JPS5936963B2 - Ｔ細胞分離材および分離方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、白血球浮遊液からＴ細胞を分離する疎水性か
つ水不溶性の多孔性分離材および該分離材を用いてＴ細
胞を分離する方法に関する。

ここで云うＴ細胞とは、ノイラミニダーゼ処理したヒツ
ジ赤血球と口ゼットを形成するリンパ球を云い、非Ｔ細
胞とは、Ｔ細胞と認識されないリンパ球、単球および顆
粒球を云う。Ｔ細胞は末梢血リンパ球の７０〜８５％程
度を占め、抗体産生の制御、細胞障害反応等の種々の免
疫反応に関与する細胞であり、従来Ｔ細胞を一段階の分
離手段で獲得することは不可能とされている。

また種々の手段を組合せ、高純度高収率で、かつ生存率
良く獲得することは、免疫学研究の必須の手法であり、
それ故また多くの問題を有している。従来の末梢血から
のＴ細胞の分離方法は、いずれもまず、ソデイウムメト
リゾエイトーフイーコール混液などの高密度等張液を用
いた比重遠心法により、白血球のうち７０〜９０％のリ
ンパ球を含む白血球浮遊液を獲得し、次いで、これを分
離処理している。この後続する分離処理の主なものは次
の三つの方法が知られている。ハ Ｔ細胞と口ゼット形
成能を有するノイラミニダーゼ処理したヒツジ赤血球を
上記前処理液に添加し、数時間以上冷所で放置後、再度
比重遠心法を施してＴ細胞を獲得する。

２）Ｔ細胞の異物表面に対する付着性が非Ｔ細胞にくら
べ低い性質を利用じ（、上記前処理液をナイロン繊維に
接触させ、・繊維に付着しにくい分画としてＴ細胞を獲
得する。

３）螢光標識したＴ細胞を認識する抗血清を用い、上記
前処理液中のＴ細胞を螢光染色し、フルオレセインセル
ソータ一を用いて螢光細胞分画としてＴ細胞を獲得する
。

第１の方法は、ヒツジ赤血球とリンパ球を共存させるこ
とにより、リンパ球を刺激してしまうという欠点を有し
、免疫系におけるＴ細胞の役割を解明する研究目的には
適用しがたい。

第２の方法は、Ｔ細胞と非Ｔ細胞の大部分は分離が十分
にされず、純度の高いＴ細胞はわずかしか得られない。

第３の方法は、理論的には最も高い純度のＴ細胞を獲得
しうる方法であるが、抗血清を用いるために細胞に刺激
や損傷を与えてしまうこと、１個１個の細胞を選別して
ゆくという操作が必須であるため、１０７〜１０８個程
度のリンパ球の大量取得が困難であるなどの欠点を有す
る。

本発明者らは、かかるＴ細胞分離方法の現状をふまえ、
Ｔ細胞を高純度、高収率かつ細胞に免疫的刺激を与えず
に獲得することを目的とし、Ｔ細胞および非Ｔ細胞の異
物表面に対する付着現象に詳細な検討を加えた結果、多
孔性表面を有する水不溶性かつ疎水性の固体が、Ｔ細胞
の選択的分離材として好適に用いうることを見出し、本
発明を完成するに至つた。

すなわち、本発明は、５００λ以上５０００人未満の平
均細孔径を有する疎水性かつ水不溶性の多孔性固体より
なる白血球浮遊液からＴ細胞を分離するＴ細胞分離材で
あり、さらに、５００Å以上５０００λ未満の平均細孔
径を有する疎水性かつ水不溶性の多孔性固体よりなる白
血球浮遊液からＴ細胞を分離する分離材に、白血球を１
９／ｄｌ以上の蛋白質を含む液中で接触させることを特
徴とする白血球浮遊液からＴ細胞を分離する方法である
。

