JPS6019996B2 - Ｌ↓−アミノアシラ−ゼ及びその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｌーアミノアシラーゼ及びその製造方法に関
し、詳しくは、フアカルタティブ（松ｃｕｌｔａｔｉｖ
ｅ）にメタノールを資化する細菌類の生産するＬーアミ
ノアシラーゼ及びその製造法に関するものである。

Ｌーアミノアシラーゼは広く自然界に分布し、それらに
ついての研究も数多くなされており、ＤＬ−アシルアミ
ノ酸類の光学分割剤として工業的にも利用されている。

しかしながら、これらのＬーアミノアシラーゼはいずれ
も単離精製がなされておらず、例えばディスク電気孫動
の移動位置を定めたものさえもない。特にフアカルタテ
イブ（ｆａｃ山ｔａｔｉｖｅ）・メタ／ール資化性細菌
類についてはＬ−アミノアシラーゼを生産するという報
告はない。本発明のフアカルタティブ（ねｃｕｌｔａｔ
ｉｖｅ）・メタノール資化性細菌とは、オブリゲート．
メチロトロフ（（ｏｂｌｉｇａｔｅ或はｓｔｒｉｃｔ）
ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈ）（即ちメタンやメタノール
及びメチルアミンの様なＣ，化合物のみを唯一の炭素源
として利用し生育できる菌。

例えばパージエイズ・マニュアル・オプ・デターミネィ
ティブ・バクテリオロジー第８版（１９７４）２６７頁
のメチロモナダセェ（ＭｅｔｈｙｌｏｍｏＭｄａｃｅａ
ｅ）科の中のメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏ岬ｓ）
属或はメ チロ コ ツカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ）扇の各菌種）とは異なって、Ｃ，化合物の内でメ
タンは資化できないが、メタノールあるいはメチルアミ
ン類を資化し、その上Ｃ２以上の炭素化合物の一部のも
の（例えば或る種の糖質、アミノ酸、アルコール、有機
酸類の一部）を単一の炭素源、エネルギー源として資化
し生育する事が可能で、その殆んどは肉汁寒天やプレイ
ンーハート・インフュージョン寒天等の様な普通の栄養
培地にも生育する細菌の総称を云う。メタノール資化性
細菌の検索は１９総年頃から現在までＳＣＰ生産や各種
アミノ酸類生産を目的として盛んに研究がなされて居り
、研究報告、特許公報、公開特許公報に多くを見る事が
出来る。本発明者等はＬ−アミノアシラーゼ生産能を有
する微生物の検索に当り、之等メタ／ール資化性細菌の
保存菌株を対象に研究を進め本願発明を成しとげる事が
出来た。本発明者らはフアカルタティブ・メタノール資
化性細菌についてＬ−アミノアシラーゼ生産能を検索し
たところシュードモナス アミノポランス（ＰｓｅＭｏ
ｍｏｎａｓ ａｍｌｎｏｖｏｒａｎｓ）ＮＣＩＢ９０３
９、シユードモナススピシーズ（ＰｓｅｕｄｏｍｏＭｓ
ｓｐ．）１１５８及びシュードモナス スピシーズ
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１７などの菌株
がＤ−及びＬ−アミノアシラーゼの両者を同時に生産し
シュードモナス スピシーズ（Ｐ．ｓｐ．）ＡＭＩＮＣ
ＩＢ９１３３、シユードモナス スピシーズ（Ｐｓｐ．
）Ｍ ２７ＮＣＩＢ９鰍６がＬーアミ／アシラーゼを生
産する事を見出し、一その各々について単藤精毅を行い
本発明を完成するに至った。

（尚、亀田らはシュードモナス窟細菌の中にＤ−及びＬ
ーアミノアシラーゼの両方を生産する菌の存在を報告し
ているが、それらはいずれも単離精製されておらず、又
生産菌もシュードモナス ェルギノーザ（ＰｓｅＭｏｍ
ｏｎａｓａｅｒ略ｌｎｏｓａ）に属すると思われる（薬
学雑誌 第７甥蓋 ７４８頁 １９５８王）ので、本発
明とは明らかに異なる。）以上の中シュードモナス ア
ミノボランスＮＣＩＢ９０３９以外はフアカルタティプ
・メタノール資化性細菌のうちの赤色フアカルタティブ
・メタ／ール資化性細菌に属するものである。

本発明に使用し得るフアカルタティブ・メタノール資化
性細菌の内、代表的な１菌株シュードモナス アミノ
ボランス（Ｐ．ａｍｌ肌ｖｏｒａｎｓ）ＮＣＩＢ９０３
９はｄｅｎＤｏｏｒｅｎｄｅＪｏｎｇによって分離され
、同氏によって１９２６年、ＴｈｅｓｉｓＴｅｃｈｎｉ
ｓｃｈｅＨ肌ｇｅｓｃｈ肌ＩＤｅ１８‘こ詳細に記載さ
れ、英国のＴｏｒひ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｓｔａｔｉｏｎ
のザー ナシヨナル コレクシヨン オプ、インダス
トリアル バクテリア（ＴｈｅＮａｔｉｏ雌Ｉ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ ｌｎｄ雌ｔｒｉａｌ 欧ｃｔｅｒ；ａ
）にシユードモナスアミノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓａｒｎｌｎｏｖｏｒａｎｓ）ＮＣＩＢ９０３９と
して保存されている。

