JPS6041488A - 異種タンパク分泌用の酵母同種シグナルの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般に、干渉となる帛の所望でないプレ配列
又は池の発現用人為購造を伴なわない分離した産物とし
て異種タンパクを合成、プロセッシング及び分泌する酵
母宿主系及び発現ベヒクルを使用する組換ＤＮＡ技術に
係る。

細胞膜を通して分泌されるタンパクは通常細胞内で暫定
プレタンパク（又は「プレ分泌」タンパクとして生産さ
れる。この形態のタンパクはイ１加的なペプチド配列を
含有しており、このペプチド配列は恐らくタンパクが細
胞膜を通過するときの補助となる。この付加的配列は「
シグナルペプチド」といわれ、分泌過程中に［シグナル
ペプチターゼ」といわれる膜関連エンドペプチダーゼに
よって、分泌されづ「成熟」タンパクから切り取られる
と信じられている。分泌タンパクのシグナルペプチドは
いくらか類似する共通部分、例えば、カルボキシル末端
の短かい側鎖アミノ酸及び疎水性中央部を有しているが
その一次構造はかなり違っている。所与の生体でさえも
シグナルペプチドのこのような変化が見い出されている
。例えば、ヒト成長ホルモンのシグナルはヒトインシュ
リンのシグナルとは実質的に異なっている。このことは
、各々のタンパクがそのタンパクの膜を通しての転置を
と特にう才く適合するようなシグナル配列をもつように
進化して来たことを示唆している。

のＤＮＡ配列及び酵母にとって内因性のシグナルのシグ
ナルペプチドをコードしている部分、例えば酵母インベ
ルターゼ遺伝子に由来するＤＮＡ配列とに有効に（発現
するように）結合すると、成熟タンパクが酵母によって
分泌されるという発見に基づくものである。ある場合に
は、成熟タンパク収率は、このタンパクがその天然のシ
グナルペプチド（酵母にとっては異種のシグナル）と共
に発現される場合よりも高くなり、しかもプロセッシン
グの信頼性も時々は向上されている。即ち、本発明は、
異種タンパクをコードしているＤＮＡを含有する酵母の
培養培地から有用な量の異種タンパクを得る手段及び方
法に係る。この場合、前記異種タンパクをコードしてい
るＤＮＡは、酵母内因性配列のプロモーター及びシグナ
ル部分を含むＤＮＡ配列に有効に（発現し得るように）
連結されている。本発明の型図な利点は、改良容易なプ
ラスミド中の異種ＤＮＡの発現により卸１胞培養培地中
に有用な分離状ａ　（ｒ１６を合していない）のタンパ
ク産物が得られることである。

本発明の背景を明らかにし、特定の場合には本発明の実
施に関する更に詳細な説明を与えるべく本明細書中に引
用する刊行物やその他の資料は引用によって本明暫釦こ
包含されるものとする。便宜上これらに番号を付しまと
めて本明細書末尾の参考文献の欄に記載する。

又、本発明は、１９８２年１１月１日に出願された米国
特許出願第４３８．２３６号及び１９８３年４月２５日
に出願された米国特許出願第４８８．３２３号に関連す
るものであり、ここに引用したことによりこれら出願の
開示内容゛を本明細書中に包含するものとする。

細胞代謝に必須な機能として、少数のある種の同種（内
因性）タンパクを原形質膜まで及び時にはそれを通して
輸送する。娘細胞の再生の初期成長として細胞が出芽す
る際には１代謝は勿論細胞壁及び原形質膜の生成に伏他
の付加的なタンパクが必要である。これらのタンパクの
あるものは分泌経路（１）によって機能部位まで輸送さ
れる。上記過程に含まれるある種の同種タンパクは粗面
小胞体（ＲＥ几）中での翻訳によって形成される。これ
らのタンパクの生合成中、シグナル認識粒子はシグナル
認識粒子（Ｓ　１１・Ｐ）という推定粒子と相互伶用し
、次いで８１１Ｐ受容体又は結合タンハク（ｄｏｃｋｉ
ｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　）といわれる推定ＲＥＲ，ｌ漠
タンパクを認識し、その後タンパクが）１．　Ｅ　Ｉ’
（、膜を通って輸送される（２−４）。タンパクは一担
ＢＥ几内・１１！に分離された後、ゴルジ装置へ移送さ
れ、次に小胞内へ包入される。小胞が（エキソサイト−
シスにより）原形質膜と融合すると、小胞内容物（タン
パク）が原形質膜と細胞壁の間に限定されたペリプラズ
ム空間（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ　５ｐａｃｅ）に放出
される。同種タンパクの少数のものは完全に細胞壁を通
過して外へ輸送されるらしい。例えばα−因子及びキラ
ー毒１（ｋｉｌｌｅｒｊｏ）（Ｉｎ　）がある（５，６
）。

しかしながら、酵母での分泌過程はまだ充分に理解され
てはいない。酵母の推定されたＳＲＰは哺乳類細胞のそ
れと同等ではないであろう。

換言すると、ある種の異種シグナル（酵母のシグナル以
外のもの）は、異種遺伝子の発現に用いた前記同種（酵
母）シグナルと全く同様に酵母ＳＲＰと結合するかもし
れないししないかもしれない。同様に、タンパクの亘旦
亘　修正′（例えばリン酸化、グリコジル化等）が分泌
過程で分泌タンパクの局在化にどの程度関与するのか明
らかではない。

組換ＤＮＡ技術により、酵母生体中の分泌過程に関する
広く知られた質問に対する解答を与える有用な手段が得
られ、これを適用することで、前記の如き生体又は池の
生体にコピーｌ（大量）の異種ポリペプチド産物を内因
的に産生させ得（例えば、７〜１７参照）、酵母宿主を
適当に操作して異種タンパクを個別の成熟形態で分泌せ
しめ得ると考えられていた。これは実際に達成されてお
り、係稿中の米国特許出願第４３８．２３６号（玉揚）
の主題となっている。

この出願には、最初はその天然のシグナル（ヒト）を伴
なうプレタンパク又はそのハイブリットトシて発現され
た異種タンパクが酵母によって成熟タンパクとして分泌
され得るという知見力゛５記載されている。

発明の概要 本発明は、酵母生体を、通常は酵母生体にとって異種で
あるタンパクの遺伝子を発現し、プロセッシング処理し
且つ分泌するようにせしめ得るという知見に基づくもの
である。即ち、このタンパクは支持培地から所望でない
プレ配列又は他の発現用の人為溝造を伴なわない分離（
個別）形態で得ることができる。このために、異種タン
パクをコードしているＤＮＡ配列を同種（即ち酵母）の
シグナル配列をコードしているＤＮＡ配列好ましくはイ
ンベルターゼの配列ｉこ結合して発現させる。α−因子
シグナル（プレプロ）ペプチ自姻升−号モー４−一及び
プロモーター、例えばインベルターゼ遺伝子のプロモー
タ慢コードしている如きＤＮＡに有効に（発現するよう
に）連結された異種タンパクをコードしているＤＮＡを
担持する発現ベヒクルで、永久系で培養されている適切
な酵母細胞を形質゛転換する。同種シグナルペプチドを
含有する融合タンパクの製造に際し、発現産物はプロセ
ッシングを受けて成熟異種タンパクが細胞培養の培地中
ζこ輸送され、生体酵母細胞を破砕する必要なくこの培
地から成熟タンパクを回収し得る。

従って、所望でないプレ配列又は他のある種の発現用人
為構造（例えば、ＡＵＧ翻訳翻訳開始ジグ−３ シルコドンの発現の結果であるイ崗善には第１のＮ−末
端アミノ酸に結合したメチオニン）を除去する必要なく
、使用に際し他の点では実質的に成熟な形態でタンパク
を回収する。即ち、生体又は破砕（即ち、溶窮又は他の
方法で破壊した）細胞を実質的に含有しない形態で培地
が得られ、これは所望の産物を含有しているのでより容
易に使用できる精製技術にかけられる。

精製後のこのような産物は意図する用途に適合する。例
えば、ヒト白血球インターフェロン産物はその用途とし
てヒト抗ウィルス及び／又は抗腫瘍剤がある（一般的文
献として７〜１７参照）。

要約すると、本発明は、基本的面で、通常は酵母生体に
異種であるタンパクを、プレ配列又は他の発現用人為構
造を半なわない分離形態で産生ずる際に使用する手段及
び方法に係る。

この点本発明では、異種タンパクをコードしているＤＮ
Ａ配列を、酵母にとって同種のプロモーターの制御下で
且つ酵母にとって同種のシグナル配列をコードしている
ＤＮＡ配列と共に翻訳解読枠（ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａ
ｍｅ　）内に配置することにより、発現、プロセッシン
グ及び分泌を達成する。更に、本発明は、前記の如きタ
ンパクを産生じ得る酵母培養物及びその培養の結果得ら
れる産物さして前記の如きタンパクを含有する酵母培養
培地を提供する。

「インベルターゼシグナルペプチド」という用語はイン
ベルターゼに通常結合しているアミ′ノ酸プレ配列を指
す。「同種シグナル」という用語は、少なくとも実質的
に、天然に存在するシグナルに対応する酵母タンパクの
シグナルペプチド領域を意味する。従って、このような
シグナル領域は、シグナルペプチドとしての機能に実質
的な影響を及ぼさないアミノ酸を含むか又はこのような
アミノ酸を欠失しているかで天然のシグナルと違いを有
し得る。「異種シグナル」は酵母以外の生体で同様な機
能を有するシグナルペプチド領域を指す。

本明細書で使用する用語「異種タンパク」は、酵母生体
によって通常は産生されず又はその生存に必要でないタ
ンパクを意味す−る。この用語は、前記の如きタンパク
をコードしているＤＮＡを組換ＤＮＡ技術により発現ベ
ヒクル中に機能的に挿入し、次いでこれを酵母生体宿主
の形質転換に使用することも意図している。ＤＮＡの機
能的挿入とは、異種タンパクをコードしているＤＮＡを
プロモーターシステムの制御下にある発現ベクター中に
挿入することを意味する。

このＤＮＡ配列を（酵母にとって）同種のシグナルペプ
チドに有効に（発現するように）連結すると、ハイブリ
ッドプレタンパク、即ち異種タンパクに融合した酵母シ
グナルペプチドを含有するタンパクが得られる。このよ
うな異種タンパクの例としては、ホルモン例えばヒト成
長ホルモン、ウシ成長ホルモン等、リンホカイン類、酵
素、インターフェロン例えばヒト繊維芽細胞、ヒト免疫
並びにヒト及びハイブリッド白血球インターフェロン、
ウシインターフェロン等、ウィルス抗原又は免疫原例え
ば口帥病抗原、インフルエンザ抗原タンパク、肝炎コア
及び表面抗原等、並びに他の種々のポリペプチド例えば
レンニン、ヒト血清アルブミン、ヒトインシュリン、ヒ
トインシュリン様成長因子−１，ｊｉｆｆｌ々の９唐タ
ンパク等がある。

本明細＃で使用する「分泌」は、原形質愼を通して且つ
少なくとも酵母生体の細胞壁内への又はそれを通過して
細胞培養を支持する培地中への産物の輸送を意味する。

因みにある場合には、「分泌」産物は何らかの態様で細
Ｉｌｉ！壁と結合しており、恐らくは異なる棺−’ｊＮ
ｌ！操作を必要とし、又は酵母宿主の構造及び機能の修
正が必要となる。「プロセッシング」とは、成熟タンパ
クから同種シグナルペプチドｆＮｍ胞内で開裂して９４
Ｎのペプチドを伴なわないいわゆる分配（個別の）又は
成熟形感で異種タンパクを産生ずることを意味している
。「異質の」ペプチドには上記のようにメチオニンのよ
うな発現用の人為構造であるペプチドが包含される。プ
ロセッシングは、成熟タンパクと結合したシグナルペプ
チドの正確な点とは離れた（しかし意味のあるような重
要な違いとはならない程近い）場所でのシグナルポリペ
プチドの重要ではない開裂を許容する。

（以１・余白） 好ましい具体例の詳細な説明 本発明の発現ばヒクルを得るために２つの基本的技法を
使用した。本発明の発現ばヒクルなる用りのＤＮＡ配列
とインベルターゼの同種シグナルＲゾチ）”Ｑ）ＤＮＡ
配列とを含むばヒクルを意味する。

