JPS5953424A - 抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、杭１匝瘍剤に関するものであり、更に詳しく
は、担子菌類由来の多糖を含む抗腫瘍剤に関するもので
ある。

近年、担子菌類由来の抗腫瘍に１物質が数多く報告され
ている。これらの多くは多糖類又は多糖を主体とする化
合物である。たとえば、カワラタケよりのクレスチン、
シイタケよりのレンチナン、スエヒロタケよりのシゾフ
イランは特に有名である。

レンチナン及びシゾフィランは、β−１，３−グルカン
を主鎖とし、１．６−結合でグルコースが分岐している
と云われている。クレスチンは糖を主体とする糖蛋白質
でその糖部分はα−又はβ−１，４結合を主鎖とし、３
又は６位で分岐したグル力／とされている。

また、同様な多糖でブクリヨウより希アルカリ抽出され
ろパヒマンは、一部β−１．６結合を含むβ−１，３グ
ルカンでグルコースの分岐を有するとされている。しか
し、パヒマン自体には抗腫瘍性が認められず、その分岐
を切断したパヒマランには抗腫瘍性が認められるｈ云う
（千原吾部著［癌と免疫増強」、１９６０年講談社発行
）。

これらのことは、これらの多糖の立体的又は化学的構造
がそれらの由来により微妙に異なるためであると推定さ
れろ。この意味で多糖の構造と抗胛胛性との関係は、ま
だ必ずしも明確ではない。

一方、ペスタロチアｆｊｉ　Ｋ　ＷＱする微化物の産生
ずる多糖はβ−１，３−グルカンの主鎖にβ−１，６−
結合でＤ−グルコピラノシル基及びＤ−グルコピラノシ
ル−Ｄ−グルコピラノシル基の側鎖の付いた構造である
とされているが、その側鎖の数は極めて多く、主鎖１０
０個当り約５５ないし約７５個であるとされている（特
開昭５６−３４７０２号公報）。

フクロタケＦｆ４に属する担子菌、キヌオオフクリタケ
、オオフクロタケ及びシロフクロタケからは水、低級ア
ルコール、低級ケトン又はエーテル等の溶媒による抽出
で抗腫ＪＩＳ性の多糖が得られることが知られている（
特開昭５７−３８７２３号公報）。

しかしその構造、物性等は全く知られていない。

本発明は、有効成分として本質的に式 ％式％（１） で表わされる第１のくり返えし単位、式で表わされる第
２のくり返えし単位及び式で表わされる第３のくり返え
しＱｉＴｅ（各式中、Ｇハはグルコピラノシル基を、「
シ字は結合位面を表わす）からなり、第１（式（１））
、第２（式（■））及び第５（式（Ｉ））の各くり返え
し単位の個数の和１００個当り、平均で第３（式（Ｉ）
）のくり返えし単位の］１＾１数が約４ないし約１２飼
で、第２（式（Ｉυ）及び第３（式（Ｉ））のくり返え
し単位の個数の和が同じく約１６ないし約２３個である
多糖類を含む抗腫瘍剤を提供するものである。

本発明の抗＋１’ｌｊ瘍剤の有効成分である多糖類の物
理的、化学的性質は以下の辿りである６＋１１　　溶解
性 アルカリ水溶液及びジメチルスルホキシドに可溶で、メ
タノール、エタノール、ｎ−ブタノール、アセトン、ベ
ンゼン、トルエン＋　酢酸エチル、プロピレングリコー
ル、ピリジン等に実質的に不溶である。

乾燥した本発明の多糖類は水に離溶性であるが、超音波
処理などの操作を加えろことにより、水に可溶化でとる
。

塩類水溶液にはわずかに溶ける。アルカリ水溶液に溶解
したのち中和すると溶解したままで残る。

（２）旋光度 本発明の多１唐類の０．５規定水酸化す）　ＩＪウム水
溶液（０５％）中での比旋光彦は、 〔α〕聞：約−１２゜ である。

注意深（充分に乾燥すると、Ｏｎ　Ｈ２ｎ　Ｏｎから計
算される値に近い値を与えるが、通常食間の水分を含有
し、 Ｃ：４３〜４５％ Ｈ：　ｓ　６〜＆４％ Ｎ：定・肝限界以下 稈度の値を与える。ハロゲン及び硫黄は検出されない。

