JPS6018396B2 - 固定化ラクタ−ゼによる乳糖分解液の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化ラクターゼによる乳糖分解液の製造法に
関する。

より詳しくはアスベルギルス・オリーゼ（＄ｐｅｒｇｌ
ｌｕｓｏひｚａｅ）起源のラクターゼを共有結合により
固定化した固定化ラクターゼを用いてミルク類やホェー
類等の乳糖含有液中の乳糖を分解し、乳糖分解液を有利
に製造する方法に関する。ラクターゼ（８ーガラクトシ
ダーゼ）（酵素番号３、２、１、２３）は乳糖（ラクト
ース）をＤ−グルコースとＤーガラクトースに加水分解
する酵素である。

ラクターゼの工業的利用対象は大別すると二つある。一
つは乳糖不耐症者および弱耐症者のためにミルク中の乳
糖を分解して消化の良いミルクを製造することであり、
もう一つはホェー（乳嫌）中の乳糖を分解し、ホェーを
新しい甘味剤あるいは新しい飲食品原料として利用でき
る様にすることである。経済的に有利にかつ効率的に酵
素を利用するには酵素を固定化することである。

酵素を固定化すると、本来均一水溶液反応の触媒である
酵素を反復および連続使用することが可能になり、生成
物に酵素蛋白質が混入してしまう事もない。工業的利用
上優れた固定化ラクターゼが有すべき条件については、
天然基質である乳糖に対する分解力が高く、酸性ホヱー
、スイートホェー、還元ホェー等のホェ類および全脂乳
や脱脂乳（スキムミルク）等のミルク糖中の乳糖をそれ
ぞれのｐＨ値で分解でき、長時間の連続使用に耐えるこ
とによって高い生産性を与えると共に殺菌剤等の薬品に
対るする耐性も強いことなどが重要な条件となる。この
様な条件を満し真に優れた固定化ラクターゼの例として
本発明者らはアスベルギルス・オリーゼ起源のラクター
ゼをマクロ多孔性の両性あるいは陰イオン交換樹脂に共
有結合で固定化した固定化ラクターゼを開発し、開示し
て釆た。（例えば、特顕昭５４一１２７７５４号明細書
；特関昭５６−５１斑４号公報、および袴願昭５５一４
５０４４号明細書：特関昭５６一１４０８９び号公報）
アスベルギルス・オリーゼ起源のうクターゼは酵母起源
、大腸菌起源あるいはアスベルギルス・ニガー起源のラ
クターゼに比べて作用ｐＨ領域および安定ｐＨ領域が広
く、種々のホェー類およびミルク類中の乳糖に対してそ
の各々の餌において活性を有し、かつ耐熱性にも優れて
いる。従ってアスベルギルス・オリーゼ起源のラクター
ゼをこのラクターゼに適した固定化法でもつて固定化す
ると工業的利用上きわめて優れた固定化ラクターゼが得
られるのである。かくしアスベルギルス・オリーゼ起源
のラクターゼを共有結合により固定化した固定化ラクタ
−ゼを用いてホェー類あるいはミルク類等の乳糖含有液
中の乳糖を分解し、乳糖分解液を製造するに際して乳糖
含有液中の乳糖の濃度が通常のミルク類あるいはホェー
類中の濃度よりも高い濃度、すなわち７％ないし１６％
の状態で乳糖を分解すれば非常に有利であることを見し
、出し本発明を完成した。

すなわち、アスベルギルス・オリーゼ起源のラクターゼ
を共有結合により固定化した固定化ラクターゼによる乳
糖の連続または繰り返し分解反応時の固定化ラクターゼ
の寿命は、同一温度においては基質液中の乳糖濃度が高
くなると共に長くなることを見出した。

