JPS59502104A - 移殖可能な生物組織のカルシウム沈着を阻止するための界面活性剤による処理 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 移植可能な生物組織のカルシウム沈着を阻止するための界面活性剤による処理 発明の背景 生物組織のグｊレタールアルデヒド拠よる保存と、特にブタの人工生体心臓弁の 導入により、ａ）初期のホルムアルデヒＶ保存の移植組織弁の性能の悪さを克服 し、ｂ）同種移植片心臓弁の使用をやめ、Ｃ）特に子供において非生体（機械） 人工心臓弁の使用に関連した血栓塞栓症を防止するために必要ではあるが好まし くない抗凝固剤の使用を避けることが可能になった。

しかし他の類似の重要な発見と同様に、ゲルタールアルデヒド保存した人工生体 器官もジレンマが生まれた。

カーペンテイア（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ　）らの比較的生物学的に不活性なゲル タールアルデヒド保存した弁は多くの例においてずくれた長期耐久性を証明した が、組織の疲労やカルシウム沈着が起きやずいという問題が発生した。さらに機 械的人工心臓弁に必要な抗凝固剤の使用が不要になるであろうから、このゲルタ ールアルデヒド保存人工生体心臓弁により最大の恩恵を被るのは小児や青少年で あろうと初め考えられた。最近増え続けている臨床研究例の結果は、これらの組 織のカルシウム沈着が激しく、比較的短期間で使いものにならなくなるというこ とが、小児や青少年の間に広がっていることを示している。従って長期的な耐久 性や総合的に合併症の発症率が低いという利点があるにもかかわらず、このゲル タールアルデヒド保存した弁はｌド児の使用には不適であると考えている人もい る。

組織のカルシウム沈着というのは概して不明な点が多い。しかしカルシウム代謝 疾患、年令、食餌、組織成分（たとえばコラーケ゛ン）の退化、そして撹乱運動 などの種々の要因がある程度関与していることがこれまでに証明されている。最 近ゲルタールアルデヒド保存したブタの異種移植片の移植後に作られた、特異的 カルシウム結合アミノ酸（ガンマカルボキシグルタミン酸）の存在が証明され、 これがカルシウム沈着に関与していると考えられている。カルシウム沈着は、移 植組織のゲルタールアルデヒド処理コラーケゞン繊維の分解的変化を伴なうが、 委縮性のカルシウム沈着が組織の退化の原因であるのか結果であるのかは不明で ある。しかし移植組織のカルシウム沈着の原因究明の研究は続いて（・る。

本発明において発明者らは、移植生物組織のカルシウム沈着の程度を効果的に減 少させ、かつ移植心臓弁の尖頭の本来の血行力学的性質を維持する方法を開発し た。本法は移植組織のカルシウム沈着のし易さを低下させ、異種移植片心臓弁の 耐久性に関するいくつかの問題を克服するのに有効である。

ろ 発明の要約 本発明においては、移植後の生物組織のカルシウム沈着を軽減又は低下させるよ うに、移植前に組織を処理する方法の改良法を開示する。本法は移植後の生物組 織のカルシウム沈着を低下させるのに有効な量の界面活性剤を組織に接触させる ことより成る。

発明の詳細な説明 本発明に従うと、多くの動物や解剖体の一部から得られる種々の移植可能な生物 組織のカルシウム沈着を起こりにくくすることが可能であると考えられる。たと えば組織は、たとえば牛、ブタ、馬、羊、カンがルー、又はウサギなど（ただし これらに限定されるものではない）の種々の物から得られ、組織としては肺、靭 帯、心臓弁、又は（脳硬膜や筋膜のように）心臓弁を作るのに用いる組織などが ある。又皮膚移植、６膜移植、大動脈移植、そして鼓膜の移植など増加させるの に用いる組織も本発明に適していると考えられる。

本発明の好適な態様のひとつにおいては、ゲルタールアルデヒドで固定し次に界 面活性剤で処理したブタの心臓弁又は６膜組織をウサギの皮下に移植した。この 処理した組織は移植後のカルシウム沈着の軽減能又は低下能を予想外に有効に長 く維持していた。カルシウム沈着の軽減が長期間続くことは、移植組織（特に移 植心臓弁）の耐久性を増加させる方法を与える。

本発明にお（・ては、組織は通常の公知の条件により保存及び処理され、リン酸 緩衝液又はリン酸を含まない緩衝液（後述）巾約０．２−約０．６重量係、好ま しくは約０．５−約０．７重量％のゲルタールアルデヒドで通常に固定（硬化） される。特に明記しない限り通常公知の組織の取扱い条件は本発明には含まない 。さらに組織は０．６２５　％のゲルタールアルデヒド又は約４−約５係のホル ムアルデヒドで減菌し得る。

