JPS59501293A - 狂犬病の抗原蛋白を発現する新規ベクタ−及びそのワクチン製造への適用 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 狂犬病の抗原蛋白を発現する 新規ベクター及びそのワクチ ン製造への適用 本発明は、狂犬病（ｒａｂｒ’ｓ　）ワクチンの製造に関する。

狂犬病は、狂犬病ウィルスにより惹起てれる疾病でちり、極度に深刻な脳を誦炎 として症状が現れ、２．３日内に致命的となることもある。

狂犬病は、人獣伝染病である。顎乳類であれ、鳥類であれ、全ての温血動物が感 染する。一般に、家畜又は野性の咄乳類にかまれることにより主として媒介され る。ワ 狂犬病の主な犠牲者は、本質的には人及び家畜である。

有効な予防手段により人の狂犬病の例は限られたものとなり、高度工業国におい ては、若干の偶発的なものとなっている。

しかしながら、南アメリカ、アフリカ及びアジアの成る国々では、狂犬病は今尚 非常に重大な疾病である。

狂犬病と闘うだめの最大の武器は、ワクチう接種による予防である。

現在用いられているワクチンは、不活性化したウィルスからなるものである。

しかしながら、工業的生産のためには、これらウィルスは、新生マウスの脳等の 媒質、烏の胚、動物の腎臓細胞又は人の二倍体細胞中で培養しなければならず、 次いで例えばβ−づロピオラクトンの作用により完全に不活性化される。

しかしながら、これらワクチンの使用には神経麻痺の事故を伴う危険性があるの で、少くとも人のレベルでのワクチン接種は非常に限られている。

加えて、上記ウィルスの培養に用いる新しい基質が神経学的危険性をかなり低減 させたが、しかしこの危険性が完全に消滅した訳ではない。しかも、不活性化ワ クチンを使用する場合は、不充分な不活性化の危険性があるという問題点がある 。最後に、上記培養培地の特殊な性質により工業的には種々の問題点がある。

即ち、現在狂犬病ワクチンは非常に高価なワクチンなのである。

本発明の目的は、神経麻痺の事故の危険性がなく、しかも工業的に低価格で製造 し得る抗原接種蛋白（ａｎｌｉｑｅｎｒｃ　ｖａｔｃｉｎａｔｉｎｑ　１ｊｒｏ ｔｅｉｎ　）を製造することにある。

狂犬病ウィルスは、杆状ウィルス（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ　）である。この杆 状ウィルスは、殻（５ｈｅｌｌ　）の形態のリボ蛋白皮膜（ｔｉｐθｐｒｏｔｅ ｉｎ　ｅｎ７）ｅｌｏｐｅ　）中に包ａｉれたＲ　、Ｖ　Ａをよむらせん状ヌク しオカプシドカ・らなる。

このしりオン’（ｖｉｒｉθｎ　）は、ゲノムＧ（糖蛋白）、■（ヌクレオ力づ シト）　、ＡＩ　！　及び、Ｗ　２　（ストリツクス）及びｌ　（１ａｒｑｅ　 、転写酵素）によりコードきれた５つの蛋白からなる。覆っている胸は、宿主由 来のものであるから、表面に存在する有効な抗原は糖蛋白である。このトランス メンづレジ蛋白は、分子量約７５．０００　ダルトンであり、血球凝集活性を有 する。

血球凝集の研究において、精製した糖蛋白は、イシタクトのウィルスに比し６倍 程度高い活性を示す。

その名が示す通り、狂犬病ウィルスの糖蛋白は、グリコジル化きれているが、こ のグリコジル化の役割は知られていない。

狂犬病ウィルスの糖蛋白のｍ　Ｒ＃　Ａ　の相補的ＤＮＡ配列は、ニー°アニリ 才二ス（Ａ、Ａｎｉｌｉｏｎｉｓ　）らによ載されている。

この遺伝子を、下記の実験において使用した。該遺伝子を図式的に示しだものが 第１図である。

本発明は、少くとも、狂犬病の抗原蛋白をコードする有効Ｄ　Ｎ　、４配列の全 て又は一部に対応するＤ　＃　、４　（１）配列及びバクテリア中でのこの配列 の発現のプロ１−ターを含有する、狂犬病の抗原蛋白の発現用ベクターに、関す る。

上記Ｄ　、Ｖ　Ａ　（１）配列は、好ましくは、次の通りである。

４ノＧＡＧＧＣＣＴＡＴＡＴＡノＩＧＴＣＴＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＣＡＴＧＣ、 ノ、ノ、１ＣＴＣ，４／ノＧＴＴ、−ＩＴＧＴＧＧΔＧＴＴＣＴ−４ＧＧＡＣＴ ＴＡＧＡＣＴＴ　、４ＴＧ　Ｇ、４Ｔ　ＧＧＡΔ（？Ａ　ＴＣ；Ｇ　ＧＴＣＧＣ Ｇ　。

実険の結果、上記／）　、＃　、４　（１）配列を含有するベクター５・ま、ｔ ’＋’ｆ弾した狂犬病の糖蛋白に対応して、血清で沈殿する糖蛋白の発現を可能 とすることが判った。

ここで、［Ｄ・ｖＡ（１）Ｊという用語は、命名法を単純にするためにのみ用い たものであり、このような配列は、狂犬病の抗原蛋白をコードする有効１）　Ｎ 　Ａ配列の全部又は一部と同一である場合、或は翻訳きれた場合に上記有効Ｄ　 ＡＴ　、−を中の配列により］−Ｆきれた有効な抗［東蛋白の免疫学的特性と同 −又は非常に類似した免疫学的特性を有する蛋白を与える場合、狂犬病の抗原蛋 白をコードする有効Ｄ　Ｎ　、４配列の全部又は一部に対応すると言われる。

成る場合には、比較的大きなサイ文の有効Ｄ　ＡＩ　Ａのフラグメントを用いる のが有利又は必要であり、持に、ラグメシトを用いるのが有利である。池のフラ グメントも同様に用いることができ、特に、部位Ｈｉｎｄ　１１−Ｐｓｌｌ及び Ｓｔｕ　ｌ　−Ｐｓｔ　１間のフラグメントが使用できるが、この場合は、対応 するＤ　ＮＡ配列がその末端部で疎水性のトラうスメンプレン蛋白をコードする ので水溶性蛋白を得る場合不利となる。

一般に、有効Ｄ　、Ｎ　Ａ配列として、工μ１ｎｄ（５部位にょ本発明のベクタ ーは、もちろん、対応するリポソームの付加（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　）を特に 確実にするための、或は狂犬病の抗原蛋白の発現を容易にするベクターの構成（ ｔｏｎ／１ｑｕｒａｔ；ｏｎ　）を与えるだめのＤＮＡの他のフラグメントから なる。

特に、本発明のベクターは、ファージ、特にファージ＋ｌｆ　１３のＤＮＡの全 部又は一部を含み得るものであり、本発明のベクターの″ｊＤｔ−ターはラクト ースオペ０ンのプＯｔ−ターで製あるのが好ましい。

使用し得るファージ１３の中でも、特に次のファージがよい。即ち、Ａｆ１３ｔ ｑ１０２、Ｍｌ　３　ｔｅｌ　ｌ’ｌ０１Ｊｆ１３　ｌｑ　ｌｌｌ　、　Ｍ　１ ３　ｌｑ　ｌ１２　、　ノＶ１３　ｔｑ　ｌ１５　、Ｍ１３１ｑ１１６、Ａ（１ ３１ｆ１１７、＃１３１ｑｌ１８、＋Ｓ／１３１ｑ１２０及びＭ１３ｔｑ１２１ ゜勿論、他の型のづＯｖニーター、例えばバクテリオファージラムダのづＯｔ− 夕−の如きコントロールされたつ口を一ターを用いることもでき、また、強力な 翻訳開始部位、例えばファージラムダの遺伝子Ｃ■のぞれを導入することもでき る。

本発明のベクターは、プラス三Ｆであってもよく、特に、バクテリアのプラス三 ドの複製起点（ｏｒｉｑｌｎ６ｆ　ｒｅｐｌｒｔａｌｉｏｎ　）　、バクテリオ ファージλのづ〇七ドする領域を少くとも含有するづラス三ドベクターがよい。

対応するバクテリア細胞中でベクターが複製するには、プラス三ド由来の複製起 点が存在することが必須であり、特にＥ、］す（Ｅ、ｃｏｌｉ　）の場合、づラ ス三ド戸ＢＲ３２２の複製起点が好ましく使用できる。事実、プラス三ド戸ＢＲ ３２２は、コピー数が多く、従って所望の蛋白を産生ずるづラス三ド量が増大す るという利点・を有する。