２■１の技法では、インばルクーゼシグナルをコードす
るＤ　Ｎ　Ａ配列を合成してＰＧＫプロモータに接合し
、このハイブリット９プロモークシグナル配列を異種タ
ンパクのコード遺伝子に接合してプラスミ白こ挿入した
。第２の技法では、ハイブリダイゼーション技術を用い
てインイルダーゼ１１′工伝子を酵母ゲノムＤＮＡバン
クから単離した。インばルターゼをコート９する遺伝子
部分を除去し、異種タンパクをコードするＤＮＡをイン
ばルターゼのプロモーフ及びシグナルをコードするＤＮ
Ａ配列に４”＋合した。Ｒ、Ｊ　ｊｊｉタンパクとして
ヒＩ・白血球インターフェロン（ＬｅＩＦＡ）を超択し
た場合を例にして操作方法を以下に詳ｉ＋１１に説明す
る。

■　材料及び方法 ＤＮＡのソース 全てのＩ）　Ｎ　Ａ制限酵素、Ｌ　憇旦Ｄ　Ｎ　Ａ　ポ
リメラーゼ大断片（Ｋｌｅｎｏｗポリメラーポリ）（１
８）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、及び烏・（η骨＋１ｒｆ＋
芽球症ウィルス（ＡＭＶ）逆転写酵素はいずれも、Ｎｅ
ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｌｏｌＩｌｂｓ又はＢｅｔｌ＋
ｅｓｄａ　Ｒｃｇｅａｒｃｌ＋Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓから入手し、処方通りにｒ重用した。デオキシヌクレ
オチド９トリポスフエートｄＡＴｌ）、ｄＧＴＰ、ｄｃ
１’Ｐ及びｄＴＴＰはＰＬＢｉｏｃｂｅｍｌｃａｌｓか
ら購入。プラスミド”　ＬｅＩＦＡｔｒｐ２５はＱｏｅ
ｄｄｅｌ等の方法（７）で調製。

細菌株及び酵ＪＵ菌株 形質転換のために使用した菌株は、Ｅ、ｃｏ月１（−１
２株２９４　（ｅｎｄＡ　ｔｈｉ　ｈｓｒ　ｈｓｍ　；
　ＡＴＣＣ３１４４６）（２２）とｎ７母菌ｐｅｐ　４
−３株（２０Ｂ−１２ｄｔｒｐ　１　ｐｅｐ　４−３　
；ＡＴＣＣ２０６２Ｇ）（２３）。

増７／Ｉ（（Ｉγ１地 Ｅ、ｃｏｌｔの増殖には、−１％の１３ａｃｔｏ　−）
リプトンと０．５％のＢａｃｔｏ−酵母抽出物と０．５
％のＮａＣ１吉を含むＬＢ培地（２５）を使用。プラス
ミド°を担う、ｒｌｌＩ菌の増殖には、架剤（２０μｍ
；　／　ｍｌのアンピシリン又はテトラサイクリン）を
添加。

ｉ１？母最小培地プレートは、０．６７％の無アミノｒ
：ｆ！！ｎａｃｔｏ−酵ＩＵ：　”ＬＸ　素塩基さ２％
のグルコースと３４上 ％のＤｌｆｃｏ−アガー岬を含むもの。酵母の形質転換
用最小培地は上記にＩＭのソルビトールを加えたもの。

ＹＮＢ＋ＣＡＡ培地は１０り／ｌのアデニンと１０　ｒ
ｎｙ　／　ｌのウラシルと５　ｇ／　１３０）　Ｄｉｒ
　ｃ。

−カザミノｃ’ｌ’２　（ＣＡ　Ａ　）を加えたノ「ン
小培地。ＹＥＰＤｊ？’ｆＪｌｋは、１ゾｂのｌｅａ　
ｃ　ｔｏ−酵イ号抽出ｈｙと２％の１３ａｃｔ。

−ペプトンと２′％のブドウ１；ｌ、Ｍ　（グル」−ス
）とを含むもの。

形質転換 一トニリ４２９４イ′（この形’ｔ’ｆ　％で４ｇ４は
公知の手順（１９）を用いて行ない、］１￥ｌυｉ’自
ｐｅｐ　４−３４？ｉ、の形’＋’ｔ’　ｉｉ’Ａ　４
Ｃ’Ｊｌｊ　［１Ｉｎｎａｎ等（２１）の方法で行なっ
た。

Ｄ　Ｎ　Ａの６周、１１１Ｊ 個々のり、ｃｏｌｌ形ｆｑ転１負体からプラスミド９１
）　Ｎ　ＡをミニスクリーニングするためにＢｉｒｎｂ
ｏｉｍ及びＤｏｌｙの方法（２０）を使用。プラスミド
ＤＮＡの量産のためには、上記方法を用いた後、１１１
ｏ−ｇｅｌ　Ａ−５０ｍ　（１００−２００メツシュ；
Ｅｌｏ−ｒｎｄ　）カラムクロマトグラフィーで分画を
行なツタ。Ｄ　Ｎ　Ａ　ｊｌｉｌｌ限ＩＩ片０）　ｊｌ
ｉ　創ニ＋ｕ、ゲル’ｉｉｃ気（（：出、フェノール／
クロロホルム抽出、エタノール沈〕股を順次用いた。２
つの４０　ｍ’ｅ　ｒ　冒鼎Ｊイデオキシスクレオチド
の化学合成にはリン酸トリエステル法（３８）を１更用
。

ゲル電気泳動 プラスミドＤＮＡのポリアクリルアミド電気泳動にはＭ
ａｎｌａｔｉｓ等の方法（２４）、同じＤＮＡのアガロ
ースゲル電気泳動には５ｈａｒｐ゛等の方法（３０）を
夫々使用し、タンパクの１’デシルイｉｉｆ　ｌ’ｉ１
２ナトリウム−ポリアクリルアミド９ゲル電気泳動はＬ
ａｅｍｍｉｌの方法（３１）で行なった。

第２図の如き酵母インベルクーゼシグナル領域をコート
９する既知のヌクレオチド配列に基いて、２つの４０ｍ
ａｙオリゴヌクレオチドを第１図の如く設計した。

酵母インベルターゼの出発ヌクレオチド配列同様に、Ａ
ＴＧ翻訳開始部位の直前の伺加ＡＴＧをＳ（Ｌ持した。

５′端に２つの付加ヌクレオチド”　（Ｇ　ｃ）６Ｈ，
１↑−ら゛うＡ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ（７）手ｎ１Ｊｌ
コＪ当すＥｃｎＲＩ制限部位を配Ｖｊｆ、　した。これ
らの２つのオリコ゛ヌクレオチ白ま３′端に互いに相捕
的な１２個のＪλ、す５９対を・ｒｌする。これらのオ
リコ゛ヌクレオチド′を逆転写酵素で修復すると、新し
く形成された二本鎖１）　Ｎ　Ａ　ノ３　’　？Ｊ　ハ
平、ＶＰμ’１Ａｊｊコなり、コノ平（ｆｔ　Ｑ：ｔＡ
は同じツー１−９枠を維持する成熟メチオニン−Ｌｅｌ
ＦＡの平滑端に結合されるであろう。５′で・；ＩＡは
Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒ１消化後接７ｆＴ昂１になる。

インイルターゼシグナルに詰ｒ１されたＬｃｌＦＡをコ
ードするプラスミ”　Ｕ）’Ｉｌｊ’　？ｉＩ！手堰゛
１を第１１ン１１ヒ示ず。

ＡＭＶ逆転写醇木を用いて２つの合成オリゴヌクレオチ
ド９の修復反応を実施した。５０　ｍ　ＭＴｒ　Ｉ　５
−ｉｔｃｌ、　ｐＨａＯ，と５０　ｍ　Ｍ　ＫＣｌと＋
３＋ｎＭＭｇＣ／？２　（！：　１　ｍＭ　：）チ第１
・レイト−ルとイ４０．２　ｍ　ＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰと１５０μＣｉのα−３λＰ−ｄｃ’ｌ”
Ｐ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）とを含
ム５０　／ｌ　ｌの反応容量に２５ユニットの逆転写酵
素（Ｕ　ＲＬ　）を加えた中に、４００ｎｇの２イ１ｐ
・頃の４０ｍａｒオリゴヌクレオチドを入れた。反　応
を４２℃で７５ケ間維持し、次にフェノール／り１　ロ
ロホルム抽出で停止した。２回抽出した水相を３Ｍ　酢
酸ナトリウム、ｐＨ５，５，で０．３Ｍに調整し、−２
０℃、６６％のエタノールで沈殿させＭｇＳＯ４，１ｍ
Ｍ　β−メルカプトエタノール及び１００　ｍＭ　Ｊ（
２−ＣＩ！　）中の２００ユニツトのＥ　Ｃｏ　ＲＩで
３時間消化し、１０％ポリアクリルＫ　ｏ　ｄ　ａ　ｋ
　フィルム（Ｘ７０ｍａｔ　ＡＲ−２）シー１〜２叱１
又１白ＤＱ　ｊ’営ブＣしプこ。オートラジオグラフィ
ー後、（インベル〃−ゼシグナルコドンを含む）　Ａ支
高放射能パント９の位置をオートラジオダラムマパ命検
出し、このバンドを湿性ゲルから←り除して透析バッグ
内でｔＩ（気溶出した。溶出１）　Ｎ　Ａをフェノール
／々ロロホルムで２回抽出しエタノールで化１１没させ
ｌ、二。次にＤＮＡを凍結乾固し１０μｌの蒸留水に懸
濁させた。

Ｅ、ｃｏｄｊ　発現プラスミド９ブこるプラスミドメチ
オニンＬ　ｅ　Ｉ　Ｆ”　Ａ　（７）　０）ｉ’ｉｆｆ
造造伝子を含む。

のＥ　ｃ　ｏ　ＲＩで切断した。この塩ノ２ツファは上
記高ｒＩ！１１バッファと同様であるズｊｉ　Ｎ　ａ　
ＣＩＪが１００ｍＭでなく５０ｍＭである。旦ｃ　ｏ　
１１　Ｉ部位は、成熟メチオニンＬｅＩＦＡのＡ　Ｔ　
Ｇ　ｌ！！ｉ１始コト１ンの１自前に存在していた。イ
ンはルターゼシグナルコト９ンとの結合後に成熟メチオ
ニン−ＬａｌＦＡの止しいコート９枠を生成するために
は、旦ｃｏＲ目ｉＢ位の３′−ストランドのヌクレオチ
ド°Ｇを除去しなければならない。このために（メチオ
ニン−ＬｅｌＦＡｉＪ！ｉ伝子を含む）ＥｃｏＲＩ断片
を３ユニツトのＤＮＡポリメラーゼ工大断片と共に２　
＜７μＭのｄ　ＴＴＰの存在下で室温で３０分間インキ
ュー？　−１−した。

反応にｄＴＴＰを存在さぜるのは、Ｄ　Ｎ　Ａ　ｙｌ？
　ＩＪメラ・−ゼＩ　’ｘＪｅｎｏｗ　断ハの３′−エ
キンヌクレアーゼ活ためである。次に、反応混合物をフ
ェノール／クロロポルム抽出しエタノール化１１ｊ　Ｌ
／た。乾燥ＩＪＮＡを３０）ｔｌの１０　ｍＭ　Ｔｒｉ
ｍ−１１ＣＩＪ　、　ｐ）Ｉ　８．０　。

時間インキュベートし、次に２回のフェノール／クロロ
ホルム抽出とエタノール沈ｊＨ没と１ごよって停止させ
た。ＤＮＡを中温バッファに懸濁させ、２ユニツトの　
ＰｓｔＩで３７℃で２１Ｔ、ｌｆ間消化し、６％ポポリ
クリルアミド゛ゲルにノロ　ｊｆＱ　Ｌ／た。〜８１０
１＋ｐＯ：）去こユＲＩ−ヱ上ユＩ所片をゲルから学Ｓ
して電気溶出し、フェノール／クロロボルム抽出しエタ
ノール沈殿した。

反応容量５０μｌの中広バッファ中で２μｇのシラスミ
ド”ＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）（３４）を１０ユニツトの
Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ吉１０ユニットの工己土ｔｌとで３７
℃で２時間消化した。大１ｉ、ｌｉ片（３，６ｋｂｐ）
を５％ゲルからｌＹｔ　９ｊ）Ｉ　Ｌ／　、デトラーリ
°イクリン１１ｉ、Ｉ　＋主債伝子を有するばクターＩ
ＩＪ？片として匣用した。２０ｎ’ｇのこの凡△ｏＲＩ
−Ｉ’ｓＬＩベククー１１Ｊ「ハを６５ｂＰのインＲル
ターービシグナルコドンと上り己の如＜宿劉された〜８
８０　ｂｐのメチオニン−ＬｅＩＦＡ断片とに結合した
６　５　Ｏｎ＋Ｍ　’ｌ’ｒｉｓ−Ｉ（ＣＪ、　ｐｉ＋
　７．６　、と１０　＋ｎ　Ｍ　ＭｇＣｄ２と２０ｍ　
Ｍ　ジチオトレイトールと１ｍＭＡＴＰａｌユニツｔ−
Ｑ）’ｒ　＝ｔリガーゼ（ＵＲＬ）とを含む反応室ｊ＋
１．’　１　ｏ　／ｌ　ｌを室温で１６時１１１Ｊイン
キユば一トシキナーゼを加えて３７℃で３０分間インキ
ュベートした。反応混合物を室温に冷却し、咀に２ユニ
ットのＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼを加えた。反応
混合物を室温で更に１６時間インキュベー１・した。

