JPS6041699A - ウシ血清アルブミン由来ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なウシ１１１′ＩＷ４アルブミン由来ペプ
チド及びその塩に間する。

木明覇告において、アミノ酸及びベプヂドの表示は、Ｉ
ＵＰＡＣ，ＩＬＩＢの規定若しくは当該分」における慣
用記号に従うものとする。

本発明のウシ血清アルブミン由来ベプヂドは、文献未載
の新規ペプチドであり、下記−次ＩＮＡ式〔１〕に示す
偶造を有している。

一次信造式〔１〕 ＨＯ−△「Ω １３４１ Ｔｒｌｌ　Ｇｌｙ−１ｙｓ　ＴＶｒＬ−ｅｕ　ＴＷ　Ｇ
ｌｕ　ｌ１ｅ−Δ１ａ１２５ Ｐｈｅ−ＩＪｓ−１１／Ｓ−’Ｇｌｕ−ＡＳＤ−Δ１ａ
−Ｌ■５−ＰＩＩＱ−ＧＩＩＪＮ末喘ＩＴ５　１２３　
１ Ｈ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Δ５ｐ−ｐｒｏ−△ｓｎ
−旧＋ｒ−Ｌｅｕ−ｃｙｓ−△５ｐ１４４　１５１　１ Ｈ−△ｒｇ−Ｈｉｓ−ｒ）ｒｏ−ＴＶｒ−ｒ”ｈｅ−Ｔ
Ｖｒ−Δｌ　ａ　−、Ｐ　ｒｏ　５１５８　ｌ　１ ＩＪｓ−Δｓｎ−△Ｉａ−７ｙｒ　Ｌｃｕ−１−ｃｕ−
Ｇ（ｕ　Ｓｌ　１ＧＧｌＩＧ９ ’Ｔ’ｙｒ−ΔＳｎ　ａｌｙ−Ｖａｌ　Ｐｉｌｅ　Ｇｌ
ｎ−Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ１６７１ ３　Ｇｌｕ １ Ｓ　Δ５ｐ １８３　１　１ Ｍｅｔ−ＴＩ＋ｒ−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ　Ｉｅ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−１ｅｕ　−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−ΔＩａ−Ｇｌ’／　
ｔ−ｙｓｌ　１７５　１７２ △ｒｇ−Ｏｆ−１ １８４Ｃ末端 〔式中の番号は、ウシ血清アルブミンのアミノ酸順位を
示づ。〕 即ち、本発明のペプチドは、ウシ血清アルブミンの１１
５Ｗｔ目のアミノ酸であるＬｅｕをＮ末端とし、１４３
番目のΔｒｇをＣ末端とする２９個のアミノロよりなる
ペプチドと、１４４番目の八ｒｇをＮ末端とし、１８４
Ｍ目のＡｒＱをＣ末端とする４１個のアミノ酸よりなる
ペプチドとが、１２３番目のｃｙｓと１６７Ｍ目のｃｙ
ｓとの間でＳ−Ｓ結合にて架橋された（Ｒ造を有してい
る。

本発明の上記〔１〕で表わされるペプチドは、またイン
スリン作用促進活性という特有の生理作用を有する点に
おいて特徴付けられる。ここでインスリン作用促進活性
とは、インスリンの作用すなわち生体内において主とし
て筋や脂ｌｌ／ｉ相様へのグルコースやアミノ酸の取り
込み及びグルコースのグリコーゲン・脂肪への転換を促
進して白糖を低下させる一力きを促進する作用をｎう。

従って本発明のペプチドは、インスリン作用の不足によ
る代用異常状態と定義されるＷ同病の治療に石川である
。

一殻に糖尿病は、大別して暉Ｈにおけるインスリン分泌
量の絶対的不足にｐＳ囚する工型糖尿病（インスリン依
存性糖尿病）と、主としてインスリンに対する感受性の
低下による■型ｍｉ病くインスリン非依存性糖尿病）と
に分類される。本発明のペプチドは、インスリン作用の
促進によりインスリン感受性の改善を計り得るものであ
り、殊に■型糖尿病の治療に有効である。また、■型、
■型糖尿病を問わず、インスリン療法に際して本発明の
ペプチドを併用することにより、インスリン製剤の使用
ｎを大ｒｌＪに節約できると同時に、インスリンの長期
あるいは大量療法にみられるインスリン抗体の産生に基
因するインスリンショックやインスリン抵抗性の発現を
予防することができる。

