ５ＥＣ１０μｌＯ”）ＤＭＦ中 ）を各々同量のヒストンＨ１（各々５０ｍＭＮａＨＣＯｓ　３００　ｔｔｌＪ中 の１ｍ９）を含有する溶液に加え、１時間２０℃でインキュベートした。５ｍＭ リン酸ナトＩＪ　ラムＣｐＨ６，８）に対して透析後これら３つのプローブを一 ２０℃で保存した。ビオチン標識ヒストンＨ１溶液の濃度は５ＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル−電気泳動によって、標識されていないヒストンＨ１と比較するこ とによって測定される。これら３つの調製物中のビオチン残基の数はＢＨ８Ｅに 含゛まれるトリチウム−マーカーによって計算され、ヒストン８１分子当り２． ７〜２０になった。

Ｃ）ポリヌタレオチドーヒストンＨ１−複合体形成環状ＤＮＳ（プラスミド）は 犬ぎな線状ＤＮＳ分子（ファージ−ラムダＤＮＳ）と同様に制限エンドヌクレア ーゼによって線状比重たは開裂されて平均サイズ約４Ｋｂとなった。研究の過程 で、ＤＮＳ断片が何ら強いハイブリダイゼーションの信号を出さないことがわか った。

それ故、ＤＮＳはＳＡＵ　３ＡまたはＨαｅ　Ｉｌｌのような酵素によって開裂 された。開裂されたＤＮＳはさらに精製することなく使用された。１μｙのＤＮ Ｓ（２０μｌ以下の緩衝液中）を１８０μｌの新しくつくつた５　ｍ　Ｍ　’） ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，８）で希釈し、加熱により変性しく１００℃、 ３分）、３分間水浴で冷却した。まず、ヒストンＨ１（約５ｔｔｌのリン酸塩緩 衝液中０．８〜１．０μｙ）を加え、その後２０μｌの２．５％ゲルタールアル デヒド溶液を加えた。このグローブを１０分間３０℃でインキュベートシ、ニト ロセルロース紙とハイブリダイゼーション溶液を入れたハイブリダイゼーション 用容器ニ直接加えた。

Ｄ）ハイブリダイゼーション これを制限エンドヌクレアーゼによって研究しようとしているＤＮＳに開裂し、 寒天ゲル−電気泳動により分画化し、サウザー７　（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）法ＣＪ 、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

９８．５０３−５１７．１９７５）によりニトロセルロース紙に運び移された。

この紙を１時間３７℃て１０陪のデ７ハーツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ　）溶Ｅ！ｊ ＡＢＢＡ、２３．６４１〜６４５．１９６６）、４　Ｘ　ｓＥｒ　（Ｉ　Ｘ　５ ＥＴ＝ｏ、１５Ｍ　ＮａＣ１１１００３Ａ／　ＴｒＺｓ　ＸＨＣｌ！、　ｐＨ８ ，１，ｍＭＥＤＴＡ）に浸漬し、プラスチック槽に移した。該プラスチック槽は １０〜２０ｍ１の透明なハイブリダイゼーション用溶液（５０％脱イオン化ホル ムアミド、２Ｘデンハーツ溶液、／ＶＸＳＥＴ、０．１％ＳＤＳおよび２０μ９ ７　ｍｌｌ酵母−ＲＮＳ）ｔ、を含有しており、１時間３７℃でインキュベート し、次いでグローブを添加後１６〜２０時間３７℃で１ 軽く撹拌した。

次いでニトロセルロース紙を６０分３７℃で５０％ホルムアミド、０．２％ＳＤ Ｓおよび５ＸＳＳＣ（１回の５ＳＣ＝０．１５ＭＮａＣＩＪ、０．０１５Ａ／ク エン酸ナトリウム）を含有する溶液で２回、４０分間２０℃で２回分のＳＳＣを 含有する溶液で２回洗った。フィルターを乾燥しビオチン指示系で展開した。