ｐＬｅＩＦＡ−インばルクーゼシグナルを含むこの全結
合混合物を（吏用し、ＬＢ培地プレート上でコンビプン
トｒｔ’４Ｅ、　ｃｏｌｉ　２９４をテトラザイクリン
耐性に形質転換した。３０個のテトラザイクリン（ｕｊ
性コロニーが・１υられた。

クローンのスクリーニングと配列決定 器々のＥ、ｃｏｄｉ　形質転換体を５μｇ〆ｍ６のテト
ラザイクリンを含む５ｍ１ｌのＬＢ培地で３７℃で１６
時間増殖した。これらの形７ｆｊ転換細胞かで調１ｇＪ
Ｌ、５０μｌの蒸留水に晋濁した。各ＩＩｆ　’ｊ“１
転換体からＩＪた１０μｌのシラスミドゞＤＮＡをＥ　
ｃ　ｏ　Ｉｉ　Ｉ及びＰｓｔＩの双方を用いて中」１に
バッファ中で３７℃で３時間消［ヒし、５％ボリアクリ
ルアｉ　＋−゛ゲルに充填した。これらの形７）１転換
体のうちの６つのクローンが、イ：／×ルターゼシグナ
ルコドンと成熟メチオニン−Ｌ　ｅ　Ｉ　Ｆ　Ａ；！’
を伝子との双方を有する〜８８０ｂｐの旦ヱユＲ■−上
ｎｔｌ断片を含んでいた。成〃１メヂオニンーＬｅｌＦ
Ａ；１゛ξ伝イを担持する〜８１０　ｂ　ｐ　Ｏ）旦二
ヱＲＩ−−凪１」−■断片を生成するプラスミＩ’（ｐ
　Ｌ　ｅ　ＩＦＡ’ｐｒｐ　２５）もコントロール実験
として含まれていた。このように、６つのクローンから
４．ｊ４導されたＥｃユｉｔ　Ｉ　−Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ断
片を単ｒ庇し、配列決定用ファー：）Ｍ１３ＭＰ９にク
ローニングした。次に、イン（ルターゼシグナルコドン
とインベルター−ビシグナルコビンとメチオニン−Ｌ　
ｅ　Ｉ　Ｆ　Ａ・１１１伝子との接合部との（−ｊ近の
ヌクレオチド配列を、ジデオキシ配列決定法（３２，３
３）で決定した。２つの有望なりローン（Ｆ３．Ｆ２）
が得られた。

酵母中でＬｅＩＦＡを発現するためにクローン（ Ｆ３とＦ２とかりｈ　ｄ％されたシラスミド８を２１↓
３１λ１の如＜４７ｙ条した。

クローンＥ３及びＦ２から得たプラスミ）Ｄｌ〈Ａを且
ユ」Ｉで直ｆｔ＋、Ａ化した。次にｈ７　（υシラスミ
ド学ＹＥｐ１３（３７）から単離されたアダプターｊｌ
：Ｉｉ片（（ｌ　ＯＯｂ　ｐ）を用いて上記ベクター断
片の旦まｔ　Ｉ　ＣｊｉＡを乱±ユＲＩ部位に転換した
。このアダプター１（１１片は、内部且ヱｏＲＩ部位と
両端の尤ま）Ｔ部位とを含む。ヱユ」工から旦ｃ　ｏ　
ＲＩまでの２４７ｂｐは酵母２μ　ＤＮＡから誘専され
１、旦ヱｏＲＩからＬ！」■までの６５４　ｂｐはｐＢ
Ｒ３２２から誘導される。１１′ＰＬって、この９００
ｂｐアダプタ１“ｉＲ片を所望クローンＩＹＪｒ片のＰ
ｓｔ１部位に挿入するとプラスミド９を担うイ）旧）コ
のアンピシリン耐性が回復した。アンピシリン＋ｆｊＪ
性クローンから単離されたプラスミドＤＮＡを１”Ｊ　
ｃ　ｏ　ＲＩで切断し５％ポリアクリルアミドゲルに流
した。〜１１００ｂｐＱ）旦±ｏ　ＲＩ　Ｉｉノ【片を
ゲルからｉ（１，気溶出しフェノール／クロロポルム抽
出しエタノール沈ｊ殴した。

醇゛母発現シラスミド”ＹＥｐＩＰ１’（３５）を３−
見見Ｉζ工で消化し、１ユニットの仔ウシＩＪｆ’ｉ＋
　腺Ｔルカリ性ボスファターゼ（Ｂｏｅｂｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｙｈｈｅ　ｉｍ　）で３７℃で１０分間処理した
。処理ＩＪＮＡを１回フェノール／クロロボルム抽出し
、次にエタノール沈殿した。１０ｎＨのこのベクター断
片と１５Ｏｒ＋Ｈの前記イン−ぐルターゼシグナルコド
ンーＬ　ｅ　Ｉ　Ｆ　Ａ　；ｌ’Ｊ仏子断片（凡り見Ｒ
Ｉ　）とを１４℃で１５時間を要して結合した。結合混
合物Ｅ、ｃｏ／？ｌ　菌２９４株の形質転換に用いた。

個々の形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、ばフ
タ−上のＰＧＫプロモータまでのインばルクーゼシグナ
ルコドンーＬ　ｅ　Ｉ　Ｆ　Ａ１ｉ！ｊ伝子の配向を１
）　Ｎ　Ａの制限パターンによって決定した。クローン
Ｅ３及びＦ２力）ら、透導された７５ｉ望のプラスミド
９１）ＮＡ、ＹＥｐ、ＩＰＴ−Ｌｅ　ＩＦ’Ａ−インば
ルクーゼシグナルを使用して酵母ｒ４′ｊｐｅｐ４−３
株を形質転換した。

ａ、抽出物調製 クローンＥ３及びＦ２から誘導したＹＥｐｌｐＴ−Ｌｅ
　ＩＦＡ−インベルターゼシグナルによって形質転換さ
れた酵母菌ｐｅｐ４−３株の細胞を１０１の発酵槽で３
０℃の２．６％酵母碩素（Ｊｉ基と１％グルコースとの
中でＡ　５５０が３−４になるまで増殖させた。この細
胞濃度では初濃度１％のグルコースが完全に消費された
。次にＡ３５０が５０−１００になるまでＩｊ’ＪＩ胞
ｔこグルコースを緩つくりと与えた。アッセイのｆ；め
に、各１０ｍ１の部分サンプルを採取し５ｏｒｖａｌ　
ＲＣａＢ中で１０．００　Ｏｒｐｍで１０分間遠心した
。アッセイｉａ前に上清（培地）をｐ　Ｂｓ　／　Ｕ　
Ｓ　Ａバッファ（２０ｍ　ＭＮａＨ２ＰＯ＋　、ｐＨ７
，４、１５０ｍＭ　ＮａＣ／？、　０．５％ウシ血清ア
ルブミン）で２０乃至１００倍に希釈した。細胞（Ａ３
５Ｏ−４−１ｏ　）を、約Ｑ、　４　ｍｌのガラスピー
ズ（０，４５乃至０．５ｍｍ、　Ｂ、ＪｒａｕｎＭｅｌ
ｓｕｒｇｅｎ　ＡＧ）を入れたＥｐｐｅｎｄｏｒｆＥｐ
ｐｅｎｄｏｒｆ遠心機で０．５分間遠心した。次に１．
５イオアツセイのために細胞溶解物を前記のＰ　Ｂ　Ｓ
／ＢＳＡバッファで希釈した。

ｂ　インターフェロンアッセイ 細胞変性効果（ＣＰＥ）阻止アッセイ（２６）を使用し
インターフェロン標準との比較によって酵母抽出物と培
地とのインターフェロンアッセイを実施した。アッセイ
に使用した細胞はウシ腎細胞（ＭＤＢＫ）である。

培地とｎＩＩ胞抽出物との双方を１０％の水冷トリクロ
ロ酢ｔ’＋シで沈殿させた。１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩
基、２０ｍＭ　ジチオトレイｌ−−ル、　０．０１％の
ブロモフェノールブルーと２０％のショ糖との中で３７
℃で３０分を要して沈殿物を溶解し、浴に入れて３分間
沸騰さぜた。室温に冷却し、１００ｍＭ　す］・リウム
ヨート９アセトアミドを加え、更−パぞリアクリルアミ
ビゲルに流した。ゲルを（ＳＯＳを含まない）　、ｆｔ
ｉ気泳動バッファに２０分間浸漬し、ケルノタンハク’
ｉ；　０．５　Ａ　ｍ　ｐで２時間を明して（Ｅ−ＣＡ
ｐｐａｒａｔｕｓ　Ｃｏｒｐ、）同じバッファのニトロ
セルロースイーパー？こ？ｉｉ：　ｌＡ＃ＣＷｂ　的に
転移させた。転移後、ニトロセルロースは−パーをＮＥ
Ｔバッファ（５０ｒｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ／？、ｐＨ７
，４，１５０ｔｎＭ　ＮａＣｌ　、５ｍＭ　ＥＤＴＡ。

０．２５（重量／容１４）％ゼラチン及び０．０５％Ｎ
Ｐ二４０）中で１晩インキユ（−トした。イーパーを簡
単に水洗し、プラスチックバッグに入れブこ。１０ｍ１
のＮ　Ｅ　’Ｊ’バッファ（！：１５０μｌのつ→ノー
ギ抗ＬｅＩＦＡ抗血清とを加え、室ｒｉ！で３時間イン
キュベートした。水及びＮＥＴバッファの各々でよく洗
い、ペーパーを１０ｍ１のＮＥＴバッファと０．２Ｃｉ
の　ニープロティンＡ　（Ｐｈａｒｒｎａｃｉａ）と共
に２時間インキュベートした。次に、イーパξ−を多姓
の水で１０分１１■１浣い、ト“ライブロット（ｄｒｙ
　ｂｌｏｔ　）Ｌ／、−７０℃の１曽感スクリーンと共
ζこＫｏｄａｋＸ線フィルムに４光した。

クローンＥ３及びＦ２から誘導されたプラスミドを夫々
含む酵母ｐｅｐ４−３形質転１コ！体を１０１の発酵槽
で別々に増殖させ、細胞除去後の培地を以下の如く別々
に精製した。

７１の培地を濃縮するために１８ｐｓｉのＹＭ−５７模
を１吏用する溜イ寸きＡｍ１ｃｏｎ祁目みセル（Ａｍ１
ｃｏｎ　ｔｈｉｎ−ｃｈａｎｎｅｌ　ｃｅｌｌ　）（Ａ
ｒｎｉｅｏｎ　ＴＣＦ　１０−９０ｍｍ及び　ＲＧ−１
１）内で５ＩＱ）２５ｍＭ酢ｒｅ酢酸アンモニウムＩ５
．０゜及び４０ｐｓｌを使用する２、５　ｌＱ）Ａｍｉ
ｃｏｎ　ＪＸ？。

拌セルに移した。透析Ｖゴ過で総ｆａｔ　１０　ｌの２
５ｍＭ酢酸アンモニウムを使用すると、非濾過液の最終
＋ｒ＜が９００ｍ１であった。次に、非濾過液を酢酸ア
ンモニウムで２１に希釈し、１．７ｍｅ／分テＣＭ５２
カラム（Ｒラドボリューム５００ｍ１）に通した。

カラムを０．５Ｍ　ＮａＣｌで溶出した。１０ゴの画分
を収集し前記の如く検定した（第５図参照）。

画分１２６−２３８をプールし、２５ｍＭ　Ｔ’ｒｌｓ
−１（Ｃｌ、　１０　ｍＭＥＤＴＡ　、　ｐＨ８，０、
に透析した。通ｉ析プール（１８８ｕ＋（りを次１こ、
Ａｆｆｉｇｅｌｌ　０　（ＢｉｏＲａｄ）に共イ１結合
したＬｅｌＦ’Ａに対するモノクローナル抗体を含む０
．５　ｍ６のイムノアフイニテイ力ラムに（カコ速０．
１！ＭＪ／分で通した。