本発明の上記インスリン作用促進活性を有する式〔１〕
で表わされるペプチドは、ウシ血清アルブミンにｉ〜リ
ブシン、アクロシン、コクナーゼ及びＥ、ｃｏｌｉプロ
テアーゼ■の少なくとも１ｆ４を作用さゼて、そのペプ
チド結合を特定部−位で切断することにより収得される
。しかして原料とするウシ血清アルブミン自体は、本発
明ペプチドに見られる如きインスリン作用促進活性を有
しておらず、該活性は上記トリプシン等による分ｗｉ反
応により始めて出現するものである。

上記方法において原料とするウシ血清アルブミンとして
は、各種方法により単離精製された市販の血清アルブミ
ンのいずれであっても良く、またこれはウシより常法に
従って単ｍｉ製されても良い。また該ウシＩｆｌｌ消ア
ルブミンに作用させるトリプシン等の酵素も酵素製剤と
しての市販品又は常法に従い単離Ｍγ１したもののいず
れであっても良い。

上記方法において最も好ましい］・リブシンによる分解
反応について詳述すると、該トリプシンによる血清アル
ブミンの分解反応は、トリプシンの作用至適潤度及びｐ
Ｈ条件下に行なわれる。具体的には約２０〜４０℃、好
ましくは約２５〜３７℃（７）　ｌ　ｌＪｉ　条件下、
ｐ　）−１５，０〜９．５、好まＩ、＜は７．０〜９．
０のアルカリ溶液中で行なわれる。

原料とづる自消アノヒブミンと１−リプシンの使用割合
は、特に制限はないが、通常前者５０〜２５０に対しト
リプシン１（重量比、以下同じ）、好ましくは前者１０
０に対し１〜リブシン１程度とするのがよく、分解反応
は、上記条件下に約１５分〜１５詩間、通常約４〜１２
時間を要して行なわれる。なお必要に応じて酵素阻害剤
例えば大豆トリプシン阻害剤（Ｓｏｙｂｅａｎ　ｔｒｙ
ｐｓｉｎ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ　）等を用いて反応を停
止させても良い。上記トリプシンによる分解反応により
原料血清アルブミンは、その立体障害のない部位におい
て、これを梧成するアルギニン（Ａｒｃ）又はリジン（
Ｌｙｓ）のカルボキシル基によりペプチド結合が切断さ
れ、かくしてインスリン作用促進活性を有づる活性画分
として本発明の所望ペプチドを収骨できる。

本発明ペプチドは、反応液より通常のペプチドの分離手
段により分１ＰＪｌ精製することができ、また通常の凍
結乾燥手段により保存することができる。

上記分的精１４手段としては、例えばセファデックスＧ
−５０、セファデックスＧ−１００（ファルマシア社製
）等のゲル濾過担体を用いる分子濾過法、透析法、電気
泳動法、ＳＰ−セファデックスＣ−２５（ファルマシア
社＠）　、ＤＥＡＥ−セルロース（ホワツ］−マン社製
）等のイオン交換カラムクロマトグラフィー又は高速液
体カラムクロマドグラフイー等及びこれ等合方法を組み
合せた方法を例示できる。上記ｖｉ製手段の好ましい一
例は次の通りである。即ち反応液又はその凍結乾燥品を
例えば酢酸アンモニウム、酢酸等の弱酸性溶液に溶解し
、ゲル濾過し、凍結乾燥づる。この時脱塩が不充分であ
れば水に懸濁後再度凍結乾燥する。