勿論、他の複製起点を用いることもでき、特に、任意のタイプの耐性因子又はエ ヒソームコリシシ産生性因子（即ちバクテリアにコリシンを合成する能力を与え る因子）をコードするプラス三ドの復製起点を用いしかしながら、プラス三ドを 選択するに当っては、その複製が過度にコントロールきれておらず、且っりＤ− ニンク領域外に好ましくない制限部位を示さないものを選ぶのが適切である。

バクテリオファージλのづロ七−ター中で、主たる左側の″ｊＯｔ−ターである λＰｒ、が好ましく用いられる。ＰＬ　は、λの早期転写に関与する強力なづ０ １−ターである。

バクテリオファージλの他のづＯｔ−ター、特に、右側のｊ〇し一ターＰＲ又は 右側から２番目のづ口ｔ＝ツタ−′Ｒを用いることも可能である。

非常に異なる翻訳開始配列を用いることも可能であるが、バクテリオファージλ のｃｌｌ蛋白のそれであるλｃＩｌｒｂｓ　が好ましく用いられる。

下記の如き理由から領域λｔＩｒｂｓ　を用いるのが特に有利であるが、他の翻 訳開始配列、特に、有利な制限部位により制限されているλＥ遺伝子のそれを用 いることもできる。

翻訳開始をコードする領域ＣＩＩｒｂＳ　は次の理由により特に有利である。

１、　プＯｔ−夕−Ｐｔ、のコｙト０−ルの下で大量のＣ［蛋白が合成烙れるこ とが示された。

２、　当該領域は、該領域の単離を容易にする制限部位により結合されている。

３、制限酵素（Ｎｄｅ　ｌ　）が、翻訳開始コドンをカバーする。

これら条件下、ＡＴＧ開始コドシを再構成して、とのＮｄｅ１部位に外来Ｄ　Ｎ 　Ａ　（１）配列を挿入すると、非融合蛋白、即ち最初のメチオニンを除き、製 造しようとする蛋白とは無関係の（外来の）アミノ酸を含有しない蛋白の発現が 生じる。

これとは対照的に、λＣ［１ｒｂＳ　の下流側の単一制限部位（５ｊｎｑｌｅ　 ｒｅｓｌｒｉｃｔｉθｎ　５ｉｔｅｓ　）　の１つにおいてＤ　、Ｎ　Ａ　（１ ）配列をり０−ニンタすると、融合蛋白の発現が生じる。

及び翻訳開始領域ｔｆＪ　の下流側に位置している。この領域において好ましい 単一挿入部位のうち、通常用いる。特定の蛋白をコードする遺伝子を、翻訳開始 コドンの４０〜５０　ｂｆｉ下流側に位置する部位に挿入すると、誘導されたｃ ■　からのバクテリアのアミノ酸のＮ−末端（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｅｘｔｒ ｅｍｉｔｙ　）において融合外来蛋白の合成が発現される。

問題のベクターは、好ましくは、更に、例えばλＮと称されるλのＮ遺伝子によ りコードてれた転写の終結阻害機能を含有する。該Ｎ遺伝子の転写産物の存在下 では、Ｐｔから始まる転写が、はとんどの停止シグナルを越えて続行される。こ れにより、転写の不完全な停止により生ずる問題点であって、り０−ッ化きれた 外来遺伝子がそのような停止シフすルを有する場合に生じ得る問題点が解消され る。加えて、ＰＬ　から始まる発現は、Ｎ＋環境（４Ｖ＋ｅｎｖｉ　ｒｏｎｍｅ ｎｔ　）中で改善されることも示てれた。

もし、づ〇七−ターがＰＬ又はＰＲではなく、例えばＰ′Ｒである場合、終結阻 害機能は異なり得る。Ｐ′Ｒは、バクテリオファーシン、の後期遺伝子の転写に 関与する。後期遺伝子の発現はＱ遺伝子産物により積極的に規制される。該Ｑ遺 伝子産物は、へ′蛋白と同様の転写終結阻害因子として作用することが示されて いる。

Ｑは、Ｐ′Ｒで開始てれた購（ｌｉ　６５　ＲＮ／７の停止時に作用し、かくし て末梢（ｄｒｓｉａｌ　）　の後期遺伝子領域の転写を可能にする。Ｑの発現自 体は、ＰＲにより制御され、ｐＲは、Ｐｔ、と同様に、ＣＩ　りづレツ寸−によ り規制をれる。この相互作用のカスケードば、発現プラス三Ｆ上で再構成され、 Ｐｔ、と同様に使用される。

外来蛋白が大量に継続して産生される場合、宿主ベクター系の不安定性と毒性の 問題を解決するために、づＯｔ−ターと、誘発され得る発現系、特に熱誘発性発 現系の全て又はいくつかと結合をせることにより、″ｊＯｔ−ターの活性を制御 する必要がある。

好ましくは、外来蛋白合成の温度制御を、転写段階で行なう。この制御は、例え ばＰＬ　の活性を２８°Ｃで抑制するが４２°Ｃでは不活性化されるｔ　ｌ　８ ５７　、、、等の宿主バクテリア中でコードされたＩＣ熱性りづレッサーにより 行なう。該りづレッサーは、づ口を一ターＰＬ　に隣接するオペレーターＬ）Ｌ 　に作用する。上記において、熱誘発性発現系の一部は、宿主バクテリアの一部 であるが、族系をベクター自体の一部とすることも可能である。

そのようなベクターは、抗生物質、例えば戸ＢＲ３２２の場合アシヒシリンに耐 性を有する遺伝子をも含有することができるが、池の耐性遺伝子、例えばテトラ サイクリン耐性のもの（Ｔｅｔ’）又はり０ラムフエニコーこのようなマーカー の加入は、り０−二−Ｊり実験中に本発明の形質転換体プラス三ド士Ｐリアーを 含有するバクテリアを選択するのに必要である。

耐性遺伝子の加入により、発酵中に選択された圧力をかけながらプラス三Ｆの安 定性を増大させることができ、また、形質転換体の単離が容易となる。

りａ−ニンタのためには、検出すべきプラスミドへＤ　、’Ｖ　Ａ　（１）配列 の挿入を可能とする系を使えるようにするのが有用である。例えば、クローニシ タ領域にＥ。

］す］β−カラクトシターゼ　ｊａｒ　Ｚ’）のＮ−末端断片を設置することが できる。この設置は、α−ワラクメントの翻訳をｃ■　配列の制限下に看＜Ａｔ ＹＩから誘導された翻訳開始領域と融合させることにより行なわれる。

上記α−フラタメントは、宿主−コード化Ｃ−末端ＩＩノフラタメシトの発現に より補足され（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　）、これにより細胞中でβ−カラク トシダーセ活性が生じる。このβ−カラクトジターゼ活性は、色素性基質５−ブ Ｑ［−４−’７００−３−インド°’ＪＩＬ　７３　”　’）ｊラクトシターセ の存在下で青色のコロニーを生成する。

２８゛Ｃで、づ口を一ターＰｔ、は不活性であり、α−フラジメントは合成され ず、コロニーは白色の１斗である。温度を４２゛Ｃに上昇させると、プロ七−夕 −ＰＬは活性化きれ、α−フラジメシトが合成てれ、コロニーは青色に変わる。

この検出系に位置するり０−ニンク部位にＤ　＃　Ａ　（１）を挿入すると、β −カラクトシダーセの合成が阻害てれ、２８°Ｃ及び４２°Ｃのいずれにおいて も白色のコロニーとなる。

また、１ａｔＺ’遺伝子に代えて、検出を可能とする池の遺伝子を用いることも できる。

更に、本発明は、上記プラス三ドにより形質転換され、又は上記ファージにより トラシスフエクトされた細菌株に関するものでもある。

使用できる細菌株のうちでも、特に挙げられる′ものは、クラム陰性菌であり、 例えば、持にＤ　ｊＶ　、４支持体ががフ′アージｒｌｌ　ｌ　３のＤ　Ａ’　 Ａである場合はニジエリしア・コリ（Ｅｓｃ／ｒｅｒｒｔｈｉａ　ｔθｌｉ　） 等が防用できる。しかし、例えばバチルス　スラチリス（Ｂａｒ：ｔｌｌｕｓｓ ｕｂｌｉｌＩｓ　）等の他の細菌株も使用できる。