カラムを０．２　ＭｒＮ’ｐｍＬ　ｐｌｉ　；２．５で
溶出しプコｏ１ｍｌの両分を収集し検定した（　７ｉＳ
　６１Ｎ参照）。両分５８（４５Ｘ１０ユニツト／　ｍ
１１′）を更に、５ｙｎｃｈｒｏ−ｐａｃｋ　ＲＰ　Ｐ
　カラムの高圧液体クロマトグラフィー（）ｌ　Ｐ　Ｌ
　Ｃ）でイ青製した。０．１　％のトリフルオロ酢酸（
ＴＦＡ）中の直線勾配０−．１００％のアクリロニトリ
ルを用いカラムを流３Ｂｍ（７７分で溶出した。１ｍｌ
の両分を収集し検定した（第７図の下部参照）□Ｅ、ｃ
ｏｉｌから、ｌ’ｉ？　ｊＪｕしたＬｅＩＦＡの５μｇ
ザンプルもコンＩ・ロールトシてクロマトグラフにかけ
た（第７図の上部参照）。両分４２　−と４３　（５，
６ｘ　１０ユニ゛ント／ｍｅ）をプールし自己列決定し
た。

８１の培地をＪα縮するためにＹ　Ｍ　５限外Ｐ３１：
１膜を用いる２、５１のＡｍ１ａｏｎ　１’？ｌ拌セル
（Ａｍｉｃｏｎ２０００）で６６の酢酸アンモニウム、
　ｐＨ５，０。

に透析Ｐ３１・“Ｎして最終量１．７１とした。濃縮液
を次に、６乃至８１の２５ｍＡ４　Ｔｒ　ｉ　５−Ｉｒ
Ｏ２，１０＋ｎＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐ）１８．０　、に
透析ど過してＩけ終１１ｉｉ、　。

を約５０ｍ１にした。非濾過液を５３０ｍ１に希釈し　
、ｉ４３０　ｍｌを、Ａｆｆｉｇｅｌ　１０に共イｊ結
合した　１゜Ｌｅ　Ｉ　ＦＡに対するモノクローナル抗
体を含む　１１、０　ｍｌのイムノアフイニテイ力ラム
に１０ｍ１Ｚ時未溝の流速で通した。カラムを２５ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−（。

１（ＣＩＩ　、　１０ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　、　ｐＨ８
，０で洗った。

０．２Ｍ酢酸でインターフェロン活性をカラムから　ｊ
溶出した。１ｍｌの両分を収集し検定した（第９図袂照
）Ｃ１両分２０（４゜０ｘｌＱユ＝ット／ｍ（りをＳ　
ｙ　ｎ　ｃ　ｈ　ｒ　ｏ　ｐ　ａ　ｋ　ＲＰ　＝　Ｐカ
ラムでＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃによ：・）更に精製した。０．
１％ＴＦＡ　、　ｐｌ（２，５、中でｒ（線勾配０−１
００％のアクリロニトリルでカラムをγ〕ＩＬ速１１ｎ
ｌ／分で溶出した（　ｇ＋目０図の下方部小参照）。１
ｍｌの両分を収４ｊ％し検定した。Ｅ、ｃｏｌｌＩＩで
産生された精製Ｌ　ｅ　Ｉ　Ｆ’　Ａの５μｇサンプル
１）コントロールとしてクロマトグラフにかけた（第１
０図の上方部分参照）。カラムから溶出し旨インターフ
ェロン活性のピークは画分４４の付斤に集中していた（
９．０×１０ユニット／ｍｌ）。

１１１ｉ分４１と４４とをプールし以下の如く配列決定
７た。

１１２列決定 酵母培地から単離されたＬｅＩＦ’ＡにＱｕｍｒｏｌＰ
ｒｏｇｒａｍを用いＢｅｃｋｍａｎ　８９０Ｂシーケン
ナ（２７）中で連続的Ｅｄｍａｎ減成（ｄｅｇｒａｄａ
−口ｏ１）処理を実施した。２　ｍｙのポリプレン（ポ
リＮ、Ｎ、Ｎ、Ｎ−テｉ・ラメチル−Ｎ−トリメチレン
ヘキ→）°メチレンジアンモニウムジアセテ−１・）を
タンパク担体としてシーケンザカップζヒ添力［ルた（
２８）。得られた２−アニリノ−５−チアゾリノンを２
５％トリフルオロ酢酸に添加し、７０°Ｃで１０分間加
熱して、３−フェニル−２−チオヒダントイン（ＰＴＨ
誘２序休）（２９）に転換した。

次に、ＰＴＨアミノ酸残基を５０％ｒ了ｔ）・ニトリル
″に溶解し、逆相高圧液体クロマトグラフィーで分析し
た。次に、標準Ｉ）　Ｔ　ｌｉ−アミノ１４’ｉ、の混
合物グの保持時間鵬比較によってＰ　Ｔ　１■−アミノ
酸の各々を同定した。

２、結果 １°料及び方法の項に記載し第１図に図示した１２塩基
対の互いに相補する２つの合成オリゴヌクレオヂト”（
４０ｍａｒ）からインベルターゼシグナルコｌ−”ンを
ｔｌ“り帛した。ＡＭＶ迎転写（１１“２（≦で２つの
相ｒ１目的オリゴヌ９　Ｌ／　ｔ　すｌ’Ｇ１［；Ｔ、
’（Ｊｔル（！：、ＩＣｏ　Ｒ１ｆ！ｉｊ：限後に平滑
３／　、４：？と旋オｒ　５／　端とをもつ二木知ｎＮ
Ａ（５４ｂｐ　）が生じた。このインベルクー−七１−
Ｐ２占。

ゼーシグナルコドンとｐＬｅｌＦＡからイ！ｆた成ｊ１
１１形メチオニンＬ　ｅ　Ｉ　Ｆ　Ａ　遺伝子（Ｅｃ　
ｏｌｊＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ断片内）とをプラスミドｐＢＲ
３２２（３４）の３ｃｏＪ目−巳し１■断片に結合する
ために、先ず、１）　Ｎ　ＡポリメラーゼＫｌ　ｅｎｏ
ｗ　１′ＩＪｉ片（角３１図）の３′−エキソヌクレア
ーゼを用いてメチオニン−Ｌｅ　Ｉ　ＦＡ　；ｌ’を公
子のＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　８１ｉ位の３′　ス］・ランド
からヌクレオチドＧをｌ・会去した。ｐＬｅｌＦＡ−イ
ンベルターゼシグナル イブリット°シラスミドはインベルターゼーシグナルコ
ト９ンから成熟メチオニン−Ｌ　ｅ　Ｉ　Ｆ　Ａ　Ｏ）
ｙｆｆ伝子伝子正しいＨ読枠を有していた。ｐＬｅＩＦ
Ａ−インばルターゼシグナルを含む３０個の形質転換体
を制限Ｍ析すると６つのクローンが〜８　０　０　ｂｐ
のＥｃ±■ローＰｓｔＩ断片を担持していた。成熟メチ
オニン−ＬｅＩＦＡ遺伝子のＥｃ　ｏＲＩ−Ｐｓ　ｔ　
Ｉ断片は〜ｓ　ｉ　ｏ　ｂｐ　（インばルターゼーシグ
ナルコト゛ンを含まない）である。これらの６つのクロ
ーンのジデオキシＤＮＡ配列決定によれば、４つのクロ
ーンがインばルターゼーシグナルコト９ンの領域に（１
つ以上の）ヌクレオチド欠失を示し、このため、インば
ルターゼーシグナルコドンと成熟メチオニン−Ｌ　ｅ　
Ｉ　Ｆ　Ａ　遺伝予きは相互にコート９枠からシフトし
ていた。

残りの２つのクローン（Ｆ２及びＦ３）は第２図に示す
如き正しいコート゛枠で存在した。クローンＦ２はイン
（ルクーゼーシグナルとメチオニン−ＬｅＩＦＡとを含
む融合をコードシていた。インばルターゼーシグナルコ
ト９ンとメチオニン−ＬｅＩＦＡ遺伝子との接合は予想
通りであったが、インばルターゼシグナルのアミノ酸残
基１５（アラニン）に対応するトリヌクレオヂ）”ＧＣ
Ｃは欠先していた。この欠先は、インばルターゼシグナ
ル領域をコート９するオリゴヌクレオヂト°の合成中に
エラーが生じたためであるとＩＩＨ　ｉｌｌｌされる。

クローンＥ３はインばルターゼシグナルと成熟ＬｅＩＦ
Ａとを含む融合をコート゛シた。このクローンの成熟Ｌ
ｅＩＦＡＪ’ｊ伝子の手前にＡ公子は存（１三しない。

（メチオニンをコート９する）ＡＴＧの欠先の理由は確
認されていないが、２５μＭｄＴＴＰの存在中でメチオ
ニン−ＬｅｌＦＡＪＪ’！伝子のＥｃｏＲＩ公子位の３
′　−ストラ、ント９でＤＮＡポリポリーゼ■のに１ｅ
ｎｏｗ１４Ｊｉ片による限定３′−エキソヌクレアーゼ
消化がＴで停止ぜずｆｌｉ（ｃ３つのヌクレオチド９ま
で進行するためであると推ｉ＋１１１される（２ｇ１図
参照）。

これらの２つのハイブリット９クローン（Ｆ２及びＦ３
）を酵母中で発現するために、クローンＦ２及びＦ３の
各々の非コード饋域の３′端のＰｓｔＩ部位を、第３図
に示す如く酵母２μ　ＤＮＡから誘導した２　４７　ｂ
’ｐのアダプター断片を用いて一ΔｃｏＲ１部位に転換
した。インベルクーゼシグナルコドンとＬ’ｅ　Ｉ　Ｆ
　Ａ　ｊｌ！１．公子とを含むこのＥｃｏＲＩ断片を酵
母発現シラスミド”ＹＥｐ　ＩＰＴ　（３５）に挿入し
た。得られたプラスミド９をＹＥｐｌＰ’Ｔ−’Ｌ（Ｉ
ＩＦＡ−インはルターゼシグナル（Ｆ２又はＦ３）、！
：命名した。従って、この発現プラスミドは、Ｅ、　０
０口中での選択と安定増（ｊｉｌとのためにアンピシリ
ン耐性遺伝子とＥ、ｃｏｌｊ復製オリジンとを有するｐ
ＢＲ３２２の一部分を含む。更に該プラスミド９は、ｔ
ｒｐ−酵母中での選択を可能にするＴＲＰＩ：ｉｌ’ｌ
伝子と公子中での自発的社製をＯＪ能にする２μシラス
ミド９複製オリジンとを含む。

このシラスミド°では、ハイブリット９潰伝子の転写が
酵母３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｐ　Ｇ　Ｋ）プ
ロモータのコントロール下にあった。

酵母発現ばクターＹＥｐｌＰＴ中のＬｅＩＦＡの天然シ
グナルコドンを含むプラスミドを前記同様に構築しく３
５）、プラスミドＹＥｐｌＰＴ−ＬｅＩＦＡ−インベル
クーゼシグナル（Ｆ２又はＦ３）のＩ、ｅＩＦＡ産生し
Ｒルの比較コントロールとして使用した。細１１’Ｍと
培地との双方からのインターフェロンの活性を測定し、
表１に示した。

表１．　酵母中のヒトＩＦＮ−α２＆）ｉ；ｆｆ生ｐｒ
ｅＬｅＩＦＡ　４．００　０．２５Ｆ２　５．８５　’
　ｉ、７５ Ｅ　３　１０．１０　１．（＋０ １１’）ＩＵ：中のＬｅＩＦＡの発現と分泌とは、ヒト
天然シグナル（異種シグナル−細胞系）よりも酵ｌυイ
ンばルクーゼシグナル（同種シグナル−Ｑｌｌ胞系）の
方が高い。培地中のインターフェロン活性は、天然Ｌｅ
ＩＦＡシグナルをコート９するシラスミドで形質転換さ
れた細胞に比較すると、Ｅ３含有プラスミド“で形質転
換された酵母菌ｐｅｐ４−３株細胞では４倍になり、Ｆ
２含有プラスミド９て形質転換された同じ菌株の細胞で
は７倍であった。