上記ゲル濾過により得た活性画分を次いで酢酸すｌ・リ
ウム、リン酸、クエン酸等の緩衝液に溶解後、陽イオン
交換カラムクロマトグラフィーを行ない、必要に応じて
、酢酸ｔｆｉ暫液で洗浄後、０．１Ｍ以下の食１７ｍを
含む緩衝液で洗浄し、０．１〜２．０Ｍ１好ましくは０
．１〜０．８Ｍ程度の食塩直線・１度勾配により溶出さ
せ、最大活性ピークを集める。これを透析後、凍結乾燥
を行ない、次いで高速Ｐａ　（’）ｉクロマ１−グラフ
ィー等により精製する。

かくして本発明のインスリン作用促進活性を有するウシ
内情アルブミン由来ペプチドを得る。

上記の如くして腎られる本発明ペプチドは、薬理的に許
容される酸性化合物又は塩基性化合物と塩を形成させる
ことができる。かかる酸性化合物としては、例えば３′
Ａ酸、硫酸、リン酸、臭化水素ｒＭ等の無ｎ酸、フマー
ル酸、マレイン酸、酢ａ１シュウ百、リンゴ酸、クエン
酸等の石門も１を、またＪＭＭ性化金化合物ては、例え
ば水ｎ）化す１−リウム、水酸化カリウム、水酸化カル
シウム、炭ｒｉ１すトリウム、炭酸水素カリウム等を挙
げることができる。

本発明のペプチド又はその４１４よ、単独であるもＸは
インスリンとＵｔ用することにより抗糖尿病剤として使
用することかできる。その場合有効成分を通常製剤的担
体と共に製剤組成の形態に加工して用いるが、中でも注
射剤として使用するのが好ましい。注射剤として調製さ
れる場合、ｌｒｌられる製剤は殺Ｎされ且つ血液と等張
であるのが好まし０゜注射剤の形態に成形するのに際し
ては、＠釈剤としてこの分野に於いて慣用されているも
のを使用できる。例えば、水、生理食塩水等を挙げるこ
とができる。なおこの場合等慢性の溶液を調製するに充
分な岳の食塩、あるいはグリセリンを注射剤の形態の７
４剤中に含有せしめてもよい。また上記製剤には通常の
緩衝剤、無痛化剤、保存剤等、更に必要に応じて着色剤
、保存剤、香ｖ１、風味剤、Ｕ＠剤等や他の医薬品をも
含有せしめ得るものである。また上記有効成分は使用時
に注ａ１用蒸留水に溶解し、溶時溶解剤としても使用で
きる。

上記の如くして調製される製剤は、その形態にもじた方
法で投与され得る。注射剤の場合には単独であるいはア
ミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与することが
できる。有効成分の投与量は使用目的、症状等により適
宜増減されるが、通常１人１日当り、０　、０８〜２４
　ｍｕ／ｋｏ程度、好ましくは０．２〜Ｂ　＋１ｔ（Ｊ
／　ｋｇ程度の範囲とするのが良く、また１日に２〜４
回に分割して投与することができる。

以下本発明を更に詳しく説明するため本発明ペプチドの
製造例を実施例として挙げる。尚実施例における試料の
インスリン作用促進活性は、以下の方法により測定した
。

〈インスリン作用促進活性〉 雄性ウィスター（Ｗｌｓｔａｒ　）系ラット（体重１５
０〜３０００　）より副皐丸脂肋組織を摘出し、Ｅ　ｘ
ｐｌａｎ（（脂肪組織塊）を調製する。１０個のＥ　ｘ
ｐｌａｎｔ　（湿ｆｆ１ｆｉとして７．５〜１０ｍｏ）
を、Ｄ−（Ｕ−１Ａ　Ｃ）グルコース０．０５μＣｉ／
酊Ｑ。

ｆｉ！１．５ｕ／＋ｎＱ、ペニシリン３５（）／ｍＧ及
びストレプトマイシン０．１＋１１（］／四を含むＭ−
１９９〔「医学のあゆみ」第６２巻、第６号、４３５頁
、昭和４２年８月５日発行参照〕培地に浮かべたシリコ
ン処理レンズベーパー上に載せ（Ｔ　ｏｐｐｅｒ、Ｙ　
。