本発明のＴ細胞分離材を用いることにより、初めてＴ細
胞と非Ｔ細胞の異物表面に対する付着性の差が著明とな
り、白血球浮遊液を該分離材に蛋白質共存下で接触させ
ることにより、Ｔ細胞のみを非付着細胞として効率良く
獲得することが可能となつた。本発明で云う白血球浮遊
液とは、リンパ球、顆譬粒球、単球などの白血球が浮遊
しており、赤血球の混入は白血球数の１０倍以内のもの
を云い、遠心法、比重遠心法、デキストラン沈澱法等い
ずれの方法により調製したものでもよい。

本発明における前記の効果は、疎水性の固体を用いた場
合でも平滑な表面の場合には十分に発現されず、５００
Å以上５０００八未満の平均細孔径を有する疎水性かつ
水不溶性の多孔性分離材が形成する表面において初めて
発現され、より好ましくは、６００Å以上３５００八未
満の平均細孔径のものが用いられる。

ここでいう平均細孔径は、水銀圧入式ポロシメーターに
より測定される。

この方法は多孔性物質に水銀を圧入して行き、浸入した
水銀量から水銀孔量（単位重量あたりの浸入した水銀量
）を求めるとともに、細孔の直径とその孔に水銀を圧入
するに要する圧力は反比例するという原理に基づいて細
孔径分布を測定するものである。

この方法の詳細は、成書、フアイン・パーテイクル・メ
ジヤーメント（ＦｉｎｅＰａｒｔｉｃｌｅＭｅａｓｕｒ
ｅｍｅｎｔ）クライド・オア・ジユニアおよびジエ・エ
ム・ダアラアバアル（Ｃｌｙｄｅ−０ｒｒ−Ｊｒ・Ａｎ
ｄＪ．Ｍ．Ｄａｌｌａｖａｌｌｅ）共著、ザ・マクミラ
ン・カンパニー、ニユ一・ヨーク（ＴｈｅＭａｃｍｉｌ
ｌａｎＣＯｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹＯｒｋ）１９５９年に
言ｖ観されている。この方法では３５〜４０人までの細
孔径分布を測定することが可能である。本発明における
平均細孔径とは、横軸に細孔（ｒ）を対数目盛で表わし
、縦軸をＤｖ／ＤｌＯｇｒ（ここで、ｖはポロシメータ
ーで測定した累積水銀孔量）で表わす孔径分布図におい
て、上記文献の方法によつて得られた細孔径分布曲線と
横軸とで囲まれる閉区間を左右等面積に縦軸に平行に区
切つたときの横軸上の細孔径値と定義する。

平均細孔径が過小の場合は、前述のように平滑な表面と
なり、非Ｔ細胞の分離材への付着が十分でない。平均細
孔径が過大の場合は、Ｔ細胞をも付着するようになり、
Ｔ細胞の溶出は困難であり、実用に供しえない。本発明
において、孔とはその孔径が４０λ以上あり、かつ表面
からの連通孔と定義し、水銀孔量もその孔に由来する値
である。

本発明の分離材に用いられる固体は疎水性であることが
必要であり、具体的には、これらの素材として、エチレ
ン、プロピレン、塩化ビニル、酢酸ビニル、スチレン、
ジビニルベンゼン、アクリロニトリル、メタクリル酸メ
チルなどの重合体および共重合体、またはナイロン、ポ
リカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエ
ステル共重合体などがある。

Ｔ細胞分離材の調製方法は特に限定されないが、重合過
程で比較的自由に多孔化高分子を調製できる。

特にスチレンなどのモノビニル単量体とジビニルベンゼ
ンなどの架橋重合性単量体を共重合して得られる多孔性
共重合体が好ましい。ここで云うモノビニル単量体とは
、ほとんどすべてのビニル単量体が該当する。