また固定化ラクターゼを乳糠液に浸潰して測定した熱安
定性すなわち活性が半減するまでの時間も同一温度では
乳糖濃度が高い程長い。また連続分解反応時における単
位時間当りのグルコース生成の絶対量も高濃度基質ほど
多くなる。従ってミルク類あるいはホェ−類中の乳糖の
分解をアスベルギルス・オリーゼ起源のラクターゼを共
有結合により固定化した固定化ラクターゼを用いて行う
場合は乳糖含有濃度を高くして行うのが有利である。自
然に得られるミルク類およびホェー類の乳糖濃度は産地
や調製条件によっていく分変るとは言え、通常約４．５
％ないし約５．５％の間であらるのが普通である。この
濃度よりも薄い濃度で用いることは実際上殆んどありえ
ない。通常の乳糖濃度で固定化ラクターゼの基質として
用いてもよいがより有利には通常のミルク類あるいはホ
ェー類中の乳糖濃度よりも高い濃度、すなわち約５．５
％よりも高い濃度の基質液を調製し、固定化ラクターゼ
による酵素反応に供するのがよい。乳糖濃度は高い程よ
いとは言え、乳糖の溶解度の問題もあり、また基質の乳
糖含有液は通常蛋白質その他の固形分を含んでいること
が多いから粘度も高くなりカラム反応の場合圧頃が大き
くなる。結局、最も好ましい乳糖濃度は７％ないし１６
％程度である。通常のミルクあるいはホヱーを乳糖濃度
が７％ないし１６％程度になるように波縮するかあるい
は還元ホェー、還元脱脂乳あるいは還元全脂乳等の粉末
を乳糖の濃度が通常の２倍ないし３倍程度、すなわち７
％ないし１６％程度になる様に溶解した液を基質として
用いるのが実際的である。１６％以上の高濃度で反応を
行っても本発明の趣旨に反しない事は当然である。

本発明の特定の方法は乳糖含有液が塩や蛋白質を殆んど
含まない乳糖液、脱塩ホェー、脱蛋白ホェーあるいは脱
蛋白脱脂乳等にも適用できる。

アスベルギルス・オリーゼ起源のラクターゼを共有結合
によって固定化した固定化ラクターゼは本来非常に安定
で連続反応時の寿命も長い。とりわけ低温では安定で半
減期は数年から１世軍程度になることがある。しかし、
高温で高い活性の状態で高い反応速度で用いると固定化
ラクターゼの安定性は低下し寿命は短くなる。

結局この様な反応条件の際に本発明における反応条件す
なわち高乳糖濃度における乳糖分解液の製造方法を適用
すると非常に意味深し、。具体的には本発明の方法は４
０℃以上、とりわけ５０℃程度以上の反応に対して特に
意義深い。酵素活性を有している限り温度の上限は特に
ないが、実際には６ぴ０より高い温度では急速に失活し
実用的意味は殆んどない。本発明が適用できるラクター
ゼはアスベルギルス・オリーゼ起源のラクターゼであれ
ば良く、すでに２、３市販されている。

そのなかで特に活性の至適ｐＨが母４．５なし、しＰＨ
５にあり、ＰＨ４．ふ３０℃において乳糖を基質に用い
た場合のミカェリス定数Ｋの＝０．１±０．０６ｈｏｌ
ｅ／そなる数値を有するアスベルギルス・オリーゼ起源
のラクターゼが工業的利用に非常に適している。固定化
された固定化ラクターゼが有意の活性を持っている限り
共有結合の方法には特に制限はない。これまでに公知の
共有結合法、または包括凝集法等いずれの方法による「
ラクターゼを共有結合で高分子化合物に結合させた固定
化ラクターゼ」も、ミルク類やホェー類等の様に高イオ
ン強度の基質液に用いた場合さえ、酵素の脱欧がなく工
業的な使用が可能である。

また、純乳糖液や、脱塩・脱蛋白ホェーの様にイオン強
度の低い基質液の場合には、公知の吸着法によって調製
された固定化ラクターゼも使用できる。共有結合法の特
に好ましい担体としてはアミ／基もしくは／および置換
アミ／基ならびにカルボキシル基を有するマクロ多孔性
フヱ／ールホルマリン系の両性イオン交灘樹脂、比較的
好ましい迫体としてアミノ基または／および置換ァミノ
基を有するマクロ多孔性のフェノールホルマリン系弱塩
基性陰イオン交換樹脂あるいは、アミノ基または／およ
び直換アミノ基を有するマクロ多孔性ポリスチレン系弱
塩基性陰イオン交擬樹脂等がある。また官能基として水
酸基のみを有する樹脂あるいは不溶Ｉ性多糖類も共有結
合法の坦体として利用できる。少くともアミ／基、また
は／および置換アミ／基ならびにカルボキシル基を有す
る高分子化合物を包括・擬築資材とし多官能性架橋剤で
この高分子化合物にラクターゼを共有結合しながら包括
・擬築した固定化うクターゼなども優れた性質を有し、
本発明の方法が有効に適用できる。上記の博捜アミノ基
は公知の通常一般のｒ共有結合法による固定イＱ酵素に
おける担体が有するもの」で十分である。乳糖の分解反
応方式には特に制限はなく、反応液を固体触媒に接触さ
せるという通常の反応方式で十分である。反応器システ
ムとしては回分式、カラム式およびそれらの変法等いず
れの方式でもよいが本発明において使用する固定化ラク
ターゼが通常粒子状であり、工業的製造規模を考嫌する
と、菱鷹のスケール、反応速度、操作性等の点から充填
床カラム反応器が最も有利である。