Ｊ、、ｅｔ　ａｔ、　Ｍｅｔｌ＋ｏｄｓ　ｉｎ　［：ｎ
ｚｙｍｏｌｏｏｙ、３９゜４４３　（１９７５））、３
％炭酸ガス含有気相下に、３７℃で２０時間培養する。

培筒後Ｅ　Ｘｐｌａｎｔの湿重量を測定し、その全角を
２Ｎ−ＫＯＨの５０％エタノール溶液Ｉ　ｍＱ中で、１
００℃で２時間加水分解する。６Ｎ−硫ｎｔｏ、５ｍＧ
で酸性化した氷解物より３鵬の石油エーテルで脂肪酸を
抽出し、常法により放射能を測定し、グルコースからの
脂肪酸への転換量を、培地中の比放射能より算出する。

試ｒ１のインスリン作用促進活性は、上記反応系内に試
料とインシュリン（０，２ｍ　ＬＪ／ｍＱ）とを添加し
て得られる上記比放射能算出値を、試料の単独添加によ
り得られる同算出値に対する百分率で表わす。

実施例１ 結晶ウシＩｆＮｆｆｉアルブミン（マイルス社製）を、
未変性のままＴＰＣＫトリプシン（ワーシントン社製）
を用い、０．１Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８，１）中
で１２時間消化した（基冒濃度１９６、酵素：基質−１
：１００！１！帛比）。消化後直ちに凍結乾燥した（後
記薬理試験で用いられている未口製の本発明ペプチドは
この段階で得られたものを使用している）。

１ｇの乾燥消化物を０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐ　Ｈ
５，６）１４．５四に溶解し、セファデックスＧ−５０
（ファイン社、４．４Ｘ９０ＣＩＩ）のカラムを用いて
ゲルか過（流速２０ｍＧ／時間、４℃、フラクション８
．７Ｗ＋Ｑ／デユープ）して、活性両分（フラクション
Ｎ０．８７〜１３０）を集め、凍結乾燥した。

上記セファデックスＧ−５０を用いたゲル濾過における
溶出活性パターンを第１図に示す。第１図において横軸
はフラクションＮｏ、を、縦軸はインスリン作用促進活
性を示す。また図中（１）は２３０ｎｍでゐ吸光度曲線
を示し、（２）はインスリン作用促進活性パターンを、
（３）は２８０　ｎｍでの吸光度曲線を示す。

上記で得た活性画分乾燥品を、更に５０℃で保温しなが
ら１時間暇引し、水にＦ！！濁して再び凍結乾燥した。

上記と同一のゲルｉ濾過操作を３ｒ！１行なって集めた
活性両分的７２０１！１ｇを６０ｍＧの０．１Ｍ酢酸す
トリウム緩ｍ液（ｐ　Ｈ４，３＞に溶解し、ＳＰ−セフ
ァデックスＣ−２５（ファルマシア社製、３Ｘ２０ＣＩ
Ｉｌ）のカラムを用いてイオン交換ノＪラムクロマＩ−
グラフィー（流速６０鵬／時間、４℃、フラクション８
−／チューブ）を行なった。

１６０舗の０．１Ｍ酢ｆｌ！＃！！１ｌｉｉ液（ｐ　Ｈ
４，３）で洗浄後、更に５００韓の０．１Ｍ食塩を含む
０．１Ｍ酢酸ａ暫液（ＩＩＨ４，３＞で洗浄し、２００
０−のＯ，ＩＭ−０，８Ｍ食食塩直線度勾配により溶出
させた。

上記溶出パターンを第２図に示す。第２図において横軸
はフラクションＮＯ，、縦軸は２３０　ｒｖの吸光度、
イ・ンスリン作用促進活性及び電気伝導度を示す。又、
図中（１）は２３０ｔｖでの吸光度曲線を、（２）はイ
ンスリン作用促進活性パターンを、及び（３）はカラム
中の電気伝ｙ９度曲線を示す。