ニトロセルロース紙をまず２０分間１０μｇ／−ポリー１−リジｙＨＢＲ，ＭＷ ２２０，０００　＜シダマ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ））及び０．ＩＡ／）リスｕｃｉ　 （ｐＨ７，５＞を含有する溶液と、次いで３％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と０ ．１ＭｈリスＨＣｌ（ｐＨ７，４）を含有する溶液と５０分間インキユベートシ 、その後６０分間アビジン−ペルオキシダーゼ−溶液（ＩＡ／　ＮａＣｌ、０． １　Ｍ　）リスｌ１ＣＬ　ｐｈｉ　７．４．０，１％トリトンＸ−１００，０， １％ＢＳＡおよび１μｆｊ／　ｍｌアビジンーペルオキシダーゼ＜　ｇ、ｙ、ラ ボラトリーズ、カリフォルニア州））とインキュベーションた。Ｉ　Ｍ　Ｎａ（ Ｊｕｌ　。

０．１’Ａ／ｌ−リスｌ−１ＣＩＪ　（ｐｌｉ　７．４　）、０．１％ＢＳＡお よび０．１％トリトンｚ−１ｏｏ乞金含有る溶液で２回２０分間洗った後、上記 紙乞色累溶液（１０ｍｌの帆Ｉ　Ｍ　）　ＩＪス１１Ｃ１（ｐｉｌ　７．４　） 、２ｍｌのエタノールに溶かした６ｍｇの３．３′−ジアニシジン、６μｌの３ ０％Ｈ２Ｏ２）とインキュベートした。発色（茶色帝）は５〜６分すると起った 。

２ すべてのインキュベーションは２０℃で軽く撹拌して行倒１に記載の如く、しか しビオチンによる標識の代りに＋２５Ｉによる標識を使用して実施した。ヒスト ンＨ１の標識は下記のようにして行われた： １ｍｃｉの固体モノヨード（１２５Ｊ）−ポルトンーノ・ンター試薬（２０００ ＣＶミリモル）（＃Ｅ＃）に６０μＡの１２０−１５０μ、９のヒストンＨ１と １００ｍＡ／のホウ酸ナトリウム（ｐＨ８，９）を含有する溶液を０℃て加え、 １時間静置した。その後０．５ＡＩホウ酸すトリウム中１．Ａ／グリシン１０μ ｌを加えた。この溶液を５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）中５０μｙのヒ ストンＨ１て調整シタカラム（ンラン化パスツールピペット）によって濾過しだ 。１２５Ｉ−ヒストンＨ１を含有するフラクションは一２０℃で保存された。

例　ａ 遺伝子地図をかくため（Ｃ１ドロスフイラ・ビリリスＣＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ　 ｖｉｒｉｌｉｓ）インサートヲ有するλ−クローンを異なる制限エンドヌクレア ーゼで切断し、太ぎい方の部分を分離し、ニトロセルロース紙に移し、同時にλ −ＤＮＳと１２５１−ヒストンＨ１からの本発明の試薬およびプラスミド（λ− クローンのドロスフイラ・ビリリスの配列を有する）およびビオチン−ヒストン Ｈ１からの本発明の試薬てノ・イブリダイゼーンヨン乞行なった。制ｌ３ 限エンドヌタレアーゼとしてはＥｃｏＲｌ、ＢａｍＨｌ、１１ｉｎｄｍ及び５ａ ｌｌが使用された。レントゲンフィルムの露光及びビオチン指示系による適合し た展開によって、相補性ポリ核酸を含む単一の断片（別の酵素により得られた） を同定できた。この方法により遺伝子地図を迅速に作成することが可能になった 。

