JPS5925695A - 菌体外生体重合体の改良製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 する。

特開昭５７−１５２８９６号公報（特願昭５７−２４　
２６２号）には、水性培地中でのキサントモナス属微生
物の好気的培養により重合体物質のキザンタンを製債す
るにあプζリ、該微生物を培養条件下で安定な油中水型
エマル／コン（以下、１〜八′１０エマルジヨン」とい
う）中で培養することを特徴とする製造方法が開示され
ている。この先の改良製法では、好寸しい実施態様にお
いて、キサントモナス属微生物は、最終粘度の達成の為
に水と混和しない液体中に分散された通常の培地中で培
養され、重合体の製造が分散相中で行われる様に続いて
処理される。〜Ｖ／（）エマルジョ／の比較的低い粘度
の故に、キリ゛／タンａ有量が高く水性相自体の粘度が
高い場合にも、酸素も・よび他の重要な成分自体を添加
することが可能である。

先の出願に係る発明の数曲の目的は、培地を一強く粘稠
化する細胞外代謝物質を・同隨に生産する他の微生物に
この培養方法を応用することである。

この様な微生物として、特にダラム陽性徒たは陰性菌、
酵母、さらにある種の真菌（Ｊ’ｉ］、ｚｅ　）および
藻類が挙げられる。

キザントモナス属微生物の他に、文献には細胞外親水性
コロイドを生産する多数の微生物が記載されている。た
とえば、次の総説およびそこに引用された文献が参照で
きる。１〜・１．１弓、５ｌｏｄｋｉ、　Ｉ＼１、Ｃ１
Ｃ−＋ｄｍｕｓ、　Ａｄｖ、Ａｐｐ］、　Ｍｉｃｒ（＋
ｂ、、　　２３　、　］　９　（１９７８）　　；　　
Ｐ、Ａ、５ａｎｄ、ｆｏｒｄ、　　Ａｄｖ、ｉ、Ｃａｒ
ｂｏｈｙｄｒａしｅ　　Ｃｂｅｍ。

１（ｊｏｃｈｅｍ、、　２６５　（１９７９）　；　　
Ｃ，・１．ＬＬＩＷ８０Ｔ］、　１．＼■。

５ｕｔｈｅｒ１．ａ、ｎｄ−、Ｉ号ｃｏｎｏｍｘｃΔ（
ｉ、ｋｒｏｂｊｕｌ、、　２．　３２７　（１９７３）
。

キザンタンと同様、他の微生物によって細胞外に生産さ
れる重合体も多糖類である。以下にその若干の例を示す １テキストラシＪ　ｙ　　１３ａｃｔｅｒｉ、ｕｍｓ　
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｊｄｅｓの
代謝生産物、１−バクテリアアルギン酸Ｊ　（Ａｚｏｔ
ｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌａｒ＋ｄｉｉ　）、［アル
スロバクタ−多糖類−１（Ａ、　ＶＩＩｉＣ（１１曲１
）、ｌスクンノグルカンＪ（Ａコｃａｌｉｇｅｎｅｓ　
ｆａｅｃａ、］　Ｉｎ　）、酵母（たとえば、ｆｌａｎ
ｓｅｎｕｌａ　ｃａｐｓｕｌ、ａｔａ、　）　”ｉ−た
ｔｒ、Ｉ　Ａ菌（乙−とえば、Ｓｃｌｅｒｏｔｊｕｍ　
ｄ、ｅｌ　ｐｈｊｎｊ　ｉ　）のイし１ｑ１生産物。

全生産物中、起源に応じてグルコース、マンノース、ガ
ラクトース、グルクロン酸、マ／ヌロ／酸、グルロン酸
などの多Ｗ１類が重’Ｐｊ−Ｃある７、さら（・乙アセ
チルおよびピルベート残基がｔｒ在する。

多くの場合、これら多ｆ、１．Ｉｉ類（・−りそれぞれ
のｐ、！ｊから成っていることは知られている。けれと
も構造（Ｃついてはごく少数の研究しかなされていない
。どころか、一般にペテロ多れ１１類は、繰り返し基本
構造として４つの単糖類単位から成ることが知ら１して
いる。他の場合には、基本のυ１１）のｆｌＩｌらや・
１ｔこ糾絖δ１的分布が、たとえばバクテリアアルギン
酸塩について調べられている。通常、ブロック溝）告（
′１２〜６個の同一の糖分子を１丁する１、さら（ご、
ただ１種の糖残基から成る多糖類、たとえはテギス１ラ
ンが研究されている。