第２図より最大活性ピークは０．５３Ｍ食塩（Ｎａ　Ｃ
Ｑ　）近傍に現れることが判る。

上記最大活性ピークを集め、スペクトラボール３（スペ
クトラム　メディカル社製、Ｍ　Ｗ　ｃｕｔｏｆｆ３５
００）透析チューブを用いて透析（５０倍停の蒸留水５
回、７０時間）し、凍結乾燥した。

上記で得た凍結乾燥品を、０．１％トリフルオロ酢酸に
溶解し、以下の条件下、逆相カラムを用いた高速液体ク
ロマ１−グラフィーにて精製した。

〈高速液体クロマトグラフィー条件〉 ｔ’！　Ｑ：ウォータース礼、Ａ１．、Ｃ／ＧＰＣモデ
ル２４４．１休クロマトグラフィーシステム、Ｍ−６６
０溶媒ブ０グラマー、 カラム：ウルＩ〜ラボールＲＰＳＣ（Ｃａ　、ベックマ
ンアルテックス社、４．６＋１１１１１Ｘ　７　、５ｃ
ｍ） 流　速＝１戒／分、２５℃ チャートスピード：６０ｃｍ／時間 注入ｍ：３００１１Ｑ／３０ｕＱ 溶　出；Ｏ〜６０９６アセトニトリル（直＃Ｉａ度勾配
、３０分） 結果を第３図に示す、、第３図において横軸は保持時間
（分）を、縦軸は２２０ｎ側及び２８０＋１！１１での
吸光度を示し、図中（１）は２２０ｎｍでの吸光度曲線
及び（２）は２８０ｎｍでの吸光度曲線を示す。咳図よ
り約２８分に、最大活性を示すピークが現れることが判
る。　゛ 上記活性ピークを凍＃＠乾燥して目的とするウシ白酒ア
ルブミン市来ペプチド製品を愕た。その収量は原料ウシ
！ｆＩ＋消アルブミン１ｇ当り５９０μＱであった（ペ
プチドＡ）。

上記で得た本発明のペプチドは以下の物性を有している
。

１）　ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動イト−（
ＩｔｏＫ、）らの方法（Ｊ、３ｉｏｌ。

Ｑｌ＋ｅｍ、、　２５５．２１２３　（１９８０））に
従い、２０．８６％アクリルアミド、０．０９６％ビス
アクリルアミド、６Ｍ尿素、０．０３３Ｍｆｉ塩、０．
３４Ｍ１−リスｊｉＦｍ（１）８８．７）の分離用ゲル
を用いた。濃縮ゲル、泳＃Ｊ緩衝液及び試料緩衝液をラ
エメリ−（ＬａｅｍＩｌｉ）らの方法ＣＮ　ａｔｔｌｒ
ｅ　。

２２７．６８０　（１９７０））に甲じて調製した。

分子量マーカーとしてはＢＤＨケミカルズ礼製キット（
分子ＥＡ１６９４９．１４４０４．８１５９．６２１４
．２５１２）を用いた。

上記ペプチドをβ−メルカプトエタノールで還元処理し
て分子量を測定した結果を第４図に示す。

第４図より上記ペプチドは、２木のバンドを示し、各バ
ンドは分子９マーカー６２１４と２５１２との間に現れ
、その夫々の分子量は約４９００及す３５００であった
。

２）　アミノ酸分析 上記で得たペプチド（乾燥品）を、４Ｎメタンスルホン
酸（０，２％の３−（２−アミノエチル）インドールを
含有）を用いてシンプソンら（Ｓ　１ｕｓｏｎ　Ｒ、王
、、ｅｔ　ａｌ）の方法（Ｊ　。

Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５１．　１９３　（１９７
６）　口こ従い、１１０℃で２４１ｉ１１￥１加水分解
した。加水分解物を中和後、日立８３５型アミノ酸自助
５）析Ｒ１を用いて分析した。結果を下記第１表に示す
Ｊ′４表中各アミノ酸はＩＵＰＡＣの略号で示し、各ア
ミノ哉組成は試料１モル当りの各アミノ酸のモル量で表
わす。また）ｌａｌｆ−ｃｙｓは、過蟻酸醸化後のシス
ティン酸として示した。