本発明は更に、本発明ベクターを含有する細菌株に適した培地中で培養すること により、上記ベクターを狂犬病の抗原糖蛋白の製造に用いる方法にも関する。

勿論、使用し得る培養条件及び培地は、本発明方法の特徴を構成するものではな く、当業者にとり各蒙株に応じて適宜決定される。

更に本発明は、本発明方法を実施することにより得られる蛋白にも関し、より詳 しくは下記アミノ酸配列を含有する蛋白に関する。

こうして得られる上記蛋白は、狂犬病の主たる抗原に対応する特異抗体と免疫沈 降を起こすので、狂犬病　會の治療又は予防を可能とする免疫賦活を惹起する。

この理由から、本発明は、まだ、免疫賦活活性成分として上記蛋白の少くとも１ 種を含有する、狂犬病の予防及び治療用の有用なワクチンにも関する。

好ｌしくけ、本発明の抗原蛋白は、ワクチンとして使用する場合、水溶液の形態 とするのがよい。

この蛋白のアミノ酸配列は、勿論、公知方法により化学的方法で合成することも できる。

同様に、この蛋白をより犬き々蛋白の中に含有させることもで寝るが、そのアミ ノ酸が、狂犬病の抗原蛋白の完全な遺伝子のそれらと全ての点において対応する ことは必ずしも必須ではなく、上記化合物の有効性を改善し、特にその溶解度を 変化きせる他のアミノ酸を付与してもよい。丑だ、アミノ酸の成る種の異なるエ レメントを上記類に結合することさえも可能である。

本発明のベクターの製造に用いられる方法について詳述する前に、対応する処理 方法を下記に要約する。

本発明のベクターは、ニー、アニリ才二ス（Ａ。

ＡｎｉｌｉｏｎＩｓ　）ら著、ネイチヤー（Ｎａｔｕｒｅ　）　２９４゜２７５ 〜２７８（＋９８１）　に記載きれているづラス三ドｐＲＧを出発物質として得 られた異なる制限配列のＭ１３ファージを、適切な部位に挿入することにより得 られる。

狂犬病の糖蛋白をコードする遺伝子の構造は、第１図に示されている。原図は、 更に、この遺伝子上に存在する異なる制限部立並ひにこの配列によりコードきれ るアミノ酸をも示す。

挿入てれた蛋白の配列は、上記糖蛋白中の疎水領域に対応し、その周りの領域は 該糖蛋白のタリコシルｆヒ部位に対応する。

この傳蛋白は、１９個のアミノ酸を有する疎水性シジすルペプチドを含有する前 駆体（ρｒｅｃｕｒｓθｒ）の形で翻訳でれるように思われる。該ぺづチドは、 第１図に１〜−１９として標識されている。

興味深いことに、上記蛋白は２つの他の疎水領域を含有している。即ち、配列端 部に位置するトランスメンプレシペづチドと小さな中央部疎水領域であるが、そ の機能は現在不明である。

第１図から判るように、成熟糖蛋白をコードする配ントを２０−ン化することは 興味深いことである。

このようなりＮＡ配列を満足し得る方法で９０−ン化するためには、翻訳開始シ ｌ）ｙルを有し且つその直後に正確なフエ−ｊ、　（ｃｏｒｒｅｃｔ　ｐｈａｓ ｚ　）のＩｆｉｎｄ　ｆｉ部位を有するベクターを構成する必要がある。

そのだめには、ベクターをファージ、ｌ／　ｌ　３を出発物質として構築する。

ファージ・１７１３においては、Ｈｉｎｄ■部位は、ベクターに応じて、フェー ズ１．２又は３の状態であり、蛋白の正確な発現を確かなものとする。

上記したように、好ましくは可溶性蛋白を得るために、Ｈｌｎｄ　［１部位の後 に位置するトランスメクラレン蛋白を除去する試みがなされるであろう。

対応する酵素でプラス三ド戸ＲＧ　を消化（ｄｊｑｃｓｔｒθｎ　ｊすることに より、次の制限配列が単離さｎた。

これら配列が、ファージＪ／　１３に対応する部位に挿入でれる　上記Ｈｉｎｄ 　ＩＩＩ／フラジメントはファージ”１３’ＶＩ０９中で９０−シ化され、Ｓｔ ｕ　ｌ　／第２図には、下部に、用いたファージｌ１１３及び該ファージの対応 する制限部位を参１）４（して、クロークＣヒされた異なる制限配列を示す。

Ｅ、コリ（Ｅ、ｒｏｌｉ　）　ＪＡｆ　ｌ　Ｑ　３株が、上記挿入物（１ｎｓｅ ｒｔｉｏｎ　）を担持するファージで呼染され、適当な培地、特に炭素源として コハク酸すトリウムで補足された培地中で、づｏｅ−夕−ｊａｒの異ｆヒ抑制が 制限されるような方法で培養される。

このづ〇七−ターの発現：は、Ｉ　ＰＴＧ添加により１δ発きれ、次いで蛋白の 合成か顕著なメチオニンの取り込みに続いて生じる。

次いでバクテリアを収穫し、糖蛋白を抽出し、精製した蛋白に対応する抗血清と 共にイン士ユベートして精製する。抗原−抗体複合体は、アフィニティ・り０マ ドグラフイーにより回収ばれ、洗浄され、解離されて抗原蛋白が単雅キれる。

精製後にこうして得られた蛋白の分子量は、予想されたものと一致している。即 ち、β−ガラクトシダーセの一部とクローン化された配列に対応する狂犬病の抗 原糖蛋白の一部と２含むハイブリッド蛋白である。

得られた結果を下記第１表に示す。

（注）アミノ酸の平均分子量が１１０タルトンであると仮定して計算を行なった 。

（ａ）翻訳の終結が、天然糖蛋白の停止コドシにおいて生じる。

（ｂ）終結が、α−ペプチド□β−カラクトシダーゼの停止コドンにおいて生じ る。

（Ｃ）α−ぺづチドの末梢のセグメントフェーズ外での翻訳。

（ｄ）糖蛋白をコードする末梢のシーケンスフェースタ本での翻訳。

（ｌ′）免疫沈降の間にハンド（／）ａｎｄ　）　が観察されなかった。

これら実験から得られる知見をより理解し易ぐするために、上記結四を第３図に 記録する。

な制限部位が示されている）を、Ｇとする。

狂犬病の抗原糖蛋白のス＋−ムが、次にＰとして示てれ、数字は吸熱糖蛋白の起 点から数えたアミノ酸の数を示す。

シリコシル１′ヒ部位も、黒用又は山内により示されている。

Ｐと同一条件で、Ｈは四角で示される疎水領域を示す抗原糖蛋白の配列を示す。

次に、１戸　は、各種のタローン制限フラグメントを図式的に示したものである 。２〆として指弥をれ、二重線で示されている制限フラグメシトは、り０−ユン グ後に免疫沈降性蛋白を生口させる制限フラグメントに対応するものである。一 方、ｌρ−として旧称され、一本線で示をれている制限フラグメントは、免疫沈 降を生じさせなかったものである１） １ノウ′とｈｐ−について行なわれた研究の結果、重複（θυｒｒｌａｌｒｐｘ ｒり）により、ス牛−ムｉＺ　中で四角で表わされる領域が単離烙れるっ該領域 は、対応する蛋白で′Ｏ免疫沈降特性の出現に必須の領域である。

５ｔｕｌとＮｒｕ　ｌとの間に位置するこの重複フラグメントによりコードされ る蛋白は、ｉＺ　の下に示されている。

この記載で用いられた略号は、国際コードに対応するもので、特にアミノ酸に対 する一文字コードは次の通シである。

Ｒ＝、４ｒｑ　Ｃ＝Ｃｙｓ Ｇ＝Ｇ／　ｙ　Ｖ＝Ｖａ／ Ｌ　−Ｌ　ｅ　ｕ　ｒＷ　＝ｒＷ　ｅ　を微及び利点を示すものであり、添附図 面を参照して説明する。図面において、 第１図は、狂犬病の糖蛋白をコードする遺伝子の構造を示す。

第２図は、Ｍｌ　３上で９０−ン化された各種制限配列を示す。

第３図は、本発明に従い重要な配列を示すだめの手法（５ｔｒｔ２ｔｅｑｙ　） を示すものである。

第４図は、＆１３の各種誘導ファージの構造を示す。

第５図は、づラスミド戸ＴＧ　９０７の合成を図式的に示したものである。

第６図は、ファージＡｆ１３１ｖ９１０　の合成を図式％式％ 第７図は、ファージ＃Ｉ　３　ｔｑ　９１０　の構造を図式的に示したものであ る。

第８図は、づラスミド１５ＴＧ　９０８の合成を図式的に示したものである。

第９図は、プラスミド戸ＴＧ　１６＋　の合成を図式的に示しだものである。

第１Ｏ図は、ファージＭ１３　ｔｑ　ＲＧ　７及び−’／１３ＲＧＩ５１中に存 在するＤ　ＮＡワラタメント及びその翻訳産物を示す。

第１１図は、本発明に従い各種菌株により産生された狂犬病糖蛋白の検出を示す ものである。

第１２図は、狂犬病糖蛋白の発現に対する誘導温度（１ｎｄｕｃｔｉｏｎ’　ｔ ｅｍ戸ｅｒａｌｕｒｅ　）の効果を示すものである。

加えて、特に指示しない限り、使用した方法及び沼株は、次の通シである。

ａ）細菌株 本発明に従い使用される細菌株は次の通りである。

ＯＴＧＥ　９００゜これは、次の特性を有するＥ　コリ　株である。即ちｓｕ　 Ｆ　ｈｉｓ　ｉｌｖ　ｂｉｏ　（λｃ１８５７ΔＢａｍΔ／／ｌ　） ＯＮ６４３７０　これは、次の特性を有するＥ−コリ株でる。即ち、Ｆ　ｈｉｓ 　ｉｌｖ　ｑａｌ＋Δ８ρｒｏＣ＋：ｉｎ　ＩＱ　ｌａｔｍ　１５　（ン、ｔ　 １８５７　ΔＢａｍ　ΔＩｆ　ｌ　）　。