また前出のバーシェィズ・マニュアルの第８版（１９７
４）の２３刀頁のアデンダム１（「Ａｄｄｅｎｄａ ｔ
ｏ 比ｅ Ｇｅｎｕｓ ＰｓｅｕｄｏｍｏＭｓ」のＡｄ
ｄｅｎｄｕｍ ｌ）の中にも記されており、公知菌株の
オーセンテック菌株（ａｕ比ｅｎｔｉｃｓｔｒａｉｎ）
である。本菌株は周知の如くグラム陰性の稗菌で、肉汁
塔地にもよく生育し、Ｃ２以上の一部の有機化合物も利
用出来るが、その特徴はＣ，化合物の内メタンは資化し
ないがメタノールを資化出釆る所謂フアカルタティブ・
メタノール資化性細菌（ねｃｕｌｔａｔｉｖｅ ｍｅｔ
ｈａｎｏｌ‐ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｎｇｂａｃにｒｉａ
）と言うべき細菌の中の一菌種である。本菌株のコロニ
ーの斜面培養における表面生育は白色〜淡黄色で赤色を
呈せず、次に述べる赤色ファカルタティブ・メタノール
資化性細菌群（ｒｅｄｆａｃｕＩＰｔｉｖｅｍｅｔｈａ
ｎｏｌ‐ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｎｇ鼠ｃｔｅｒｉａ）の
菌株とは一見して区別し得る菌株である。ここに赤色フ
アカルタテイブ・メタノール資化性細菌類（ｒｅｄ 鷺
ｃｕｌｔａｔｉｖｅ ｍｅｔｈａｎｏｌ ‐ａｓｓｉｍ
ｉｌａｔｉｎｇｂａｃ企ｒｉａ）とは、グラム陰性、単
極毛で運動する無胞子稗菌で、細胞内に頚粒を形成し、
菌体内にカロチノイドを含み、コロニー及び斜面培養は
赤色乃至ピンク色を示し、前記の如くＣ，化合物の内で
メタンは利用出釆ないが、メタノールあるいはメチルア
ミン類を資化し、その他にＣ２以上の有機化合物の一部
のもの（例えばグリセリン、ピルビン酸、乳酸、フマル
酸等）を資化し得る細菌群を言う。

本発明者等は乃等「フアカルタティブ・メタノール（ね
ｃｕｌｔａｔｉｖｅｍｅｔｈａｎｏｌ）資化性細菌３内
朱を試験し、Ｄーアミノアシラーゼ及びＬーアミノアシ
ラーゼ生産菌として１９珠、Ｌ−アミノアシラーゼのみ
の生産菌としてＺ株を得た。

第１表にシュードモナス アミノボランス及び赤色フア
カルタテイブ・メタノール資化性謎菌株の検索の結果を
例示する。尚、供試赤色メタ／ール資化性細菌約４ｑ敷
ま文献記載の菌株であって多数のタイプ ストレイン（
ｔｙｐｅｓｔねｉｎ）及びオーセンテツクストレイン（
ａＷｈｅｎｔｉｃｓｔｗｉｎ）を含むものである。第
１ 表 註１． （１） 文献名： Ｂｅｒｇｅｙ′ｓ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｙ第７版（１９５７）（２） 文献名： Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｊ．８１，４６５（１９６１）（３） 文献
名： Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．９２，６０９（１９６４）
（４） 賄賂： ＢｅｒｇｅｙＳ Ｍａｎｕａｌ ｏ
ｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ第７版（１９５７）２０１頁（５） 文献名：
特許公報 昭４９−３７２７４註２． 丁土などの
記号はデンシトメトリーによる相対活性を表わし、上記
のシュートモナス スピシーズ １１５８株を１００と
して 日日 は１３０以上、 十十 ７ ０〜１３０
，十２０〜７０，土は２０以下註３． 註１の（１
１，（２），（３）及びシュートモナスァミノボランス
以外の供試菌枕はすべて「ＣＩ−化合物における微生物
の増殖」 （【ＭｉｃｒｏｂｉａＩ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｎ Ｃ，Ｃ
ｏｍｐｏｕｎｄｓ”ｐｌｌ〜２１（１９７５））に幸隙
誓の菌株であるｏ第１表のシュードモナス アミノボラ
ンス（Ｐ．ａｍｌｎｏｖｏｒａｎｓ）以外の赤色の細菌
は、形態的、培養的、生理的性質に於て共通した点が多
く、ストック（Ｐ．Ｋ．Ｓｔ比ｋ）とマッククレスキー
（Ｃ．Ｓ．ＭｃＣ１ｅｓｋｅｙ）等（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ 総巻 １０６５頁１９６４王）が述べている如
く、またクェィル（Ｊ．Ｒ．Ｑｕａｙｌｅ）（Ａｄｖ．
ｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７巻 １１
９頁１９７２牢）が彼の総説の中で論及している様に近
似した性質を共有する細菌群であって、赤色フアカルタ
ティブ・メタノール資化性細菌として総括出来る。

第１表に示す如く、之等赤色フアカルタティブ・メタノ
ール資化性細菌群中の僕試した殆んど全ての菌株がＬー
アミ／アシラーゼ生産能を有した。次にこれら等非常に
近似し、多くの共通した性質を有する本願Ｌ−アミノア
シラーゼ産出の赤色フアカルタティブ・メタノール資化
性細菌の中から、代表的な２菌株を選んでその菌学的性
質を託す。

この代表２菌株シュードモナス スピシーズ（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏＭｓｓｐ．）６１７及びシュ−ドモナススピシ
ーズ（Ｐ．ｓｐ．）１１球はそれぞれ徴工研菌株寄託番
号４６３１号及び４６３２号として寄託されている。‘
１｝ Ｍ．６１作菌株（徴工研菌株寄託４筋１号）形態
的性質細胞：稗菌 大きさ：０．８〜１．２×１．５〜
４．０ミクロン単極鞭毛で運動する。