例　４゜ ２（１９（５Ｘ１０３単位）の西洋ワサビのペルオキシダーゼ（ベーリンガーア ンノ・イム、１級）：２２０μｌの９０ｍＭリン酸ナトリウム（ＩＩ　６．０　 ）　ＶＣ溶解させ、次いで１ｒｎｌのエタノール中３０ｍ９のｐ−ペンゾキノン ヲ含有する溶液６０１１１と混合した。この混合物’Ｖ１時間３７℃で暗中反応 させた。共有結合したベンゾキノン分子を有するペルオキシダーゼを、緩衝液な しに帆１５ＭＮａＣ１１中セファデックス０１００カラム６ｍ／！’＜使用した ゲル沢過により未反応ベンゾキノンから分離した。褐色になったフラクション（ 約１．８ｍ７りをいっしょにし、１８０　μｌｌのＩ　Ａ／　Ａ’ａＨ’ｃＯｓ 及び２．７　ｆｉｌｌ（１３３１１＆）のポリエチレンイミン溶液（ボリミン０ ３５ＢＡＳＦ）の添加によってｐｌＩ値を上昇させることによって次に続く反応 を進めた。反応混合物を１４時間３７℃で暗中に置き、次いで５ｍＭリン酸ナト リウム（ｐＨ６，８）に対し”て透析し、３℃で保存した（溶液Ａ）。溶液Ａの 蛋白質濃度は約７μｇ／μｌであった。。３ケ月間の貯蔵の間に何ら活性低下は 見られなかった。

ペルオキシダーゼ結合物の大きさ及び組成を、＋２５１　＝ポリエチレンイミン （ポルトン−ハンター試薬で標識）を使用しだ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル 電気泳動およびコオマシ−（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）−青染色ゲル乞相当するオー トラジオグラムと比較することによって測定した。

その結果すべてのペルオキシダーゼ分子はすてに修飾されていた。該結合物は下 記の大ぎさを有した。５０Ｍつα１０％：１００ＫＤａ６０％；　１５０ＫＩ） ａ　２０％：２００ＫＤａ　５％：２５０Ｋ１．）α２％。すべての結合物はペ ルオキシダーゼ対ポリエチレンイミンのモル比が１であつ環状二本鎖ＤＮＡ分子 を制限エンドヌクレアーゼで線の５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）中１μ ｇＤＮＡを加熱変性（１００℃、３分）し、氷上で３分間／り却した。まず２０ μｌの溶液ＡＹ加え、その後６μｌの５％ゲルタールジアルデヒド溶液乞加えた 。グローブ乞３７℃で１０分間インキュベートし、次いで直接にニトロセルロー ス紙およびハイブリダイゼーションの溶液を含むノ・イブリダイゼーション反応 物に加えるか、あるいは４０％のポリエチレングリコール８０００（シグマ社製 ）乞含有する溶液２８μｌを添加することによって沈靴させる。この混合物′Ｐ ！：６分間遠心分離し、沈殿を５ｍＭ！Ｊン醗ナトリウム（ｐＨ６，８）中１５ ＭＬ−リジン１０μｌ〕−５ に溶かし、ノ・イブリダイゼーションのためにとっておいた。ゲル濾過のカラム によるＤＮＡ−結合の研究によって、約２５％のペルオキシダーゼ活性がＤＮＡ ＶＣ共有結合していることがわかった。これは蛋白質：　ＤＮＡの重量比約３０ に相当する。

ノ゛ンデのノ・イブリダイゼーションと可視化ニトロセルロース紙（シュライヘ ル濠ンル（Ｓｃｈｌｅ−ｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｉｉｌｌ）製）を固定化された ＤＮＡと１時間３８℃で１０×デンハ−ツ（Ｄ　ｅｎｈａｒｄ　ｔ　ｓ　）溶液 、４×５ＥＴ（ｌＸ５ＥＴは０．１５　Ｍ　ＮａＣＬ　０．０３　Ｍ　トリス− ＩｉＣｌ、　ｐｌｉ’　８．１　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　）および０．１％ＳＤ Ｓに浸漬し、２〜２０ｍ１のプランクツｈイブリダイゼーゾヨン混合物（５０％ ホルムアミド、２×デンノ・−ツ溶液、４ＸＳＥ’ｌ’、０．１％ＳＤＳおよび ３０μｇ／、、１酵母ｔｌンＮＡ）を含有するプラスチック容器に移し、振とう しながら１　。