（４）赤外線吸収分析 ＫＢｒ錠剤法による赤外線吸収スペクトルを第１図に示
す。

８９６ｃｍ−’における吸収はＤ−グルコース残１１〜
のβ−結合に特有なものである。

ＩＱＩ　　Ｏ”　−ＮＭＲ分析 ６１．４ にピークを示す。

（６１発色反応 アンスロン反応　　　二陽性 ニンヒドリン反応　　：陰性 ディシュのカルバソー西反応　：　陰性（７１分子情 濃度［Ｌ１モル／／、ｐＨａ６のトリス塙酸塩緩（ギｉ
液を移動相とするゲル濾過高速液体クロマトグラフィに
おいて分子州約３０万ないし約８０分の分画中に溶出す
る。

＋８１　　Ｌｍ　化セチルピリジニウムとの反応水溶液
中用化セチルヒリジニウムと沈殿を生成しない。

（９）構成糖類 本発明の多糖類を１規定硫酸水溶液中、１００℃で加水
分解した後、ペーパークロマトグラフィにより、及びア
ルジトールアセテートに訪導後、ガスクロマトグラフィ
により同定するとグルコースのみが検出される。

（ＩＩＮ　　結合構成 メチル化分析により、モル比で ２、４４．６−チトラーＯ−メチルグルコース２、４．
６−　）ジ−０−メチルグルコース約五７ないし約５．
０ ２．４４−トリー〇−メチルグルコース約０．３０ない
し約［＋５５ 及び ２．４−ジー０−メチルグルコース 約［１７ないし約１．３ を与える。

エキソ型のβ−１，３グルカナーゼを用いて酵素分解す
ると、グルコースとゲンチオビオースを生成する。

また、メタ過ヨウ素ナトリウムで充分に酸化し、水素化
ホウ素す）　ＩＪウムで還元後、緩和な条Ｖト、例えば
、α１ないし０．２１’ｌｌ定何１酸で、８０ないし１
００℃、１〜２時間程度加水分解すると側鎖に相当する
グルコース基の除去された直鉛状β−１，３グルカンが
得られる、１このものはメチル化分析で２．４．６−　
）リー０−メチルグルコースと痕跡にの２．４４．６−
テトラ−０−メチルグルコースな与える。この直鎖状β
−１，３−′グルカンをエキソ型β−１，６−グルカナ
ーゼでｒ１￥力分解するとグルコースのみが生成する。

従って、この多糖類の主鎖は実質上β−１．３−結合の
グルコース残基のみからなる。

これらのことからこの多糖類は、連続したβ−１，３−
グルコシド結合の主鎖よりなり、β−１，３−結合のグ
ルコース結合４〜６飼に１８Ｍの割合で、その６位にβ
−結合で主として単独のグルコース残基よりなる側鎖を
有するが、側鎖約３　（＋ｌ！ｉＩのうち１個はβ−１
，６−結合した２個のグルコース残基からなるものと認
められる。それ故、この多糖類の基本（〃Ｃ造は６１丁
述の一般式のくり返えし単位からなるということができ
る。

これらのことからこの多糖類は、公知のスクレログルカ
ン、シゾフィラン及びキクラゲ子実体からイｎられる分
枝型β−１，５−グルカンよりも枝分れの頻度が少ｆｒ
、　（、かつ分枝中にわずかのβ−１゜６−結合で２個
以上連続したグルコース残基からなる分枝をもつ多情で
ある。