すなわち、スチレン、メチルスチレン、ジフエニルエチ
レン、エチルスチレン、ジメチルスチレン、ビニルナフ
タリン、ビニルフエナントレン、ビニルメシチレン、３
，４，６−トリメチルスチレン、１−ビニル２−エチル
アセチレン等の炭化水素化合物：クロルスチレン、メト
キシスチレン、プロムスチレン、シアノスチレン、フル
オルスチレン、ジクロルスチレン、Ｎ，Ｎ−ジメチルア
ミノスチレン、ニトロスチレン、クロルメチルスチレン
、トリフルオルスチレン、トリフルオルメチルスチレン
、アミノスチレン等のスチレン誘導体：メチルビニルス
ルフイド、フエニルビニルスルフイド等のビニルスルフ
イド誘導体：アクリロニトリル、メタクリロニトリル、
α−アセトキシアクリロニトリル等のアクリロニトリル
誘導体：アクリル酸、メタクリル酸：アクリル酸メチル
、アクリル酸ラウリル、アクリル酸クロルメチル、アセ
トキシアクリル酸エチル等のアクリル酸エステルリメタ
クリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸ジメチルアミノ
エチル、メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸テトラ
ヒドロフルフリル、メタクリル酸ヒドロキシエチル等の
メタクリル酸エステルリマレイン酸ジエチル、フマル酸
ジエチルリメチルビニルケトン、エチルイソプロペニル
ケトン等のビニルケトン、塩化ビニリデン、臭化ビニリ
デン、シアン化ビニリデン等のビニリデン化合物：アク
リルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−ブトキシメチルア
クリルアミド、Ｎ−フエニルアクリルアミド、ジアセト
ンアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアク
リルアミド等のアクリルアミド誘導体：酢酸ビニル、酪
酸ビニル、力プリン酸ビニル等の脂肪酸ビニル誘導体：
チオメタクリル酸フエニル、チオアクリル酸メチル、チ
オ酢酸ビニル等のチオ脂肪酸誘導体：さらにＮ−ビニル
スクシンイミド、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルフ
タルイミド、Ｎ−ビニルカルバゾール、ビニルフラン、
２−ビニルベンゾフラン、ビニルチオフエン、ビニルイ
ミダゾール、メチルビニルイミダゾール、ビニルピラゾ
ール、ビニルオキサゾリドン、ビニルチアゾール、ビニ
ルテトラゾール、ビニルピリジン、メチルビニルピリジ
ン、２，４−ジメチル−６ビニルトリジアン、ビニルキ
ノリン等の異節環状ビニル化合物がある。また、架橋重
合性単量体としては、ジビニルベンゼン、ジビニルトル
エン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタリン、ジビニ
ルエチルベンゼン、ジビニルフエナントレン、トリビニ
ルベンゼン、ジビニルジフエニル、ジビニルジフエニル
メタン、ジビニルジベンゼン、ジビニルフエニルエーテ
ル、ジビニルジフエニルスルフイド、ジビニルジフエニ
ルアミン、ジビニルスルホン、ジビニルケトン、ジビニ
ルフラン、ジビニルピリジン、ジビニルキノリン、ジ（
ビニルピリジノエチル）エチレンジアミン、フタル酸ジ
アリル、マレイン酸ジアリル、フマル酸ジアリル、コハ
ク酸ジアリル、炭酸ジアリル、シユウ酸ジアリル、アジ
ピン酸ジアリル、セバシン酸ジアリル、酒石酸ジアリル
、ジアリルアミン、トリアリルアミン、リン酸トリアリ
ル、トリカルバリル酸トリアリル、アコニツト酸トリア
リル、クエン酸トリアリル、Ｎ，Ｎ′一エチレンジアク
リルアミド、Ｎ，Ｎ′−メチレンジアクリルアミド、Ｎ
，Ｎ′−メチレンジメタクリルアミド、エチレングリコ
ールジメタクリレート、トリエチレングリコールジメタ
クリレート；゛ポリエチレングリコールジメタクリレー
ト、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペン
タエリスリトールテトラメタクリレート、１，３−ブチ
レングリコールジアクリレート、１，６−ヘキサンジオ
ールジアクリレート、トリメチルプロパントリアクリレ
ート、ペンタエリスリトールテトラアクリレート、トリ
アリルイソシアヌレート、１，３，５トリアクロイルヘ
キサヒドロ一１，３，５−トリアジン、ジアリールメラ
ミン等が含まれる。