時間３８℃てインキュベートし、ゾンデを添加後２〜１６時間３８℃でさらにイ ンキュベートした。１６　ｈｎ　−ｃｈｃｎ−およびＨｕｍａｎ−単一複写−遺 伝子配列の分析のために、ハイブリダイゼーションはポリエチレングリコール８ ０００の存在下に行った。ノ・イブリダイゼーション混合物は、ホルムアミドの みの代りにホルムアミド中１２％（重量／容量）ポリエチレングリコール溶液を 使用することによって修飾された。このニトロセルロース紙を、６０分３８℃で ５０兄ホルムアミド、０．４％ｓｇｓおよＱ’０．５ＸＳ、Ｓ’Ｃ（１ｘＳＳＣ は０．１．５　Ａ／　ＮａＣ１！１工６ ０．０１５＆クエン酸ナトリウム）乞含有する浴液７２回交換して、および２０ 分２０℃で２ｘｓｓｃ’を含有する溶液２２回交換して洗った。次いでこのフィ ルターを２０℃で暗中色素溶液とインキュベートした。ペルオキシダーゼは、１ ０ｍＭイミダゾール、２ｍｌ！のエタノールを含有する１００ｍＭトリス−ＨＣ ｌ（ｐＨ７，４）の溶液（６ｍ９の３，３′−ジアニシジンを溶解〕および１０ μｌの３０％ｌＩ２０２によって可視化された。発色後フィルター７洗いトリス −ＨＣ６−イミダゾール緩衝液中で保存した。

第１図中、薄板ａは別々の制限エンドヌクレアーゼによって切断されたｐＨＢＶ ｌ　４．１．ＤＮＡの寒天ゲル−電気泳動図（エゲジウムブロミドで発色）乞示 し、左から右へＢａｍＨｌｌＢｇＩＩＩ、ＡｖａＴ　、Ｊ／ｆｐａｌｌ、Ｐｓｔ Ｉによる切断を示す。各々の横線は１００　ｎｇのＤＮＡ’ｘ訝む。断片は正し く下記長さくＫｂ　）の標識物を含んでいた。

２３．１．９．４．６．６．４．４．２．３．２．２．２．０．１．１．０．７ ５．０．５６．０．３８（例６）。薄板すは、薄板ａ、中に示されるＤＮＡを移 しｊ）’ｃｏＮＩで切断したｐ　ＢＲ３２２ＤＮＡとハイブリダイゼーションを 行なった後でペルオキシダーゼ（１０μｌの溶液Ａ）と結合しアニシジン−Ｈ２ ０２で染色したニトロセルロース紙を示す（例７）。

薄板ＣはＨＢＶＤＮＡ配列と７・イブリッドをつくり、ペルオキシダーゼで標識 されたコピーフィルターを示す。

寒天グルー電気泳動のＰｓｔＩによる切断後ｐＨＢＴ／’１４．１１７ の挿入物（３，２Ｋｂの犬ぎさ）を下に入れて溶出した。

そのようにして得られた帆５μＩの挿入物ＤＮＡをペルオキシダーゼで標識した （１０μｌの溶液Ａ）（例８）。

薄板ｄは、ＨＢＶＤＮＡ（ペルオキシダーゼで標識）およびｐＢＲ３２２ＤＮＡ 　（アルカリ性ホスファターゼで標識）とノ・イブリダイゼーションしたコピー フィルターを示す。挿入物ＨＢＶＤＮＡ０．５μｓをペルオキシダーゼと結合し く１０μｌの溶液Ａ）、線状化ｐＢＲ３２２ＤＮＡＯ，’５μｇをアルカリ性ホ スファターゼで標識した（例５による溶液Ｂ１０μｌ）。

ハイブリダイゼーション後濾紙をまずホスファターゼのだめの基質溶液とインキ ュベートしたところ青く呈色し、次いでアニシジンてベルオキシダーゼトインキ ユベートシてペルオキシダーゼを可視化した（茶色の帯）。