Ｃ以下余白） Ｆ２又はＥ３プラスミドを含有する＋’：’と計ヅ）Ａ
ら酵母によって産生されたＬｅＦＩＡの性ｉ′（を理乃
了するためにｎＷｅ　ｓ　ｔ　ｅ口１″　プロ゛ントプ
ロセス（３６）を使用した。細胞タンパクと培［也クン
、ｅりとを１２．５％　Ｓ　Ｄ　Ｓ　−；Ｉ￥リアクリ
ルアミドゲルで分ｉ’ｉ＋ｌｔ　Ｌ　、　引続いてニト
ロセルロースペーパーに移シた。ブドウ球菌凡堕枦す１
ｏｃｏｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　（Ｄ放射イｔヒタンパク
ＡでＬｅＩＦＡに対して強化した・フサ１１１冗体によ
ってｌ、ｅ　Ｉ　ＦＡを検出した。；ｉｒ　４　：ｔｒ
　＋ｃ示ず如く１．′ｌ′ｌ１１胞及び培地の双方から
のＬ　ｅ　Ｉ　Ｆ　Ａ（：Ｉ　Ｐ：　、　ｃｏｌｉから
産生された成″シメチオニンー１、ｅＩＦＡと同じ位１
１′イーに移行した。伺ツノ目的ｆＪ　’１ｒ５１．射
ｆ１）１バンドは検出されなかった。これらのイＩ凸さ
は、１、　ｅ　Ｉ　Ｆ　Ａが１°；；′、母によって発
現さｉｔ入つシ目士んり完全なプロセッシングが行なわ
れプこことを示す。

Ｅ３含有プラスミドから発現されたＬ　ｅ　ＩＦ　Ａに
ついて本当につ商切なプロセッシングがｆｉなわれブこ
か否かをイ１１乙己するため１こ、カル、］？　４−７
メ・ブールセルロース（ＣＭ−５２）クロマトグラフィ
ー（ネＩ５図参照）とモノクローナルｉｆｉ　ｆ本？フ
イニテイクロマトグラフイー（第６図参照）と高圧７′
夜休クロマトグラフィー（第７図参照）とをボ［合せて
、Ｅ３プラスミドを含む酵母からイ尋たＪ＠」也をス、
１・契した。

精５１）ｖＬｅＩＦＡをＳＤＳ中でゲル７１を気休ち・
ｂに力）けるとｉＴ　＜染まった１つの集合ノマンドカ
５生じた。１（イ製タンノ♀りに１５サイクルのＥｄ＋
ｎａ　ｎ　ｉｒｉ　Ｈ戊ｔ；１ｐ　ｉ：ｒ＋ｒを実施し
た。第８図に示す如く、Ｉｔ靜＋１：ＶＬｅｌＦＡのア
ミノ末端配列は既知のＬｅＩＦＡｌ’ｌ己夕１］？こ＜
−＋シ＜、このことは、（１ψ・ＩＪシグナルペプチダ
ーゼ力ｉ　＋ｇｔ合インベルターゼーシグナルＬｅｌＦ
Ａの一次（；５スＸ１ｊを認識するのみでなくヒトＬ　
ｅ　Ｉ　Ｆ’　Ａの天然ｌｊ見：’”（１〜］杉を生成
するために正しモ）（α位で１′、ｉｌ〜・込１−るこ
とを示唆する。

Ｆ２含有シラスミドで形質転換さ才したｌ’ｌ’Ｎ母力
）ら得プこ培地は、ＣＭ５２カラムクロマトグラフィー
ＬｃＩＦＡ（Ｆ２）のアミノ末Ｎｊ　ｉ’ｊｅ夕１ｊの
！！ｌ’ｌ’　）ｌ；’？　Ｉこより、Ｌ　ｅ　Ｉ　Ｆ
　Ａのメチオニン７；ｉ、’　Ｊ４：ｉの手［）ＩＩで
１４ｉｊ’ｉ’）−′ｈ’生じ、たことが判明した（第
８１２１）。メス方のノ杉゛ｔＩｔ＜・！く＄　体に於
いてシグナルを除去す２）たｙ）のプレーＴ、ｅＩＦＡ
のプロセッシングは完全であると、１５、ＡつＪｔ、る
。

１、材料及び方法 ｉ、、：ｑ　、、ｔ々Ｊゲノノ、ライブラリーの（Ｍｌ
よＳｍｉ　ｔ　ｈ及びＨａ　１ｖｏｒｓｏｎ　Ｏ＞方法
（３９）を）１１い′ｌｌ−ツカロミー１ｚス・セレ）
ぜシエ５ｎＣＣ１１ａｒＯ＋ＩＩ　ＣＦ、！１ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ　の！’ｌｉ’ｉ：３１Ｍ　Ｓ　１７９９
０　ｉｃｅ　（α」−■と１工脱１ｐ土主）から全りゝ
ツムＤ　Ｎ’Ａを−ｌトｉ’、１１シた。３７０μｇの
ＤＮＡを２ｍ１反１５１ｋｔ合！ｌＱ７＋　１”の２５
ユニツトのＳａｕ　３　Ａ　Ｉ　（Ｎｅｗ　ｚｎｇｌａ
ｎｄＢｉｏｌａｂ）　で部分消化した。１０．２０及び
３０分後に部分ザンプルを除去し、冷却して２０　Ｉｎ
ＭＥＤＴＡで失活させた。プールレフエノール抽出した
ＤＮＡをＩＭＮａ（１，２０ｍＭ　ＴｒｒＳ−Ｈ，Ｃ９
゜（ｐＨ８，０）及び１Ｑｎ１４ＥＤＴＡ中で１０−５
０襲のショ；ｉ゛１“：勾配で遠心して分画した。アガ
ロースゲル１；１、気休！ｌｌｈで決定さ扛たＳａｕ　
３　Ａ　Ｉ　１ｌＪ７片１５　Ｋｌ）を単ｊ’１ｉｌｌ
　Ｆ７　、プラスミドＹＲｐ７のアルカリ４１ホスファ
ターゼ−処理ＢａｍＪ（Ｉに挿入した。　次にイ（Ｉら
れた結合ＤＮＡを使用してＥ　、ｃｏ　Ｉ　ｉ　ｉ’ｌ
’４２９４（：（ミを形質転換した。形質転換体を個々
にｊ・名取し、Ｌ　Ｉ３培地中の１０チジメチルスルホ
キシドの存在中２０℃で９６ウエルの組髭（」１′！ｉ
、類マイクロクイクーＩＩＩＬ（Ｃｏ５ｔａｒ、Ｃａｍ
ｌ）ｒｉｄｇｅ、　ＲりＡ）に収容した１、プローブの
合成 インベルクーゼ；ｙｊ公子のシグナルペプチド′ＩＶＣ
玉域に対応する合成オリゴヌクレオチド（１９ｍｅｒ　
）プローブを、リンｆｉ、ｔ　）リエステルＹノモ（３
８）をＪｉｌ（ハ′ｃ　ｉ＋、ｖ　ｒ傅した。ヌクレオ
チド１１己夕１ｊは（５’−ＡＡＧ　ＣＴ　Ｔ　Ｔ　Ｃ
ＣＴ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　ＣＣＴ　’ｒ　Ｔ　Ｔ　−３’　）
でありＤｒ、Ｍａｒｉａｎ　Ｃａｒｌｓｏｏ、　１）ｃ
ｐａｒｔｎ＋ｃｎｔ　ｏｆｌ（ｔｌｌｌｌａｆｌ　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏ１ｕ＋ｎｌ＋ｉａ　Ｕｏｉｖｃｒｓ
ｉｔＹ、ＮｅｗＹｏｒｋから得られた。

ダ・旧イア（シラスミドの単１”：ｉ１１°６ＩＵニゲ
ツムライブラリの　見、（０，Ｆ　ｊ　Ｉｉ−短１巾ぺ
；籐イ本を９６ウエルのマ・イクーコク・ｆクー１１１
１の２０７１１７ｍｇのアンピシリンをｒ引むｆｉｂい
Ｌ　Ｂ　ｊ；（ＩＩ賀こ長し’（１１「・ｆ！　Ｊ’ｉ
’ｌ　！ｉ（ルた。１′斤しい、ｌ田川１ｊを、アンビ
ンリン（２０μｍ７７　Ｉｌ＋／’　）を含む８−アガ
ーＩプレート（１ｇ、、ｉ１％す３２ｇのトリプトン、
５ｇのＡ／′ａＣＮ、１５９の１）ｉｆｃｏ　−アガー
＃：ｏ、２ｇのＮ　ａＯＨ）　ｊこ：・・４ぜｉこプｌ
ｉ　ｒ’ｕ、￥白−−トロセルロースフイルター及びフ
ィルターから１］ニ成されたｎ　ｉ’ｌ　Ｉｉ：（ｋ次
に、）′ン♂ンリン（２０１（ｇ／７Ｉｌｅ）トクロラ
ムフコニニコール（１５０ｔｔｒｔ　／ｍｌ）との双方
を訝む別０）　Ｓ　−’７−ガーメプレーＩｎｃ移した
。ｌ　４１ｔ；’ｊ間”　ｉ１７　’ｉ’、’ｊ　ｔ、
Ｊｔ　、：１０ニーをハイブリグイゼーション処」ｙｌ
　シた。このＪＪ　、［！ｉｊでは、１．５Ｍ　Ｎａ（
＃ｌ　、：０．５ＭＮＲＯＵ１との中でコロニーを３分
間変性し、３−　ＯＭＮａＣＡ１０．５　Ｒ１Ｔｒｉｓ
−ＨＣＲ、ｐＨ１７，５の中で３分間中１１１し、最後
に、５ｘＳＳＣで３分間ｉ：□１ｇつだ。フィルクーを
風乾し、８０℃の真Ｋ、゛ご炉で２時間；）等した。

ヲ゛レハイブリダイゼーションを行なうために、プレハ
イブリタ゛イゼーンヨンパッファ　（０，Ｉ　ＭＴｒｉ
ｓ　−ｌ１ＣＡ　、ｐＨ７，５、６ｍＲ４Ｅｌ）ＴＡ　
。

０．１ｍＭ　ＡＴＰ、１ｍＭ　ｅロリン１゛ｒナトリウ
ム、　１　ｍ　Ｍリン酸ナトリウム、　０．９１１．４
　Ｎ　ａＣ，０゜１　ｘ　Ｄｃｎｌ＋；＋ｒｄｔ’　Ｓ
　７（、’ｆｆｆｉ、　０．！３’Ｍ６ＮＰ−４０　及
びｏ、　１ｍｙ／ｍｌの　ｐ、ｃｏｌｉ　ｔ　ＲＮＡ　
）　中で４２℃でｊ１°Ｌ打し乍らフィルターを１晩イ
ンキユベートし島プレハイブリダイゼーション後、汚し
いプレハイゾリグイゼーションパツファ中で上：尼の７
２Ｐ、　−ラベルしたオリゴヌクレオチド（１９ｍａｒ
　）の合ｊ’　Ｉｊ、２プローブと共にフィルターを４
２°Ｃて１１Ｌ１己イントユベートシた。次にフィルタ
ーを３７℃の６×ｒ；　ｓ　ｃ中で２０分ｉＨＩを要し
て３回Ｈ）：１１　ツた。乾４′・（’、ｔ）・イルタ
ーを、−８＋）℃のＩ）ｕｐｏｎｔ　Ｊ’：ｌ（ｅ：’
ニスクリーン４：共に１（ｏｄａｌｃ　Ｘ　ｎ　−２ｘ
、？Ｑフィルムに１７Ｘ光した。

１）　Ｎ　Ａ配列決定 中−鎖ファージＢ（１３ｍｐ　８．！：Ｍ１３ｍｐ　！
１１と合ＩＩυ゛）丁−ジ！１〒、鴇的ゾライマーＪ：
を使用しノブオキシ悄、１３結プ１１セス（ｄｉｄｅｏ
ｘｙ−ｃｔｌａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｐｒｏｃ
ｅｄｕｒｅ　）　（３３、４０、４］、　）でインベル
ターゼ；、ｔ：Ｉ：伝子とそのフランキング領賊とのＤ
　Ｎ　Ａ配列を決定した。５チポリアクリルアミド／８
Ｍ１４ｊ　；（“’ｔ’）゛ハフ”ゲルの７［は・（ｉ
永ｒ“・〕１にか（げて−ナンプルを分１’ｌＡ　した
（　４２　）ＯゲルをＩＡ／ｈａｔ＋ｎａｎ　３ＭＭペ
ーパーに乾ガｊ弘し、ｊｌ、ｉ々の時間の間に０ｄａｋ
　Ｘ１ｊＶｉ！フイ）Ｌｔ　ム＋ｃ　ｉ・ｆ（光シタ０
　杏と兜す凹しε賢−どＭ貿ザとミイノベルターゼ遺伝
子とそのフランキング１ｌｌ（、：’・・（つ（４，Ｏ
ｋ　ｂ　）との１ｔ列を第１３図に示ず。話１　ｎＲ（
ｌｉｊ・−シは５３２個のアミノ酸残ジルをもつ分子ｆ
ｊｔ’　６０１６４９のブレインベルターゼをクー１ご
する。グリコシレーソヨンの可能な部位は下ｉｊ′ｌ！
で示されている。

