JPS5934890A - Ｌ−イソロイシン類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｌ−イソロイシンは必須アミノ酸の一つとして医薬品及
び栄養的に広い用途がある。又Ｌ−アロイソロイシンは
容易に得難い試薬で双方共に高価なアミノ酸である。Ｌ
−イソロイシン（以下Ｌ−ｉＬｅｕと略す）の製法とし
ては化学的合成法及び醗酵的製法がある。前者は２−メ
チルプクナール又はメチルエチルケトン等から合成し得
る事は公知であるが、工程も長く且４種の光学異性体（
Ｌ−１Ｌｅｕ、　Ｌ−アロイソロイシイＤ−インロイシ
ン、Ｄ−アロイソロイシン）が併生するため、此等の単
離精製は極めて煩雑なものである。故に現在では醗酵法
によって行はれている。醗酵法としてはＤＬ−α−アミ
ノ酪酸。

Ｄ−スレオニン、α−オキシ酪酸等を前駆体として添加
して培養を行う外、ブレビバクテリウム属細菌のび一ア
ミノーβ−オキシバレリアン酸耐性菌やスレオニン生産
菌から誘導されたＤＬ−エチオニン耐性菌の如き変異株
を育成して培養する方法が知られている０此等の変異株
はＬ−ｉＬｅｕの生合成酵素系が培養液中に生成せるＬ
−ｉＬｅｕにより阻害されるという欠点を回避するため
に種々菌株改良・育成が行はれた結果得られた。このよ
うな労作の外、醗酵法による場合はＬ−ｉＬｅｕの外多
種類のアミノ酸の副生が避は難く必ずしも有利とは云え
ない。

本発明者等は近年合成化学的に安価且容易に入手出来る
ｄｌ−α−ケト−β−メチルバレリアン酸（以下ｄｌ−
ＫＭＶと略す）を一段階でＬ−インロイシン類に転換出
来る微生物を探索した結果バチルス属、ミクロコツカス
属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属、エシエ
リソチア属、アルスロバクタ−属、アルカリ土類金属。

セラチア属、アスペルギルス属　等に属する微生物が顕
著な転換能力を有する事を見出した。

Ｋ来ｄＩ−ＫＭＶをアミノ化してＬ−イソロイシン類に
転換する方法は報告されていない。

本発明によれば、Ｌ−ｉＬｅｕ生成酵素系とＬ−ｉＬｅ
ｕ間に見られる如き阻害又は拮抗現象は回避する事が出
来ると共に他のアミノ酸の副或は著しく少く、単離精製
も容易である。

一般にα−ケト酸がα−アミノ酸に転換される場合には
、トランスアミノ化反応と遣元的アミン化反応による場
合が知られている。

本発明の場合はそのいづれもが反応にあづかっていると
思はれる。しかも安価なアンモニウム塩類の添加のみで
充分反応は進行し、高価なＬ−アミノ酸を添加する必要
はない。結果としてｃｌ−ＫＭＶはＬ−１Ｌｅｕに、ｌ
−ＫＭＶはＬ−アロインロイシンに転換されるのである
。本発明に使用される微生物はｄＬ−Ｉ（ＭＶをイソロ
イシン類に転換する能力を有するものであればよく、実
施例１に挙げたようにバチルス属以下公知の微生物から
選択する事が出来必ずしも醗酵法で使用する如き所謂Ｌ
−インロイシン生産菌である事を要しないし、広く土壌
・排水中より採取出来る。本転換反応に使用する菌体は
微生物の培養物（例えばｉルコーズブイヨン培地）、洗
滌菌体、菌体抽出物、固定化菌体等の形で使用出来る。

反応溶液に添加するＮＨ，塩としては、　ＮＨ，ＣＩ。

醋酸アンモン、乳酸アンモン、ピルビン酸アンモン等が
好適であり、尿素を使用する事も出来る。通常ｄｌ　−
ＫＭＶ　１ｍｏ＋に対し８〜６　ｍｏｌ　（７）ＮＨｒ
塩添加が良い・反応ｐＨはｐＨ５，０〜１１の間。

ｐＨ７，０〜９５がよく、温度は１５°〜６０°Ｃの間
８０〜４０°Ｃがよい。転換反応を促進したり、菌体活
性安定化のためにグルコーズ、ＳＨ−化合物。

アスコルビン酸塩、ＮＡＤ、ＮＡＤＩ−１，、ピ１ノド
キサール燐酸等の補酵素類、ｚｎ、−等重金属塩類の添
加も有用であり、使用菌種番こより選定サレる。かくし
て旧−ＫＭＶのアミン化率は約８０％に達する。

生成せるＬ−ｉＬｅｕ、Ｌ−アロイソロイシンは通常の
中性゛アミノ酸の単離法によって単離出来る。

此は混合物のま５アセチル化した抜機アシラーゼを作用
させるとアセチル−Ｌ−ｉＬｅｕの方ＡＥ優先的に脱ア
シル化されるのでＬ−アロイソロイシンとは良好に分離
出来る。以下実施側番こて示す０ 実施例　ｌ。