生体重合体は、水溶液中Ｖこおいて帖”％’ｉ　ｆ’ｌ
用４’ｐ’　４、す。部分的にはチキソトロピー性が認
めらＬ′１．る。

これらは既に工業的に製造されており、Ｉｌｌ広い用途
、たとえば医薬の分野、食Ｈ品内づ）野において、１だ
化粧品製造用の濃厚剤および増粘剤として、さらに多数
の化学工業製品に利用さ、ｔしている。

生体重合体の工業的製造に当つＣは、生成する物質の特
殊な性質の為（Ｃ種々の大きな制約が伴なう。培養Ｃ（
よって生成する生体重合体は培養塊中で既にはっきりと
しだ増粘凝固作用を示すので、生成物濃度が低い時点Ｖ
ｆｉ於てさえ培イ（期間中に障害を生じ、たとえば培養
混合物中への基質の移送及びその一様な拡散が困難にな
る。培養の際に強度の剪断力を導入すれば、生成した粘
稠な水性培地の部分的チギストロビー性を利用してこの
様な障害をこぐ限られた時間に抑制することができる。

従って、強力な攪拌装置、たとえば複数の多葉状ｉＰシ
ャベルタービンを備えだ反応容器中で、かなりの攪拌エ
ネルギーの導入のもとで培養を行なえは、反応混合物を
、たとえば酸素移送が確保される様な流動可能の状態に
作詩することができる。

しかしながら、この様な条件下でも、なお生産効率はご
く限られたものである。

文献には、用いた微生物１７こついて、生成物収率（培
養添加物を基準とし、乾燥物としてＨ１算される）は微
生物に依存して２〜１０係斗たはそれ以下であると記載
されている。しかし、実際には一般に不満足な収率しか
達成さ１しない。

本発明の目的は、キザントモナス閑産生重合体物質を製
造する先の特許用５願（’４’＃開１”に５７１５２８
９６号公報）の方法を、他の釧１１〜外生体千ａ体の生
産に応用することにある１、従′つて、培養１υ１間中
は不利であるが目的生成物では望寸れる重合体の増粘作
用が、培養段階て非′畠；こ低ドないし除去され、様々
な態様による製造が６易（ｌこなる。すなわち本発明の
第一の目的ｉｄ、培養条件１・゛て培式器内の流動相の
粘度を低下さ、Ｌ！−１しかも高いど１ゴ本重合物収量
を確保することである。ま、装本発明（・［、水性培養
箱として高′ｆＡ！、ＩＩの固秋物質合］存仔させるこ
とが可能であり、しかも通′帛の技術或い（１装置によ
って処理することの出来る培地を提ｆ］（するものであ
る。本発明にまれは、生体重合物製侍４１１（いエネル
ギー消費で断続的に父己ＪｊＦ続的に：Ｊｆ、ｊＬｉＬ
、しかも従来技術に比較して同程Ｉ」１又はより高いレ
ベルの収率を得ることが可能となる。

本発明（ｄ、水性培地中でのキザントモナス属微ξ１ミ
物の好気的培養によりキサントモナス菌産生重合体物質
を製造するにあたり、該微生物を培養条件下で安定な油
中水型エマルジョン（Ｗ／（→エマルジョン）中で培養
する方法の改良であって、水性培地に対して濃厚化作用
を有する他の細胞外生体重合体を生成する微生物種を培
養することを特徴とする方法を提供するものである。そ
の他の点では、先の特許出願の一般的な指ｆ１が適用さ
れる。

エマルジョン（Ｗ１０エマルジョン）ニ於テｋｌ、均一
な油相中に微細に分配され／ｒ−分散相として水性の培
養器が存在し、この水性相中で微生物の増殖、或いは物
質代謝が行なわれる。微生物の培養過程（はこの水性分
散相の個々の小滴中で進行するのであり、これらの小滴
への酸素ｆＪＬ給はＷ１０エマルジョン中に酸素又は酸
素含有ガス、特に空気を通すことによって達成される。

この様な水ｔ＜ｊ三培養相の個々の小滴に於ける粘度増
加は、培養器内に存在する混合物全体としては全く、或
い（・」実７”ｆ的に無祝しつるものである。なぜ、ｔ
ら培ｈ　型内ｃ〕）反応塊の粘度は閉鎖油相に七つて決
定されるからである。

キサントモナスを他のグラノ・陰＋′ｊ−菌、グラム陽
性菌、真菌または酵母で置き代えた場合、微生物の生存
能力のみならず培養条件トーのエマルシヨンの安定性を
維持できるかは決して明らかではない。

