JPS60244297A - Ｌ−リジンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はＬ−リジンの製造法に関し、さらに詳しくはα
−アミノ−ε−カプロラクタム（以下ＡＣＬと略す）ラ
セマーゼ活性を有する形質転換体を用いるＬ−リジンの
製造法に関する。

［従来の技術］ し− ＡＣＬラセマーゼはＡＡＣＬ加水分解酵素との共同作用
により、Ｄ−１あるいはＤＬ−ＡＣＬを原料としたＬ−
リジン生産に用いられている有用物質である。く文献１
）。

従来、ＡＣＬラセＹ−ゼ生産能を有する微生物としてア
クロモバクタ−・サイクロクラステス（Ａｃｈｒｏｍｏ
ｂａｃｔｅｒ　ｃｅｃｌｏｃｌａｓｔｅｓ　）、アクロ
モバクタ−・オーバエ（Ａ　ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ
　ｏｂａｅ　）　、フラボバクテリウム・アルボレッセ
ンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒ　ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎ
ｓ）　、ア人 ルカリゲネス・フイカリ≠（Ａ　１ｃａｌｉｏｅｎｅｓ
ｆａｅｃａｌｉｓ　）が報告されている（文献２）。

これらの公知の微生物から、ＡＣＬラセマーゼをコード
する遺伝子を取出し、遺伝子操作技術を適用すれば該酵
素の生産性向上が期待される。

そこで本発明者らは該酵素生産能を有する菌から該酵素
をコードする遺伝子のクローニングとそれを用いて該酵
素の生産性の増大を試みた。一般的な遺伝子クローニン
グの方法として、Ａ、ＯＬラセマーゼ生産能を有する菌
株に変異を起し、当該酵素欠損株を創成し、これを宿主
とし、宿主のＤ−ＣＬＡ資化能回復を指標としたセルフ
クローニングの方法、ＡＣＬラセマーゼの抗体を用いた
ｉｎ　ｓｉｔｕｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ法（例えば文献
３）、あるいはＡＣＬラセマーゼのアミノ酸配列に基づ
く推定ヌクレオチド配列を有するオリゴＤＮＡをプロー
ブに用いたコロニーハイブリダイゼイション法（例えば
文献４）などが考えられる。

しかるに、上記ＡＣＬラセマーゼ生産菌の形質転換を行
なうための適当なプラスミドや形質転換法が見当らず、
またＡＣＬラセマーゼは失活し易いため、抗体の調製や
アミノ酸配列決定に供する大量の純化された当該酵素を
ｉｌ１％４することは容易ではなかった。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明者らは、かかる状況に鑑み創意工夫を成し、細胞
内プラスミド上のＡＣＬラセマーゼをコードする遺伝子
が、リジン要求性変異を有する宿主大腸菌内で発現すれ
ば、Ｌ−ＡＣＬ加水分解酵素共存下に、宿主はＤ−ＡＣ
Ｌを春リジンに変えこれを資化し増殖するであろうとい
う作業仮説を立て、鋭意検討を進めた結果、当該酵素を
コードする遺伝子を有するプラスミドの取得に成功し、
次いでＤＮＡ供与体よりも高いＡＣＬラセマーゼ生産能
を有する大腸菌形質転換体を創生ずると共に、当該酵素
をコードする遺伝子の発現にインデューサーとしてのＡ
ＣＬを不要とすることに成功し、かくして本発明を完成
させるに至った。

［問題点を解決するための手段］ すなわち本発明は、ＡＣＬラセマーゼ活性を有するエシ
ェリヒア属の菌の形質転換体と、し−ＡＣＬ加水分解酵
素をＤ−またはＤＬ−ＡＣＬに作用せしめて、これらを
１−リジンに転換せしめ採取する口とを特徴とする「−
リジンの製造法を提供するものである。

本発明の形質転換体は、ＡＣＬラセマーゼをコードする
遺伝子を含む相換え体ＤＮＡで形質転換することにより
製造することができる。ＡＣＬラセマーゼをコードする
遺伝子を含む組換え体ＤＮＡとしては、プラスミドｐＮ
Ｎ３、ｐＮ　Ｎ　８９０　、ｐＮ　Ｎ　８９３またはｐ
Ｎ　Ｎ　３２が好ましく使用される。これらのプラスミ
ドは例えば、ＡＣＬラセマーゼ生産能を有する菌のＤＮ
Ａ断片を大腸菌のプラスミド・ベクターに結合させたプ
ラスミドにより形質転換した大腸菌リジン要求性変異株
の形質紘換体を、Ｌ−Ａ　ＣＬ加水分解酵素とＤ−ＡＣ
Ｌとを含む培地中で選択培養し、増殖した形質転換体の
中からＡＣＬラセマーゼ活性を有する形質転換体を選抜
し、この形質転換体からプラスミドを抽出することによ
り製造することができる。