時に分枝（ｂｒａｎｃｈｉ増）を行い多形態となる。

グラム染色陰性、細胞内に額粒を有する。胞子を形成し
ない。

抗酸性染色で染まらない。

各種培養に，おける生育状態 １％メタノール・基礎寒天平板培養のコロニー：（３０
ｑｏ、４錨時間）円形、凸円状、全縁、表面平滑、光沢
あ り、赤色、不透明 同上寒天斜面培養：（３０℃，４８〜？幼時間）生育中
等度、線状、平滑、光沢あり、赤色、培地不要 肉汁寒天斜面培養：（３０午○，４８〜７幼時間）１％
メタノール・基礎寒天斜面とほぼ同じ １％メタノール添加肉汁液体培養：（３０ｑｏ，４８〜
７幼時間）混濁する、被膜はつくらないが時々リン グ生成、枕糟生成、異臭なし ゼラチン穿刺培養：（２０ｑｏ，２０日間以上）表面或
は上部の生育が良い。

ゼラチンを液化せず。

リトマス ミルク：（３ぴ０，２０日間以上）微かにア
ルカリ性となる。

凝固、液化等はない。

生理的性質 １：硝酸塩の還元 ：揚陸２：脱窒素
反応 ：陰性３：Ｍ収テスト
：陰性４：ＶＰテスト
：陰性５：インドールの生成：陰性６：硫化水素の
生成：陰性 ７：澱粉の加水分解：陰性 ８：クエン酸の利用性陽性 ９：無機窒素源の利用：アンモニウム塩、硝酸塩を単独
窒素源として生育する １０：色素の生成：水溶性色素を形成しない１１：ウレ
アーゼ：陽性１２：オキシダーゼ：おくれて陽性 １３：カタラーゼ：陽性 １４：生育の範囲：餌４．０〜９．０に生育する。

穣通風６．５〜７．５ 生育温度１０℃及び４２０に生
育しな い。

最適生育温度２５〜３２０ １５：酸素に対する態渡：通性好気性菌 １６：ＯＦテスト（Ｈｕか＆仏ｉｆｅｏｎ法）：Ｌ−ア
ラビノースから酸化的及び醗酵的に酸 を生成する。

１７：メタノールを単一炭素源として資化しよく生育す
る。

１８：各種炭素源から酸及びガスの生成 胸 ガス城 鰯 ガス城
Ｌ−ァラビノース ＋ − 蕉 糖 − −Ｄ−
キシロース 十 一 乳 糖− −Ｄ−グルコース
トレハロースＤ−マンノ−ス 十 Ｄ
−ソルビトールＤ−フラクトース Ｄーマン
ニトールＤ−ガラクトース ＋ イノシトール麦
芽 糖 − − グリセリン十 一可溶性澱粉 ■ Ｍ．１１班（徴工研菌株寄託４６３２号）形態的性
質細胞は０．８〜１．２×２．０〜４．５山の大きさの
稗菌、単極毛により運動する。

グラム陰性、抗菌性なく、胞子は形成しない。細胞内に
額粒を蓄積する。培養的性質 肉汁寒天コロニー：点状〜円形、凸円状、全縁、赤色〜
ピンク色、不透明肉汁培養：均一に混濁、膜は作らない
。

肉汁寒天斜面：生育中等度、線状、緑なめらか、表面平
滑、赤〜ピンク色、培地不変 １％添加メタノール合成培地斜面：生育良好、他は前肉
汁寒天と同様。

肉汁ゼラチン穿刺培養：表面及び上部生育、ゼラチン液
化せず。

リトマスミルク：不変、７日頃僅かにアルカリ性となる
。

生理的性質 硝酸塩の還元：陰性 脱窒反応：陰性 Ｍ町テスト：陰性 ＶＰテスト：陰性 インドール生成：陰性 硫化水素の生成：陰性 澱粉の加水分解：陰性 クエン酸塩の利用：士 無機窒素の利用：アンモニウム塩を利用する。

色素の生成：水溶性色素を形成しない。

ウレアーゼ：腸性 オキシダーゼ：陰性 カタラーゼ：腸性 リジン・オルニチン脱炭酸反応：陰性 セルラーゼ：陰性 生育の範囲：軸４．０〜９．５に生育する。

最適生育餌６．５〜７．５温度：１０℃〜４ｙＣで生育
する。

５０℃以上で生育しない。

最適温度３０〜３５℃ 酸素に対する態度：好気性 ＯＦテスト：グルコースから好気的及び嫌気的に酸及び
ガスを生成しないがアラピノースから酸化 的、醗酵的に酸を生成す る。

メタノールの資化性：メタノールを唯一の炭素源として
よく生育する。

炭水化物から酸及びガスの生成： 鰯 ガス職 鰯 ガス城
Ｌ−アラピノ」ス 十 トレハロースＤーキシ
ロース ＋ Ｄ−ソルビト−ル ー −Ｄ−グルコ
ース Ｄ−マンニト−ルＤ−マンノース
イノシトールＤ−フラクトース − − グリセ
ロ−ル 十 一麦 芽 糖 可溶性デンプン
− −蕉 糖 − −乳 糖 − − 以上の性質から両菌株はＣ，化合物のメタノールを資化
するがＣ２以上の炭素化合物も利用するから、前世のパ
ージエイズ・マニュアル第８版（１９７４）の２職責）
のメチロモナダセェ（ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａ船ｃｅａ
ｅ）科のメ チロモナス（（ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ
）属に属させるわけには行かない。