本発明の範囲内の有機界面活性剤としては、陰イオン性、陽イオン性、そして非 イオン性界面活性剤とそれらの塩がある。本発明の好ましい界面活性剤の塩には ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩及びハロケゞン化物がある。本発明 の非イオン性界面活性剤とは、脂肪族基、芳香族基、及び陰性荷電のイオン性基 に結合したそれらの組み合わせなどの、炭化水素残基の比較的大きな疎水性部分 を持つものである。脂肪族残基は分枝鎖、直鎖、環式、複素環式、飽和又は不飽 和テモよい。これらの疎水性残基はカルボン酸塩、硫酸塩、又はスルホン酸塩な との陰イオン性官能基に直接結合していてもよいし、エステル、アミド、スルホ ンアミド、エーテル、又はアリール基などの中間の結合を介して陰イオン性官能 基に結合していてもよい。

本発明のひとつの態様における陰イオン性界面活性剤は、ステロイドのアルギル 側鎖に結合したカル」ぐン酸を有するもの、又は側鎖のアミノ酸を介して結合し たカルボン酸を持つもの（たとえば胆汁酸）である。本発明の胆汁酸の例と、し てはデオキシコール酸、コール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココー ル酸及びそれらの塩があるが、これらに限定されるものではない。本発明者らが 見出した移植組織のカルシウム沈着の軽減に有効な好適な胆汁酸とその塩はデオ キシコール酸ナトリウムである。本発明の陰イオン性界面活性剤は、好ましくは 約８−約２０個の炭素原子を有する直鎖の脂肪族基に結合したカルボキシル基を 持つもの（たとえば脂肪酸のナトリウム塩）をさらに含む。

本発明のカルボキシル基を有する陰イオン性界面活性剤は、Ｎ−アルカノイルア ミノ酸やＮ−アセチル化アミノ酸のように、アミド、スルホンアミド、又はエス テル結合を介して疎水部に結合したカルボキシル基を有するものをさらに含む。

Ｎ−アルカノイルアミノ酸の例としては、式Ｒ１００’ＮＲ２ＣＨＲ３Ｃｏ；　 （式中Ｒよは好ましくは約８−約１８の炭素原子を有する脂肪族残基であり、Ｒ ２は水素又はメチルであり、Ｒ３は通常のアミノ酸側鎖である）を有する界面活 性剤をさらに含む（ただしこれらに限定されるものではない）。側鎖の例として はアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンそしてゾロリンの非極性脂肪族側 鎖、グリシン、セリン、スレオニン、シスチンなどの極性側鎖、そしてアブパラ ギン酸、グルタミン酸、リジンなどの荷電した極性基がある。本発明のこの態様 における好適なカルざン酸含有界面活性剤は、Ｎ−ラウロイルサルコシンのよう なアミド結合を含むものである。

本発明の別の態様の陰イオン性界面活性剤には脂肪族アルコールのエチレンオキ サイドで変化させた硫酸塩、硫酸塩化エタノールアミ「、又はアルキルフェソー ル（タトエハスルホン化アルキルフェニルエーテル）がある。陰イオン性界面活 性剤にはさらにアルカンスルホン酸やアルキルアリールスルホン酸がある。本発 明のアルカンスルホン酸には、イオウが疎水性残基に直接結合したもの（たとえ ば１−デカンスルホン酸）、又はエステル、アミｙ又はエーテルを介して結合し たもの（たとえばＮ−メチルタウリン）がある。アルキルアリールスルホン酸塩 とは、イオウがフェニル又はナフチルなどの芳香族環に直接結合し、一方これが 好ましくは約８−約１８個の炭素原子を有する疎水性残基に結合したものである 。後者の界面活性剤の例としてはドデシルベンゼンスルホン酸がある。

本発明の陽イオン性界面活性剤にはアルキル四級アミンやそのハロゲン化塩があ る。本発明の好適な界面活性剤には疎水性残基に直接、又はアミド結合を介して 結合した四級アミンの塩化物塩や臭化物塩がある。

このアミンはベンゼン、ピリジン又はナフチレンなどの芳香族残基；分枝又は分 枝してない、環状、飽和又は不飽和の脂肪族鎖；又は芳香族残基と脂肪族残基の 組合せを有する比較的大きな疎水性部分に直接結合していることが好ましい。ア ルキル四級アンモニウム界面活性剤の例としては、塩化セチルピリジニウム、臭 化デシルトリメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニラなど があるが、これらに限定されるものではない。