２、結果 インベルターゼ；Ｈ＋（公子を含むρＪ仙シラスミ１：
′の同定 Ｆ）、′母ゲノムライブラリから得た約１０，０００個
（り　１ｔｌｌｌ　ｉ％ｉ　コロニｙ、、、　、−ｊ２
′、ラベルしたオリゴヌクレオチド（１９ｍｅｒ）と共
に　ｉｎ　５ｉｔｔ＋　ハイブリダイゼーションさぜる
ためにスクリーニングした。５４個のコロニーをプロー
ブにハイブリダイズした。これらの５４個のコロニーが
らイ、ＪたプラスミドＤＮＡを　ｕｉ　ｒｎｂｏｉｍ及
びＤｏｌｙノ方のハイブリダイゼーションをテストした
。５４１１ＬＩのプラスミドＤＮＡのうちの５つが強力
にハイブリダイズした（第１１図）。これらを夫々Ｆ１
１−５と命名した。ＤＮＡポリポリーゼＩ（ｋ　、Ｉ　
Ｑｑ　ＯＷ　Ｉｌ：ｆ素）のプライマーとして同じオリ
ゴヌクレオチドの１９　＋ｎｅｔ　を使用すると、これ
らの５つのプラスミドは、スーパーフィルドＤＮＡ配列
決定法（４０）によって更に７１ｍ　Ｗ、ｔされた。全
゛Ｃのプラスミドは、配列決定された少くとも１８０の
」塩基対に間して等しいＤＮＡ配列をイ１していた。

このＩ）　Ｎ　Ａ配列から推定されたアミノ酸配列は、
残基１２個乃至４０個の既知のインベルターゼｉり１り
分配列と十分に一致する（４３）。これらのｆｉ４を果
より、５つの組換プラスミ１：′が、インベルターゼ遺
伝子の一部又は全部を含むことが明らかである。

限マツプ ＤＮＡインサートの１１１１限部位をマツプするため（
乙　クローンＦＩＩ−５から調峙されたプラスミドＤＮ
’Ａを種々の制限酵素で消化して；」子桁した。

５つのクローンのうぢの１つ（ＦＩ４）が全インベルク
ーゼバ”ｉ分子を含んでいた。その制御′叩マツプなｌ
′１１１２図に示ｒ０このマツプは、Ｃａｒｌｓｏｎ　
及び’Ｈｏｔｓｔｅｉｎ　（４４）が報告したものと同
一である。

クローンＦＩ４（第１２図）からｆｉｔ　Ｈ：ｆされた
インベルターゼ遺伝子を含む４．０ＩＣ１１のＥＣ０Ｒ
Ｉ断片を高いコピー数のＩｌ’ｌ母発現プラスミドＹＥ
Ｄ９Ｔに挿入した。このプラスミドは、ＹＥｐｌＰＴ（
３５）中のＰＧＫプロモータのＥＣ０ＲＩ−Ｈｊｎｄ　
Ｉ　Ｉ　工［（１７片を　ｐＢＲ３２２（３４）の上輩
旧−几罰ｄｒＩＩｌｉ片で置１（へして得られたもので
ある。得られた組換プラスミドのＥｃｏＩζｌ断片の２
つの配向を利用してｆｑｐ母蘭ｐｅ　ｐ４株を形質転旧
した。イ１１１胞を遠沈させ、高グルコース（５乃）又
は１１（グルコース（０，１％）含有ｊ、＋４地に１時
間を９にして４’−ｊ！ｉｙ魯ソ；１いせた。前記同ｈ
ｐ　（４５）に、インベルターゼ活性を測定した。異な
る配向の２つのプラスミド（ＹＥ、ｐ９Ｔ’　−Ｙ　’
Ｉ　ＲとＹＥｐ９Ｔ　−ＹＩＬ）を夫々含む形質転換体
でのインベルターゼの発現レベルは／Ｅいに等しく、１
時間の抑１ｉｉ１１１’ｌ’４除　（０，１係グを汀む
形″ｔ′正転換体でのインベルターゼの産生は１１１１
制（５チグルコース）状ｆｉ’ｊｊ下で完全（・こ１１
回１１］さオしないが、野生型株ｐｅｐ　４　では抑ｉ
１ｉ’ｌされるこ、とである。

の）”１己列 クローンＦＩ／４の源１０ＩからＡＣＣＩ　までの約４
１（ｂのＤＮＡ断片を配列決定しＰｊ；１３図に示す。

このＤ　Ｎ　Ａ　７４２列から推定されたインベルター
ゼのアミン末端配列は　Ｐｒ、ｒｌｍａｎ　等　（４３
）によって（浸告された部分的アミノ末端配列と完全に
一致した。更に、カルボキシ末端の最後の３゛つのアミ
ノ酸は、カルボキシペプチダーゼ分析（４６）からｊ％
　”７−ＸされたＰｅｒｌｍａｎ　等ｉこよるＢＣ，夕
ｌＪ　ｉこ等しい。

；“Ｉ￥１３図に示す如く、全インベルクーゼ遺公子は
５３２個のアミノ酸残基をコードしている。ゾレ／？ｄ
　セ坤刊＝（ｐ　ｒ　ｅ　ｓ　ｅ　ｃ　ｒ　ｃ　ｔ　ｏ
　ｒ　ｙ　）インベルターゼの分子（，４，は６０．６
４９である。このＩＢ￥素は１４個のグリコシレージョ
ン部１ヶを含むことができるが、９個のグリコシレージ
ョン部位だけが（Ｑ３．（ｌｆされ°Ｃいる（４６．４
７） インベルターゼプロモータとインベルターゼ遺伝子の１
油部（ｉ′Ａ＠　１２図参照）とを含むＥＣ０ＲＩから
１３ａｍＨＩま’ｔ？（１−）　１７　ｋｌ）（＋）１
’、ｌｉ片をりｏ−７ＦＩ４ズハら−（ｌｊ　ｔ’：ｉ
１′Ｌ、７＋Ｅ　１５　ｔ”１　ニ示’Ｊ−１ｉｉｌ　
＜シラ７　ミ）’　ＩＪＵｃ１λ（２，６ｋｂ）１こサ
ブク「１−ニングした　（Ｄｒｓ。

Ｐ、ＳｅｅｂｕｒｇｇＬ、びＪ　、　７ｙ１ｃｓｓｉｎ
ｇ、Ｉ’ｃｒｓｏｎａｌＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ　
）ｏ　１３ｉｒｎｌＪｏｉ＋ｎ　及び１１ｏ１ｙの方法
（２０）でシラスミドＤＮＡを形’ｆ’ｊ小・：：ｊｔ
’３体からｊ＋ｌ’、Ｉ４．・間しブこ。このプラスミ
ドＩ）　Ｎ　ＡをＮｃｏＪ及びＰｓｔ４で消化し、火１
・１［片（３，Ｌ　＋（＋）　）をベクターとして”ｌ
’　＋・（トシた。回しシラスミＦＤＮＡを股」Ｉで切
ｉｔ’ｌＩＬ焦１ｎｄＩＩＴ　でＱｉ、ｌ（分［・υ、
ｊ［シ、インベルクーゼシダナルフドンの１’ｉｉＪ　
ｉ’（ｌｉ　’ｓ：含１’ｃ４００ｈｐの断片を５９６
ｄ？リアクリルアミドダルから１１）た。前記クローン
Ｅ３のプラスミドＤＮＡからＬ　ｅ　Ｉ　Ｆ　Ａ　ｌ１
ｊｌ伝子な単：ｉ］！、　Ｌ、こｉ’Ｌを７１　ｉ　ｎ
　ｄ　Ｉ　Ｉ　ＩとＬリエとで９Ｊ　［ガした。この〜
８６０　ｂｐの１４　ｉ　ｎ　＜ｉＩ　Ｉ　Ｉ−Ｐ　ｓ
　ｔ　Ｉ　ＩＩ：’Ｉｉ片（Ｊｌ　インベルクーゼング
ナルコドンの後部とＬ　ｅ　Ｉ　Ｆ　Ａ　、ｉｉ′ｊ伝
子と公子む。これらＹＩｐｓｐ−ＬｅＩＦＡがイ（Ｊら
れた。このプラスミドはインベルターゼプロモータ（Ｙ
Ｉｐ、）とシグナルコドン（Ｓｐ）とＬｅＩＦＡ　の遺
伝子とを含む。

この１．Ｂｋｂの□旦ＲタＲＩ−一旦上ｔＩｉ９ｒ片を
切除し、ｐｎｒζ３２２の上ヱ０ＲＩ−エ巧ｊクーＩ　
大ＩＣＪ？片と結合してｐＢＲ３２２中でＩＩエクロー
ニングした（１丁５１６図）。

Ｙ　Ｉ　ｐｓｐ−Ｌｅ　Ｉ　ＦＡ　を含むｐＢＲ３２２
からのシラスミドＤＮＡをＰｓｔｌ　で直ｉ１’ｌ！化
した（第１６図）。この」」１ｌ部位をｐｃｏｌｔＩ　
部位に変えるために、醇刊プラスミドＹＥ　ｐ　１３　
（３７）から単離した９　Ｑ　Ｑ　ｂｐｐｓｔＩｌ・ノ
ｒ片を挿入した。

この９００　ｂｐえり１１所片は、ｐ　Ｂ　Ｉ尤３２２
から含んでいた。（ｔ’ｌ−って、このｐｓ　ｔ　Ｉ　
Ｉｆｉｌｒ片を挿入すると、プラスミドを担う＆（１１
菌のアンピシリン耐性が回復した。アンピシリンｉｍＪ
性形質転換体から得たシラスミドＤＮＡをか創ＲＩでり
断じ、２．１１（ｂの断片を単１；１１１シ、１ｊ５．
母マルヂコビ゛−プラスミ＋：　ＹＥ￥）９Ｔの１４ｉ
−一旦旦旦ＲＩ　部位にト；１人した＜　２１１１６図
）。プラスミドｌ：ｐ９Ｔ　は、耐２世中での、選択マ
ーカーたるＴｒｐｌマーカーと１９ｒＩｌｆＪ中ごの２
μ複−製オリジンとを含む。得られたプラスミドＹＥｐ
９Ｔ−ＹＩ　１３８１）−ＬｅＩＦＡを［吏用して：Ｉ
Ｅ：　ｉ’ｊｆ　ｐ　ｅ　ｐ　４株を形質転１）１シた
。

培地にグルコースを）、刈つくりと送り込む発ｔ’＋１
？　１’７’１ハ で１□＋ｉ！母形質転換体を増／Ａｌ′ｌシた。＋＋：
ｌｌｌ胞負Ｌ；、　２し４　ｊ；ｌ／９゜のとき培地中
のインターフェロン活性は１５０ミ（ｔｏ’） し）−４ リオンユニット／２に到：１１ｂシたが、　Ｋ１１Ｉ胞
内・インターフェロンは約３５０ミリオンユニツト／９
てあった（第１７図参照）。この段階でインターフエ１
」ンの産生は遅滞した。これは、培地［１月こ注入した
グルコースの針が多：１１′６ｔぎてインベルターゼプ
ロモータの抑制が生じたためて”あると思われる。炭＋
＋Ｚソースとしてグルコースに代えてフラクトースを使
用すると、インターフェロンの産生が妨害されずグルコ
ースを含む培地の約１０倍に達した。

Ｐ　Ｇ　Ｋ　フロモータト合成インベルターゼシグナル
とを含むプラスミドで形質転換されたに（１１胞の場合
同様、ＹＥｐ９Ｔ−ＹＩｐｇｐ−ＬｅＩＦＡで形ガ転換
された細胞は、ＬｅＩＦＡが天然シグナルに融合して発
現され完全成熟ＬｅＩＦＡを形成するプロセスを経由す
る場合よシも高いＬｅｌＦＡの分泌を示した。

（以１余白） 倭乃文蔀 １、　Ｎｏｖｉｃｋ、　Ｐ、、　ＦｉｅＷ、’　Ｃ，、
ａｎｄ　５ｃｈｅ］／ＪＴＩａｎ、　Ｃｅ１１社、　２
０５−２１６４１９８０）、’３、Ｗａｉｔｅｒ、　Ｐ
、　ａｎｄ　Ｂｌｏｂｅｌ、　Ｇ、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　
Ｄｉｏｌ、　９１゜５４５−５６１　（１９８１）。

４、−１１ｅｙｅｒ、Ｄ、工、ｅｔａ１．ｔＴ、Ｃｅ１
ｌＢｉｏ１．９２゜５７９−５８３　（１９８ｆＴ、−
一 ５、Ｄｕｎｔｚ、些ａ１．．５ｃｉｅｎｃｅ　ＩＧ＋］
、　１４７２　（１９７０）。