次に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するがそ
の趣旨を越えない限り以下の実施例によって限定される
ものではない。

なお実施例中に記載されている固定化ラクターゼの活性
測定は次の方法で行ったものである。０．０９Ｍ濃度の
酢酸塩緩衝液液（ｐＨ４．５）に溶かした１３．ＸＷ′
Ｖ）％濃度の乳糖溶液３０の‘に０．２の‘程度の固定
化ラクターゼを浸綾し、３０℃で１５分間往復振濠（１
０びｐｍ以上、猿中３．＆沫以上）しながら反応させ、
生成したグルコース土をグルコースオキシダーゼーパー
オキシダーゼ−色素系を用いて定量する。

１分間に１山ｍｏｌｅのグルコースを生成する酵素量を
１単位（１１ＬＵ）とする。

また固定化ラクターゼの乾燥重量は次の様に測定する。
すなわち、反応終了後固定化ラクターゼを炉別し、５０
ｑｏで８時間以上減圧乾燥した後１．虫篭間以上室溢（
１８〜２ｙＣ）のデシケーター中に放置後重量測定を行
い、恒量に達していることを確認した後この値を固定化
ラクターゼの乾燥重量とする。固定化ラクターゼの活性
はグラム乾燥重量当りの単位（ＩＬＵ／夕‐ＩＭは）で
表示する。なお特別の場合のみ体積当りの単位（ＩＭＬ
／泌‐ＩＭＬ）で表示した。実施例 １ イオン交換基としてポリエチレンポリアミン基とカルボ
キシメチル基を有するマクロ多孔性フヱ／ールホルマリ
ン系両性イオン交換樹脂（粒子径２５０山ないし８４０
ｒ）を迫体とし、この担体にアスベルギルス・オリーゼ
起源のラクターゼをグルタルアルデヒドによる共有結合
で固定化した固定化ラクターゼがある。

（活性８９０１ＬＵ／夕−ＩＭＬ）この固定化ラクター
ゼ９．５の‘づつを同じ大きさの３本の外套管付きカラ
ムに充填し、カラム温度を５５℃に保ちながら、乳糖濃
度を５％、１０％および１５％に調整したスキムミルク
液（ｐＨ６．６５）を各カラムに空間速度ＳＶ＝１皿ｒ
‐１で流下した。毎日の基質液通液時間を４時間とし、
その後は固定化ラクターゼの殺菌剤水溶液への浸糟によ
る殺菌と洗浄を行うというサイクルを２０日間続けた。
殺菌・洗浄による活性の低下はないことは別に確かめら
れている。第１日目の分解率は乳糖濃度５％、１０％お
よび１５％のスキムミルクに対して各々８９％、８０％
および６６％であった。この時のグルコース生成量は順
に４．２夕／ｈｒ、７．６夕／ｈｒおよび９．４夕／ｈ
ｒであった。１０日目で各々７７％、７５％および６３
％で２０日目は各々５９％、６０％および５９％であっ
た。

この時のグルコース生成量は順に２．８夕／ｈｒ、５７
夕／ｈｒおよび８．４夕／ｈｒであった。通常のミルク
中の乳糖度にほぼ等しい乳糖濃度５％のスキムミルクの
場合は２０日間の連続繰返し反応により、乳糖分解率は
８９％から５９％へと３０ポイント下がっているが、乳
糖濃度１０％および１５％のスキムミルクの場合には同
じ反応期間中に各々２０ポイントおよび７ポイント低下
しているに過ぎない。以上の結果から、通常のミルク中
の乳糖濃度にほぼ等しい乳糖濃度）この例では５％）よ
りも高い濃度で固定化ラクターゼによる乳糖分解反応を
行う方が固定化ラクターゼ活性の寿命が長く有利である
ことがわかる。