同書にはブロタミノバクター（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａ
ｃにｒ）属はすでに削除されており、また２６９頁のＦ
ｕ山ｅｒｃｏｍｍｅｎｔｓの中にも記されている如く「
メタン或はメタノールのオプリゲート（ｏｂｌｉ滋ｔｅ
）資化性でない細菌」は今後更に研究を続けねばならな
いとされている。

之等の菌株がシュードモナダセ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ船ｃｅａｅ）科シュードモナス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属させるについては、
同書第２１刀官１こＣ，化合物は資化不能とあり、一方
本出願に使用する細菌が総てＣ，化合物のメタノールを
資化する故、疑問がある。

しかしシュードモナス アミノボランス（Ｐ．ａｍｉｎ
ｏｖｏｒａｎｓ）とシユードモナス ヱキストーケンス
（Ｐ．ｅ幻ｍｑｕｅｎｓ）が２３７〜２紙頁の「Ａｄｄ
ｅｎ舷 の 比ｅ ＧｅｎｕｓＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
」にその名前が追記されているし、又第１表に示した如
く赤色フアカルタティブ・メタノール（ｒｅｄｆａｃｕ
ｌねｔｉｖｅｍｅｍａｎｏｌ）資化性細菌のシュードモ
ナス スピシューズＡＭ１（Ｐ．ｓｐ．ＡＭＩ）はベー
ル（Ｄ．ｐｅｅｌ）とクエイル（Ｊ．Ｒ．Ｑｕａｙｌｅ
）（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．８１巻４６５頁１９６１年）
によって分離され、同定記載されＮＣＩＢ９１＄として
寄託保存されており、またシュードモナス スピシーズ
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｍ２７はアントニー
（Ｃ．抑ｔｈｏｎｙ）とザットマン（Ｌ．Ｚ，Ｚｔ岬ｎ
）（ＢｉＭｈｅｍ．Ｊ．９２巻６０期蓋１９私）等が分
離し、同定後、ＮＣＩＢ９斑６として保存されている。
之等は総てオーセンティック菌株（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ
ｓｔねｉｎ）で、その他の菌株は河野と尾崎（Ｍｉｃｒ
ｏｂｉａｌＧｒｏｗｈｏｎＣ，一Ｃｏｍｐｏ血船１１〜
２１頁１９７５）が報告したＧｒｏｕｐｍの細菌のもの
である。現在分類学的に問題はあるが、他に所属さすべ
きところがなくＱｕａｙｌｅ等或はＺａｔｍａｎ等にな
らってシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ岬ｓ）属に属
させるのが最も妥当と考えられる。（しかし前記した如
く今後分類学研究の進展によって、これ等フアカルタテ
イプ・メタノール質化性菌の分類学上の位置が明確にさ
れ、シユードモナス（ＰｓｅｕｄｏｍｏＭｓ）から他の
属に移行されたり、或は新属又は新種名が提案される可
能性は大きい。）次にＬーァミノアシラーゼ生産とその
酵素の酵素学的性質をシュードモナス スピシーズ（Ｐ
ｓｅＭｏｍｏｎａｓｓｐ．）１１＄生産の酵素について
具体的に説明する。

グルコース２％、フアルマメデイア■（トレーダース・
オイル・ミル社製）０．８％、コーン・ステイーブ・リ
カ−０．５％の熱ＯＫ抽出液を軸７．０に調整し、１２
０ｑｏ、１５分間殺菌したものを培地とし、これに当該
菌株を無菌的に接種した。

２８ｏｏ、４日間振トウ培養後、菌体を遠心分離によっ
て得、生理食塩水で洗浄後０．０１Ｍリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ７．４）に懸濁し、これを超音波破砕機にか
け、酵素を抽出した。

遠心分離後得られた無細胞抽出液に硫酸ストレプトマイ
シン溶液を最終的に０．４％（Ｗ／Ｖ）になるように添
加し、更に３母分間冷却しながらかく拝した後遼心分離
した。

上燈に硫酸アンモニウムを加え硫安６０％飽和（Ｗ／Ｖ
）にし３０分間冷却、損拝すると、酵素は沈澱物として
得られた。沈澱を遠心分離によって集め、０．０１Ｍリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解・し同じ緩衝
液で一夜透析して硫安を除く。透析内液を予め０．０１
Ｍリン酸カリウム緩衝液で平衡化させたＤＥＡＥ−ｓｅ
ｐｈａｃｅｌ■（ファルマシア社製）（ＤＥＡＥーセル
ロース）カラムに吸着させ、洗浄後、緩衝液濃度をグラ
ジェンターで連続的に増加させて港出を行った。本酵素
は上記緩衝液濃度０．１９Ｍ附近で溶出され、一方同時
に生産されるＤ−アミノアシラーゼは０．１Ｍ附・近で
溶出された。活性画分を０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝
液（斑７．４）で透析し、透析内液を凍結乾燥した。

これを予め上記緩衝液で平衡化したセフアデックス■Ｇ
−１００（ファルマシア社製）カラムでゲル滋過し、活
性溶出画分をダイアフ。‐■メンブレンＰＭ−１０（ア
ミコン社製）で濃縮した。これを予め０．０１Ｍリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したセフアデツ
クス■Ｇ−２ｏｏ（ファルマシア社製）カラムでゲル猿
過を行った。