−，１，Ｇｏｅｄｄｅｌ、　匹ａ１．．　ＮａＬｕｒｅ
　２８７．４１１　（１９８０）。

０、Ｇｏｅｄｄｅｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ
　２９０．２０　＋１９８１）。

１０、　Ｇｏｃｄｄｅｌ、ｅｔ：　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｏ＊ｃａｒｃｌ＋　８゜４０５
７　（１９８訂、−一 １１、　νＪｅｒｔｚｅｌ、Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｃｉ
ｅｎＩ：ｉｓｔ　立見、６６４　（１９８０）。

１２、ＷｅｔＺｅｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　＄　１９．６
０９６　（１９８０１゜１３、　Ｄａｖ土５．　ｅｔ　
ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔａｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、（
ｔＪ！；八）７８、５３７６エ四８１） １４、　１１ｉｔｚｅｍａｎ、匹虹９．匣皿二と巳、　
７１．７　（１９Ｂ１１゜Ｉｓ、Ｋｌａｉｄ、　ｅｔａ
ｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２１４．１１２５　（１９８
１１゜１６、　Ｌａｗｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　ＡｃＷｓ　Ｒｅｓ、９．　６１０３（１９８１１ニ
ー　− ら１−ｂＺ／　ｌ上ソ／幻。

１９、Ｍａｄｅｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　ｌ−１ｏ
１．　Ｂｉｏｌ、　５３．１５９−１６２（１９７０）
　、−ｍ− ２１、［ｌ１ｎｎｅｎ、　Ａ、、　Ｈｉｃｋｓ、　Ｊ、
Ｂ、、　ａｎｄ　Ｆｉｎｋ、　Ｆ、Ｒ，。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、７．　１５１３
−１５２３　＋１９７９）。

２３、Ｊｏｎｅｓ、　Ｅ、、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　８５
．２３　（１９７６）。

２４、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　％　１４
．３７８７−３７９４（１９７５）　−− ２７、Ｐ、　Ｅｄｍａｒ＋、、Ｇ、　Ｂｅｑｑ、　”Ａ
　Ｉ’ｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ”Ｅｕｒ、　
Ｊ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　ｌ、　８Ｏ−Ｉ９１　（１９
６７）。

２９、ｌＶｉｔｔｍａｎｎ−Ｌｉｅｂｏｌｄ、　Ｄ、、
　Ｇｒａｆｆｕｎｄｅｒ、　Ｈ，、ａｎｃｌＫｏｈｌｓ
、　Ｈ，、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７５．６２
１−６３３　（１９７６）。

３０、　５ｈａｒｐ、　ｅｔ　ａｌ、、　７１２．３０
５５−３０６３（１９７３）。

３１、Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８
０−６８５　（１９７０）。

３２、Ｓｍ１ｔｈ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｒすｐ　６５
．４９９−’５６０（１９８０１゜ ３３、　Ｉ−！ｅｓｓｉｎｇ、ｅＬ　ａｌ、Ｎｔｔｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、９゜３０９−３２１　０
丁８　Ｉ’７’、　−３４、Ｂｏｌｉｖａｒ、ａｔ　ａ
ｌ、、　Ｇａｎｅ　２．　９５−１１３　＋１９７７）
。

３７、Ｂｒｏａｃｈ、ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　旦、１
２１　（１９７９）。

３９、　Ｓｍ１ｔｌｌ、ｅＬ　ａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｉシ１１ｚ　ｎｌ０１０　Ｌ２ｔ５３Ｂ−５４
１ゴ１苅７）。

４０、Ｓｍ１ｔｈ、　Ｍｅｔｂｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　
ｍｏｌｏ　６５．４９９−５６０（１９［］０）。

４１、　Ｓａｎｇｅｒ、ｅＬ　ａｌ、、Ｉ’ｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、八Ｃａ（１，５ｃｉ、ＵＳＡ１２、　５３Ｂ−
５ン「１ゴ１９６）゛　、　−４２、Ｓａｎｇｅｒ、ｅ
Ｌ　ａｌ、、ＦＥＢＳ　Ｔ、ｅ計上ｅｒｓ　８７．　１
０７−１１０（１９８０）。

４５、　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、ｅＬ　ａｌ、、Ｍｅｔｂ
ｏｃｌｓ　ｉｎ　ｌｎｚ　１１１０１０（１４２、５０
４−５１１７ｉ打５）。

４７、Ｌｅｈｌｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏ：
Ｌ、　Ｃｂｅｍ、　２５４゜１２２０９−１２２１８　
ｕ９７Ｕ７．　−一