しかし、本発明（ｌこよれば、先の７侍♂「４青き出願
に記載された培養液の粘度の実質的、生下降（１、新し
い知見、に基づき、微生物のモルポロジー（・こＱ−１
依＜ｊニー４−るーことなく他の生体重合体の製造に応
用することができる。

本発明方法に於ける有機／（ｋ体１１としては、ｆｔＥ
Ｉｌｌする微生物に対して非＋ｊＪ　（４１であり、ま
た培＆　ｔｆｌ下で不都合な変化を（＝Ｊら示さず、１
ｊ１つて、特：こハ゛１養条件下て酸素の作用に対して
全く或い（り１実７′↓的に活性を示さず、旧つ、Ｗ１
０エマルジョノＧ′）形成が可能である様な水と混合し
ない液体（ｆユ原則としてすべて用いることが出来る。

７！ｊ　Ｖこ、本発明７１）法の条件下で水性相との平
衡（で於てごく少量の水分を含有するだけである様な有
機液体が望ましく、その水分含量が０５重量係を越えな
いもの、特に０１重量係を越えない様な有機液体を用い
ることが好ましい。更に、生成する重合体に対して溶媒
作用及び／又は軟化作用を全く又は実質的に示さない様
な有機液体を使用するこ１１−か望４しい。この様な油
相成分は少なくとも培養ｒ＋、、＋　＋Ｊｌ−Ｃ流動相
として存在することが要求され、イＪのｈ　：Ｉ！点が
２５°Ｃを越えないもの、特に２０°（）を越、・モな
いものであって、特に好捷しくに１０°Ｃより高くない
ものが良い。更に、この油相成分は培養条件下で全く揮
発性を示さないか、或いは揮発性のごく小さいものであ
ることが好ましい。特別な条件が何１し存在しない時に
は、たとえば培養混合物中に空気流を導入して培養を行
なう方法では、反応操作が著しく簡単なものとなる様に
することが出来るが、一方で、本発明の種々の実施形態
に於ては、目的生成物の処理に際して油相の部分的分離
が望ましい場合もあり、或いは完全な分離が重重しい場
合もあるので、それを考慮に入れてそれぞ／ｈの条イイ
１のもとて最適の状態を保持できる様（・こするのか望
ましい。

有機相は、無加圧で加熱することにより殺菌できる様に
選択するのが有利であることか明らかシこされている。

この様にして選択された油（１１成分が微生物の増殖に
ついて毒物学的に問題のないものであるかどうか＆１、
簡単な予備試験によって確かｙ）られるが、実際に広範
囲の有機液体について明らか１１こ（−の条件が満たさ
れることが確認されている。

まだ、この様な油相成分は、重合体生成物を含有する水
１つ１：和から十分容易に分離されイ４Ｉる様な疎水性
液体であることが好ましい。具体的に（・−１非ｆ／：
換の及び／又は置換された流動ＰＩ炭ｒヒ水素ｒヒ合物
が挙げられ、これにはｊ脂肪族及び芳香か、の化合物が
包含される３、脂肪族化合物Ｑま直鎖、分枝法ｙは環状
のいずれてあっても良い１１寸だ、これら；’、）炭化
水素ｆヒ合物は単独て用いても良く、或いは一神以」二
の混合物として用いることも出来る。この様な炭化水素
化合物の具体例としては、たとえば鉱油、ケロ／ン又は
ナフサの炭化水素フラクション、及Ｕベンゼン、キンレ
ン、トルエンの様な有機炭化水素化合物が挙げられ、特
に分枝状炭化水素化合物をベースとしたもの、たとえば
、イソパラフィンベースのものが好￥！Ｌい。捷だ、非
置換の、場合によっては不飽和の、特にオレフィン系不
飽和の炭化水素化合物も好適であり、更に水不溶性のア
ルコール、特に８〜２０個、好ましくは８〜１２個の炭
素原子を有するもの、また植物油、エステルアルコール
、ホリオールエーテル、ソの他へテロ原子含有化合物た
とえばシリコーン油等もＪ旧いることが出来る。この他
に、１イソパール（Ｉｓｏｐａ、ｒ　）　　Ａｉ　Ｊの
商品名で市販されているイソメζラフイン混合物、或い
は水不溶性イソノζラフイン酸をヒドロキノベンジルシ
アリファティックアミンにより部分中和した部分中和生
成物（米国特許第２，２６２，７２０号に詳述されてい
る）も有用であることが明らかにされている。

本発明で用いる水性培地は、文献、ｊピ載の各微生物に
用いられるものの中から選択することができる０たとえ
ば％　Ｊ、Ｈ，、Ｎ○ｒｒｉｓ、　Ｄ、Ｗ、Ｈｊｂｂａ
ｎｓ編。