実施例 ２ 活性が９７０１ＬＵ／夕−ＭＬである以外は実施例１と
同じ固定化ラクターゼを９必ずつ同一の大きさの外套管
付きカラム２本に充填し、７％、および１４％の固形分
濃度に調整した還元ホェー液の不溶分を遠心分離（３０
０に）除去したホェ‐液（斑４．３）を５０午Ｃで１日
に１拍時間ないし１劉時間上向流で流した。

その後固定化ラクターゼの殺菌洗浄を行い、これを１日
の操作とし５０日間繰り返した。この連続反応において
は乳糖の分解率を２本のカラム共に８０％に保つ様にし
、活性が低下した場合には空間速度ＳＶを下げた。この
７％および１４％ホェー液の乳糖濃度は各々４．８％、
９．６％である。第１日目のＳＶは、７％ホェー液では
１８．靴ｒ‐１、１４％ホェ−液では１１．がｒ‐１で
あった。各カラム１時間当りのグルコース生成量は順に
約６．５２／ｈｒおよび約７．４２／ｈｒであった。こ
のカラム連続反応を５０日間続けた時のＳＶは各々１４
．紬ｒ−１および１０．仇ｒ‐１であり、この時の各カ
ラムのグルコース生成量は５．０夕／ｈｒおよび６．９
夕／ｈｒであった。実施例 ３マクロ多孔性のフェノー
ルホルマリン系弱塩基性陰イオン交換樹脂（粒子径２５
０りないし１０００〃）を坦体とし、この担体に共有結
合でアスベルギルス・オリーゼ起源のラクターゼを固定
化した固定化ラクターゼがある。

（活性：５０５１ＬＵ／夕‐ＩＭ山）このラクターゼ９
叫づつを同じ大きさの外套官付きカラム２本に充填し、
カラム温度を５４℃に保ちながら乳糖濃度を４．５％お
よび９％に調整したスキムミルク液（ｐＨ６．６５）を
各カラムに１日約１斑時間流下させた。分解率７５％保
つようにしたところ、流下のＳＶは第１日で４．５％の
乳糖濃度のスキムミルクに対しては６批ｒ‐１、９％乳
糖濃度のスキムミルクに対しては４．乳ｒ−１であった
。固定化ラクターゼの殺菌洗浄を毎日行いながら１日約
１糊時間のカラム反応を２０日間続けたところ２０日目
のＳＶは各々３．袖ｒ−１および３蝿ｒ‐１であった。
ＳＶの低下は固定ラクターゼの活性の低下を反映してい
るから、４．５％乳糖濃度のスキムミルクの場合に比べ
て９％乳糖濃度のスキムミルクの場合の方が２０日間に
おける活性低下割合は小さく、寿命は長いことがわかる
。実施例 ４ アスベルギルス・オリーゼ起源のラクターゼにアルブミ
ンおよびプルランをまぜて溶かした溶液にグルタルアル
デヒドを加え、この混合液をトルェンークロロホルム混
合溶媒系に滴下することにより得られた「包括凝集法に
より共有結合にて固定化したゲル型の固定化ラクターゼ
」がある。

（粒度：直径０．３肋ないし０．８凧、活性１８９ＬＵ
／泌−固定化ラクターゼ）乳糖濃度４．８％および９．
６％になる様に還元ホェー粉末を溶解した１００の‘の
還元ホヱー液（ｐＨ６．２）をガラス製反応容器中６０
℃に保ちつつ１０奴の固定化ラクターゼを投入し１２０
ＲＰＭ（振中４肌）で往復振動によって燈拝しながら５
時間反応を行なわせた。反応後ホェー液を炉遇し、各々
の濃度の新しいホヱー液を更に反応させるという操作を
３の司繰り返した。３ｍ団後の活性は、乳糖濃度４．８
％のホェー液では最初の２８％に、乳糖濃度９．６％の
ホェー液の場合は５５％に低下しているに過ぎなかった
。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アスペルギルス・オリーゼ起原のラクターゼを共有
   結合により固定化した固定化ラクターゼを用いて乳糖含
   有液中の乳糖を分解し乳糖分解液を製造するに際して、
   乳糖含有液中の乳糖の濃度が７％ないし１６％の状態で
   乳糖を分解することを特徴とする乳糖分解液の製造方法
   。