第１表 アミノ酸　組成（モル） 測定値　理論値 Ａｓｐ＋Ａｓｎ　６．７　７ Ｔｈｒ　１．８　２ ３ｅｒ　０　０ Ｇｌｕ＋ＧＩｎ　８．７　．９ ｐｒｏ　４．８　５ ＧＩＶ　２．９　３ Ａ１ａ　５．６　６− Ｖａｌ　１．２　１ Ｈａｌｆ　−ＣＶＳ　３．６　４ Ｍｅｔ　Ｏ，６１ １１ｅ　１．９　２ ｌ−ｅｕ　６．８　７ ７ｙｒ　６．１　６ Ｐｈｅ　４．０　４ ＴｒＤ＊　０．１　１ ＬｙＳ７．７　Ｂ ）１１ｓ　１．０　１ Ａｒｏ　２．８　３ 合計　７０ Ｍ、Ｗ、　８３３３ ＊ｒｒｐは加水分解時に分解されるため測定値が理論値
に比べ低い値となっている。

３）　Ｎ−末端アミノ酸配列 ペプチド試料を、エドマン分解にかけ、３段階まで測定
を行なった（　ｔ　ｗａｎａｇａ　ｓ　、、ｅｔ　ａｔ
。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｃｍ、、８．１８９　（１
９６９）　）。

アミノ酸のフェニルヂオヒダントイン誘導体の同定は、
ＣＩＡ逆相カラム（ＴＳＫ、ＬＳ４１０Ｋ。

ＯＤＳ、　東洋曹達社製）を用いたＨ　Ｐ　ｌ−、Ｃに
より行なった（　Ｑ　ｎ＋ｉｃｌ＋ｉ　Ｋ　、、Ｏｔ　
ａｔ、　Ｊ　、　３　ｉｏｃｈｅｍ、。

８７．４８３　（１９８０））。

その結果第１段階でＡｒｏ及びｌｅｕが、第２段階でＨ
ａｓ及び１−ｙｓが、第３段階でＰｒｏが夫々同定され
た。

４）　等電点 本発明ペプチド試料をオファーレル （０’　Ｆａｒｒｅｌｌ、　Ｐ、　Ｈ，）の方法ＬＪ、
　Ｂｌｏｌ　。

Ｃｈｅｍ、、２５０．４００７　（１９７５）’）に準
じて等重点電気泳動を行なった結果、その等電点は約５
．１であった。

以上の理化学的及び梠造的特徴より本実施例で得たペプ
チドは前記−次慴造式〔１〕で表わされるものと推定さ
托る。

実施例２ 実施例１において、ＳＰ−セファデックスＣ−２５を用
いたイオン交換クロマトグラフィーに代え、ＤＥΔＥセ
ルロース（ワットマンＤＥ５２、ワットマン社製、３．
２ｘ６０ｃｍ）を用い、セファデックスＧ−５０による
ゲル濾過活性両分乾燥品５００ｍｇ当り０．ＯＩＭ！炭
酸アンモニウム５０＋ｎＱｒＲ液（ｐ　Ｈ８，０）とシ
テ、庄ｍ　Ｆｌｊ）　７　ンモニウム澹度勾配〈０．１
〜０．４Ｍ）法によりイオン交換クロマ１へグラフィー
（流速４３四／時間、フラクション１０脱／チユーブ）
を行なった。

上記で得た活性両分につき、以後実施例１と同一操作を
ｎ返して、目的とするウシ血清アルブミン由来ペプチド
を得た。その収量は原料アルブミン１ｇ当り１３５０μ
０ｇであった。またその物性は実茄例１で得たそれと一
致した。

以下に上記実施例で得たペプチド試料についてインスリ
ン作用促進活性の試験例を挙げる。

試験例１ 実施例１で行なったウシ自消アルブミンのトリプシン処
理に凹し、トリプシンによる消化時間、即ち１５分、３
０分、ＩｒｇＩ間、２Ｍ間及び１４詩間の夫々について
その消化物のインスリン作用促進活性をＤ−（Ｕ−”　
’　Ｃ）グルコースから脂肪ｎ１への転換量を指標とし
て前述した方法により測定した。結果を第５図に示す。