活性溶出画分を集め、限外渡過膜で濃縮し、下記に示し
た条件でプレパラティブＤｉｓｃ鰭気泳動を行った。活
性区分を０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４
）に対して透析し、透析内液を精製酵素としてその諸性
質を検討した。この酵素標品は亀気泳動的に均一であっ
た。

尚、酵素活性は下記の方法で測定し、１時間にｌｒｍｏ
ｌのＬーバリンを生ずる酵素活性を１単位とした。活性
測定法：２５０ｈＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４
）１０一そ、１仇ｈＭコバルト５ムそ、５仇ｍＭＮ−ク
ロアセチル−Ｌーバリン２０ムそを混合し、酵素液及び
蒸留水を加えて液量を５０ムそに調整した反応液を３０
ｏｏ、１８分間反応させ、直ちにドライアイスーアセト
ン格で凍結させ、氷冷下冷却した５０％酢酸５０ｒ〆を
加えて反応を停止させた。

生じたＬ−バリンをニンヒドリン法で定量した。ニンヒ
ドリンによる定量はＹｅｍｍらの方法（小ａｌ鱗ｔ８の
萱２０９頁１９５３王）に準じて下記の様に行った。

反応液を蒸留水で２倍に希釈し、その内１００メタを分
析試料として用いた。分析試料１００ムそを小試験管に
取り小隊酸緩衝液（ＰＨ５．５）０．８ｈ夕、ＫＣＮー
ニンヒドリン溶液（ニンヒドリン０．５夕を５９の‘の
メチルセロソルブに溶かし、０．０１ＭＫＣＮＩの【を
添加したもの）１の‘を加え良く麹梓した後、ガラス玉
でフタをする。以上の操作を氷冷下で行い、操作完了後
直ちに沸騰水浴中に浸し１５分間煮沸した。冷却後５０
％ｎーブ０パノール３Ｍを加えて希釈し、良く渡洋した
後日立２００‐１０型分光光度計を用いて５７肌ｍで比
色定量した。標準液として０．１〜０．７ｍＭのＬーバ
リン溶液を用い、反応液中のＬーバリン量を定量した。
又、目的に応じては下記に示す薄層クロマトグラフィー
・デンシトメトリ法も合わせ用いた。

上記反応液２．５ム〆を、シリカゲル・プレートにスポ
ツトし、ｎーブタノール：酢酸：水＝４：１：１の溶媒
系で展開後、プレートを風乾し、０．０２Ｍニンヒドリ
ン溶液（ｐＨ５．０）中に浸し、１００℃、５分間発色
後、島津二波長クロマトスキャナ−ＣＳ−９１０を用い
てデンシトメトリーを行った。藤準液とし０．１〜０．
７ｍＭのＬーバリン溶液を用い反応液中のＬ−バリン量
を定量した。尚デンシトメトリーは発色後１８分以内に
完了する様にした。本酵素はＬ−アミノ酸のＱ−ァミノ
基のＮーァシル誘導体（フオルミル、アセチル、クロロ
アセチル、グリシル、ベンゾイルなど）を特異的に加水
分解しＬ−アミノ酸と当該脂肪酸を生ずる酵素で下記の
性質を持つ。【１’熱安定性：酵素をｐＨ７．４のリン
酸カリウム緩衝液中で、１８分間各温度で処理した後、
残存活性を測定した。

図に示す如くｐＨ７．４６０℃の処理で９０％以上失活
した。（第１図）‘２１ 反応温度（冊７．４）：他の
アシラーゼと同様、失活限界ほぼ６０℃まで相対活性は
増加した。

（第２図）‘３１ｐＨ安定性：酵素液をｐＨで５℃一夜
放置した後、残存活性を測定したところ、ｐＨ６．郭付
近で最も安定であった。

（第３図）‘４１反応恥：温度３０℃で種々のｐＨで反
応を行った結果、軸７．巡付近が反応の至薄ｐＨであっ
た。

（第４図）■ 分子量：セフアデツクス■Ｇ−２ｏｏ（
ファルマシア社製）を用いてゲル猿過法により分子量を
測定した。

本酵素の分子量は約７５０００であった。尚、標準蛋白
としてチトクロームＣ（分子量１２５００）、キモトリ
ブシノーゲンＡ（分子量２５０００）、鶏卵アルブミン
（分子量４５０００）、牛血清アルブミン（分子量６７
０００）、ウサギ筋肉アルドラーゼ（分子量１斑０００
）、ウシ肝臓カタラーゼ（分子量２４００００）を使用
した。

【６１等電点ＬＫＢ８１０１カラム（ＬＫＳ社製）０．
８アンフオラィン■（ＬＫＢ社製）を用いて４℃、３０
０Ｖ、４劉時間通電後１．５の【ずつ分画して等電点を
求めた。

本酵素の等露点はｐｌ＝５．４５であった。‘７’Ｄｉ
ｓｃ電気泳動：７．５％ポリアクリルアミドゲル（ｐＨ
８．９）、トリス・グリシン緩衝液（餌８．３）の条件
で４℃、２ｒＡ／ゲル通電後、ゲルを取り出し、泳動方
向と平行にゲルを二分し、一方を染色、一方を活性測定
して鍬敷位贋を求めた。

本酵素のプロモフェノールブル−に対する相対移動度は
ＲｍＢＰＢ＝０．５７であった。【８’元素分析：上記
電気漆動の条件で活性区分を集めゲルを蒸留水中でつき
くだいて酵素を抽出した。それを蒸留水に対して一夜透
析し、透析内液を蒸発乾固して元素分析を行い下記の組
成を得た。Ｃ：５２．２６％，Ｈ：７．２３％，Ｎ：１
５．７５％‘９）金属イオンの影響：礎準反応液のＣｏ
十ナィオンの代りに種々の金属塩を添加して活性を測定
した。