本発明の非イオン性界面活性剤には、ポリオキシアルキレンエーテル、ポリオキ シアルキレンアルキルアリールエーテル、脂肪族エステル、ポリエーテル、ポリ オキシアルキレンエステル誘導体、糖類エステル誘導体、及びこれらの組合せが ある。非イオン性ポリオキシアルキレン（好ましくはポリオキシエチレン）エー テルとは、比較的長い疎水性残基とひとつ又は２つ以上の酸化アルキレン残基に 結合したヒドロキシル末端を有するものである。ポリオキシアルキレンエーテル の例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（Ｂｒ１ｊ　）　、７％　 ＩＪオキシエチレンオレイルエーテル、＆　ＩＪオキシエチレンセチルエーテル などがある。非イオン性ポリオキシアルキレン（好ましくはポリオキシエチレン ）アルキルアリールエーテルとは、比較的大きな疎水性残基と、アリール（たと えばベンゼン又（まナフタレン）やひとつ又は２つ以上の酸化アルキレン残基に より、その疎水性残基に結合したヒドロキシル末端を有するものである。ポリオ キシアルキレンアルキルアリールエーテル リコールｐーインオクチルフェニルエーテルばトリトンＸ−１００）などがある 。非イオン性ポ１ノエーテルとは式Ｃ！Ｈ３（ＯＨ２）Ｎ−〇−（Ｃ２Ｈ４０） Ｍ　（式中Ｎは約１１であり、Ｍは約２６である）を有するものである。

非イオン性脂肪族エステルには、脂肪族脂肪酸エステル、ポリゾロぎレンゲリコ ール脂肪酸エステル（たとえばモノステアリン酸プロピレングリコール）、そし てグリセロール脂肪酸エステル（たとえばモノステアリン酸グリセロール）があ る。脂肪族脂肪酸エステルとは、式Ｒ４Ｃ００Ｒ５（式中，Ｒ４は好ましくは約 ８−約２０個の炭素原子を有するアルキルであり、Ｒ５は１−約５個の炭素原子 を有する脂肪族残基である）を有するものである。糖類及びポリオキシアルキレ ンエステル誘導体とは、前者に５炭糖又は６炭糖を有し後者にポリオキシアルキ レン鎖を有しており、エステル結合を介して比較的長い疎水性残基に結合して（ ・るものである。糖類誘導体の例としては、ソルビトールが脂肪酸に結合して、 トリオレイン酸ソルビトール、ステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸゛ノル ぎタンなどを形成しているものがある。ポリオキシアルキレンエステル誘導体に は、モノオレイン酸ポリオキシエチレン、モノステアリン酸ポリオキシエチレン などカニある。本発明において有効と見出されたポリオキシアルキレンエーテル 誘導体とソルビトールエステル誘導体の組合せには、モノオレイン酸ポリオキシ エチレン（２０）ソルビタン（　ＤＩＦＣＯの製造しているポリソル９ ベ−）−８’０、ツイーン−８０）のようなポリオキシエチレンソルビタン脂肪 酸誘導体がある。

本発明において界面活性剤の有効濃度はその分子量により若干変化するが、好ま しくは約０．１−約ｉ０％（Ｗ／Ｖ　）であり、さらに好ましくは約０．５−約 ５係である。最も好ましい界面活性剤の濃度は約０．５−約１．５係である。組 織の界面活性剤による処理は、固定化（硬化）工程の時、滅菌工程の時、又は固 定化のあとと滅菌の前で別々に実施され、そして約２−約６０時間、好ましくは 約６−約２４時間実施される。

本発明の好適な態様においては、組織は約２０　’Ｃ−約４０°Ｃの温度で界面 活性剤で処理ずろ。ある態様においては界糧活性剤は滅菌段階に含ま第１、その 崩効性は室温（２０°Ｃ）以」二の温度で約３０−４０　°Ｃの範囲まで上昇す ることがわかっている。

本発明においては、組織安定化ＰＨ％すなわち組織成分に対し無害なＰＨの範囲 で、組織を固定、保存、及び滅菌をすることが好ましい。好適なＰＩ］の範囲は 約７．０−約７．６であり、さらに好ましくは約７，１−約７．４であり、本発 明において最も好ましいＰＨは７．ろてあ、る。