（＋／＋＊ｌＱ３゜これは次の特性を有するＥ、　コリ株である。即ち、Δ（ｊ ａＣ−ｐｒｏ　）　ｓｕ戸Ｅ　ｔｋｉ　ｅｎｄ、４ｓｂｔＢ１５　ｓｔｔ、Ｊ　 ｒｋ　ｎ＆”／Ｆ’　ｔｒａＤ３６ｐｒｏ　ＡＢ”　１ａｔＩａｌａｔＺΔｍ１ ５゜上記株を用いた理由は、それらが入数可能であるからである。しかし、詳述 した如き成る種必須の特性を有する限り、他の株を使用できるのは勿論のことで あプラスミド又はファージ・１ｆ１３のＤ　Ａ’　Ａの小規模製造（ｍｒ　ＩＩ 　＋−戸ｒｃｐａｒａｌｒ’ｏｎｓ’　）は、アイシューホ０ウイッッ（ハｈ− Ｈｏｒｏｔｎｒ’ｔ＝　）　（文献ｌ）により記載された方法でｒテなうが、唯 一の相違点は、Ｄ　Ａ’　、４が使用前にエタノ−１して再度沈殿きれることで ある。

大規模製造（ｍａｘｉ　−ｐｒｃｌｒｔｒｒａｌｉｏｎｓ　）は、上記文献記１ １＆の方法にて行ない、更に、ＣｓＣ１／　エチデイウムプロマイドの密度勾配 により補足的に精製する。

ｔ）り０−ニングの手法 持シて指示しない限り、制限酵素によるＤ　Ｎ、４の処理は、製造者、即ち二１ −イングラシト　バイオラ″ｊ反（ＮｔＷＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　） 　、ベセスダーリサーチ・ラボラトリーズ（ＢｅｔＡｅｓｄｅ　Ｒ）ｓｅａｒｃ ｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）及びベーリシガー・マンハイム（Ｂθｅｈｒ ｉｎｑｅｒＡｆａｎｎｈｅｒ’ｍ　）により指定きれた条件下に行なった。

必要に応じ、５末端のリン酸エステルは、バクテリア性アルカリ性ファスファタ ーセ又は子牛の腸由来のファスファターぜを３７゛Ｃ１３０分間で制限酵素の緩 衝液中で用いることにより、除去される。

フレナラ（Ｋｌｔｎｏｗ　）ポリメラーぜ（ベーリンガーマンハイム）を用いる 付着末端の修復は、５０ｍＭのトＩＪ　ス（ｔｒｚｓ　）　ＨＣｌ、ｐＨ７，８ ，５ｙｎＡＩのＭｑＣｅ２．１０ｐｎ・１ｔのβ−メルカづトエタノール及びＱ 、　４　ｍ　Ｍのｄ、■Ｔｐｓ及びＤＮＡ１□　−２００ｐｑ／ｍｌの上記酵素 の混合物中、２５°Ｃにて１５分間行なう。

ヌクレアーぜＳ工（マイルｉ、Ｍｉｌｅｓ）　は、０，３ｔルノｕａｔ＊　、　 ０．０３　ｅ　ルノｕａｏＡｔ　、　ｐ　Ｈ４，８、及び０、００３　ｅ　Ｉｂ のＺｎＣ（１２の媒体中、２５°Ｃにて３０分間の条件下、ＤＮＡ１μｑ当り２ 単位の量で用いる。

ＢａＩ　３１は、パブヨタトス（Ｐａｎａｙｏｌａｔｏｓ　）らの方法（文献２ ）に従って使用する。結合操作は、特にＮ　示Ｌ　ｆｚ　イ限’）、１５°Ｃテ ４−２４　時間、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリシガー　マンハイム）並びに１０ ０Ｅ　’Ｊ　ｅ　Ｌ　ｔ７）　ＮａＣ７！、　６６三りｅ　ＬのトリスｌＩＣ１ 、戸Ｈ７，５、ｌ　ＯＥ　ＩＪ　Ｅ　Ｌ　ｔ７）　ＭｑＣｅ２．０．５　＝　リ ５　＋ｂ　１７１）　スペル三ジ：ハ０．２三りｔルのＥＤＴ−イ、２三り七ル のＤＴＴ、１三りｔルの７７　Ｔ　Ｐ、Ｑ、　ｌ　Ｉｎり／　ｍｌのＢ　、５． ４及び５〜５０μｑ　／　ｍｌの７）　、ｙ・１の混合物を用いて行なわれる。

約３０単位／肩ｔのリガーゼが、粘着末端を結合ず８のに用いられる。約１００ 単位／　ｍｌのリガーゼが平滑末端（ｒｚｌｒｅｍｉｌｅｓ　ｆｒａｎｃｈｅｓ 　）を結合するのに用いられる。

各種酵素反応の中で、Ｄ・■−・１寸ンづルはフェノ−１し／′クロロホルム混 合物で抽出きれ、エタノールで沈うされる。必要な場合、Ｅ、］り又は醇母のｔ 　−ＲＮ−４が、随伴剤（ｒｎｉｒｔｘｎｌｎｑ　ａｑｅｎｌ　）として使用で れる。分子アダづター〔〕ラボラテイづ　リサーチ（ｔｏｌｌａｈｏｒａｔｒｖ ｅ　Ｒｒｓｅａｒｃｈ　）　、ベセスダ　リ寸−手ラボラトリーズ、ニューイン クランド　バイオラづズ〕は、予備交雑（ｐｒｅｈｙｂｒｌｄｉｚｅ　）　ｄれ 、ＤＮＡの平滑末端に対し１０〜５０倍の過剰七ル量で、上記緩衝条件下、４° Ｃ，＋５時間にて１００単位／　ｍｌのＴ４リガーセと共に用いられる。もし、 非リン酸化アダづターが用いられる場合、未反応アダプターは、結合後、スペル 三ン　テトラハイド０′）０ライドで沈殿をせて直接除去てれる（ターづス（Ｈ ｏｏρＣキ）ら。文献３）。

リン酸化アダＪＶターが用いられる場合、適当な制限酵素での特異的切断及びス ペル三ン　テトラハイドロクロライトでの沈殿の前に、結合混合物は、まずフェ ノール／クロロホルム混合物で抽出はれ、次いでエタ。

ノールで沈殿きれる。

適当なバクテリア細胞が調製されプラスミドで形質転換又は＋ｌ／　ｌ　３のＤ 　、’Ｖ　、４にてトランスフェクト芒れる。

これはタゲルト（Ｄａｑｒｒｌ　ｌとエーリツしく　Ｅｈｒｌｉｃｈ　）の方法 （文献４）に従い行なう。

これらのベクターの構造を下記第２表に示す。その構造は、出発ファージを切断 する制限４素の性質、得られたワラクメシトに対する特殊な処理及びこうして露 出された部位に結合させられた挿入物（１ｎｓｅｒｔ　）の性質に関連している 。

ファージｈｆ　ｌ　３　ｍ　ｐは、Ｂ　Ｒ７−社（Ｍｅｓｓｅｒｓ、　ＢＲＬ　 ）より市販されているＯ Ｍｌ　３　ｍ　ｐ　７０１は、右側に位置するフラタメシトＰｓｔ　ｌ　−Ｅｃ ｏＲｌ　（ＣＴＧ　Ｃ，９Ｇ　−、、ＧＡＡ　ＴＣＣ）をＣＴＧＣ！ノＧ　Ｃ， ４，イ　ＴＴＣという配列で置き換えることにより、ｌＩ　ｌ　３　ｍ　ｐ　７ から得られる。