Ｈｇ＋＋，ＣｕＨイオンによってて著しく阻害され、Ｃ
ｄＨ，ＳｎＨイオンでもｌｍＭの濃度で５０％程度の阻
害を受けた。又Ｎｉ＋十イオンにゆるやかなＣｏＨイオ
ンに多大の賦活効果が見られ、その至通濃度はｌｍＭで
あった。（第２表）第２表こ金属イオンの影響００ 阻
害剤等の影響：酵素液を各種阻害剤と、３０℃，１３分
間放置後、活性を測定した。

キレ−ト剤であるＥＤＴＡによって著しい阻害を受けた
。又、ＳＨ阻害剤であるＰークロロ水銀安息香酸でも阻
害を受けたが、Ｎーェチルマレィミド、モノョード酢酸
では阻害されなかった。（第３表）第３表 阻害剤
などの影姿費 （１１）基質特異性：各種アミノ酸のＮ−アシル誘導体
を基質として酵素活性を測定した。

Ｎ−ァセチルーＬーメチオニンを１００とした相対活性
を表に示した。（第４表）第４表 基質特異性 アシル基の種類としてはクロロアセチル＞フオルミル＞
ァセチルの順に加水分解されやすいと思われる。

本発明に使用できる微生物はフアカルタティブ（ｆａｃ
山ｔａｔｉｖｅ）にメタノールを資化し、Ｌーアミノア
シラーゼ生産能を有する菌株であればいずれの菌株でも
使用できるが、代表例としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．１１斑 ， Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａ
ｍｌｎｏｖｏｒａ瓜ＮＣＩＢ９０３９などがあげられる
。

Ｌーアミノアシラーゼ生産菌の培養は通常の栄養源の存
在下で行われるが、必要に応じて酵素生産誘導物（Ｌ−
アミノ酸及びその誘導体などがあげられる。）や安定剤
として塩化コバルトなどを添加しても良い。培養はｐＨ
５〜８の範囲で可能であるが、ｐＨ６〜７の範囲が好ま
しい。培養温度は２０℃〜３７℃、好ましくは２８〜３
０ｑｏの範囲で行われ、通気濃伴を行う必要がある。本
酵素は主に菌体内に生産されるので、通常の方法で菌体
を回収し酵素源とする事が出釆る。

抽出及び精製には通常、酵素に対して用いられる方法を
使用できる。即ち繭体を種々の物理的方法で破砕、又は
リゾチーム等で溶菌して酵素を抽出し、凍結融解ストレ
プトマイシン、ブロタミンなどによる除核酸処理、硫安
分画などで精製し、更に必要ならばＤＥＡＥーセルロー
ス、ＤＥＡＥーセフアデックス■などによるゲル吸着ク
ロマトグラフィー、櫨週などにより精製出来る。又連続
反応を行うには菌体より抽出、精製した酵素を通常の方
法で固定化しても、使用できる。即ちＤＥＡＥ−セルロ
ースなどによるイオン吸着、或いはポリアクリルアミド
ゲルによる包括などの固定化法が用いられる。以下本発
明を実施例により具体的に説明するが、これらの実施例
によって本発明が限定されるものではない。

実施例 １ グルコース２％、フアルマメデイア■（トレイダース・
オイル・ミル社製）０．８％、コーン・ステイープ・リ
カー０．５％、の熱水抽出液（ｐＨ７．０に調整）１０
０の【を含む５００の上客ェルレンマィャ−・フラスコ
１０本を１２０℃、１５分間殺菌し、冷却後ＰｓｅＭｏ
ｍｏｎａｓｓｐ．１１斑株のスラント培養物の一部を無
菌的に接種した。

フラスコを２び○、２日間猿トウ培養しこれを種母とし
た。同様の渚地組成、操作で５００の【客ェルレンマィ
ヤ−・フラスコ５００本を作成し、上記種母フラスコか
ら各２叫当り種母を添加した。

添加後、フラスコを２８℃、４日間振トウ培養した。フ
ラスコ内容物を集め、０００、１０００仇ｐｍ、１５分
間の遠心分離により菌体を分離し、生理食塩水及び０．
０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した
。得られた洗浄菌体（湿重量１００夕）を０．０１Ｍリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）５００の‘に懸濁し
、超音波破砕機（トミー糟工社製ＵＲ−２０解）で６０
ＷＩ分間の処理によって細胞を破砕し、合計１粉ご間処
理した。処理液を０℃．１０００仇ｐｍ３ひげ間遠心分
離し透明な上情を得た。細胞固形分は０．０１Ｍリン酸
カリウム緩衝液３００叫に懸濁し、同様な処理で超音波
破砕を行った。１度目の上情と２度目の上清とを合わせ
無細胞抽出液総０の‘を得た。

この無細胞抽出液に含まれるＬ−アミノアシラーゼ活性
は約８５０山単位であった。因みにＤ−アミノアシラー
ゼ活性はＮ−クロロアセチルーＤーバリンを基質とし１
時間に１山ｍｏｌｅの○ーバリンを生ずる酵素活性を１
単位とすると約３００の単位含まれていた。実施例 ２
実施例１で得られた無細胞抽出液８３０の‘に、硫酸ス
トプトマィシン３夕を５の‘の蒸留水に溶解し餌７に調
整した液を冷却、縄拝しながらゆっくりと加えた。