本発明の態様に使用さ」１．る緩衝液は、安定で、安定化工程と相互作用はぜず 、特に組織の固定時に許容できるＰＨを維持できるたげの充分な緩衝能を有する ことが好ましい。選ぶべき適当な緩衝液とその濃度は個々の組織の固定化条件に より異なり、いくつかの製造業者が異なる方法を採用している。緩衝液は通常の ０．０１−０．０２　Ｍのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢｓ）、又は０．１−０ ．２　ＭのＰＢＳよりもリン酸の含量１７）少な（・リン酸欠乏溶液でもよく、 好ましくは約０．００１−約０．００２　Ｍリン酸以下のものである一本発明の 好適）ｓ緩衝液としてはボヴ酸緩衝液、炭酸緩衝液、重炭酸緩衝液、カコジル酸 緩衝液（勅装置おいて毒性がない）、及び他の合成、人丁、又は有機緩衝液、た どえばＨＥＰＥＳ　（Ｎ−２−）ニトロキシコーチルビペラジン−Ｎ′−２−エ タンスルホン酸）、ＭＯＰＳ　（２−（Ｎ　−’Ｅルホリノ）ゾロパンスルホン 酸）、そしてＰＩＰＥＳ　（ｉ　、　４−ピペラジンジー丁、タンスルホンｂ史 ）がある３、本発明に使用する緩；菊敲又は非ｇ衝液は、ゲルタールアルデヒド Ｊ）ような固定化剤により与えられる組織の安定化工程を妨害しないことが好ま しい。１寸なおちそれらが固定化剤と反応しｊｌす、固定化剤にＪ、る組織の正 しい同定化を妨害したりしてはいげな（・６１、−の例としてばトリス（ヒドロ キシメタン）アミノエタン（トリス）のような−級及び二級７−ミンを含有する 緩衝で夜があり、これはゲルタールアルデヒドやホルムアルデヒドのアルデヒド 基と反応することが知られており、従って通常の組織安定化工程を妨害する。

本発明を以下の例により説明するが、これらに限定されるものではない。

ＰＢＳ　（塩化ナトリウム０．８８５重量％）の等張（２８５＋１５ミリオスモ ル）液でＰＨ７，３、約４°Ｃで完全に洗い、液を大量にかける。そして等張の リン酸緩衝液（ｐｔ（７，４）中の０．６２５重量％のゲルタールアルデヒド中 室温で固定する。

例２　抽出したブタの大動脈心臓弁組織を、０．５１７７１のＮ−２−ヒドロキ シエチルピペラジン−Ｎ／　−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ　）のすトリ ウム塩と０．８８５重量％の塩化ナトリウムを含有する等張（２８５−１−１５ ミリオスモル）液（ｐＨ７，３）巾約４°Ｃで完全に洗い、液を大量にかげる。

そして５．３９　ｇ／ｌのＨＥＰＫＳのす１・Φリウム塩（０，０２Ｍ　）、［ １，，４４０重量％の塩化ナトリウム、そして２．６　ｇ／　ｔのＭｇＣｌ２・ ６Ｈ２０を含有する等供液中０．６２５重量％のゲルタールアルデヒドで室温で 固定する。

例３　例１の抽出組織を４　＋０．４　％のモノオレイン酸ソルビタンポリオキ シエチレン（ツイーン−８０）を含有する０、０２　ＭのＰＢＳ　（０，８８５ 重量％の塩化ナトリウム）（７１］ｍｌ中６平方インチの組織）（ｐＨ７−６） 中３５°Ｃでさらに安定化する。２４時間後この溶液から組織を取り出し、０． ０２　Ｍ　ＰＢＳ中０．６２５係のゲルタールアルデヒドで１０分間ずつ４回洗 い、発育期のつ、ザギの皮下に移植する。この弁組織を正確に１週間隔で６週後 まで取り出した。取り出した後原子吸光分析法で乾燥組織中のカルシウムの重量 類を定量的に追跡し、又Ｖｏｎ　Ｋｏｓｓａ　染色【−１た組織のカルシウム沈 着の程度を目で追跡することにより組織学的蹟、カルシウム沈着の程度を測定し た。組織ｑ的及び定量的結果共に、ツイーン−８０を加えな（・以外は基本的に 全ての詳細な点においてここに記載したのと全く同じ方法で処理した弁組織に比 較し、移植した弁組織はカルシウム沈着が有意に低下していたことを示している 。