ハイブリダイゼーションの容量および時間は各々１５ｍ１ないし３時間であった （例９）。

第２図においては、薄板ａは下記試験の結果を示す：ディー・ビリリス（Ｄ？７ ｉｒｉｌｉｓ）の挿入物を含むｐＤτ１、すなわちｐＢＲ３２２プラスミドをＥ ｃｏＲｌおよびｐｖｕｌｌで切断したところ４つの断片が形成した：２ディー・ ビリリス（Ｄ、　ｖｉｒｉｌｉ、ｓ）断片（２，８Ｋｂ　と２．４Ｋｂの大きさ ）および２　ｐ　Ｂ　Ｒ３２２断片（２，３Ｋｂおよび２．０６Ｋｂの犬ぎさ） 。連続希釈物（各々５００．１、００および２０　ｐｇ）を電気泳動にかけ、吸 い取り、０．５μｙのＥｃ　ｏ　Ｒｌ線状化ｐＢＲ３２２とノ飄イブリッドを形 成させ、これをペルオキシダーゼ（１０μｌの溶９Ａ）と１６時間２，０−の容 量でハイブリッド形成した。

中央の列の２本の帯は２４ないし２１　ｐｇＤＮＡを含む。

両方の帯の中の断片は２，３ないし２．０６Ｋｂの長さである（例１０）。

の容量でＰｓｔｌて線状化したｐＢＲ３２２りｏ−７０，５μｇによって４．８ 　Ｋｂの挿入物と３時間ハイブリダイゼーションを行なった後のニトロセルロー ス紙を示す。ここで該挿入物はアルコール脱水素酵素遺伝子を有し、ペルオキシ ダーゼ（溶液ＡＩＯμｌ）と結合させである。帯中のＤＮＡ断片は４．’８　Ｋ ｂの長さてあった（例１１）。

薄板ｃ）＆すａ）と同様に滴定実験の結果を示しているが、リコールの存在下に 行なわした。右端の列の２つの帯は４．７ないし４．．１　ｐｃｌＤＮＡを含む （例１２）。

薄板ｄ）は、１０μｙのひな胎児−ＤＮＡを５ａｃｌで切断し、これを寒天ゲル −電気泳動に付して、欠いてニトロセルロース沖紙上に移した試験の結果を示す 。ハイブリダイゼーションは、’ＥｃｏＲＩで線状化されたｐＢＲ３２２プラス ミドであって、ひな赤芽球症ウィルスのｅｒｂＡおよびｅｒｂＢのだめの同調配 列を有しペルオキシダーゼ（溶液Ａ５０μｌ）と結合させであるもので行なわれ だ。ハイブリダイゼーションの時間は１４時間で、容９ 量は５ｉであった。このハイブリダイゼーションの混合物は６％ポリエチレング リコールを含有していた。帯は下記Ｋｂの大きさに一致した：８．１．７．５． ５．０．３．０．２．５（例１３）。

薄板ｅ）は下記試験の結果を示す。すなわち、ヒーラＣＨｅＬａ）細胞からの人 間のＤＮＡ１５μｓをＨｉｎｄ　ＩＩＩで切断し、寒天ゲル−電気泳動により分 離し、ニトロセルロース戸紙上に移し、１５時間（５ｍｊ！の容量で）Ｅｃ。

１１！Ｉで線状化されたｐＫ７’２１８−プラスミドであってアルブミン遺伝子 ＜２Ｋｂ）の同調領域を含みペルオキシダーゼ（溶液Ａ５０μｌ）と結合させで あるもの２．５μＩを使用してハイブリッド形成させた。このハイブリッド混合 物は６％ポリエチレングリコールを含有していた。