また、ベスタロチア属の微生Ｉ吻のＮ生ずる多（１、＋
１と化べると枝分れの頻度が著しく小さい。

この多＄７．！ｉ　４Ｊｉは水で抽１１１されないから
特開昭５７−３８７２５号公報で開示された多糖とは別
の物質である。

本発明の抗腫瘍剤で用いる多Ｋｌ、１ＩＨ２は、フクロ
タケ屈に属する担子菌ｑ旦す１ｙｉθｌｌａ■↓９ａ−
９明入特にフクロタケをアルカリ水溶液で抽出すること
により容易に調製す４）ことができる。原料として用い
ろフクロタケは、その子実体及び菌糸体のいずれであっ
てもよい。そしてこれらは、生の状ｔ７ＩＨであっても
乾燥品であってもよい。抽出に序）たり原料をあらかじ
めｌ１ｎｎ断することは抽出効率をあげるために子「効
である。

抽出に用いるアルカ゛り水溶液としては、例えば水１１
８化すトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ全屈水酸
化物を用いることができる。特に水酸化ナトリウム水溶
液が便利である。

用いるアルカリの節度は特に限定的て°はないが、約［
１１月宝ないし約５１ＬＬ定の範囲内で用いるのが好ま
しい。抽出に用いるアルカリ水溶液の駁は、通常１回の
抽出当り、原料乾燥重用の約５ないし約１００倍Ｎｔ’
　Ｅ　ｌｅｔである。この甲は少なすぎれば抽出効率が
悪く、多すぎれば後処理がｍ１倒である。

この抽出工程においては、多糖の分解又は過酸化等の変
性を防ぐため、ゆ素等の不活性ガスの雰囲気下で抽出を
行うことが好ましい。またさらに、水素化ホウ素ナトリ
ウム等の還元剤の存在下で行ってもよい。

抽ＩＨｒＭＫ度には格別の限定はないが、約３０°Ｃ以
下が望ましい。さらに高活配、例えばつｉマ］常の熱ア
ルカリ抽出の湿度条件である６０ないし８０℃程度で抽
出すると、さらに多くの分岐を有する多糖類が抽出され
るからである。抽出ト■作はくり返えし行ってもよい。

本発明の抗腫ノら１削の多糖類の原料であるフクロタケ
も自己の生命を維持するための多くの成分をそのｒｉ１
体内に含んでいる。従ってアルカリ水溶液でそのまま抽
出すればｆ１１！々の夾雑物が目的の多糖類中に含まれ
てしまう。この抽出液から目的の多糖類を精製すること
は可能ではあるが、煩肩１な工程を必要とする。本発明
の抗１４１瘍剤で用いる多糖類は、水、アルコール等の
溶Ｉ１１．トでは抽出されないので、アルカリ水溶液で
抽出する工程に先立ち、水、熱水、緩衝水溶液、アルコ
ール又はこれらを１１１合せた溶媒により、これらの夾
や（１物を除去しておくことが好ましい。なお、この様
な１・ｆ１作によりアルカリ水溶液抽出の際、夾雑物と
なる蛋白中ｌ。

マンガノラクトン、グリコーゲン様多ＩＷｉ等を予めか
なりの程度除去することができろ。この様にして抽出を
行ったアルカリ水溶液は’　”＋４１’、ｉ；、酢酸等
の酸で中和する。通常、この状態では目的の多糖は、結
晶溶液中に溶解している。ついでこの？Ｙｊ液に塩化セ
チルピリジニウムなどの第四級アンモニウム塩を加えて
夾雑する酸性物質を不溶性沈殿として４１１出させる。

この化１１没は耐過、遠心分＋＋ａｔ等の通常の分離手
段により除去する。こうして得た上清液をそのまま又は
濃縮後、水で透析し、透析液を乾燥することにより目的
の多糖）：１１を得ろことができろ。第四級アンモニウ
ム塩による処理で得た上清液をそのまま又は濃縮した後
、これにアルコール。

ナセトンなどの沈殿剤を加え、得られた沈殿を所望によ
り水に対して透析し、乾燥して目的の多糖ｆ１”１を固
体としてイｎてもよい。その際の乾燥方法としては、減
Ｆ″Ｆ乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥等の適当な乾燥手段を
用いろことができろ。