本発明のＴ細胞分離材の形状は特に制限はなく、球状、
繊維状、ペレツト状などいずれも用いうるが、分離効率
を向上させるためには、水中において７５ミクロン以上
８００ミクロン未満の粒径を有する球状のものが好まし
い。この場合、過小な粒径のものは、Ｔ細胞の非特異的
付着力塙まり好ましくない。また過大な粒径のものは接
触確率が低下するために、大部分の白血球は十分に分離
されずに流出してしまう。Ｔ細胞分離材の水銀孔量は、
前述の平均細孔径と同じく水銀圧入式ポロシメーターに
より測定される値であるが、０．１ｍ１／９以上４ｍ１
／９未満であることが好ましく、０．３ｍ１／９以上３
ｍ１／９未満であることがより好ましい。

過少な水銀孔量を有するＴ細胞分離材は、平滑な表面を
有する場合と同様に、十分に白血球浮遊液中の非Ｔ細胞
を付着することができず、また過大な水銀孔量を有する
Ｔ細胞分離材は強度の低下をきたし、いずれも非実用的
である。

Ｔ細胞分離材が酸性官能基を有することは、Ｔ細胞のＴ
細胞分離材への付着を抑制する効果をもたらすので好ま
しい。

酸性官能基としては特に制限はないが、スルホン基、カ
ルボキシル基、ホスホン基およびフエノール基が好まし
い。また酸性官能基の固体への導入方法は、モノマー段
偕で導入しても、重合後に付加反応により導入してもよ
い。酸性官能基の交換容量は、水中において１ｍ１容量
あたり０．１ミリ化学当量以下であることが好ましい。

過大な化学当量の場合、非Ｔ細胞のＴ細胞分離材への付
着をも抑制することとなり、Ｔ細胞分画のＴ細胞純度が
低下してしまい好ましくない。本発明における白血球浮
遊液の調整方法は、遠心分離により得られる白血球層も
しくは比重遠心法により得られるリンペ球層より得るこ
とが一般的であるが、比重遠心法の方が顆粒球の混入が
少なく実用的である。また、Ｔ細胞分離材と白血球の接
触に際しては、１ｇ／ｄｌ以上の蛋白質を含む液、好ま
しくは自己血清、動物血清、哺乳動物の胎児血清を３０
％以上含む培養液もしくは緩衝液、さらに好ましくは１
００％の哺乳動物の胎児血清が用いられる。

１ｆ！／ｄｌ以下の蛋白質を含む緩衝液を用いた場合、
Ｔ細胞分離材へのＴ細胞の吸着率が増加する傾向にある
。

また、あらかじめＴ細胞分離材を１９／ｄｌ以上の蛋白
質を含む液を用いて蛋白質コーテイングを行つておけば
、分離操作の際、その度にＴ細胞分離材を蛋白質溶液で
洗浄する必要がなく、分離操作が簡便になり、便利であ
る。

本発明のＴ細胞分離材は、図面に示すようなＴ細胞分離
器に形成して用いるのが好適である。

Ｔ細胞分離器を図面に基いて説明すると、白血球浮遊液
ならびに洗浄液を注入する入口１と、白血球浮遊液なら
びに洗浄液を流出させる出口２とを持つたカラム３に、
出口の所にＴ細胞分離材が流出しない程度の孔径を有す
るフイルタ一４を取り付け、カラム３内に前記したＴ細
胞分離材５が充填されているものである。なお、フイル
タ一４は入口側にも設けてよい。上記の如きＴ細胞分離
器を用いて白血球からＴ細胞を分離するには、まず血液
から遠心法、比重遠心法などの方法により調整した白血
球を、１９／ｄｌ以上の蛋白質を含む液に浮遊せしめる
。

この液をあらかじめ１９／ｄｌ以上の蛋白質を含む液で
洗浄した分離器に注入し、浮遊液が本発明のＴ細胞分離
材に浸潤し終つた時点で流出を止め、一定時間静置し、
その後、洗浄液を流して未付着細胞を洗い出すことによ
り行う。以上の方法により洗い出した洗浄液中には、Ｔ
細胞が含まれることとなる。

白血球浮遊液の分離器中での静置時間は、非Ｔ細胞のＴ
細胞分離材への付着を十分に行うために、３０分から６
０分程度静置することが好ましい。

分離操作の際の温度は、細胞障害を与えない温度であれ
ばいずれでもよいが、室温（１８〜２５゜Ｃ）から３７
℃程度の範囲が好ましい。このようにして得られたＴ細
胞は、生存率、幼若化能、抗体産生調節能などはいずれ
も、分離操作前と比較して変化は認められなかつた。