全量添加後更に３０分間縄拝し０℃，１０００比ｐｍ３
０分間遠心分離して透明な上清８００の上を得た。この
上清に、乳鉢で粉末状に挽いた硫酸アンモニウム３１２
夕を冷却、燈拝しながらゆっくりと加えた。全量添加後
更に３０分間蝿梓を続け、生じた沈澱を０℃，１０００
仇ｐｍ３０分間の遠心分離によって得た。沈澱を０．０
１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、同
じ緩衝液５Ｚ‘こ対して３時間透析し、更に同じ緩衝液
１４ＺＩこ対して一夜透析した。透析内波を０℃，１０
００伍ｐｍ１５分間遮心分離して透明な上清１７０の‘
を得た。この上清に含まれるＬーアミノアシラーゼ活性
は約５５００単位で、比活性（たん白ｌｗｏ当りの酵素
単位）は無細胞抽出液の０．４１単位／奴に対して１．
３１単位／駁と約３２倍に上昇した。因みにＤーアミ／
アシラーゼ活性は実施例１と同様の酵素単位で約１５０
山単位含まれていた。尚、蛋白の定量はＫａｌｂらのＵ
Ｖ法（ＡＭＩＢｉ比ｈｅｍ．８２巻 ３６１頁 １９７
７年）を用いて行い、次式により算出した。

蛋白ｒ夕／舷＝１８３×Ｌ約一７５．８×ん６ｏん３ｏ
，Ａ側はそれぞれ２３仇ｍ，２６仇血での吸光度を示す
。

実施例 ３ 実施例２で得られた粗酵素液１７０Ｍを予め０．０１Ｍ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化させたＤ
ＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ■（ファルマシア社製）カラ
ム（５弧×６０弧）に吸着させ、６００の‘の０．０２
Ｍリン酸カリウム緩衝液（冊７．４）で洗浄した後、緩
衝液濃度を０．０８Ｍから０．２Ｍまで直線的に増加さ
せて溶出を行った。

Ｌーアミノアシラーゼは緩衝液濃度０．１９岬付近で溶
出され、一方Ｄ−アミノアシラーゼは０．１Ｍ附近で溶
出された。Ｌ−アミノアシラーゼの活性区分を集めて、
０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１４夕
に対して一夜透析し、透析内液を凍結乾燥した。ここに
含まれるァシラーゼ活性はＬーアミノアシラーゼ活性の
みで約３０００単位であった。又、比活性は１０．１単
位／奴となり無細胞抽出液から約２５割こ上昇した。実
施例 ４ 実施例３で得られた凍結乾燥粉末を０．０１Ｍリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．４）２の‘に溶解し、同じ緩衝
液５そに対して３時間透析後、予め同じ緩衝液で平衡化
させたセフアデックス■Ｇ−ｌｏｏ（ファルマシア社製
）カラム（２仇×６０仇）でゲル渡週を行った。

活性区分を集めダイアフロー■メンブレンＰＭ−１０（
アミコン社製）を用いて濃縮し、これを予め０．０１Ｍ
リン酸カリウム緩衝液（冊７．４）で平衡化させたセフ
アデツクス■Ｇ−２ｏｏ（ファルマシア社製）カラム（
２．５仇×５瓜〆）でゲル穣週を行った。活性区分を集
め精製酵素とした。この精製酵素にはＬ−アミノアシラ
ーゼ活性約２８０■単位が含まれ、比活性は６２．４単
位／ｗｃ（無細胞抽出液から１５ｑ昔）であった。実施
例 ５ 実施例４で得られた精製酵素についてディスク・ゲル電
気縁動を行った。

ゲルの調製は仇船ｔｅｉｎ‐Ｄａｖｉｓらの方法に準じ
て行い、７．５％ポリアクリルアミド、ＰＨ８９ ４肋
×４．５伽の分離用ゲル及び２．５％ポリアク・リルア
ミド、ｐＨ６．９の濃縮用ゲルを作製した。

緩衝液はトリスーグリシン緩衝 液 ＰＨ８３（ Ｔｒ
ｉｓ（ ｈｙｄｒｏ奴ｍｅｔｈｙｌ ）ａｍｌｎｏｍｅ
ｔ舷ｎｅ）（６夕、グリシン２８．８のこ蒸留水を加え
てＩＺ‘こしたものを用い、実施例４で得られた精製酵
素１００ムそと４０％シュクロース１００ムクを混合し
た液を濃縮用ゲルの上に添加し泳動を行った。泳動は４
℃、２ｈＡ／ゲルの条件で行いマイナス側の緩衝液にブ
ロムフェノールブル一を添加して泳動の指標とした。泳
動終了後、ゲルを取り出しカミソリで泳動方向に平行に
ゲルを二分し、一方をアミノブラック１船で１時間染色
した。

その後余分な色素を７％酢酸で脱色したところ図の様に
３本の染色された帯が任められたので、残りの半分のゲ
ルについて、染色帯に相当する所を切り取り、下記の方
法で活性を測定した。活性測定法：切り出したゲルを０
．２９ＭＩＪン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１００
Ａ〆に浸し４００、一夜放置後、２５一その１肌Ｍ塩化
コバルト、１００〃その５仇Ｍ Ｎ−クロロアセチル−
Ｌーフエニルアラニンを添加し、３ぴ０，１時間反応さ
せた。