本発明の抗１沖瘍剤はこうして？１＋られろ多糖ｇ１を
慣用の処方で含んでよい。例えば、必要に応じて助剤を
含有する生理食塩水に溶解して調製することができろ。

本発明の抗腫瘍剤は、レンチナン、シゾフイラン等の免
疫賦活剤と四桶、例えば静脈内に容易に投与することが
できる。他の抗１１ｉ）ｉ瘍剤と併用することもできる
。

原料調製例１ 風乾したフクロタケ子実体１００ｆをｐＨ１口のＥｌ　
Ｉ　Ｍ　＋７ン酸塩緩種１液１１に一夜漬した後、ミキ
サー及びホモジナイザーで破砕した。さらＫこれに同じ
リン酸塩緩衝液２１を加えて４時１１１目Ｗ拌し、遠心
分離した。得られた固形分を同じリンｌｌＰ塩緩衝液３
１に入れホモジナイザーで分散させた後、４時１１旧・
９を拌し、遠心分離し沈殿を得た。この沈殿を３１の水
に分散させ、オートクレーブ中、１２０℃で６０分間加
熱した。冷却後遠心分離して沈殿を得た。この熱水抽出
処Ｔ１１をさらに４回くり返えし、水溶性画分をほぼ完
全に抽出除去した。

こうして得られた水不溶性画分を、　水素化ホウ素ナト
リウム５ノを溶解させた１規定水酸化ナトリウム水溶液
５１に分１１＋させた。窒素気流下に２５℃で４時間攪
拌した後遠心分１’！ＩＰ、した。

この沈殿−に対して１規定水酸化ナトリウム７に溶液に
よる抽出操作をくり返えした。

雨水酸化ナトリウム抽出液を合併し、これを３ＮＩ塩酸
で中和し、ｐＨ６，５に調整した。

こうして得られた抽出液に塩化セチルピリジニウムミー
水溶液（１０％）を攪拌下に、その添加によって新たな
沈殿が生じなくなるまで滴下し、ツいで１０，０００Ｇ
で３０分１１ｆｌ　Ｍｔ　心外Ｆｉｌｔヲ行イ、生じた
沈殿を除去した。この上清に等容のメタノールを加えて
悄拌し、多糖類を沈殿させた。このｒｔｆＩＤを蒸留水
５００ｍεに加えホモミキサーで分散後、流水中に５日
間透析した。透析内液を凍結乾燥し、目的物１五〇？を
得た。

元素分析値 ０：４４．０５％ Ｈ：６．０５　　％ Ｎ：定借限界以下 比旋光度 〔α）ｕｓ：　　１２゜ 赤外吸１１’７スペクトル 第１図にＫ　Ｂ　ｒ　＠刑法による、フエリエ変換赤外
吸ｌ１ｌ（スペクトルを示す。

分子帯 口、ＩＭ、ｐＨａ６のトリス塩酸塩緩衝液を移ｎｔ））
相として、東洋曹達工業ｑ■すＧ５０ｏｏｐｗカラムを
用いたゲルＦＡ高速液体クロマトグラフィで分子■１約
６８万のリテンションタイムの（ｔ”’、　ＩＦ（に溶
出した。

□１ｍ−ＮＭＲ分析９発色反応及び塩化セチルピリジニ
ウムとの反応 前述した物理的、化学的性質と同じであった。

構成糖及び結合様式 得られた多糖をメチル化し、さらに加水分解した。得ら
れたメチル（目”、’ｉをアルジトールアセテートに誘
導した。これをガスクロマトグラフィで分析した。（ｉ
）　ｊ、れたメチル化糖のモル比は： ２、３．４．６−テトラ−０−メチルグルコース　１２
、４．６−　）ジ−０−メチルグルコース　　　３７６
２．４４−）ジ−０−メチルグルコース　　　０．３３
２．４−ジー０−メチルグルコース　　　　　１．０１
別にこの多糖をエキソ型β−１，５−グルカナーゼで酵
素分解した。グルコースとゲンチオビオースが４Ｎられ
た。