例４　例２の抽出組織を４４−０．４　％ホルムアルデヒド、２２．５係のエタ ノール、０．２６　ｇ／ｌのＭｇＣｌ２・６Ｈ２０を含有する０、０２ＭのＨＥ ＰＥＳ　（５，ろ９９／ｌのナトリウム塩）緩衝化生理食塩水（７０ｍＬ！中ろ 平方インチの組織）中ＰＩ−（７，ろ、ろ５°Ｃでさらに安定化させた。２４時 間後に組織を取り出し、Ｑ、［］　２　Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水中０． ６２５　係のグルタ−ルアルデトードで１０分間ずつ４回洗い、発育期のウザぞ の皮下に移植した。

正確だ１週間隔で６週後まで弁組織な取り出した。取り出した後原子吸光分析法 で乾燥組織中のカルシラノ、の重量類を定量的に追跡し２、又　Ｖｏｎ　Ｋｏｓ ｓａ　染色した組織のカルシウム沈着の程度な目て追跡することにより組織学的 に、カルシウム沈着の程度を測定した。組織学的及び定量分析の結果乞、種々の 界面活性剤で処理した組織の結果と比較した。

２２．５　％のエタノール、１１．６ｍＭ（１−５重量％）のモノオレイン酸ソ ルビタンポリオキシエチレン（ソイ−：／−８０）、０．２６　ｊｊ／ｌのＭｇ Ｃｌ２・６Ｈ２０を含有する０、０２　Ｍノ’）ｔＥＰＥｓ　（５，３９ｇ／ｌ ノナ）　リウム塩）緩衝化生理食塩水（７０ｍｌ中６平方インチの組織）中ｐＨ ７，３，６５°Ｃでさらに安定化させた。２４時間後組織を取り出し、０．０２ 　Ｍ　ＨＫＰＰ２Ｓ緩衝化生理食塩水中０．６２５　％のゲルタールアルデヒド で１０分間ずつ４回洗い、発育期のウサギの皮下に移植した。正確に１週間隔で ６週後まで弁組織を取り出した。取り出した後原子吸光分析法で乾燥組織中のカ ルシウムの重量％を定量的に追跡し、又　Ｖｏｎ　Ｋｏｓｓａ　染色した組織の カルシウム沈着の程度を目で追跡することにより組織学的に、カルシウム沈着の 程度を測定した。組織学的及び定量的分析の結果共に、界面活性剤なしで例４に 従い処理した弁組織に比較し、移植組織のカルシウム沈着は有意に低下していた 。

例６　例２の抽出組織を、エタノールを加えないことを除いては基本的に全て力 詳細な点において例５と同様に処理した。組織を滅菌し洗浄した後、発育期のウ サギに移植し正確に１週間隔で６週後まで組織を取り出した。取り出した後原子 吸光分析法で乾燥組織中のカルシウムの重量係を定量的に追跡し、又Ｖｏｎ　Ｋ ｏｓｓａ染色した組織のカルシウム沈着の程度を目で追跡することにより組織学 的に、カルシウム沈着の程度を測定した。組織学的及び定量的分析の結果共に、 界面活性剤溶液中のエタノールの存在はカルシウム沈着の軽減に効果がなかった ことを示している。

例７　ツイーン−８０のかわりに２４．０　ｍＭのトリトンＸ−１００（１，５ 重量％）を用いたことを除いては、基本的に全ての詳細な点において例５と同様 に、例２の抽出組織を処理し、発育期のウサギに移植し、分析した。結果は、界 面活性剤を含まず例４に従い処理した弁組織に比較し、この移植弁組織ではカル シウム沈着が有意に低下していたことを示している。

例８　ツイーン−８０のかわりに５７゜２　ｍＭの１−デカンスルホン酸（１， ５重量％）を用いたことを除いては、基本的に全ての詳細な点において例５と同 様に、例２の抽出組織を処理し、発育期のウサギに移植し、分析した。結果は、 界面活性剤を含まず、例４に従い処理した弁組織に比較し、この移植弁組織では カルシウム沈着が有意に低下していたことを示している。

ルベンゼンスルホン酸（１，５重量％）を用いたことを除いては基本的に全ての 詳細な点において例５と同様に、例２の抽出組織を処理し、発育期のウサギに移 植し、分析した。結果は、界面活性剤を含まず例４に従い処理した弁組織に比較 し、この移植弁組織ではカルシウム沈着が有意に低下していたことを示している 。

例１０　ツイーン−８０のかわりに４２　ｍＭのカリウムココナツ脂肪酸加水分 解たん白（Ｍａｙｐｏｎ　−４０）（１，５重量％）を用いたことを除いては基 本的に全ての詳細な点におい”て例５と同様に、例２の抽出組織を処理し、発育 期のウサギに移植し、分析した。結果は、界面活性剤を含まず例４に従い処理し た弁組織に比較し、この移植弁組織ではカルシウム沈着が有意に低下していたこ とを示している。