Ｆ：１７ｒ築の原理を次のス＋−乙に記載する。

ＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ ＴＧＣ八ＧＣＡＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣＭ１３ｍｐ７０１Ｔ Ａ ↓ Ｔ Ａ Ｔ Ａ Ｔへ Ａ ＡＴＧ　ＡＣＣＡＴＧ　ＡＴＴ　ＡＣＧ　ＡＡＴ　ＴＣＣＣＣＧ　ＧＡＴ　ＣＣ ＣＡＡＧ　ＣＴＴ　ＧＧＧ　ＡＴＣＣＧＴ　ＣＧＡ　ＣＣＴ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　 ＡＴＴ　ＣＡＣＴＧＧ　ＣＣ（註）　（”）　’Ｊ　ン酸化Ｈｒｎｄ■　配列Ｃ ＣＡＡＧＣＴＴＧＧ　のアダづ（Ｃ）非リン酸化紐■配列Ｃ−４Ｇ　、ＪＴ　Ｃ Ｔ　Ｇ　のアダづり（ｒ）Ｊ／、ｌ　３　ｍ　７）のＥｃｏＲｌ−Ｂａｍ１ｆ　 Ｉ　フ５り）ｙト。

（ハＰｓｌ　１部位にアダプターを結合し１．４を充填し、スフレアーぜＳエ　 で処理。

酵素（制限醇泰、Ｄ　ｉＶ　、４ポリメラーゼ、Ｔ　、４Ｄ　＃　、−７９カー ぜ）の使用づロトコールは、製ｊ責会社の指示に示を持つ合成オリづヌクし才子 ド〔コラポラテイラ　リサーチ、インコーホレイテッド（Ｃｏ１１θｂθｒｔｒ ｌｒυｅＲｅｓｅａｒｃｈ　、　Ｉｎｃ、）　、ｒ）　ル寸ム（Ｗａｌｔｈｔｒ ｍ　）　、マ’ｊチューセッッ（ＭｔｒＳＳ　）　０２　＋　５４、アメリカ合 衆国（Ｕ　Ｓ、４　）　）である。

リコシしすントファージＭＩ３ｔｑＩ　ｌ　８の配列が確かめられた。ファージ Ａｆ１３’ｑｌ１８及びｍｐ７０１の二重＠ＤＮＡは、アイシューホロビッツ　 ディー・（Ｉｓｈ　−Ｈｏｒｏｗｉｔｘ　Ｄ　）及びパーク　ジエイ　エフ（Ｂ ｕｒｋｅ　Ｊ、Ｆ、）の方法（Ｎｕｔｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　９　。

２９８９〜２９９８　（＋９８１）参照）により精製し、適当な制限酵素で切断 し、子牛の腸のアルカリフオスファターぜ（シグマ社製）を用いて脱リン酸化し た０ 第４図は、問題としている種々の、ｌ／　１３フアージ並びにそれらの製造に用 いるファージｍｆｉ７及びｐｎ　ｐ７０１を示ず。

第４図には、ファージのＤ！■Δ配列に加えて、対応するタンパク及び制限部位 をも示しだ。

図の右側には、ファージ・ｌ１１３がＥコリ、特にＪ　＃１０３株、に挿入これ たときの□す＋ｒａ伝子に対するα−相補性（（Ｊ、　−ｃＬ）ｔｎ戸１　ｅｍ ｅｎｌａｌ　ｉ　ｏｎ　）の有無をも示しだ。

実施例２ 狂犬病の糖蛋白の遺伝子フラグメントの製造シューホロビッツのクリアー　ライ セード　メソッドにより精製した。５００μノのプラスミドＤＮＡをＩｆｒｎｄ ■及びＬ旦　Ｉ制限酵素により切断した。消化生成物を低温のアカ０−スゲも（ ＢＲＬ社製）の上に載置した。水動後、１．、ｆ、ｋｂ　のバンドを含むゲルを 切出し、６７°Ｃで溶解し、フェノール処理し、エタノールシア社製）のカラム にかけた。流出した分画をエタノール（２倍容量）で沈殿させ、１００μｅのＴ Ｅ緩衝液に溶解した。かくして２００μｑの精製Ｄ　、Ｖ　、４を得た。

１１、制限酵素による消化 各サブフラグメントのクローニングのため、５μｑの精製Ｄ　Ｎ　Ａを適当な制 限酵素で消化した。

上記に示された様にして製造きれたベクター中に、狂犬病の糖蛋白の遺伝子すづ フラグメントを結合をせだ。結合は、製造会社の推奨する条件下で、等ｔルの割 合で行なわれた。

結合生成物は、ＥＣｏｌｌＪＭ１０３なる細菌中に形質転換された。得られたフ ァージス１３中の挿入物の存在及び寸法は、バーンポイン　エイチ　シー（Ｂｉ ｒｎｂｏｉｍ　Ｈ，Ｃ，）及びドーリ−・ジエイ（Ｄｏｌｙｊ　）の三ニーライ セード　メソッド〔ニュークしイソ２　アシラス　リサーチ（Ｎｕｔ（、，４ｔ ｒｄｓ、　Ｒｅｓ、）。

（′こ藩を才るＩＪ　ｍｌシしすシ（・ファージが得られた。

ワ］−）シすシト　ファージを、炭素源としてコハク酸ｊ　ｌ−りつム（０５％ ）を１］［１えたＭ９　最少限培地〔三う−　ジエイ　エイチ（、ＷＩｌｌｅｒ 　Ｊ、　Ｉｆ、）　、イクスペリメンツ　イン　七し＋ニラー　ジエネテイツク ス（ＥｘｐｒｒＩｍｔｒｒｔｓ　ｒｎ　、Ｗｏ（ｅｃｕｉａｒ　Ｇｅｎｔｌｒｔ ｓ　）　（ｌ　９７　’ｌ　）。

」−１シｌ；　スづリンク　ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｒ＋ｒｃｌ’　５ｐｒ ｘｒｑ　ｌ１ａｒｂｏｒ　ＬａｈｏｒａｉｏｒＶ）　〕ｌ　Ｏ７中で、０Ｄ６６ ｏが０．２５　になるまで培養した。この段階で、Ｌ（３５Ｓ）−メチオニン（ １２１１Ｃｉ、／）ｎｌ　）又び渥ヅ５μｑ／肩ｌのＬ−メチオニンと共に、７ ｍ曵−Ｑ、　ｌ　ｒｎ　、ＷのＩＰＴＧ（イソづロヒルチオカラク１゛ヒラノシ １４′）を加えた。１時間の取り込み時間の後、細菌を収穫し、濃度２ノη／　 ｍｌのり９チームの存在下、４　”Ｃで５分間溶菌した。清澄１′ヒさせた上澄 液を抗狂犬病積上日抗体（ウィスター　インステイテ１−１−　（Ｗｒｓ（ｒｒ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　）　、米国より供給をれだ〕と４°Ｃて１６時間、次いで ８ノ歿のプロティンΔセファロース（ファルマシア社製）と２５゛Ｃで１時間イ ン士ユベートした。

これ：〆ま、ラセ　アール（Ｌａｔｈｅ　Ｒ，）らの方ｌ去（ｖａＬｕ＝　２８ ４，４７３＝４７４（１９８０）　）に従い行なつｔ０完全に洗浄後、このプロ ティー）Ａを、１０％ア２リルア三Ｆ　＋　ｓ　／、）　、５の慣用ゲル〔ラエ ムリ　ユーザー（Ｌａｅｙｎｍｉｉ　Ｕ、に、）　、Ｎａ１ｕｒｃ、２２７．　 （５３Ｑ−６８５（１９７０））にかけた。

泳動後、ゲルをｐｐｏで処理し、次いで乾燥路せ、きらした（　ｅｘ）ｊｏｓｅ ｄ　）　（ポンす−　ダラリュー　エム（Ｂｏｎｎｅｒ　ＦＭ、）及びラス士− アールニー（Ｌａ５ｋｔｙ　Ｒ，，４，）、１−０ヒアン　ジャーｊル　オフ　 ハイオケＥストリー（Ｅｕｒ、　、　ｊ、Ｂｒａｔｈｅ？ｎ、）　４　（ｆ）　 。

８３〜８８（ｉＱ７４））。

これらの研究は、細菌により合成をれた糖蛋ＥＩ及び寸づフラクメンｌ−か、抗 血清、持にＩｈ　ｎｄ　ｉｌｌ　／’　Ｐヨー１、Ｌアｌｉｔ／力ヱ１、Σ凭Ｉ ／Ｐ；ｔｌ及びＬ屁ＩＩＩ／”’ヱ１の配列にＬリコードきれたフラグメントに よって、効１）す的に認識逼れることを示すものである。

実施例５ 本発明に従うプラスミドの製造は、まｉ’　ｐ１３Ｒ３２２のｒＮ数起点を１） ゛むづラス三Ｆ□、該づラス三１；　ｏアムヒ程で単一のｉｉｉ’ｌ限部位を舌 に得るために、Ｍ　ＩＪ克・つ過程て干渉性制限部位を消失埒せる必要かある。