七〇モル比は前ニアｉ１モルに対して後者［１Ｌ１７７
モルであった。

さらに％ｓ　この多糖をメタ過ヨウ素酸ナトリウムで充
分罠酸化し、水素化ホウ素ナトリウムで僅元した。これ
をさらにα１　（”ｉｆ、　５’Ｆ−の硫酸中、１００
℃で２時間加水分解したところ、側鎖に相当するグルコ
ース基の除去された直鎖状のグルカンの沈殿が得られた
。この沈殿を同様にしてメチル化分析を行ったところ、
２，４．６−トリー　〇−メチルグルコースと痕跡量。

の２．５．４．６−テトラ−０−メチルグルコースを与
えた。また、この沈殿をエキソ型β−１，３グルカナー
ゼで酵素分解したところ、グルコースのみが生成した。

従って、イ＋ｆられた多糖は前述した式（■）。

（ｎ）及び（ＩＩ）のくり返えし学位からなり、その個
数の比がこれらのくり返えしＱ１位の合計の個数１００
個当り、式（組のくり返えし単ｆ＼１７１１ａ、式（Ｉ
Ｉ）のくり１区えし単位とべ（ＩＩＩ）のくり退Ｊ、Ｌ
卑ＩＬヒ の個数の和は２１個であった。

風刺潤製例２ アルカリ水溶液抽出の前の工稈を１τ科潤隼す例１と同
様にして行った後、抽出？昌度を２０　”Ｃに変えた以
外は原料調製（ｆｌｌ　１と同様にしてアルカリ水溶液
抽出を行った。イ［１られた抽出液を”Ｖ　ＩＩ？でｐ
Ｈ６，５にｈ！Ｍ整した後、原料Ｍ１．：Ｉ製例１と同
様にして１晃仕セチルピリジニウム水溶液（１０％）を
加え、生ずる沈殿を遠心分１’！ｆｔにより除去した。

上ｉ’ｒを２日間流水中に透４１ｒ　した後、透析内液
を３ぎにまで４０℃で減用下にｐＨ４縮した。これに等
容のメタノールを加え、生じた沈Ｅ１仕を１０．０００
　ｏで３０分間遠心分離した。この沈殿を５００　Ｔｎ
ｆ！のメタノールに顯え、約１時間かくはん遠心分ｐｉ
　Ｌ　、沈殿をイ遣トた。このメタノールによる洗浄を
さらに２度くりどえしたのち、沈殿を減圧乾１：％　ｔ
、、［１的ｌ吻１０．５２を得た。

こうして得た多糖について原ｆ４調製例１と回（壬にし
て分析を行った。

元素分析値 ｃ　：　４４．５１％ ＴＩ：＆１０％ Ｎ：定量限界以下 分子量 分子４約５５万の位置に溶出した。

メチル北壁のモル比： ２、３．４．６−テトラ−０−メチルグルコース　　１
２．４．６−）リーＯ−メチルグルコース　　　　４，
２６２．３．４−トリー〇−メチルグルコース　　　　
１１３２２．４−ジー０−メチルグルコース　　　　　
　１．０１エキソ型β−１，５−グルカナーゼ消化で得
られたグルコースとゲンチオビオースとのモルｌ七： ｊ：０．１６０ くり返えし単位の割合 合計個数１００個当り式（１呻のくり返えし単位６個で
、式（ｎ）のくり返えし単位と式（坤のくり返えし単位
の個Ｉ？の和は１９個であった。