得られた帯は下記Ｋｂの大きさに一致した　６．２．４．２．１．８（例１４） 。

添付図面において本発明で得られた例６〜１４の結果は得られた電気泳動によっ てさらに詳しく示されている。

該図面中、第１図は本発明の標識ゾンデを使用したプロットハイブリダイゼーシ ョンの結果を示しており、第２図は滴定−およびグツムーブロット−実験の結果 を示し例４に記載の如く、アルカリ性ホスファターゼとボ＋ｊエチレンイミドの 結合物を製造した。−力子牛の腸からのアルカリ性ホスファターゼ（１級、ベー リンガーマン０ ハイム製）ｔＯ，ＩＶリン酸ナトリウム（、ｐＨ６，０）Ｋ対して透析した。９ ０μｌのｐ−ベンゾキノン溶液を例４の如く添加し、暗中で１時間３７℃でイン キュベートしだ。ゲルクロマトグラフィー（６Ｔｎ！、のカラムセファデックス Ｇ２５）後、ホスファターゼ含有フラクションをいっしょにしく約９００　μｌ ）、１００／ｆｇのＩ　Ｍ　Ｎａ１ＩＣＯ３および２０μｙのポリエチレンイミ ンと混合した。この混合物を１８時間３７℃で暗中インキュベートし、５ｍＭリ ン酸ナトリウム（ｐｌｉ　６．８　）に対して透析し３℃で保存した（溶液Ｂ） 。

ゾンデの製造は例４に記載の如く、しかし溶液Ａの代りに溶液Ｂを使用して行な った。同じくノ・イブリダイゼーションも例４に記載の如く行なった。

リン（ＮＥＴ）および５−ブロム−４−クロル−３−インドキンルーホスファト −４−トルイジン塩（ＢＣＩＰ）を含有し次のようにして製造されたｇＮ１５ｍ Ａ！を添加することにより可視化された：５−の０．１Ｍ）リス−１１Ｃ１（ｐ Ｈ９，５）、０．１ＭＮａＣ１３，５ｍＭＭｇＣｌ２（緩衝液Ａ）に５〜ＮＥＴ を懸濁し、１分間激しく動かし、短時間遠心分離した。上清を１０ｍ１の緩衝液 Ａに傾瀉し、３７℃で加温した。次いで２．５ｍ！／ＢＣＩＰを５ｏμ、ｇのジ メチルホルムアミドに溶解させ、動かしながら上記ＮＥＴ溶液に滴下した。発色 後、フィルターを洗い、５ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ含有１．００　ｍＭ　）リス− ＨＣｌ　（７）Ｈ７，４，）図面の簡単な説明 ２１ 中で保存した。

浄書（内容に変更なし） 手続補正書（方式） ３６補正をする者 事件との関係　出　願　人 住所 名称　オイロは−イシェス・ラボラトリラム・フーール・モレクラールビオロギ ー（エーエムベーエル）Ｚ補正の内容 国際調査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）　ポリヌクレオチドと特定の物質との複合体を形成し、このようにして形 成された複合体をノ・イブリダイゼーション反応のために使用することによるハ イブリダイゼーション反応を実施する方法であって、−水銀ポリヌクレオチド及 び正に荷電した、核酸と結合している証明し得る蛋白質またはポリアミンを溶液 中で反応させ、生成した複合体を交叉結合剤で共有結合させ、得られたポリヌク レオチド化合物を未知のポリヌクレオチドの相補性配列の探索の際のハイブリダ イゼーション実験において標識として使用することを特徴とする方法。
2. （２）　ヒストンＨ１を核酸結合蛋白質として使用し、変性核酸との複合体を形 成し、２つの官能基を有する交叉結合試薬で交叉結合させることを特徴とする請 求の範囲第１項の方法。
3. （３）複合体形成の前凍たは後に蛋白質部分またはポリアミン部分に標識をつけ ることを特徴とする請求の範囲第２項の方法。
4. （４）等量の核酸とヒストンＨ１をｐＨ５〜８の緩衝液中グルタルアルデヒドで 交叉結合させることを特徴とする請求の範囲第２項の方法。
5. （５）−水銀ポリヌタレオチド及び正に荷電した、核酸と結合している特定の蛋 白質またはポリアミンから得られた共有交叉結合した複合体からなるあるいはこ れらのものを含むことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第４３ 項の方法を実施するための試薬。
6. （６）蛋白質としてヒストンＨ１を含有することを特徴とする請求の範囲第５項 の試薬。
7. （７）蛋白質及び核酸を帆１ないし１．５の重量比で含むことを特徴とする請求 の範囲第６項の試薬。
8. （８）　ポリアミンとしてポリエチレンイミンを含むことを特徴とする請求の範 囲第５項の試薬。
9. （９）ポリエチレンイミン−酵素−化合物及び核酸を１〜３０：１のモル比で含 有することを特徴とする請求の範囲第８項の試薬。