反応後２分間煮沸して反応を停止させ、冷却後その２．
５ム〆をメルク・キーゼルゲル・プレート（メルク社Ａ
ｎ．５７１５）にスポットし、ｎ−ブタノール：酢酸：
水＝４：１：１の溶媒系で展開後、プレートを風乾し、
ニンヒドリン溶液を贋奏して１２ぴ○、５分間発色させ
た。酵素活性を持つ反応液のみＬーフェニルアラニンの
スポットを与えた。以上の方法により本酵素のブロムフ
ェノールブル一に対する相対移動度は０．５７と決定し
た。

第５図は本酵素の亀気泳動のバンドを示す図で、図中１
は濃縮用ゲル、２は分離用ゲルを示し、３はＬ−アミノ
アシラーゼ、４，５は不純物蛋白、６はＢＰＢのそれぞ
れバンドを示す。実施例 ６実施例１及び２，３と同様
な方法で ＰｓｅＭｏｍｏｎａｓａｍｌｎｏｖｏ畑ｎｓＮＣＩＢ９
０３９珠からＬ−ァミノアシラーゼ溶液を得た。

これを実施例５と同様な方法でディスク・ゲル電気泳動
を行し、泳動位置を求めた。本酵素のブロムフェノール
プル一に対する相対移動度は０．５７であった。実施例
７実施例１と同様の培地５０の‘を含む２５０私客ェ
ルレンマィャーフラスコを実施例１と同様に殺菌後ねｃ
ｕｌｔａｄｖｅにメタノールを資化する菌株類を接種し
、２８午０、４日間振トウ培養した。

培養液を冷却下１０００仇ｐｍ、１８分間の遠心分離し
、得られた菌体を０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（冊
７．４）で洗浄後、同じ緩衝液１の‘に懸濁した。懸濁
液を超音波破砕機で６０Ｗ、１分間の処理をし、０００
，１０００仇ｐｍ、３０分間の遠心分離により各々の菌
株の無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液７５〃そ，
０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（冊７．４）５０〃〆、
１仇ｈＭ塩化コバルト２５ムそ，５伽Ｍ Ｎークロロア
セチルーＬーフエニルアラニン１００〃〆を混合し、３
ぴ○、１時間反応させ、２分間の煮沸によって反応を停
止した。同様にして基質をＮークロロアセチルーＤ−バ
リンとした反応も同時に行った。これらの反応液をメル
ク・キーゼルゲル・プレートにスポットし、ｎ−ブタノ
ール：酢酸：水＝４：１：１の溶媒系で薄層クロマトグ
ラフィーを行った。プレートを風乾後ニンヒドリン発色
により、フエニルアラニン及びバリンのスポットを与え
る株、即ちＬーアミノアシラーゼ及びＤーアミ／アシラ
ーゼ活性を与える株を検索した。その結果は第１表のと
おりである。実施例 ８ 実施例４で得たＬーアミノアシラーゼ溶液１ｏｗ‘（９
００単位）を予め０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液で平
衡化させたＤＥＡＥ−セルロース（ブラウン社製）カラ
ム２の‘に吸着させた。

カラムを同じ緩衝液で洗浄後、活性を測定したところ２
０３単位／私の残存活性があった。（固定イリ技率４５
％）

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素の熱安定性を示し、第２図は反応温度を
示し、第３図は、軸安定性を示し、第４図は反応ｐＨを
示す図で、何れも縦軸は本酵素の相対活性を％で示す。 第５図は本酵素の電気泳動のバンドを示す説明図である
。第１図 第２図 第３図 第４図 第５図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ フアカルタテイブ（ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ）・メ
   タノール資化性細菌類が生産する次の性質を有するＬ−
   アミノアシラーゼ、（１）基質特異性；Ｎ−アシル−Ｌ
   −アミノ酸のアシル基を加水分解するアミノアシラーゼ
   、しかし、Ｎ−アシル−グルコサミン、Ｎ−アシル−エ
   タノールアミンには作用しない。 （２）安定性； 温度：５０℃で僅かに失活し、５０℃以上となると急激
   に失活し、６０℃で殆んと失活する（ｐＨ７．４，１５
   分間）。 ｐＨ：ｐＨ６〜７で安定。 ｐＨ５又は９となると活性は半減する（温度５℃、一夜
   放置）。（３）反応性： 温度：他のアシラーゼと同様、失活限界の６０℃までは
   温度と共に直線的に活性を増加し、６０℃以上となると
   急激に反応性を失う（ｐＨ７．４）。 ｐＨ：ｐＨ７〜８で反応性が高く、７．４で最高、ｐＨ
   ６及び９となると８０％となり、それより下又は上では
   急激に反応性を失う。 （温度３０℃） （４）分子量；７５０００（ゲル濾過法）（５）等電点
   ；＿ＰＩ＝５．４５（６）Ｄｉｓｃ電気泳動；Ｒｍ＿Ｂ
   ＿Ｐ＿Ｂ＝０．５７（７）元素分析（％）；Ｃ５２．２
   ６Ｈ７．２３ Ｎ１５．７５ （８）金属イオンの影響；Ｃｏ＾＋＾＋により賦活され
   、Ｎｉ＾＋＾＋により弛やかに賦活、Ｈｇ＾＋＾＋によ
   り弛やかに賦活、Ｈｇ＾＋＾＋，Ｃｕ＾＋＾＋により著
   しく阻害される。 （９）阻害剤；ＥＤＴＡによつて著しく阻害、Ｐ−クロ
   ロ水銀安息香酸でも阻害されるが、Ｎ−エチルマレイミ
   ド及びモノヨード酢酸では阻害されず。