例１１　ツイーン−８０のかわりに５５．３　ｍＭのＮ−ラウロイルサルコシン （１，５重量％）を用いたことを除いては基本的に全ての詳細な点において例５ と同様に、例２の抽出組織を処理し、発育期のウサギに移植し、分析した。結） ば、界面活性剤を含まず例４に従い処理した弁組織に比較し、この移植弁組織で はカルシウム沈着が有意に低下していたことを示している。

キシコール酸（１，５重量％）を用いたことを除いては基本的に全ての詳細な点 において例５と同様に、例２の抽出組織を処理し、発育期のウサギに移植し、分 析した。結果は、界面活性剤を含まず例４に従い処理した弁組織に比較し、この 移植弁組織ではカルシウム沈着が有意に低下していたことを示している。

デシルトリメチルアンモニウム（１，５重量％）を用いたことを除いては基本的 に全ての詳細な点において例５と同様に、例２の抽出組織を処理し、発育期のウ サギに移植し、分析した。結果は、界面活性剤を含まず例４に従い処理した弁組 織に比較し、この移植弁組織ではカルシウム沈着が有意に低下していたことを示 している。

例１４　ツイーン−８０のかわりに４１．２　の臭化ヘキサデシルトリメチルア ンモニウム（ｉ、ｓ重ｒｔ％　）を用いたことを除いては基本的に全ての点にお いて例５と同様に、例２の抽出組織を処理し、発育期のウサギに移植し、分析し た。結果は、界面活性剤を含まず例４に従い処理した弁組織に比較し、この移植 弁組織ではカルシウム沈着が有意に低下していたことを示しトリメチルアンモニ ウム（１，５重量％）を用いたことを除いては基本的に全ての点において例５と 同様に、例２の抽出組織を処理し、発育期のウサギに移植し、分析した。結果は 、界面活性剤を含まず例４に従い処理した弁組織に比較し、この移植弁組織では カルシウム沈着が有意に低下していたことを示している。

例１６　例乙の方法に従い処理した組織を、界面活性剤に接触後の組織に対する 影響を調べるためにさらに分析した。収縮温度による架橋安定性、プロナーゼ分 解による組織安定性、アミノ酸分析、ニンヒドリン分析、ウロン酸含量、ヘマト キシリン−エオシン染色、アルデヒドツクシン染色、ＰＡＳ／アルシアンブルー 染色、そしてトリクローム染色による組織学的検査、走査電子顕微鏡と透過電子 顕微鏡により測定した表面形態において有意な差がなかった。

本発明を詳細に好適な態様に関連して説明した。しかし当業者は本発明の精神と 範囲を逸脱することなく、本発明を変更できる。

補正書の翻訳文提出書（持；、琺ｍ　１８４条の７帽項）昭和５９年７　月１１ ゜ キ 特許庁長官　殿 １、特許出願の表示　ＰｃＴ／Ｕｓ８ろ１０１７０３２、　発明の名称　移植可 能な生物組織のカルシウム沈着を阻止するための界面活性剤による処理 ３、特許出願人 居　所　〒１ｏＯ東京都千代田区人手町二丁目２番１号新大手町ビルヂング３３ １ 訂正請求の範囲 （１９８Ｃ２月１０日に国際事務局に受理された。

原請求の範囲第１項から第８項までを削除し、新しい請求の範囲第９頂から第４ ６項を加えた。）９　組織の固定条件下で生物組織を固定する工程、及び移植後 の組織のカルシウム沈着を低下させるのに有効な量の非イオン性界面活性剤の溶 液を固定した生物組織に接触させる工程から成ることを特徴とする、１ｊｌｌｌ ’！’／ｌＩｃオ１．’てカルシウム沈着を阻止するために移植前に生物組織を 処理する方法。

１０　界面活性剤はポリオキシアルキレンエーテル、ポリオギシアルキレンアル キルアリールエーテル、ポリオキシアルキレンエステル、ソルビタンエステル、 及びポリオキジアルキレンツルビクンエステルより成る群から選ぶ、請求の範囲 第９項記載の方法。