ＤＮＡ供与体としては、Ａ　Ｃ、Ｌラセマーゼ号）、ア
ルカリゲネス・フィカリス（微工研め奇第７７８号）な
どが挙げられるがこれに限定されない。

ＡＣＬラセマーゼをコード、する遺伝情報を荷うＤＮＡ
の菌体からの抽出精製は例えば文献５記載の３　ａｉｔ
ｏ　−Ｍ　１ｕｒａ法など通常の方法に従って行なうこ
とができる。この場合界面活性剤を用いた溶菌過程は３
０〜６５℃、２０〜６０分で行なうとＤＮＡの収量をよ
り高めることができる。精製したＤＮＡの断片化は１−
（ｉｎｄｌｌ［、ＥＣＯＲ＋などの市販の制限酵素を用
いることができ、この酵素反応条件は例えば酵素メーカ
ーのマニュアル、もしくは文献６の簡便法が使用できる
。

本発明に用いるベクターは限定しないが例えばｐＢＲ３
２２やｐＡＣＹＣ１８４のように諸性質がよく調べられ
ているものが便利である。いずれも公知のプラスミドで
あり、例えばＡＴＣＣから入手可能で、それぞれ、ＡＴ
ＣＣ３７０１７、ＡＴＣＣ３７０３３として寄託されて
いる。プラスミドの複製と精製は例えば文献８など通常
の方法で行なうことができる。

ＤＮＡ断片の結合は例えば文献７などの−［４ＤＮＡリ
ガーゼを用いた通常の方法で行なうことができる。この
際ベクターの自己環化を抑制するためベクターの制限末
端をアルカリ・フォスファターゼ処理しリン酸残基を除
去することが望ましい。

本発明の組換え体ＤＮＡのうち、特にプラスミドＯＮ　
Ｎ　３、ｐＮ　Ｎ　８９０およびρＮＮ８９３は、アク
ロモバクタ−・オーバエのＤＮＡのｌ−１ｉｎｄｌ断片
をｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ■部位に組み込んで作製する
ことができる。

作製した組換え体−Ｄ　Ｎ　Ａは通常の形質転換法で宿
主内に導入する。例えば文献９に記載のルビジウムを用
いた形質転換法が使用できる。

宿主としては［）−ＡＣＬを窒素栄養源、もしくは炭素
栄養源として資化することのできない大腸菌の、リジン
要求性変異株を用いる。

その作成法は、例えばＭＭ２９４　（ＡＴＣＣ３３６２
５）のような公知の株に通常の変異′剤、例えばＮ−メ
チル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（略称Ｎ
ＴＧ）を作用させて変異を誘起せしめ、例えば文献１０
にような通常のペニシリン・スクリーニング法を用いて
取得できる。

ＡＣＬラセマーゼをコードする遺伝子を含む粗換え体Ｄ
ＮＡを含有する形質転換体は次のようにして選抜できる
。すなわち宿主のリジン以外の栄養要求は補完する最少
培地で、μ しかも２０〜５００輛０／ｄのＤ−ＡＣＬとし−ＡＣし
加水分解酵素を含有することを特徴とするスクリーニン
グ培地で増殖する形質転換体をまず選抜する。し−ＡＣ
Ｌ加水分解酵素の使用量は、これを培地に加えることに
よって宿主が自己の有する栄養要求マーカーとは無関係
に増殖することができない量であれば多い程良いが通常
１０〜１００単位／ｍｆ！の範囲で用いられる。ここで
いう単位とは、酵素を含んだ０．４　ｄの２　ｍＭＭｎ
　Ｃｌ　２．−１０％Ｗ／ＶＬ−ＡＣＬ−ｆ−ＩＣＩ　
（ｐｌ−１８）を４０℃、１時間インキュベートした際
、０゜１μｍ　１．ｌのリジンを生成する酵素活性を１
単位とする。Ｌ−ＡＣＬ加水分解酵素の調製は文献１１
の方法が使用できる。