第５図において（１）は消化物＋０．２ｍＵ、／功イン
スリンを、また（２）はｌｉ化物単独の揚台を各々示す
。

第５図より消化物単独ではいずれの処Ｆｌ！時間に対し
ても脂肪酸への転換量の増加はみられないのに対し、イ
ンスリン共存下では処理時ｉが長くなるに従い脂肪酸へ
の転換ネの増加、即ちインスリン作用促進活性が現れ、
４時間以−上では最大の活性（約５００％）が得られる
ことが判る。

試賎例２ ウシ自消アルブミンにつき、トリプシン未処理のものと
実施例１で得たトリプシン処理後のものく未精製）につ
き、Ｄ−（Ｕ−Ｉ　Ａ　Ｃ）グルコースから脂肪酸への
転換量を指標として前述した方法によりインスリン作用
促進活性を測定した。結果を第２表に示す。

第２表より、インスリン無添加の条件下では、トリプシ
ン処理の有無にかかわらず、いずれの血）ｎアルブミン
にに対しても脂肪酸への転換飛の増加はみられないが、
インスリン存在下ではトリプシン未処理では脂肪酸への
転換舟の増加が認められないのに対して、トリプシン処
理を行なうことにより、対照群に比し、有意な脂肪酸へ
の転換９の増加、即ちインスリン作用促進活性が現われ
ることが判る。

試験例３ 実施例１で骨た本発明のペプチドの各ｒ４４度における
インスリン作用促進活性を、前述した方法により別室し
た。その結果を第６図に示す。

第６図において、（１）は本発明ペプチド＋〇、　２１
１１　Ｕ／四インスリンを、（２）はウシ１１１′Ｉ消
アルブミン単独を示す。

第６図より本発明ペプチドの利用によれば１０−’Ｍよ
り濃度に依存したインスリン作用促進活性の上昇がみら
れ、１０−５Ｍでは約５００９６以上の促進活性を示す
ことが判る。

試験例４ 実施例１で得た本発明のペプチドの一定ｍ（２ＸＩＯ−
ｅＭ）について、添加するインスリンの１度を段階的に
変化させた場合のインスリン作用促進活性を、前述した
Ｄ−（ＬＪ−１’　Ｃ）グルコースから脂肪酸への転換
昂を指標として測定した。

その結果を第７図に示す。

第７図において（１）は本発明ペプチド＋インスリンを
、（２）はインスリン単独の場合を示す。

第７図より本発明゛ペプチドは添加するインスリン濃度
に依存して活性を示し、その値はインスリン濃度が約０
．１０〜ｉ、　０１！１　Ｕ／話で顕著に上昇し、それ
以上では一定値を示すことが判った。

試験例５ 実施例１で得た本発明ペプチドがインスリン作用促進活
性を有することを示す他の指標として、単離脂肋柵胞で
のＤ−（Ｕ−”　Ｃ）グルコースからの００２産生に及
ぼすインスリンの作用に対しても、上記ペプチドが同様
に促進活任を有するかどうかについて実験を行なった。

即ち、う゛ツ１−のｉｌｌｌｌ前脂肪１ｍ出し、ロッド
ベル（Ｒｏｄｂｅｌｌ、　Ｍ　）の方法Ｌ１．Ｂ’ｉｏ
ｌ。

ＣＩ＋ｅｍ、、２３９　．３７５−３８０　（１９６４
））によって酵素処理し、１％ウシｔｈ清アルブミン及
び１１１１Ｍグルコースを含むクレブスリンゲル（Ｋｒ
ｃｂ　−Ｒｉｎｏｅｒ　）　Ｉ−ＩＥＰＥｓＩ　百　〇
　（ｐ　Ｈ７，４）中で懸濁させた。そのｌｔｏ、５μ
ＣＩ／−のＤ−（Ｕ＝　Ａ　Ｃ）グルコースを含む前記
と同様の緩四液中に約１．２ＸＩＯ５個／ｎの［ｉを入
れ、空気１００％、３７℃で３時間培養した。