１−戸／Ｎン３２２におシするＰ５１１部位、Ｄ抑制ｉ”ｌｌ用−Ｆ　’：”＋ ”　Ｉｆ’ｉ　ｊ　ラスＥ　Ｆ　＆ｉ　ｌ’Ｂ”　３２２　ｆ　アル。シカ−し なρ・らこえＬば８ｍ　ｐ　Ｒ遺伝子の内部にムゴＩ耶］限部（立を有する一Ｆ ｉｌｌかある。なせならば、同一性質の部イ立う・後にクローン１シ二・ノーン で唯一の制限部位としてｆｊ用でれるからである。従って、づラス三Ｆ　ｐＢＲ ３２２の突然変異体、１！ＩＪちづラス三ｌ−′戸ＵＣ’ｉ３を用いて芹ゴーＩ 耶］限部位を消失芒ぞるのが適当である。」二記プラス三トｐＵｃ　３に？いて は、アムヒシリン耐性遺伝子はＬユＩ制限部位を有していない（この部位はイン 、しドＯにおける突然変異によシ除去されている）。ｐＢＩＸ　３２２は市販さ れており、特にベセスダ　リ寸−チーラボラトＩＪ　−ｆｉ　（Ｂｒｔｈｅｓｄ ａ　Ｒｅ５Ｉ！ａｒｃｈ　Ｊ−ａ／ｒｏｒａｉｏｘｅｓ　）Ｊ：り市販されてｈ ・す、またｐＵＣ３は文献５に記載されている。

本実施に当っては、ｐＢＲ３２２における１、　６６９１’戸の灼上ｌ／つ二■ フラタメンＩ〜をづラス三ト□ＷＣ８からの同様のＰｖｕ　１７　／）、、　■ フラタメントにより置換える。この置換の実施のために、フラス三ト□ρ１３Ｒ ３２２及びｐｖｃ　ｓを速読的にＰ−ｕ　ｌ及びたヱ■で処理し、次いてリガー ゼを用いて円形にする。

かくしてもばやＰｓｔｌ制限部位を有さす、また当切１’ＢＲ３２２上に存在し ていた（第５図には示てれていない）・■ｄｅ　ｌ制限部位をも失なったプラス 三１−□ｐＴＧ２−づ口上−夕−Ｐｒ、及びλＮ遺伝子の挿入及びプラス三Ｆ、 Ｉ）ＴＧ　９０７の製造 ｐＴＧ　９０２に挿入するためにラロを一ターＰｚ、及びλＮ　遺伝子を、プラ スミドｐｘｃ　３０から単離する。除去づれたセグメントはまたオペレーターＯ Ｌ　を含有しており、該オペレーターには、実験で示すように、熱感受性しづレ ッサーＣ１８５０が作用する。また上記方法ではＥｔｏＲｌ及びｆｈｎｄｍ部位 の除去も可能であるが、次いで＞、ｔ■ｒｂｓの挿入を可能とするＮ遺伝子の下 流に単一のむ二Ｈ１部位を保持している。づラスミド戸ＫＣ３０は文献Ｏに記載 きれている。

ｐＴＧ　９０２をその単一のＥｔｏＲｌ　制限部位で切断し、生ずる５′−末端 をヌクレアーぜＳ□　で処理して除去する。１３ａｍｌｆ　ｌ　を用いて消化後 、大きい方のフラグメントをゲル上で精製する。

ｐＫＣ３０を畳１、ヌクレアーゼＳ工及びＢａｍ１ｌｌを用いて同様に連続的に 処理して、づ口を一ターＰｔ及びλＮ　遺伝子を有するフラグメントを製造する 。ゲル上で精製後、該フラグメントにリガーゼを作用させてＥｔｏ　Ｒｌ及びｂ 上ｌを融合し、ＢａｍＨ１部位を再構成する。

得られた結合混合物を用いて受容能力を有する（　ｒｏｍｐｅｔｅｎｔ　）宿主 細胞ＴＧＥ　９００　を３０″Ｃでトランスフオームさせる。この細胞株は除去 されていだづロファージλ（１ｙｒｏ戸ｈａｒ　ｑ　ｅλ）、熱感受性λしづレ ッサーを付与する＞、　ｃ　ｌ　８５７　ΔＢａｍΔＨｌ及びＰｔ、から始まる 転写を妨げるのに必要なｒ１８５７を有している。

このことは、・■“媒体中でのＰｔ、の活性が、Ｎ終結阻害作用（＃　ａｎｔｉ ｔｅｒｍｉｎａｔｚｏｎ　ｆｕｎｃｉｒｏｎ　）のために致命的（１ｅｔｈａｌ 　）　なので、重要である。

制限酵素による分析によれば、クロークは正確な構造のプラス三Ｆを含んでおり 、之等は次いで４２°Ｃに２ける生存能力の欠如を調べるだめの試験に供孕れる 。

得られたプラスミドのうちのひとつ、即ち／’ＴＧ９０６を、Ｐａｕ　ｌ　−、 シリｌセグメントに含まれていた制限部位を抑制し且つこの二つの末端の制限部 位を消失させるような方法で、上記Ｐｖｕ　１１−　Ｓａｌ　ｌセグメントが除 去てれるように処理する。これを実施するだめに、１’ＴＧ　９０６を５ｏｌＩ 、ヌクレアーぜ５１ゝり竺−１及びリガーぜで順次処理する。

上記によりプラスミドｉ’ＴＧ　９０７を得る。これはこの段階の最初に述べた すべてのエレメシトを含んでおり、しかもＰｓｔ−１Ｅｃｏ−１Ｈ１ｎｄ−１Ｓ ａｌ−１Ａｖａ−１ｒＶｄ　ｔ′−１Ｐ７）ｕ［ｌ−である。このプラスミドの 合成を第１図に示す。

３−ン、ｔ　［１ｒｂｓ領域のクローニンク不合成における第二の重要なフェー ズは、ｌａｃ　Ｚ’遺伝子（β−カラクトシターぜのα−フラクメント）の開始 部位に、ニー１ｖａ　ｌ　／’　Ｔａｑ　ｌフラグメントの形で／、ｔ　１１　 ｒｂｓ領域を挿入することである。上記遺伝子は・ｌ／１３１ｑｌｌｏと呼ばれ るファージｌ１１３中でクローン１ヒをれる。この手法はｒ７ｉｓに対する簡単 な機能的試験、即ち／　／７　ｔ　Ｚ’＋白の製造を可能とし、七の結果／ＰＴ Ｇ及びＸｑ　ａ　／　の存在下でのフルー　づラークの入手を可能とする。また これは所謂ジデオ士シ法（ｄｒｄｒθχ１ｍｔ・１ｈｏｄ　）　を用い７’Ｔ、 　ｔｊ”（咬の迅速な配列決定をも可能とする。

Ｃ１１ｒｂ３　領域をプラスミド１）ＯＧＩ＋　を起源として分離する。該づラ ス三ト□ばＣｒθ遺伝子の中心からｔ■をコードする領域の中心へと伸びている ン、　Ｈｒヨ［１／　５ａｕ３θフラジメシトを含んでいる（　ｒｒｏ及びＣ■ 　は、特にバクテリオファージλの溶原生成（１ｙｓｏｑｔｎｒｐｓｉｓ　）の 規制に関与している）。

１’ＯＧ　ｌ　１においてｔ［ｌｒｂ領域を含ｔｒ　Ｉ　８６　ｂｆｉ　−４ｖ ａ　Ｉ／Ｔａｑ　ｌ　’：）　’：）クメントを、差し引＠　（ｄｅｔｊｕｔ／ ｃｄ　）、りＬ／ナウ　ポリメラーゼ（Ｋｌ　ｅｎｏｗ　ｐｏｔ　ｙｍｅｒａｓ ｅ　）　で処理する。またファージ−１／１３ｒｑｌｌＯを色−Ｈ１次いでフレ ナラ　ポリメラーゼで処理し、更に子牛由来の陽ホスフアダーセで処理する。得 られたフラグメント（ぞＴ４リカーセを作用づイる。

ｃａｒθＳ　領域を含むｐｏＧｘ　フラグメントの配列及びファージＪ’　Ｉ　 ３１　ｔｙ　Ｉ　ｌ　Ｏの試験により、１ａｌＺ′ｊ告伝子はＣ■　遺伝子の、 ４　Ｕ　Ｇからはじｌる朔訳のための）ニーズ中に存在するが、親の”　ｌ　３ 　’　ｑｌ　ｌ　０株に対応するララーク（ａ白色であるという事実を考慮すれ ば、”１３１ｑｌｌＯの小二Ｉｉ１部位に？・いてＣ１］・ｈ３　を有するフラ タメじ・トを挿入することにより、１−ランスフェクトζ几たホ■Ｉ菌の醗酵後 にづループラータの生成が生じるものと予測される。