また、必要に応じ、ベクターの有する薬剤耐性に対応す
る薬剤を培地成分に加えることができる。次にこのスク
リーニング培地で増殖する形質転換体のλＣＬラセマー
ゼ活性を調べ、ＡＣＬラセマーゼ生産能を有する形質転
換体を選抜する。活性測定の方法は例えば文献１２のよ
うに旋光針を用いることができる。当該活性がプラスミ
ド由来であることの確認は、例えば文献１３の通常のプ
ラスミド少量抽出法で取得したプラスミドを用い宿主を
再形質転換し、得られた形質転換体の当該活性を調べる
ことで可能である。

本発明のプラスミドｐＮ　Ｎ　３２は次の方法によって
製造することができる。すなわち、ＡＣＬラセマーゼ生
産能を有する細菌のＤＮＡの断片をベクターｐ８Ｒ３２
２に組込ませたプラスミドを用いて大腸菌のリジン要求
性変異株を形質転換し、この形質転換体をＬ−ＡＣＬ加
水分解醇索とＤ−・ＡＣＬを含みリジン以外の栄養要求
を補完する最少培地中で選択培養することにより、ＡＣ
Ｌラセマーゼ活性を有する形質転換体を取得し、該形質
転換体から抽出したプラスミドをＥＯＯＲ＋で消化し、
得られるＤＮＡ断片をプラスミドｐＡＣＹＣ１８４に組
込むとことにより得られる。

この様にＡＣ，ＬラセマーゼをコードするＤＮＡを他の
ベクターにサブクローニングする具体的な方法は、例え
ば文献７のような方法で行なうことができる。

ＡＣＬラセマーゼ生産能を有する形質転換体は、Ｌ−Ａ
ＣＬ加水分解酵素と併用することで、Ｄ−Ａｃｔ−１も
しくＤＬ−ＡＣＬをし一リジンに変換することができる
。その方法は例えば文献１に従って行なうことができる
。

Ｌ−ＡＣＬ加水分解酵素は、例えばクリプトコツカス・
ラウレンテイ（微工研菌寄第７０９号）、キャンデイダ
・フミコラ（同第７１７号）、トリコスポロン・クタネ
ウム（同７１４号）から製造することができ、Ｌ−リジ
ンの合成反応にあたっては、酵素として使用できるのみ
でなく、これら生産菌の菌体抽出液、処理菌体、生菌体
、さらに培養物（液）。

として使用することもできる。またＡＣＬラセマーゼ生
産能を有する形質転換体も、それのみでなく該形質転換
体が生産するＡＣＬうはマーゼを反応に使用することも
もちろん可能である。

以下実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１ （１）ＡＣＬラセマーゼ生産菌のＤＮＡの抽出アクロモ
バクチー・オーバエ（微工研菌奇第７７６号）をＬＢ培
地（トリプトン１％、イーストエキス０５％、塩化ナト
リウム１％、ｐＨ７，’５）Ｉ！、中、３２℃で４．５
時間、好気培養した対数期後期の菌体を１５ＩＩｔｇリ
ゾチーム塩酸塩を含んだ３ａｅの０．１５ＭＮａ　Ｃ１
−０、ＩＭＥＤＴＡ−５０ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣＩ（１
）Ｈ８）に懸濁し、３７℃、１５分間インキュベートし
た後、凍結融解し、次に２５ａｉ！の０．１ＭＴｒｉｓ
　−ＨＣｌ　（ｐＨ９）−１％５ＤＳ−０，ＩＭＮａＣ
ｌを加え６０℃、２０分インキュベートし溶解した。以
後３ａｉｔｏ−Ｍｉｕｒａの方法（文献５）を適用し７
００μ９のＤＮＡを得た。

（２）制限酵素によるＤＮＡの消化と分画文献６の反応
条件下、０２５μｇ／μｌの物（ＤＮＡ団で１２５μグ
）を１２ａｆ！の１０しｔ −４０％曽糖密度勾配中遠心し０．５厩ずつ分画採取し
た。遠心は日立ＲＰＳ４０Ｔローターを用い、２０℃、
２５．ＯＯＯｒｐｍ　２４時間行なった。電気泳動で各
両分のＤＮＡの長さを測定し、２〜ＬＯＫｂの画分をプ
ラスミドに連結した。制限酵素は宝酒造■製を用い、活
性単位は付属説明書の定義によった。