その他の結果は原料：Ａ製例１で得た多糖の場合と実質
的に同一であった。

実施例１ 原料調製例１で得た多糖を生１！１１食塩水圧溶解して
抗＋ｈｒｉ　瘍剤を調製し、ＩｃＲマウス群でザルロー
フ１８０個型肺瘍に対する効果を試験した。

■ＯＲマウス１匹につキ、ザルコーマ１　Ｂ　Ｏｆ（Ｉ
Ｊ。

水癌細胞５×１０・個をそけい部課下に接神した。

実験群は６匹あてとした。癌細胞移植後、翌日より１０
日間、１日１回薬剤を腹腔内にＥｌ　ｌ　ｍｌずつ投与
した。試験群には本発明の抗腫瘍剤（Ｅｌ　Ｉ　ｍｅず
つ試験群に投与したとき第１表に示した投与６）になる
様に潤製したもの）を用い、対照群には生理食塩水のみ
を投与した。ル１！瘍移植後、３５日目上癌を摘出して
その１Ｉ−１７％を測定した。各群の肺ノ（“う抑制率
は次式によりｉ９−出した。

結果を第１表に示す。

本発明のＦｔｎ、腫瘍剤の急性毒性（ＬＤ、。）は腹腔
内投与で１０　ｍ！？７Ｆ＜９吋舒以上であった。

第　　１　　表 実施例２ 原料調製例１で得た多糖に代えて原利潤デ！例２で得た
多糖を用いて実施例１をくり返えした。

実施例１の場合とほぼ同様の結果が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の抗ル０瘍剤の原料として用いた多糖
類の赤外吸収スペクトルを示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ＋１１　　有効成分として本質的に式 １式％］ で表わされる第１のくり返えし単位、式で表わされる第
   ２のくり返えし単位及び式で表わされる第３のくり返え
   し単位（各式中、Ｇ／ｕはグルコピラノシル基を、また
   数字は結合位置を表わす）からなり、第１．第２及び第
   ５の各くり返えし単位の和１００個当り、平均で第３の
   くり返えし単位の１周ル゛Ｑが約４ないし約１２個で、
   第２のくり返えし単位と第６のくり返えし単位の個オ（
   ｆの和が同じく約１６ｔ「いし約２５飼である多糖イｒ
   ＋を含む抗腫瘍剤。 （２）　　多糖類がフクロタケ由来の多糖類であるｌ特
   許請求の範囲第１′ｆｎ記載の抗腫１＋＠剤。 （３）多糖類が、濃度０−１　モル／　ｌ　＋　ｐ　Ｈ
   ａ　６ノトリス塩酸塩緩衝液を移動相とするゲル濾過高
   速液体クロマトグラフィにおいて分子ｈ１約３０万ない
   し約８０万を与える多糖類である特許請求の範囲第１項
   または第２頂君已載の抗１匝ｊ易剤。 （４）多糖類が、メチル化分析により、２．Ｓ、４．６
   −テトラ−０−メチルグルコース、２，４．６−トリー
   〇−メチルグルコース、　２．５．４．−　）ジ−０−
   メチルグルコース及び２．４．−ジー〇＝メチルグルコ
   ースを２．５．４．６−チトラー〇−メチルグルコース
   を１としたとき、モル比で２、４．６−　）リー０−メ
   チルグルコース約３７ないし約５．０，２．へ４−トリ
   ー〇−メチルグルコース約［１３０ないし約０．５５及
   び２．４−ジー０−メチルグルコース約α７ないし約１
   ．５の割合で力える多糖類である特許請求の範囲第１項
   ないし第３項のいずれかの項記載の抗Ｊｌｊｒｉ瘍剤。 （５）　　多糖類が、アルカリ水溶液及びジメチルスル
   ホキシドに可溶で、メタノール、エタノール、ｎ−ブタ
   ノール、アセトン、プロピレングリコール、ベンゼン、
   トルエンｌピリジン及び酢酸エチルに実質的に不溶な多
   糖類である特許請求の範囲第１項ないし第４頂記載の抗
   腫瘍剤。 （６）　　多糖類が、フクロタケをアルカリ水溶液で抽
   出して得た多糖類である特許請求の範囲第１］ｒｊｙ：
   ｒ：いし第５項のいずれの項記載の抗１１ｉ１’ｔ　Ｊ
   ｒ。 剤。