【図面の簡単な説明】

第１図は、インベルターゼシグナルと成Ｍ！メチオニン
−ＬｅＩＦＡとをコードするプラスミドの信条手順の説
り４図。 ４１’−２図は、インベルターゼシグナルとインベルタ
ーゼの一部とのヌクレオチド及びアミノ酸の配列を示し
、同時に　ＬｅＩＦＡＫ接合したインベルターゼシグナ
ルの予想され７ｃ配列と（［・を県された配列とに対す
る比’［＆を示す説１．ｌＩＪ　１図。 （以１・余白） ’：！Ｔ　３図はインベルターゼシグナルにｌｊ４合し
たＬｅＩＦＡ　を発現するためにＣ１ｒ母に挿入される
プラスしドの本″り染手順の説明図、 第４図は形質転４哀されたＬＩＩＰ　ｆＪによって産生
さ４ｔだｉｔ（［１胞ＬｅＩＦＡ　と電池ＬｅＩＦＡ　
とのＷｅＳｔｅｒｎ　プロットを示す図、 第５図は、プラスミドｙＥｐｌＰ１’−インベルターゼ
シグナル−ＬｅＩＦＡ（Ｅ３）を含む酵母１）ｅｌ）　
４”−３ｉ’！ｅから：１また培地ＬｅＩＦＡ　のカル
ボキシメチルセルロース（ＣＭ５２　）カラムクロマト
グラフィーを示しており、文字Ａは２５ｒｎ　Ｍ酢酸ア
ンモニウム、ｐＨ５，０によるカラムの洗浄開始を示し
、文字Ｂは０．５Ｍ　ＮａＣＡによる溶出開始を示す、 ；、１’ｚ　６図は、第５図のＣＭ　５２カラムからイ
））た培地ｌｅ　Ｉ　ＦＡ　のイムノアフイニテイカラ
ムクロマトグラフイーの図、 第７図は、第６図のイムノアフイニテイカラムの両分５
８から得た培地ＬｅＩＦＡ　の高圧液体クロマトグラフ
ィ１−の図であり、コントロールとして、Ｅ、ｃｏｌｉ
　から１１１　梨されたメチオニン＝ＬｅＩＦＡ　（５
μｇ）を１）ｉｊ　シた結果を図の上部に示している、 ｒＦ８図は、クローンＦ２及びＥ３から得た断片を含む
シラスミドから産生されたＬｅ　Ｉ　ＦＡのアミノ末端
配列を示すＩｇｌ　。 第９図は、プラスミドＹＥｐｌＰＴ−インベルクーゼシ
グナルーＬ（！ＩＦＡ　（Ｆ’２）を含む１ｆ１【イＱ
ｐｅｐ　４−３ＬＫから了１７’ｊ培ＪルＬｅＩＦＡ　
のイムノアフイニテイ力ラムクロマトグラフイーの図、 １．５１０図は、第９図のイムノアフイニテイ力ラムの
画分２０からイ！）た培地ＬｅＩＦＡ　の高圧液体クロ
マトグラフィーの図であり、コントロールとして、　Ｅ
、ｃｏｌｉ　から４ｉＶ　、ｊｌｉ％されたメチオニｙ
−ＬｅｒＦｈ　（５μ、！ｉ’）を１１１コしブ：　Ｇ
’ｉ果を図の上部に示す、 ｉ；ｊ’４１１図は、プローゾ＋−＊；ｌニトロセルロ
ースフィルターでのプラスミドＤ　Ｎ　Ａのハイブリダ
イゼーションによるインベルターゼｊｙｔ公子含有コ、
ロニーのスクリーニングの図、 Ｍｌ　２図は□Ｘ丸旦工　と旦工斐ｒｔ　ｒ　との間に
挿入されたｐＦＩ４（〜５．５ｋｂ）の制限マップイン
ベルクーゼｊ１１シ伝）とそのフランキング領１−’ｅ
（４，Ｏｋ＋）　）士のＤＮＡ配列の１〆こｊ１ン！Ｎ
１４図はプラスミドＩ）ＹＥｐ９Ｔ−Ｙ　Ｉ　Ｒ（又は
Ｌ）の図、 ｊ’ｉ’ｒ　１５１゛に１は、ヒトインターフェロン遺
伝子（ＬｅｌＦＡ）　にインベルターゼゾロモータ及び
シグナルコドンを結合する（ＹＩｐｓｐ　−ＬｅＩＦＡ
　の４；ｉ　省Ｓ手順の）説明図、２）１１６図は、Ｙ
Ｉｐｓｐ−ＬｅＩＦＡをＥＣ（ＩＲＩｌｉＪｒ片に変角
し酵母プラスミドＹＥＴ）９Ｔに］１１１人する（ｙｐ
；ｐ９Ｔ−ｙｉｐＳｐ−ＬｅＩＦＡの１ブｌシ内手順の
）１良問図、 ’、’＠　１７図はｉヒ母インベルクーゼプロモーク及
びｂｔ’ｆＵシグナルコード配列を部用したｒ・、−寸
中でのＬｅＩＦＡ　の発現及び分泌を示すダラフである
。 代理人プ「埋土今　４寸　元 Ｆ”ｉｇ、４、 Ｆｉｇ、５ 画か會号 Ｆｉｇ、６ □ □ 」 画か白子 Ｆｉｇ、７゜ −２３−２２−２１−２０−１９−１８−１７−１６−
１５−１４−１３−１１し１）へルターヒ’　Ｍａｔ　
Ｌｅｕ　１．ｅｕ　Ｃ１ｕ　Ａｌａ　ＰｈｅＬｅｕ　Ｐ
’−ＬｅｔヒＡ １２　−１１　−１０　−９ ｂｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　、Ａｌａ Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖ
ａｌ　にｌｙ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　にＩ
ｎＦｉｇ、９ 画分負号 白か合号 ＥｃｏＲｌ （ＥＣＯＲ１） 第１頁の続き （４）Ｉｎｔ、Ｃ１，′Ｉ　識別記号　庁内整理番号チ
ラシ　シスコ、テレグラ カリフォルニア・９４　］　３３Ｘサン・フランツ・ブ
レイス０５６ 一丁・わ°ｄン山−住−ｒ−１，：　（）°ノへ）ＩＩ
！ｉ　（ＩＩ　！ｌ）！〕（：Ｉ’　９月／２１１’ｌ
＋　＋；’Ｉ’　Ｉ　ｈ−トミ官　志　ｔｕｔ　学　１
！１２２、弁明の名称　異（・トタンバク分泌用のｎｒ
　ＩＩ　ｌｉ’ｄ　（・［・ジグノルの使用 Ｔ、ン１１ｉ　ｉｆをりる名 ′Ｉｉ　ｆｌとの関係　１旨’ｌｌ＋Ｉ（イ１人名　（
ブ１、　ジ−１ネンｊツク・イン＋−ｒ１：　ｌノイ１
ツト／１５代　即　人　巾県都新循１ヌ新Ｙｉ１１１１
−１　賛【１４号　Ｉｌｌ　ＩＩ＋ヒルε１　、　ン山
１１　６月勺下） （′１）明ｆ’ｌｌｌ　ｒ’＋中、第（ｉ（ｉｊ’ｉ第
（ｉｆ−ｉ　１１に［・・・・・・を示り図、」ど（１
す〈；屋−１１・・・・・を小・ＩＶパ゛己、１と１市
１１りる。 べ゛ゲター ９００ｂｐ　Ｐｓｔ　ｌ　ｑｑ厳趣 ）’ｓｔｌ　ＥｃｏＲＩ　Ｐｓｔｌ −２３−２２−２１，−２０ −１９−１８−１７−１６−１５−１４−１３−１２−
１１−１０−９−８−７１、Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｔ、ｅｕ
　Ｇｌｕ、Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｉ、ｅｕ
　Ｔ、ｅｕ　Δ１．ａ　ＧＬｙ　Ｐｈｅ２、Ｍｅ虹Ｌｅ
ｕ　Ｔ、ｅｕ　Ｇ１．ｕ　Ａ１．ａ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　
Ｐｈｅ　Ｔ、ｅｕ　Ｌｅｕ　ＡＵ−ａ　Ｇｕｙ　Ｐｈｅ
３、　）ｆｃｔ：　Ｌｃｕ　Ｌｃｕ　Ｇｌｕ　Ａｈａ　
Ｔ’ｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔ’ｈｅ　Ｔ、ｅｏ　Ｔ、ｅｕ　Ａ
ｈａ　Ｇｌｙｌ、ブレインベ）しダー亡゛ ＬｅＩＦＡ １００χ ↓ Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｃ
ｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　ＧｉｎＦｊす、１３（
巧め４） ２０ ＴＣＴ　ＧＣＡ　ＴＣＡ　ＡＴＧ　ＡＣＡ　ＡＡＣＧＡ
Ａ０ ＴＡＣＧＡＴ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＧＣＣＡＡＡ
０ ｔｈｒ　ｓｅｒ　ａｓｐ　ａｓｐ　ｌｅｏ　ｔｈｒ　ａ
ｓｎＡＣＴ　ＴＣＣＧＡＴ　ＧＡＴ　ＴＴＧ　ＡＣＴ　
ＡＡＴ０ １ｅｕａｌａ　ｇｌｙ　ｐｈｅ　ａｌａ　ａｌａ　ｌｙ
ｓ　１ｌｅＴＴＣ；　ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＴＴＴ　ＧＣＡ
　ＧＣＣＡＡＡ　ＡＴＡ０ ｔｈｒ　ｓｅｒ　ａｓｐ　ａｒｇ　ｐｒｏ　ｌｅｕ　ｖ
ａｌ　ｈｉｓＡＣＴ　ＡＧＣＧＡＴ　ＡＧＡ　ＣＣＴ　
ＴＴＧ　ＧＴＣＣＡＣ０ ０ ｔｒｐ　ｈｉｓ　ｌｅｕ　ｔｙｒ　ｐｈｅ　ｇｉｎ　ｔ
ｙｒ　ａｓｎＴＧＣ；　ＣＡＴ　ＣＴＧ　ＴＡＣＴＴＴ
　ＣＡＡ　ＴＡＣＡＡＣ０ ０ ｔｒｐ　ｇｌｕ　ａｓｐ　ｇｉｎ　ｐｒｏ　ｉｌｅ　ａ
ｌａ　１ｌｅＴＧＧ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＣＣＣ
ＡＴＴ　ＧＣＴ　ＡＴＣＦｉｇ、７３（む５）、。 １０ ＧＴＴ　ＧＡＴ　ＴＡＣＡＡＣＡＡＣＡＣＧ　ＡＧＴ４
０ １（ Ｃ（ ７０ ｇｌｎ　ｐｈｅ　ａｒｇ　ａｓｐ　ｐｒｏ　ｌｙｓ　ｖ
ａｌ　ｐｒｏ０ ２０ ５０ ０ １７０　ｖａｌ　ｌｅｕ　’ａｌａ　ａｌａ　ａｓｎ　
ｓｅｒ　ｔｈｒ７Ｓ’ｒ　ＧＴＴ　ＴＴＡ　ＧＣＴ　Ｇ
ＣＣＡＡＣＴＣＣＡＣＴ８０ ｎ＝　ｔｒｐ　ｔｙｒ　ｇｌｕ　ｐｒｏ　ｓｅｒ　ｇｌ
ｎ　ｌｙｓ００ ２２０ ３０ １１ｅ　ｇｌｕ　ｖａｔ　ｐｒｏ　ｔｈｒ　ｇｌｕ　ｇ
ｌ−ｎ　ａｓｐ　”ＡＴＴ　ＧＡＡ　ＧＴＣＣＣＡ　Ａ
ＣＴ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　ＧＡＴ　１５０ ６０ ａｓｎ　ｇｌｎ　ｊｙｒ　ｐｈｅ　ｖａｌ　ｇｌ、ｙ　
ｓｅｒ　ｐｈｅ　ｔＡＡＣＣＡＡ　ＴＡＴ　ＴＴＴ　Ｇ
ＴＴ　ＧＧΔＴＣＣＴＴＣ１ｇ１ｎ　ａｓｐ　ｔｙｒ　
ｌｙｓ　ｉｌｅ　ｇｌｕ　ｉｌｅ１０ ｇｌｎ　ｔｙｒ　ｇｌｕ　ｃｙｓ　ｐｒｏ　ｇｌｙ　１
ｅｕＣＡＡ　ＴＡＣＧＡＡ　ＴＧＴ　ＣＣＡ　ＧＧＴ　
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ａｌＣＣＴ　ＴＣＣＡＡＡ　ＴＣＴ　ＴＡＴ　ＴＧＧ　
ＧＴＣ７０ １ｓｎ　ｇｌｙ　ｔｈｒ　ｈｉｓ　ｐｈｅ　ｇｌｕ　ａ
ｌａ錆Ｔ　ＧＧＴ　ＡＣＴ　ＣＡＴ　ＴＴＴ　ＧＡＡ　
ＧＣＧＦｉｇ、１３（々）７）２８゜ Ｓ ＧＡ’ ９０ ａｌａ　１．ｅｕ　ｇｌｎ　ｔｈｒ　ｐｈｅ　ｐｈｅ　
ａｓｎ　ｊｈｒ　ａｓｒＧＣＣＴＴＧ　ＣＡＡ　ＡＣＴ
　ＴＴＣＴＴＣＡＡＣＡＣｒ　ＧＡ（１０ Ｌｒ（ Ｔ（〕１ ２０ ｅ１ ＡＴ＋ ４０ Ｓ１ 、〜■ ５０ ａｓｎ　ｌｅｕ　ｌｙｓ　ａｈａ　ｇｌｕ　ｐｒｏ　ｉ
ｌｅ　１−ｅｕ　ａｓｒｐ　ｐｈｅ　ｇｌｙ　ｌｙｓ　
ａｓｐ　ｔｙｒ　ｔｙｒＩ’　ＴＴＴ　ＧＧＴ　ＡＡＧ
　ＧＡＣＴＡＣＴＡＴ００ ）　ｐｒｏ　ｔｈｒ　ｔｙｒ　ｇｌｙ　ｓｅｒ　ａｌａ
：　ＣＣＡ　ＡＣＣＴＡＣＧＧＴ　ＴＣＡ　ＧＣＡｐ　
ｇｌｕ　ｔ、ｙｒ　ｓｅｒ　ａｌａ　ｐｈｅ　ｖａｌ：
”；　ＧＡＧ　ＴＡ−ＣＡＧＴ　ＧＣＣＴＴＴ　ＧＴＣ
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；　ＴＣＴ　ＴＴＧ　ＧＴＣＣＧＣＡＡＧ　ＴＴＴ］ｐ
ｒｏ　ｇｌｕ　ｔｈｒ　ｇｌｕ　ｌｅｕ　１ｌｅｒ　Ｃ
ＣＡ　ＧＡＧ　ＡＣＴ　ＧＡＡ　ＴＴＧ　ＡＴＣ６０ １ｉｌｅ　ｓｅｒ　ａｓｎ　ａｌａ　ｇｌｙ　ｐｒ。 Ｆｉｇ、１３（吟の８） ３８０ しｙｒ　ａｓｎ　ｖａｌ　ａｓｐ　ｌｅｕ　ｓｅｒ　ａ
ｓｎＴＡＣＡＡ、Ｔ　ＧＴＣＧＡＴ　ＴＴＧ　ＡＧＣＡ
ＡＣｌｅｕ　ｖａｌ　虹ｙｒ　ａｌａ　ｖａｌ　ａｓｒ
＋　ｊｈｒＴＴＧ　ＧＴＴ　ＴＡＣＧＣＴ　ＧＴＴ　Ａ
ＡＣＡＣＣ４１，０ ＴＴＴ　ＧＣＣＧＡＣＴＴＡ　ＴＣＡ　ＣＴＴ　ＴＧＣ
；４０ １ｅｕ　ａｓｐ　ａｒｇ　ｇｕｙ　ａｓｎ　ｓｅｒ　１
．ｙｓＴＴ’Ｇ　ＧＡＣＣＧＴ　ＧＧＴ　ＡＡＣＴＣＴ
　ＡＡＧ７０ しｈｒ　ｔｈｒ　ｌｅｕ　ｔｈｒ　ｌｙｓ　ａｌ−ａ　
ａｓｎ　５ｅｒＡＣＡ　ＡＣＴ　Ｃ，ＴＡ　ＡＣＴ　Ａ
ＡＧ　ＧＣＣＡＡＴ　ＴＣＴ９０ ｓｅｒ　ｔｈｒ　ｇｌ−ｙ　ｔｈｒ　ｌｅｕ　ｇｌｕ　
ｐｈｅ　ｇｌｕＴＣＧ　ＡＣＴ　ＧＧＴ　ＡＣＣＣｒＡ
　ＧＡＧ　ＴＴＴ　ＧＡＣ４（’）０ ２０ ｐｈｅ　ｌｙｓ　ｇｕｙ　］−ｅｕ　ｇｌ−ｕ　ａｓｐ
　ｐｒｏ　ｇｌ−ｕＴＴＣＡＡＧ　ＧＧＴ　ＴＬ’Ａ　
ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＧＡＡ３０ ５０ ｖａｌ−１ｙｓ　ｐｈｅ　ｖａｌ　ｌｙｓ　ｇｌｕ　ａ
ｓｎ　ｐｒ。 （’；ＴＣＡＡＧ　ＴＴＴ　ＧＴＣＡＡＧ　ＧＡＧ　Ａ
ＡＣＣＣＡＦｉｇ、７３Ｃむ９）１ □ ７０ ＧＡＧ　ＡＡＣＧＡＣＣＴＡ　ＡＧＴ　ＴＡＣＴＡＴ０
０ ｍｅｔ：　ｔｈｒ　ｔｈｒ　ｇｌｙ　ｖａｌ　ａｓｐ　
ａｓｎＡＴＧ　ＡＣＣＡＣＴ　ＧＧＴ　ＧＴＣＧＡＴ　
ＡＡＴ５３０　５３２ ｖａｌ　ａｒｇ　ｇｌｕ　ｖａｌ　］、ｖｓ　Ａｔ４Ｇ
ＴＡ　ＡＧＧ　ＧＡＡ−ＧＴＡ　ＡＡＡ　ＴＡＧ　ＡＧ
ＧＴ’６０ ｖａｌ−ａｓｎ　ａｓｎ　ｇｌｎ　ｐｒｏ　ｐｈｅ　ｌ
ｙｓ　５ｅｒＧＴＣＡＡＣＡＡＣＣＡＡ　ＣＣＡ　ＴＴ
ＣＡＡＧ　ＴＣＴ８０ ９０ １０ ２０ Ｔ’ＡＴＡＡＡＡＣＴＴＡＴＴＧＴＣＴＴＴＴＴＴＡＴ
ＴＴＴＴＴＴＣＡＦｉｇ、　７６　（む１） ｐＢＲ３２２ ＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｆ　Ｉ 沢酊甫 〜１．８　ｋｂ　１ｌｆｒｌ”ｙ単離 （ べ７′７− １立。 軸２）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　酵母生体にとって異種のタンパクをコードして
   いるＤＮＡ配列と翻訳解読枠で連結された菌種酵母シグ
   ナルペプチドをコードしているＤＮＡ配列の少なくとも
   実質的な部分に有効に結合された酵母プロモーターのＤ
   ＮＡ配列を含む酵母発現ベヒクル。 （２）シグナルペプチドの実質的な部分をコードしてい
   るＤＮＡ配列がインベルターゼのシグナルペプチドのＤ
   ＮＡ配列に対応することを特徴とする特許請求の範囲第
   １項に記載の発現ベヒクル。 ｔ３＋　７’ロモーターがインベルターゼプロモーター
   であることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
   発現ベヒクル。 （４）プロモーターが酵母の３−ホスホグリセレートキ
   ナーゼプロモーターであることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項に記載の発現ベヒクル。 （５１プロモーターが酵母インベルターゼプロモーター
   又は酵母３−ホスホグリセレートキナーゼプロモーター
   であることを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の
   発現ベヒクル。 （６）　異種タンパクをコードしている配列がヒト白血
   球インターフェロンαをコードしていることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載の
   発現ベヒクル。 （７）特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記
   載の発現ベヒクルで形質転換された酵母生体。 １８）　サツカロマイセス　セレビジアエ（８ａｃｃｈ
   ａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第７項に記載の酵母生体
   。 （９）　特許請求の範囲第７項又は第８項に記載の生体
   を含む酵母細胞培養物。 （１０１ｆｉ−許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれ
   かに記載の発現ベヒクルで酵母生体を形質転換し、 形質転換した生体を培養し、 培養した培地から異種タンパクを回収すること から成る、酵母に対して異種のタンパクの製造方法。 αＤ　特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記
   載の発現ベヒクルで酵母生体を形質転換して形質転換し
   た生体を培養することから成る、酵母に対して異種の分
   離タンパクを培養培地中に分泌させる方法。