づルーづラークを除去し、コロニーを次いで三ニー調製ｍｒｎｉ　−ｐｒｅｐａ ｒａｔＩｏｎｓ　）の酵素的制限の分析ニヨり選別し、得られた構成が正しいこ とを配列決定により確認する。

Ｊ／　］　３　ｔ　ｑ　９１０クローシを得る。その全構造を第６図の下部に示 し、詳述な構造を第７図に示す。

ｃ（Ｉｒｂｓ　フラグメントの挿入によりＢａｍＨｌ及びｔｆＪ、の１１（−７ Ｇ　から妬捷る翻訳によって、Ｃ■　の１３個の末端アミノ酸及びｔｔｒｔ／蛋 白の８個のＮＨ２−末端アミノ酸が融合をれる。

４−づラスミド戸ＴＧ　９０７への＞、　ｃ　■ｒ　ｂ　ｓフラグメントの挿入 本合成の第３段階は、ファージＪ／１３１ｑｌｌｏのｃ　［１ｒ　ｈ　ｓ　／　 ／　ａ　ｔ　Ｚ’　）−）　’ｊメシトを、上記で得た戸ＴＧ９０７プラス三ド ベクター上に転移させることからなる。

これを行なうために、まずｃＩｌｒｂｓ　の上流のＥｃｏＲｌ、μ１ｍ１ｌｌ及 びＪ　７／　ａ　１　部位を除去し、次いでＬａ■部位を挿入するのが適切であ る。

之等の条件下で、Ｃ１１ｒｂＳをＢｑｉ　１ｌ−Ｂｑｌ　［１フラグメン１−の 形に切断し、ｐＴＧ９０７のプロ七−ターＰｒ、及び后■遺伝子の下流のＢａｔ ｎｌｌｌ　部位に配置する。

ファージ＋ｌ／　ｌ　３１　ｑ　９１０　を堕ユＲＩ　で消化し、次いでＢａ１ ３１　及びフレナラ　ポリメラーぜで処理する。

得られるフラグメントに次いで非リン酸化アダづター合混合物を用いて受容能力 のある細胞ＪＭ１０３を形質転換ζぞる。次いでづルー　づラークを選別する。

２等クローンを、次いで之等がｓｑｔ■部位を有し、且つもはや上流にＥｃｏＲ ｌ又はＢ　ａ　ｍＨ１部位を含ぽないことを確認するべく分析を行なう。刀・く して＝ｌ／　ｌ　３１　ｑ９１２のようなりＯｙを得る。そのｆＲ造を第８図に 示す。

Ｌ１３１　を用いた処理により、１０１ｂ７の除去即ちＥｃｏＲｌ　、虞二ＩＩ ｌ　及び倶五１　部位の除去が行なわれる。同様にｌａｔ、４Ｔｃ及びムハＳ　 ｈ　ｉ　ｎ　ｅ　／　Ｄｏｔ　ｑａｒｎ。

配列の除去がなこれる。導入されたＢｑｌ１１部位はｔｌｌの、４　Ｔ　Ｇ　の 約１ＯＯｂｐ上流及びＰ　（ａ　ｃの＋ｏｂｐ下流に位万する。

ファージＭｌ　３１　ｆ　９１２の少ゾＨ１部位をシーＲ１部位で置換するため 、該ファージをμｚｍ／／ｌ　及びヌクレアーゼＳ□で処理し、之等の処理生成 物をｂヱＲ１アダづターＧＧＡＡＴＴＣＣの存在下に結合きせ、かくしてファー ジＭＩ３ｔｑ９１３を得る。

続いて、本合成では、／＞ＴＧ９０７のＢａｍＨｌ及びアダ″ｊターを用いる。

Ｍ］　３　ｔ　ｑ　９．１３のＢｙｔ１／　Ｉｆ、すｌフラグメントを、発現系 の各種エレメントが所望の結果をもたらすことを示す第一の指示を得るために、 得られたづラスニド即ち／）ｆＧ１６１を；■６４３７宿主株に転移する。この 殊はまた１８５７と、形質転換後プラス三Ｆによってコート烙れるα−フラグメ ントに相補的なβ−カラクトシダーゼの０１−フラグメントとを有しており、Ｉ ＰＴＧ十＼！’　ａ’　′Ｔ：’＋’Ａむウェル中て２８°Ｃにおける白色から 、４２゛Ｃで転移された場合、約３０分後に青色への変ｆヒ及び対応するファー ジ・１ｆ１３を消化することにより、狂犬病Ｍ伝子の各種フラグメントが、上記 づラスミド内でＥｔｏＲ１／　Ｐ　ｓｔ　ｌフラグメントの形態で夕０−ンｆＥ される。該制限フラグメントをＴ４リガーゼで結合させる。

この方法により各種プラスミドを得る。即ちファージｊｌ／　ｌ　３　ｒ　ｑ　 ７を起源としてｉ’ＲＧ　ｌ　０７を、ファージＭ１３ｒｑ７　（７）突然変異 体を起源として、１）ＲＧ７１−２２を、Ｍ（３ｒｚ７１−２２　由来のファー ジを起源として戸ＲＧ。７２　及び７３を、ファージＭｌ　３　ｒｑ　ｌ　５１ を起源と（、ＣＩ’ＲＧ１５１を、ファージｊ／　ｌ　３　ｒ　ｑ　１２３を起 源とし−（ｐＲＧ１２３を夫々得る。

応等プラス三トを用いて、Ｅ、ｔｏｌｉ　ＴＧＥ９ＱＯ株を形質転換させる。

各種プラスミドを含む該７”　Ｇ　Ｅ　ｇ　００株を、６６０ｎｍでの光学密度 が０．１になるまで、２８．５°Ｃで富培地（ｒＩｃｈ　ｍｅｄｉｕｍ　）上で 培養し、再度３５°Ｃで５時間イン士ユベートする。細胞を遠心分離により回収 し、ＳＤＳの存在下にゲル上で電気体動させる。

上記ゲル上に分離された蛋白を電気体動でニドＯｔルロース上に転移させる。狂 犬病の糖蛋白に対するｔツクローナル抗体と結合能を有する抗原を、バーネット （Ｂｕｒｎｅｔｔｌ　、Ｉ　９８１　）の方法に従い、１ず上記抗体と培養し、 次いで１２５Ｉ　で標＝−ｙれた、マウスの免疫グロブリンに対するＰ千抗血清 と培養することにより検出する。

オートラジオクラフィーにより放射活性バンドを見る（第１１図）。各結果は以 下の爛に対応する。

４４　・・無挿入のプラス三Ｆ戸ＴＧ　Ｉ　６１１ｎ・・　ＫＤで示す分子量マ ーカーの位置上記試料の性質を考慮すると、認められた各位置は単なる近似値で ある。

特異的に検出されたバンドの位置を矢印で示ず。’ｈ４Ｉ゛にち・いて約３８Ｋ Ｄの軽微なバンドは、この味で発現した狂犬病糖蛋白の配列と抗体との若干の反 応を示し得る。

ウィスター　インステイテユートから供給され、ウィルスを中和する二つのｔツ クローナル抗体１０１−１及び５０９−６の混合物を用いて、狂犬病抗原の最初 の固定を行なう。

実施例７ 培養温度の影響 ＴＧＥ９００／戸ＲＧ＋２３　株を富化培地（ｅｎｒＩｃｈｅｄｍｅｄ　ｒ’　 ｕｍ　）で２８５°Ｃで生育させ、６６Ｏｎ、ｍにおける光学密度を０１とする 。５　ｐＣｉ　ｍｔ−１の活性を有するＬ−５３５−メチ才二シを加え、各分画 （ａ（ｊｑｕｏｌｓ　）を各種温度で５時間培養する。細胞を遠心分離により濃 縮し、ラエムＩＪ　（Ｌａ　ｅｎｎｎｌ　ｉ、＋９７０）の方法に従いＳＤＳの 存在下１０％ポリアタアダア三ドミド上で電気泳動でせる。フルオロクラフィー （Ｌａ５４ｅｙ　＆Ｊ／＋’／／Ｓ、Ｉ　９７５　：］により放射活性ノヘンド を検知する。