（３）　ベクターＤ、ＮＡのｍ製 プラスミド・ベクターｐＢＲ３２２は大腸菌ＭＭ　２９
４内で複製した。複製ならびに菌体からの抽出精製は文
献８に従い、５ＩＲｇ／ｌのテトラサイクリンを含むＬ
Ｂ培地で培養したプラスミド含有菌体をリゾチーム・Ｓ
Ｏ８で溶菌した後、フェノール抽出し、セシウムクロラ
イド−エチジウムブロマイド密度勾配平衡遠心とバイオ
ゲル・カラムクロマトグラフィーで精製した。培地１を
当り、ｐＢ　Ｒ３２２は５２０μグ得られた。２ベクタ
ーとして供するため、制限酵素）−１ｉｎｄｌ［［を用
い文献７の反応条件下完全分解した後、文献７に従いア
ルカリフォスファターゼ処理を施した。

（４）宿主の作製 ５ｄのＬＢ培地中で３７℃、３時間培養した対数期のＥ
　、ｃｏｌｉ　ＭＭ　２９４を文献１０に従い、ＴＭ緩
衝液中で１００μｆＪ／ｌｄのＮＴＧを用いて変異誘発
した後、ペニシリン・スクリーニング法を用いてリジン
要求性変異株Ｅ　、ｃｏｌｉ　ＭＭ　２９４　Ｌｙｓ−
を単離した。この株はジアミノピメリン酸脱炭酸酵素活
性が欠損していた。

（５）ＤＮＡの連結と形質転換 （２）で得たＤＮＡ断片０．５μ９と、（３１で得たベ
クターＤ　Ｎ　Ａ　０．５μｑとを、文献７の方法を基
に０５単位の７４　ＤＮＡリガーゼと共に、１００μｔ
の６１１ＭＭ（］　Ｃｌ　２−６　ｍＭβ−メルカプト
エタノール− υ ｍＭＴｒｉｓ　−　Ｈｅｌ　（　ｔ）Ｈ　７．６　）中
で４℃−晩インキュベートした後、この反応液の１０μ
ｉを、（４）で作製した宿主を文献９の方法でコンピテ
ント化した菌液２００μ℃と混ぜ、４℃、４５分間、次
いで４２℃、９０秒間、そして４℃、１分間インキュベ
ートした後、しＢ培地を加えて１ｄとし、３７℃、１時
間振どう培養して形質転換を行なった。この形質転換体
ミックス中のアンピシリン耐性かつテトラサイクリン感
受性の形質転換体はベクター１μｇ当り２．５〜ａ３Ｘ
１０ｓだった。

（６）　スクリーニング 前項（５）で調製した形質転換体ミックス中の菌体を３
０μｇ／−のアンピシリンを含むスクリーニング培地＜
０．４％グリ］−ス、０，１％塩化アンモニウム、０．
０５％Ｄ−ＡＣＬ。

０．３％ＫＨ２ＰＯ４，０，７％Ｎａ２ＨＰ○４．０．
０５％食塩、１１１１ＭＭｇＳＯ４，０２ｍＭＭｎ　Ｃ
１２，０，１ｍｆＶＬｃａ　Ｃｌ　２．５０μ７／ｌｌ
ｌ１！チアミン、５０μｗ／ｄ、プロリン、５０単位／
ａｉ！Ｌ−ＡＣＬ加水分解酵素を用いて遠心操作により
２回洗滌後、該培地１ｍに再懸濁し、この菌液の５０μ
℃を、４２℃に予め加温しておいた０、　７％のＬＭＰ
アガロース（Ｔａｋａｒａ　ＬＯ３）と３０μ９／ｄの
アンピシリンとを含む上記スクリーニング培地３ｍと混
ぜ、これを直径９　ｃｒｎのテルモシャーレ内に固化し
た１５〜２０ａｅの下層固体培地（１，５％の寒天と３
０μｇ／−のアンピシリンを含み、Ｌ−ＡＣＬ加水分解
酵素とＭｎＣ１２とを除いた上記スクリーニング培地）
上に重層し、３０℃での静置培養で形質転換体の選択培
養を行なった。培養３日目で１シャーレ当り平均０．２
個のコロニーの発生が認められ、生じたコロニーを上記
アガロース・アンピシリン含有スクリーニング培地に移
植して増殖能を再確認した後、文献１３の方法に従いプ
ラスミドを抽出し、ベクタープラスミドより大きい事を
確認した後、次項（７）の方法で形質転換体のＡＣＬラ
セマーゼ活性を測定した。