１１、固定時に組織を界面活性剤だ接触させる、請求の範囲第９項記載の方法。

１２、固定後の滅菌時に固定組織を界面活性剤に接触させる、請求の範囲第９項 記載の方法。

１６、溶液中の界面活性剤の量が約０．１−約１０重故係である、請求の範囲第 ９項記載の方法。

１４　組織を約２−約６０時間界面活性剤の弓液に接触させる、請求の範囲第１ ３項記載の方法っ１５　ｍ液中の界面活性剤の級は約０．５−約５　Ｍ　ｔ　％ である、請求の範囲第１６項記載の方法。

１６界面活性剤カモノオレイン酸ノルビタン）ｆ？　ＩＪオキシエチレンである 、請求の範囲第１５項記載の方法。

１Ｚ　組織をゲルタールアルデヒドで固定する、請求の範囲第９項記載の方法。

１８、組織をゲルタールアルデヒドて固定し、ポリオキシアルキレンチーチル、 ポリオキシアルギレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシアルキレンエステ ル、ソルビタンエステル、及びポリオキジアルキレンツルビクンエステルより成 る群から選んだ約０．１−約１０重址係の界面活性剤を有するｉＪ＃Ｖｃ接触さ せる、請求の範囲第９項記載の方法。

１９　生物組織が鍵、靭帯、心臓弁、脳硬膜、又は６膜である、請求の範囲第９ 項記載の方法。

２０　溶液中の界面活性剤の址が約０．１−約１．５重量φてあり、生物組織は 肚、靭帯、心臓弁、脳硬膜、又は６膜てあり、生物組織はゲルタールアルデヒド で固定され、界面活ｅｔ剤はモノオレイン酸ノルビタンボ゛リオキ／エチレンで あり、組織な約６−約２４時間、ｐＨは約７．〇−約７．６で界面活１〈Ｌ剤に 接触させる、請求の範囲第９項記載の方法。

２１、固定後の滅菌時に組織を界面活性剤に接触させ、界面活性剤は約４−約５ 係のボルムアルテゝヒトをさらに含む、請求の範囲第２０項記載の方１去っ２２ 　固定条件下で生物組織を固定する工程、そして移植後の組織のカルシウム沈着 を低下させるのに有効な量の陽イオン性界面活性剤（この界面活性剤はアルキル 四級アンモニウム塩である）の酸液冗固定生物組織を接触させる工程を含む、動 物においてカルシウム沈着を阻止するために、移植前に生物組織を処理する方法 。

２３界面活性剤は塩化トリメチルフェニルアンモニウム、臭化デシルトリメチル アンモニウム、及び臭化ヘキサデシルトリメチルより成る群から選ぶ、請求の範 囲第２２項記載の方法。

２４、塩は塩化物又は臭化物である、請求の範囲第２２項記載の方法。

２５、固定時に組織を界面活性剤に接触させる、請求の範囲第２２項記載の方法 。

２６、固定後の滅菌時に組織を界面活性剤に接触させる、請求の範囲第２２項記 載の方法。

２Ｚ　溶液中の界面活性剤の量が約０．１−約１０重置部である、請求の範囲第 ２２項記載の方法。

２８、組織を約２−約３０時間界面活性剤的液に接触させる、請求の範囲第２７ 項言ｅ載の方法。

２９　溶液中の界面活性剤の量が約０．５−約５重ｔ％である、請求の範囲第２ ２項記載の方法。

３０、　ｆｆｉ織をゲルタールアルデヒドで固定する、請求の範囲第２２項記載 の方法。

３１、　ａ［ラブルタールアルデヒドで固定し、組織をハロクン化トリメチルフ ェニルアンモニウム、ハロダン化デシルトリメチルアンモすウム、及びハロゲン 化ヘキサデシルトリメチルより成る群から選んだ約０．１−約１０重量％の界面 活性剤を有する溶液に接触させ゛る、請求の範囲第２２項記載の方法。

６２、生物組織が馳、靭帯１．心臓弁、脳硬膜、又は６膜である、請求の範囲第 ２２項記載の方法。

６３宕液中の界面活性剤の量が約０．１−約１．５重量％であり、生物組織が腿 、靭帯、心臓弁、脳硬膜、又は６膜であり、生物組織はゲルタールアルデヒドで 固定され、界面活性剤は・・ロケゞン化トリメチルフェニルアンモニウム、ハロ ケゞン化デシルトリメチルアンモニウム、及びハロゲン化ヘキサデシルトリメチ ルより成る群から選び、組織を約６−約２４時間ｐ）（約７．０−約７．６で界 面活性剤溶液に接触させる、請求の範囲第２２項記載の方法。