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。

実施例 １ 分離材の調製： 還流冷却器、ステンレススチール製二枚羽攪拌器、温度
計を備えた３１の三ロフラスコにジビニルベンゼン（純
度５６％、不純物として４４％のビニルエチルベンゼン
を含む、以下５６％ジビニルベンゼンと記す）１００９
、フタル酸ジメチル１５０９、アゾビスイソブチロニト
リル１９を加え均一溶液にする。

さらに部分ケン化ポリビニルアルコール１，５９、塩化
ナトリウム６０９を溶解した蒸留水１５００９を加え、
２００ｒｐｍの回転数で攪拌を行いながら６０℃で１時
間、７０℃で２時間、８０゜Ｃで２時間、さらに９０℃
で４時間加熱した。生成した共重合体は良好な球状であ
り、直径６０ミクロン以上１０００ミクロン未満の範囲
にあり、平均細孔径は１４００λ、水銀孔量は１，１ｍ
１／９であつた。

このものをＴ細胞分離材として用いる。

分離器の作成： 該分離材をステンレス篩で分級し、１５０以上３５０未
満ミクロンの粒径のものを２ｍ１分けとり、リン酸緩衝
液加生理食塩水（以下ＰＢＳと略す）に充分に浸し、洗
浄後、この分離材を底面に５０ミクロンのナイロンネツ
トのフイルタ一を取付けた液入口と出口とを有する内径
１０ｍｍのアクリル製カラム（図面参照）に、気泡が入
らないように注意しながら充填することにより作成した
。

分離操作：ヘパリン加ヒト末梢血からソデイウムメトリ
ゾエイトーフイコール混液（２０℃での比重１．０７７
）を使つて、比重遠心法により分離し、ＰＢＳで洗浄し
た白血球分画（Ｔ細胞６４．９％を含み生存率９８％）
を４×１０６／ｍｌの濃度で１００％牛脂児血清（蛋白
含有量４．３９／ｄｌ）に浮遊させた液０．５ｍ１を調
整する。

このものを前もつて１００％牛脂児血清４ｍ１で洗浄し
た分離器の入口より静かに流し込み、浮遊液が充分に分
離材に浸透し終つた時点で、液の出口を閉じて流出を止
めた。その後、３７℃１時間静置後、出口を開いて、Ｐ
ＢＳ４ｍｌをカラム入口から流し込み、自然落下の流速
で分離材に吸着していない細胞を洗い出して回収した。
リンパ球の分析 全全細胞回収率は、自動血球計数器または血球計算盤を
使つての顕微鏡観察により求めた。

また、Ｔ細胞をノイラミニダーゼ処理羊赤血球とのロゼ
ツト反応により求めた。細胞の生存率はトリパンブルー
による色素排除試験法により求めた。

結果は表１に示す。

実施例 ２ 実施例１で使用した反応容器に、５６％ジビニルベンゼ
ン１００９、トルエン３００９、アゾビスイソブチロニ
トリル１９を加え均一溶液とする。

以下実施例１と同様の操作を施し、球状の共重合体を得
た。このものの粒径範囲は、６０ミクロン以上１０００
ミクロン未満であり、平均細孔径は２３００八、水銀孔
量は２．９ｍ１／９であつた。このものを１００ミクロ
ン以上３００ミクロン未満の範囲で湿式分級し、実施例
１と同様のカラムに充填し、Ｔ細胞分離器とする。実施
例１と同一白血球浮遊液を用い、同一の分離操作を施し
た後の結果を表１に示す。