（７）活性の測定 前項（６）の３０μｃｉ／−のアンピシリンを含むスク
リーニング培地１００ｄ中で形質転換体を３５℃、−晩
好気培養し、５０ｍＭリン酸緩衝液（中性）で洗滌後、
同緩衝液を加えＩＩｄとし、ｌｌＲ１の１０％Ｄ−ＡＣ
Ｌ　（ｐＨ８＞と混ぜ、４０℃２時間反応させた後、沸
とう水中５分間インキュベートし、１０，０００ｘｇ、
１０分間遠心し、て、その上澄を堀場高速自動旋光計５
ＥＰＡ２００にかけ旋光度を測定することによりＡＣＬ
ラセマーゼ活性を調べた。当該活性を有する大腸菌の形
質転換体３株のラセマーゼ活性を表１に示す。

ｐＮ　Ｎ　３を含有する形質転換体Ｅ、ｃｌｏｉ　ＭＭ
２９４Ｌｙｓ−／　ＤＮＮ３は微工研菌寄第７６１１号
として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託しである
。アクロ宅バクター・オーバエ（微■研菌奇第７７６号
）を用いた対照実験も表１中に示した。

表１　ラセマーゼ活性 上記の各形質転換体からプラスミドを抽出し、これを制
限酵素Ｈｉｎｄｌ［ｌ、Ｅ　ＣＯＲ＋で消化し、各々の
分解物を０９％アガロースゲルで電気泳動者キした。結
果を第１図に示す。

図中１はλＤＮＡのＨｉｎｄＩ［［分解物を、２は１）
Ｎ　Ｎ　３のｌ−１ｉｎｄｌ［分解物を、３はｐＮ　Ｎ
　８９０のＨｉｎｄｌＩ分解物を、４はｐＮ　Ｎ　８９
３の１−（ｉｎｄｌ［［分解物を、５はｐＮ　Ｎ　３の
ＥＣｏＲｌ分解物を、６はｐＮ　Ｎ　８９０のＥｃｏＲ
１分解物を、７はｐＮ　Ｎ　８９３のＥｃｏＲ１分解物
を各々示ず。

（８）ＡＣＬラセマーゼの性質 海砂を用い、４℃で摩砕した後、ミリポアフィルタ−を
通したろ液を、セファデクスＧ２００を用いたゲルろ過
によりＡＣＬラセラーゼの分子量を測定したところ５万
だった。この酵素溶液にヒドロキシルアミンを５×１０
−５　Ｍとなるように加えたところ失活したが、す これに炸リドキサールリン酸を５Ｘ１０−５Ｍとなるよ
うに加えたところ古酒した。これらの性質はアクロモバ
クタ−・オーバエ微工研菌奇第７７６号由来のＡＣＬラ
セマーゼと同じ性質であった。

実施例２ （１）　サブクローニング 実施例１で取得したプラスミドｐＮ　Ｎ　３を制限酵素
ＥＣＯＲ＋で消化し、生じたＤＮＡ断片をＴ４　ＤＮＡ
リガーゼを用いてｐＡ　ＣＹ　Ｃ１８４のＥｃｏＲ１部
位に連結し、実施例１の（５）で調製した宿主のコンピ
テント・セルと混ぜ形質転換反応を行ない、０．７％Ｌ
ＭＰアガロースと５μ９７ｍｆｔのテトラサイクリンを
含むスクリーニング培地で増殖する形質転換体を取得し
、これらの形質転換体から文献１３の方法でプラスミド
を抽出し、電気泳動法でその大きさを比較し、最小のプ
ラスミドをｐＮＮ３２と命名した。