下記組成の培地（ａ）及び（ｂ）を作成ｌ−た０（ａ）
　　グルコース　　　２％　（ｂ）　　グルコース　　
　２％ポリペプトン　　１％　　　馬鈴薯浸出液（４０
％）肉エキス　　０，３％ 酵母エキス　　０１％　　　　　　ｐｉ−（５，６食　
　塩　　　０６％ ｐＨ，７，０ 表−１に示す各微生物を（ａ）又は（ｂ）の培地で、３
０°Ｃ２４時間培養し、遠心分離、　　Ｏ，１４Ｍ食塩
水８回洗滌して後湿菌体１００　ｍ９／ｒｎｌとなるよ
うに０１４Ｍ食塩水の懸濁液とした。反応液成分は次の
通りである０ （１）０．４ＭＮａ２ＣＯ３，ＮａＩ（ＣＯ３（ｐＩ（
１０，５）　　０．５ｍ１（２）　０．２６Ｍ　ＫＭＶ
−Ｎａ ０１８Ｍ　グルコース １．２Ｍ　　　ＮＨ４，Ｃｌ ４６ｍＭ　　Ｋ２ＰＨ０４ １６ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，−７Ｈ２００，５＋＋＋／（８）
菌体懸濁液　　　　　　　　　　　ｌ・０ｍｌ全量　　
２．ｏｍｌ （１）、　（２Ｌ　（３）を混合した反応液は小試験管
中３７°Ｃ９２４時間緩かに振盪し、生成せるＬ−イソ
ロイシン類をＴＬＣにて測定した。結果は表−１で示し
た０ ＞−Ａ　ｆ　休臼 明細書の浄８（内容に変更なし） 別　　　　紙 表−１ 実施例　２ 実施例１の培地（ａ）４０１にバチルススフエリカス］
ＰＯ３５２６を接種し、ジャーファメンターで１Φ時間
通気攪拌培養を行った。

遠心分離・次いて食塩水洗滌し湿菌体２９７ｇが得られ
た。

σ 湿菌体１００ｇ／ｆ１０．１２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＩ
−１８，０）の反応液、Ｉｆを、７、。ａＢ間反応□Ｌ
いるとＬ−イソロイシン５．０ｇ、Ｌ−アロイソロイシ
ン６２ｇが生成していた０（転換率６５％）反応液のア
ミノ酸アナライザーによる生成情況は図−１に示した□
菌体を除いた後除蛋白した。次にアミノ酸を強酸性陽イ
オン交換樹脂（ＩＲ−１２０１−Ｉ型）カラムニ吸着セ
Ｌ　メ、　　２．５Ｎ−Ｎｌ−１，０１−Ｔで溶出、減
圧濃縮してＬ−イノロイシン、Ｌ−アロイソロイシン混
合粗結晶９５ｇを得た。

この結晶７．Ｏｇを無水酢酸にてアセチル化し２８８ｇ
のアセチル体が得られた。此を１０％Ｎａ０１−１約ｘ
ｏｍｌ！に溶がし、　ＣＯＣｌ２°６　Ｈ２Ｏ３，２ｍ
９゜黴アシラーゼ（大野製薬（仲製品）及び水を加えて
４０ｍ１とし、　ｐＨｅ、ｏ、　３７°Ｃ２日間放置し
た。

減圧濃酸し析出結晶を５０％メタノールより再結晶して
Ｌ−イソロイシン０．６４ｇを得た。〔α〕２８′−１
−３９．８°（Ｃ＝１．５Ｎ−ＨＣＩ）を示し、ロイコ
ノストックメセンテロイデスによる微生物定量では純度
９６％であった。Ｌ−イソロイシン採取後の母液をＨＣ
Ｉ酸性とするとアセチル−Ｌ−アロイソロイシン結晶２
．８ｇが得られ、ｍｐ１５４〜１５７’Ｏ［α〕ゎ＋２
１２°（Ｃ−４，エタノール）であり、ｌ−ｌＣｌ加水
分解するとＬ−アロイソロイシン結晶０９ｇが得られる
。水晶は〔ａ　］ｏ　＋４０８°（Ｃ＝、ｌ、　５Ｎ−
ｌ−１ｃＩ　）を示し、９９％の純度を示した。

【図面の簡単な説明】

実施例２で得たＬ−イソロイシン類のアミノ酸分析によ
る生成状況図である。Ａｉ−ｊＬ−アロイソロイシン、
ＢはＬ−インロイ７ンを示す。 −５０］ 昭和５７年１２月λ２日 特許庁長官殿 ■　事件の表示 昭和５７年特許願第１４３２４８号 ２　発明の名称 Ｌ−インロイシン類の製造法 ８　補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 小代理人

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ｄｌ−α−ケト−β−メチルバレリアン酸又はその塩類
   を緩衝水溶液中、無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、
   又は尿素の存在下、旧−α−ケト−β−メチルバレリア
   ン酸をＬ−インロイシン類に転換する能力を有する微生
   物の培養物、培養菌体又は菌体処理物を作用せしめ、生
   成せるＬ−イソロイシン類を単離する事を特徴とするＬ
   −インロイシン類の製造法。