実施例 ３ 実施例１で使用した反応容器に、５６％ジビニルベンゼ
ン１００９、アジピン酸ジオクチル１５０９アゾビスイ
ソブチロニトリル１ｆ！を加え均一溶液とする。

以下、実施例１と同様の操作を施し、球状の共重合体を
得た。このものの粒径範囲は６０ミクロン以上５００ミ
クロン未満であり、平均細孔径１１００紙水銀孔量は１
．７ｍ１／９であつた。このものを３５０ミクロン以上
４５０ミクロン未満の範囲で湿式分級し、実施例１と同
様のカラムに充填し、Ｔ細胞分離器とする。実施例１と
同一白血球浮遊液を用い、同一の分離操作を施した後の
結果を表１に示す。

実施例 ４ 実施例１で調整した共重合体をクロルスルホン酸を用い
てスルホン化処理を施した。

このものの交換容量は、湿体１ｍ１あたり０．０５ミリ
化学当量であつた。このものを１５０ミクロン以上３５
０ミクロン未満の粒径範囲で湿式分級し、実施例１に用
いたと同じカラムに充填し、ＰＢＳにてよく洗浄した後
、４ｍ１の１００％牛脂児血清を添加し、一夜室温放置
し、ＰＢＳにて洗浄を行つた。

次に実施例１で用いたと同一の白血球浮遊液を用い、分
離器の入口より静かに流し込んだ。

以下、実施例１と同様の操作を施した結果を表１に示す
。実施例 ５実施例１と同一の操作を、牛脂児血清の代
りに５０１）アルブミンを含むＰＢＳを用いて行つた。

結果を表１に示す。比較例 １ ナイロンフアイバ一（和光純薬業株式会社から講入）を
ピンセツトでよくほぐし、０．３１を５ｍ１容量のプラ
スチツク注射器に入れ、２．５ｍ１の目盛まで均一につ
めた。

該注射器に５％の牛脂児血清を含むＰＢＳを満たし、１
時間放置後、実施例１で用いたものと同一のリンバ球浮
遊液を０．５ｍ１・上部より注入し、３７℃で１時間放
置した後、ＰＢＳｌＯｍｌにて２ｍ１／分の流速で非吸
着細胞を流出させ、Ｔ細胞分画を得た。

結果を表１に示す。

以上説明したように、本発明によれば、分離に際してＴ
細胞を免疫的に刺激せず、新鮮なＴ細胞を高純度、高収
率で獲得できる効果があり、また分離器の件成力熔易か
つ安価となり、さらに白血球と分離材の接触に際し、蛋
白質を共存させることにより、非特異的付着を抑制し、
迅速にＴ細胞の分取が可能となる効果がある。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明のＴ細胞分離器の一例を示す断面図である
。 １ ・・・・・・液の入口、２・・・・・・液の出口、
３・・・・・・カラム、４・・・・・・フイルタ一、５
・・・・・・Ｔ細胞分離材。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ５００Å以上５０００Å未満の平均細孔径を有する
   疎水性かつ水不溶性の多孔性固体よりなる白血球浮遊液
   からＴ細胞を分離するＴ細胞分離材。 ２ 疎水性かつ水不溶性の多孔性固体が粒状であつて、
   水中での粒径が７５ミクロン以上８００ミクロン未満で
   ある特許請求の範囲第１項記載のＴ細胞分離材。 ３ 疎水性かつ水不溶性の多孔性固体の水銀孔量が０．
   １ｍｌ／ｇ以上４ｍｌ／ｇ未満である特許請求の範囲第
   １項記載のＴ細胞分離材。 ４ 固体が水中において１ｍｌ容量当り０．１ミリ化学
   当量以下の酸性官能基を有する特許請求の範囲第１項記
   載のＴ細胞分離材。 ５ 酸性官能基がスルホン基、カルボキシル基、スルホ
   ン基またはフェノール基である特許請求の範囲第４項記
   載のＴ細胞分離材。 ６ ５００Å以上５０００Å未満の平均細孔径を有する
   疎水性かつ水不溶性の多孔性固体よりなる白血球浮遊液
   からＴ細胞を分離する分離材に、白血球を１ｇ／ｄｌ以
   上の蛋白質を含む液中で接触させることを特徴とする白
   血球浮遊液からＴ細胞を分離する方法。 ７ 蛋白質が哺乳動物の胎児白清蛋白質である特許請求
   の範囲第６項記載の白血球浮遊液からＴ細胞を分離する
   方法。