七の結果を第１２図に示す。培養温度は以下の通りで分子量マーカーの位置を關 〃１に示す。その分子量はＫＤで表示する。狂犬病糖蛋白の位置を矢印で示す。

該蛋白の生成に対して培養温度が強く影響していることが判り、最高温度ば３４ ５°Ｃである。

１　アイシュ−ホロウイツッ　ディー（Ｉｓｈ−１１ｏｒｏｗｒ　ｅｘ　Ｄ、　 ）及びハーク　ジエイ　エフ（Ｂｕｒｎｔ２Ｑ９８（＋９８１　）。

２　バすヨタトスエヌ（Ｐａｎａｙｏｔａｌｏｓ　４Ｖ、）及びト３　ツーラス 　ビー・シ（Ｈｏｏｐｅｓ　Ｂ、　Ｃ，）及びマクルア゛アール　アー＋１．　 （ｒＶｃｔｌｕｒｅ　Ｒ，Ｒ，）、ニュクレイツク　アシツズ　リサーチ、９． ５４９３−５５０４（＋９８１）。

４　ダゲルト　エム（Ｄａｑｔｒｌ　Ｊ／　）　及びエルリツしニス　ディー（ ＥｈｒｌＩｔｈ　Ｓ、　Ｄ、　）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）、２３−２８（＋９７ ９）。

５　ヴイエイラ　ジエイ（Ｖｉｅｉｒａ　／、　）　及びメシンタ６　シマタケ 　エイチ（Ｓｈｉｍａｉａｋｔ　／／、）及び〇−ぜンバーｐｉ　−エム（Ｒｏ ｓｔｎｂｔｒｑ　ｋｌ、）、ネイ予セ−ＵＶｔｒｉｕｒｅ）、２９２．　１２８ −１３２（＋９８１）。

７　バーネット・タラリュー　エヌ（Ｂｕｒｎｔｔｔｐ　Ｗ、　＋Ｖ、）、アナ リテイカル　バイオケ三ストリー（，４ｎａｌグｔｉｃａｉＢＩＯＩ：ｈ１２ｎ ）、１１２．１９５−２０３（＋９８１）。

８．５エム’Ｊ　ニー　ケー（Ｌａｅｎｎｎｌｉ　Ｕ、　Ｋ、　）　、ネイチＰ −，２２７，６８０−６８５（１９７０）。

９　ラス＋−・アール　ニー（Ｌａ５ｋｅｙ　ＲＪ）　）及び三ルズ　ニー　デ ィー（、ｌｌ１ｌ／ｓ　、４．　ｌ）、　）　、ヨー。ヒアシ　ジセーすル　才 う　バイオケ三ストリー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂ＋ｏｃｈｅｍ　）　、　５　６　 、３　３　５　−　３　４　１（＋９７５）。

ＲＧＬＹＫＳＬＫＧＡＣＫＬＫＬＣＧしＧＬＲＬＩＶＩＤＧＴＷＶ卆　、−ご　 ００ ＋−ｅ　＋−口　←ロ　ヒ０　トΦ　−ロｌＡｌ−−−ｌＡｌ−−−ｕトート ＝（３：ζ　ｚ＜　Ｚ（工（ 声　−諷の　、■４ハτ　、Ｊｎ 八ｕＩＩ 国際調査＋１４ぐ１ ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　Ｙｇ　ＩＮＴＥＲＮＡ７ＩＤＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯ ＲＴ　ＤＮｏ−ｍｓｅｄｉｎ＋−＋ｌ１ｍ０−−＋−ｗＰＣＴ／ＦＲ８３１００ ０９２ＰＣＴ／ＦＲ８３１０００９２ 第１頁の続き ｐｉ）Ｉｎｔ、　ｃｌ、３ａｉｄ別記”ｔ　ＶＪ　内”ＣＩ１番（ＣＩ２　ｐ　 ２１０２ ＣＩ２　Ｒ１／１．２５）６７６０−４Ｆ（Ｃ１２Ｐ　２１０２ ＣＩ２　ＲＣＩ９　）６７６０−旧

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　狂犬病の抗原蛋白を］−ドする有効Ｄ　−Ｖ　Ａ配列の全部又は一部分に対 応するＤＮＡ（１）配列、及びバクテリア中での上記配列の発現のづ口で一ター を少くともな有する、狂犬病の抗原蛋白の発現のためのベクター０ ２、ＤＮ・Ｊ（１）配列が少くとも次の通りである請求の荀囲第１項に記１ｒｉ ！２のへタター。即ち１、Ｊ＆、Ｊ　ＧＧｃ　ＣＴＡ　ＴＡＴ　Ａ、４Ｇ　ＴＣ ＴＴ７’ＡＡＡＡ　ＧＧ−４ＧＣ，４ＴＧＣＡｊノ、ＪＣＴ（：、ぐＪＡＧＴＴ ＡＴＧＴＧＧＡＧＴＴＣＴ、−ｔＧＧ、イＣＴＴ、イＧＡＣＴＴＡＴＧＧＡＴＧ ＧＡＡＣＡＴＧＧ　ＧＴＣＧＣＧ ３　有りＪな部分Ｄ　ＶＡ配列′が、全有効Ｄ　、Ｖ　Ｊ配列の部位Ｌゴ■及び ±二■、五組ｍ−Ｌ匡■又はＬゴ■−２逸Ｊ−Ｉ　間に含まれている請求の範囲 第１項記・戒のベクター。 ４　有効な部分的Ｄ　Ｎ、４配列が、全有効ＤＮＡ配列の部位Ｌヨｉｌｌ　−Ｐ 、匹１又は多重１−．らリー１　間に存する請求の範囲第１項記載のベクター。 ５　部分的有効Ｄ　■Ａ配列が、Ｉｈｎｄ■　部位により５′にも・いて制限さ れている全Ｄ　ＪＶ　Ａ配列中に存する請求の範囲第１項に記載のベクター。 ６、　ファージＩＷ　Ｉ　３のＤ・・■・Ｊの全部又は一部分を含有する請求の 範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載から選ばれたファージのＤ　Ｎ　Ａの全 部又は一部分を含有する請求の範囲第６項記載のベクター。 ８、Ｄ　Ｎ　Ａ　（１）配列の発現のづ口ｔ−ターが、バクテリオファージラム ダづ口を一ターである請求の範囲第１項乃至第７項のいずれかに記載のベクター 。 ９、細菌のプラス二Ｆである請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載のベ クター。 １０　細菌のプラスニドの複製起点、翻訳開始領域及びバクテリオファージラム ダづ口を一ターＰＬ、ＰＲ又１１　翻訳開始領域がン、ｔＩｒｂｓ　である請求 の範囲第１０項記載のベクター。 １２、使用するづ口を一ターが、プｏｅ−夕−Ｐｔ、である請求の範囲第１０項 又は第１１項に記載のベクタ１３　転写終結阻害機能を更に含有する請求の範囲 第１０項乃至第１２項のいずれかに記載のベクター。 １４、転写終結阻害機能が、″ｊＯｔ−ターＰｔ、又はＰＲにλＱ遺伝子である 請求の範囲第１３項に記載のベクター０ １５．１’ＢＲ３２２の複製起点を含有する請求の範囲第１０項乃至第１４項の いずれかに記載のベクター。 １６、抗生物質に対する耐性を］−ドする遺伝子を含有する請求の範囲第１Ｏ項 乃至第１５項のいずれかに記載のベクター。 １７　アンヒシリンに対する耐性をコードする遺伝子を含有する請求の範囲第１ ６項に記載のべ′フタ−８１８づ０七−ターが、りづレツリ−により調節されて いる請求の範囲第１０項乃至第１７項のいずれかに記載のベクター。 １９　りづレッジヨシ配列が、温度上昇により誘発きれる請求の範囲第１８項に 記載のベクター。 ２０、請求の範囲第１項乃至第１９項のいずれかに記載のベクターで形質転換又 はトランスフェクトされた細菌。 ２＋、　Ｅ　コリ又はＢ　スラチリスの菌株である請求の範囲第２０項に記載の 細菌。 ２２、請求の範囲第２０項又は第２１項のいずれかに記載の細菌を、適当な培地 上で培養することを特徴とする狂犬病の抗原蛋白の製造法。 ２３、細菌が、Ｅ　コリ又はＢ　スづチリスである請求の範囲第２２項に記載の 製造法。 ２、特許請求の範囲第２２項又は第２３項に記載の製造法を実施することにより 得られる抗原蛋白。 ２５、少くとも次の配列 ＲＧＬＹＫＳＬＫＧＡＣＫＬＫＬＣＧＶＬＧＬＲＬＭＤＧＴＷＶを含有する狂犬 病の抗原蛋白。 ２６、　請求の範囲第２４項又は第２５項に記載の蛋白を少くとも１種含有する 狂犬病の治療又は予防のだめのワクチン。 ２７　蛋白が水溶液の形態にある請求の範囲第２６項に記載のワクチン。 ２８、クローニング及び発現のベクターとしての次のフ−Ｊ／１３　ｔ　ｅ　ｌ 　２１　。