ろ４．固定後の滅菌時に組織を界面活性剤だ接触させ、界面活性剤溶液は約４＝ 約５％のホルムアルデヒドをさらに含む、請求の範囲第ろろ項記載の方法。

６５、動物においてカルシウム沈着を阻害するために移植前に生物組織を処理す る方法において、固定条件下で生物組織を固定する工程、そして移植後の組織の カルシウム沈着を低下させるのに有効な量の非イオン性界面活性剤の塩を有する 溶液（ここで界面活性剤は脂肪族アルコールのエチレンオキサイド硫酸塩、アル キルフェノールの硫酸塩、アルカンヌルホン酸、アルキルアリールスルホン酸、 胆汁酸、脂肪酸、Ｎ−アルカノイルアミノ酸、Ｎ−アセチル化アミノ酸、硫酸塩 化エタノールアミド、及びスルホン化アルキルフェニルエーテルより成る群から 選ばれる）を固定組織に接触させる工程を含む、上記処理方法。

ろ６．界面活性剤がナトリウム塩、カリウム塩又はアンモニウム塩である、請求 の範囲第６５項記載の方法。

６Ｚ　固定時に組織を界面活性剤に接触させる、請求の範囲第２５項記載の方法 。

６８、固定後の滅菌時に組織を界面活性剤に接触させる、請求の範囲第６５項記 載の方法。

６９　溶液中の界面活性剤の量が約０．１−約１０重散チである、請求の範囲第 ３５項記載の方法。

４０、組織を約２−約６０時間界面活性剤溶液に接触させる、請求の範囲第３９ 項記載の方法。

４１、溶液中の界面活性剤の量が約０．５−約５重置部である、請求の範囲第６ ５項記載の方法。

４２、　組織をゲルタールアルデヒドで固定する、請求の範囲第３５頂言ｅ載の 方法。

４６　組織をゲルタールアルデヒドで固定し、脂肪族アルコールのエチレンオキ サイド硫酸塩、アルキルフェノールの硫酸塩、アルカンスルホン酸及びアルキル アリールヌルホン酸より成る群より選んだ約０．１−約１０重置部の界面活性剤 を有する酸液と接触させる、６ 請求の範囲第３５項記載の方法。

４４、生物組織が腿、靭帯、心臓弁、脳硬膜、又は６膜である、請求の範囲第３ ５項記載の方法。

４５、ｍ液中の界面活性剤の量が約０．１−約１．５重量％であり、生物組織が 胸、靭帯、心臓弁、脳硬膜、又は６膜であり、生物組織はゲルタールアルデヒド で固定され、界面活性剤がＮ−ラウロイルサルコシンであり、組織を約６−約２ ４時間ｐＨは約７．０〜約７−６で界面活性剤に接触させる、請求の範囲第３５ 項＝２載の方法。

４６　固定後の滅菌時に組織を界面活性剤に接触させ、界面活性剤溶液は約４− 約５％のホルムアルテ“ヒトをさらに含む、請求の範囲第４５項記載の方法。

国際調査報告

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．　移植後の生物組織のカルシウム沈着を低下させるのに有効な非イオン性界 面活性剤の一定量を生物組織に接触させることより成る、移植前に生物組織を処 理する方法。 ２、界面活げ剤をポリオキシアルキレンエーテル、ポリオキシアルキレンアルキ ルアリールエーテル、ポリオキシアルキレンエステル、ソルビタンエステル、そ してポリオキシアルキレンソルビタンエステルヨリ族る群より選ぶ、請求の範囲 第１項記載の方法。 ３、　固定時に組織を界面活性剤に接触させる、請求の範囲第１頂記載の方法。 ４　固定後の滅菌時に固定組織を界面活性剤に接触させる、請求の範囲第１項記 載の方法。 ５、移植後の組織のカルシウム沈着を低下させるのに有効な一定量の陽イオン性 界面活性剤を組織に接触させることより成る、移植前に生物組織を処理する方法 。 ６、　界面活性剤がアルキル四級アンモニウム塩である、請求の範囲第５項記載 の方法。 ７　界面活性剤は塩化トリメチルフェニルアンモニウム、臭化デシルトリメチル アンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルより成る群から選ぶ、請求の範囲第 ６項記載の方法。 ８、　移植後の組織のカルシウム沈着を低下させるのに有効な一定量の陰イオン 性界面活性剤を組織に接触させ、この陰イオン性界面活性剤は脂肪族アルコール のエチレンオキサイド硫酸塩、アルキルフェノールの硫酸塩、アルカンスルホン 酸及びアルキルアリールスルホン酸より成る群から選ぶことを特徴とする、移植 前に生物組織を処理する方法。