第２図にｐＮ　Ｎ　３２の制限地図を示す。

（２）　ラセミ化 ７６１２号）を５０ｍの５μｃＪ／ｍｅのテトラサイク
リンを含むスクリーニング培地で培養し洗滌した菌体の
遠心ペレットを２ｍ！、の５％Ｄ−ＡＣ’Ｌ−ＨＣＩ　
（ｐＨ８）と４０℃で反応させた後実施例１−（７）の
方法で反応液の旋光度を測定したところ４時間で＋０．
７３から０００へ変化しＡＣＬラセマーゼ活性が認めら
れた。この反応液をミリポアフィルタ−（口径０．４５
μＴｒＬ）を用いろ過した後、このうち０．３．ｄを６
Ｎ塩酸１ｄと共に１１０℃、３時間封管中反応させ（こ
の条件下、ＡＣＬもリジンもラセミ化しない）、中和後
、０．４５Ｍホウ酸緩衝液＜１）Ｈｌｏ、２）２ｍを加
え、Ｌ−ＰｈｅＮ　ＣＡ　３０ｍｌと３分間反応された
後、１Ｎ塩酸１威を加え反応を停止しｌ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　
Ｃ分析を行なった。カラムは４．６×１５０ｍｍのコス
モシル５０１８を、移動層は０．０５％リン酸水溶液を
用い毎分２ｍの速度で流し、２１４ｎｍの波長で検出し
た。その結果、第３図（ａ　）に示される如く、対照実
験のＤＬ−ＡＣＬの第３図（ｂ、）と同一のＨＰＬＣ分
析波型を成し、Ｄ−ＡＣＬがラセミ化されていることが
確認された。

図中、■はＬ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　−ａ　−Ｌ　ｙｓの
ピークを、■はＬ−Ｐｈｅ−Ｄ−ａ−１ｙｓのピークを
、■はＬ−Ｐｈｅのピークを、■はＬ　−ｐ　ｈ’ｅ−
Ｌ−４−ＬＩＳのピークを、■はＬ−Ｐｈｅ−Ｄ−ε−
ＬｙＳのピークを各々示す。

（３）ＤＮＡの供与体との比較 上記１１ＮＮ３２を有する形質転換体とＤＮＡ供与体で
あるアクロモバクタ−・オーバエをスクリーニング培地
あるいはＬＢ培地５０ｄ中３２℃、２０時間好気培養し
、実施例１−（７）の方法に従い菌体量当りのＡＣＬラ
セマーゼ活性を比較した結果を表２にまとめた。

但し、形質転換体の培養にはテトラサイクリンを培地に
５μｇ／ｄ加えた。形質転換体は面 キ培地中でＤ　、Ｎ　Ａ供与体の２倍以上の活性を有し
ていた。

表２　ラセマーゼ活性の比較 （４）宿主の検討 文献９の方法でコンピテント化した大腸菌ＭＭ２９４、
ＨＢｌｏｌ、箕４７８の３株のｐＮＮ３’２による形質
転換体を５μ’ｊ／ｄのテトラサイクリンを含む５０ｄ
のＬＢ培地中で２０時間培養し、遠心で集菌・洗滌した
後、１ｄの１０％Ｄ−ＡＣＬ　（ｐＨ８）と４０℃１時
間反応させ、ＡＣＬラセマーゼ活性を比較した。その結
果が表３であり、実施例］−（４）で作製した変異株以
外の宿主でもＡＣＬラセマーゼ活性が認められた。

なお大腸菌トｌ８１０１、＝ｍ４７８はいずれも公知の
株であり、例えば前者はＡＴＣＣ３３６９４、後者はＣ
Ｇ５Ｃ４２１２として、それぞれＡＴＣＣ，Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　Ｇｅｎｅｔｉｃ３　ｔｏ、ｃｋｃ　ｅｎｔｅｒに寄
託されている。

表３　ｐＮＮ３２による形質転換体のラセマーゼ活性＊
転換率−Ｌ／（Ｄ十Ｌ） （５）Ｌ−リジンの製造 Ｌ−ＡＣＬ加水分解酵素生産菌であるクリプトコツカス
・↓ウレンティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｕｒ
ｅｎｔｉｉ　＞微工研菌奇第７Ｃ）９号を０．５１し ％グ≠コース、１％ＤＬ−、ＡＣＬ−ＨＣ１０゜１％、
ＫＨ２ＰＯ４，０，０５％Ｍｇ　ＳＯ４・７Ｈ２０，０
，００２％、ＭｎＣ，ｌ　２　・　４Ｈ２０１α０５％
酵母エキス（ｐＨ７，２）を成分とする培地３００威中
、３０℃、２０時間培養した後、遠心操作により、集菌
、そして水を用いた洗滌を２回行なった。（２）項で創
成した形質転換体を２００−の５μｇ／ｄのテトラサイ
クリンを含むＬＢ培地中３５℃、１５時間培養した後、
上記クリプトコツカスの場合と同様に集菌洗滌を４℃に
て行なった、上記２種の菌体を１００ｄの１０％のＤＬ
−ＡＣＬ（ｐＨ７，５＞に懸濁し、４０℃、３時間イン
キュベートした後、遠心操作で除菌し、上澄をミルボア
フィルターでろ過し、アミノ酸自動分析機でリジンを定
量した結果、ＤＬ−ＡＣＬがＬ−リジンにモル換算９８
．５％変換した。このろ液５０ｍＡを希塩酸でｐＨ４，
１にした後、活性炭０．５ｇと４分間煮沸し、冷却後ミ
リポアフィルタ−でろ過し、ろ液を蒸発乾固し、生じた
結晶を更に５０℃、１０時間真空乾燥し５．８５　ｆｆ
の結晶を得た。旋光度の測定から光学純度は９８％だっ
た。