”　ＣＯ２（Ｄ捕集灰（ｆ計測は、オーツ（Ｏｎｏ、Ｍ
）Ｗ　’７）方法（Ｂ　ｉｏｃｈｉｍ、　Ｂ　１ｏｐｈ
ｙｓ、　ＡＣｔａ、、　２８４　。

２８５−２９７　＜１９７２））に準じて行なった。

その結果を第３表に示す。

第３表　ＣＯ２産生に及ぼす効果 インスリン　ウシ自消アルブミン　ＣＯ２由来ペプチド
Ａ 出量ご吠」スｒｌｏ’Ｍ）−立！凰ユ区剋ｙ遡±０　−
　１４．７２±１．２５ ＋　１６．５３±１．２９ １０　２８．１５±２６０６ ＋　３８．７１±２．２３ ３０　５１．５１±３．０４ ＋　６６．５１±３．１１ １０ｌｌ１０００（−７８，５４±５．８６＋　７４．
７３±５．４６ ｍｅａｎ＋ｓＥＭ （ｎ＝４） 第３表より本発明ペプチドがインスリンの存在下ではＤ
−（Ｕ−１’　Ｃ）グルコースの細胞内移行を促進し、
ＣＯＲ産生を増加することが実証され、しかもその効果
にはインスリンの添加濃度にある最適密度が存在するこ
とが示唆された。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１に従うセファデックスＧ−５０を用い
たゲルＩ濾過における溶出パターンを示す図、第２図は
同イオン変換カラムク０マドグラフイーによる溶出パタ
ーンを示す図、及び第３図は高速液体り０マドグラフイ
ーによる溶出パターン図を示す。また第４図は本発明ペ
プチドのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による
分子量測定結果を示す図であり、第５図乃至第７図は本
発明ペプチドがインスリン作用促進活性を示すことを明
らかにする試験結果を示すグラフである。 （ＬＪ、上） 代理人　弁理士　三　枝　英　二　′ 第４図 一一一一− ？１′シ　５　１１ 一崗イ■等　間　（ｇ子＆’ｌ） 第　６　１−一１ ウシ庄１ノ対アＪしフ゛ミン由Ａシｖ７°４−）”５及
刀ξ（Ｍ）手続補正書（自船 昭和５９年３ζ夕゛′月１４日 特許庁長官　若杉和大　殿 １、事件の表示 昭和５８年特　許　願第１４８５５３　号２・発′Ａ　
ｏ　’ｌｙ称　ウ、、アエプエ１．来ぺ−ｊ、ド３、補
正をする者 事件との関係　特許出願人 株式会社　大塚製薬工場 ４、代理人 大阪市東区平野町２の１０沢の鶴ビル電話０６−２０３
−０９４１Ｃ代）補　正　の　内　容 ｌ　明細書中の記載を下記正誤表の通シ訂正する。 ２　明細書第２６頁第７〜ｌＯ行に「その後・・・・・
・・・・・を入れ、」とあるを次の通シ訂正する。 ［この脂肪細胞懸濁液０．４　ｍｌ　（細胞数的５×１
０”）に、Ｄ−（−Ｕ−”Ｃ）シルコースｌＯμｌ（０
，２μＣｉ）　を加え、」 ３　明細書第２７頁に記載の第３表に「ウシ血清アルジ
エン由来ペプチドＡ（２×ＩＯ６＃）Ｊとあるを［ウシ
血清アルづ三ン由来ぺづチド（２×１ｏ−６ｖ）ｊと訂
正する。 ４　第２図を別紙の通シ訂正する。 ５　第３図を別紙の通シ訂正する。 （以　上）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ０式 ％式％ 〔式中の１！号は、ウシ白酒アルブミンのアミノｎ順位
   を示す。〕 で表わされるウシｆｆｒｉＷ１アルブミン由来ベブヂド
   及びその塩。