参考文献 １、Ｔ、　Ｆｕｋｕｍｕｒａ　；　Ａａｒ、　Ｂ　ｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ、。

４１．１３２７〜１３３０　（１９７７）２　Ｔ、　Ｆ
ｕｋｕｍｕｒａ　；Ａｇｒ、　Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、。

４１．１．３２１〜１３２５　（１９７７）３、Ｒ，Ｗ
ｕ編：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ　ｎＷｕｍｏｌｏｇ
ｙ。

６．８，４２８〜４３６　（１９７９）４、同上、６８
；　３７９〜３８９　（１９７７）５、斉藤日向：蛋白
質核酸酵素、１１．．４４６〜４５０　（１９６６） ６、Ｒ，Ｗ、Ｄａｖｉｓら編；　Ａ　ｄｖａｎｃｅｄ３
ａｃｔｅｒ＋ｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　、　Ａ　Ｍａ
ｎｕａｌ　ｆｏｒＧｅｎｅｔｉｃ　Ｅ　ｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ、　ｐ２２７〜２３０（１９８０） Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ−１ａｒｂｏｒ　Ｌ　ａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅｗ’１０ｒｋ。

７、同上、ｐ１３８〜１３９ ８、Ｔ　、　Ｍａｎｉａｔｉｓら編；　ｌｙｌ　ｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　Ｍａｎｕａｌ　、ｐ　８６〜９６　（１９８２） Ｃｏｌｄ　３ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂＯｒａ
ｔｏｒｙ　、ＮｅｗＹ、ｏｒｋ。

９、重定勝哉：細胞工学２．６１６〜６２６（１９８３
） １０、石川辰夫編゛微生物遺伝学実験法”ｐ８６〜８８
　（１９８２）井守出版 １１、Ｔ、Ｆｕｋｕｍｕｒａ　ら；　Ｆ　Ｅ　Ｂ　Ｓ　
Ｌｅｔｔｅｒｓ。

８９．２９８〜３００（１９７８） １２、Ｓ、Ａ’、Ａｈｍｅｄら；　Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、。

４７．１８８７〜１８９３　（１９８３）１３、Ｈ，Ｃ
，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　＆Ｊ、　ＤＯｌｙ　；　Ｎｕｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅｓ、　７．１５１３〜１５２３（
１９７９）

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られたプラスミド０ＮＮ３、ｐＮ
　Ｎ　８９０、および１１Ｎ　Ｎ　８９３の電気泳動”
１ｌｌｔ−結果を示す゛。第２図は実施例２で得られた
プラスミドｐＮ　Ｎ　３２の制限地図を示す。 第３図（ａ　）は実施例２の形質転換体を用いＤ−ＡＣ
Ｌをラセミ化した反応物のＨＰＬＧ分析結果のチャート
を示し、（ｂ　）は対照であるＤし−ＡＣＬの）（ＰＬ
Ｏ分析結果のチャートを示す。 特許出願人　東　し　株　式　会　社 ｌ　２３４５６７ 第１図 第２図 ５ＴＡＲＴ（ｄ） ５ＴＡＲＴ（ｂ） 一第　３　園

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　α−アミノ−ε−カプロラクタム・ラセマーゼ
   活性を有するエシェリヒア属の菌の形質転換体と、Ｌ−
   α−アミノ−ε−カプロラクタム加水分解酵素をＤ−ま
   たはＤし一α−アミノー０ε−カプロラタムに作用せし
   めて、これらをし−リジンに転換せしめ採取することを
   特徴とするし−リジンの製造法。
2. （２）形質転換体がα−アミノ−ε−カプロラクタム・
   ラセマーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｃＮ　
   Ｎ　３２で形質転換された大腸菌である特許請求の範囲
   第１項記載のＬ−リジンの製造法。