八ｊｅｔｈｏｄＳ　ｉｎ　　八Ｉｊ、ｃｒｏｂｉ、ｏｌ
ｏｇｙ　　第　３　　Ａ　　巻　（Ａｃａ、ｄｅｍｉｃ
１’ｒｅｓｓ、　　Ｌｏｎｄ、ｏｎ）（１９７０）、Ｈ
，、Ｌ　、　ｕ〜’ｂ　］ｓ　ｔ、１　ｅ　ｒ、＋３．
Ｎ。

Ｂｅｍｊ、１１ｅｒ編：　ＪｎｄｕｓｔｒｊａＪ　Ｏｕ
ｍｂ、　ｌゝＯ１ｙ’＞ｕｃｃｈａＴＩｄＬｊｎａｎｒ
ｌ　Ｄａｒｊｖａｔｉ、ｖｅｓ　（同出版社）（１９７
３年）に記・１とされた水性培地が挙げられる、。

典型的な水性液体培地は、／ことえは、有機窒素源（た
とえばトウモロコノ膨潤水及び／父は太ヴ粉）、燐酸塩
（たとえば燐酸水素二アルカリ金；・１１塩及び／又は
燐酸水素二アンモニウム）及び好゛・↓しい微量元素、
特にマグイ、／ラム及び場合：（よってはマンガン、モ
リブデン、鉄及こトカルンウノ、仏６以上の１）ＩＩ値
、好ましくは６５〜７の１〕１１値で含有するものであ
り、更に、この曲（こ適当な炭水化物が好ましくは水性
相溶解成分としてａ有さｔしている、この様な炭水化物
としてにＬ、たとえばグルコース、ザツカロース、マル
トース、フルクト　ス。

ラクトース、転化処理された甜菜糖蜜、転化糖、ｐ過、
希釈された殿粉、或いはこれらの炭水化物の混合物を用
いることが出来る。これらのうち特に好ましい同化性炭
素源はグルコ　スである。この様な同化性炭水化物の濃
度は１１ｆ＋常、水性オ旧（対して０５〜５重量係の範
囲である。これより高い同化性炭水化物濃度では毒性副
生ｂ！物が蓄積して微生物の増殖が阻害される。寸だ、
多くの用途には好捷しくない低分子代謝生産物も生成さ
れつる。

さらに、多くの場合培養過程が甲く終丁してしまる。

この同化性炭水化物の添加は培養期間中Ｃて断続的に又
は連続的に行なうことが可能であるので、最終的（（は
かなりの高濃度の炭水化物全転換できることになる。

本発明の特別な態様では、炭素数が１０を越えるｎ−パ
ラフィンを油相として用い、同化性炭素源として上記の
ものを利用する微生物を同時に培養する。１この種の微
生物（１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ。

１（ｒｅｖｉ　ｂａｃｔｅｒｊ、ｕｍおよびＭｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ属のもので、たとえばＣ，ｖ］ｓｃｏ
ｓｕｍまたはＡＪ、　ＬａｃｌＪｃｏｌｕｍなどが知ら
れている。

さらに他の態様では、水素しよび酸素ガスのｆＩ：在下
に二酸化炭素を同化性炭素４Ｓ＋とじて利用するＢａ、
ｃｔｅｒｊ、ｕｍｓ　Ｐｓｅｕｄ、ｏｍｏｎａｓ　ｈｙ
ｄｒｏｇｅｎｏｖ＋＋ｒａ　　を用いる。

いずＪｔの場合も、培養温度は約３０Ｃ前後が好１しく
、たとえば３０　Ｊ＝　１０”Ｃである。ｊ＠養（・ま
約１００時間或い（１それ以上の時間にわだつ′Ｃ行な
うことが出来る。

これに関して、通常用いられる反応方法もこついては、
先に引用した総説に記載された文献が参１１ｒｊされ、
一般にキサンタン製造１．・こ準＋ｌで行われる。

キサンタン製造の為に通常Ｌｉ〕いられる反応操作、及
びその際使用される反応助Ｆｌｌ、特に液体培地及び培
養条件については、たとえば米国特ボ［第３，２３ｆ３
．８３１号に詳述されている。

本発明に用いる好−牛しい油（［１及び液体培地、７〕
選択および調製は、本発明方法の項部に稈が最も４易に
進行する様に行なわれるが、同時に一；ｔ　７Ｃ％　ｆ
Ｉｆられる生成物の使用目的も、’Ｖ、’ｊ　（こ油相
の選択の際には考慮される。たとえば、４１体重合体が
油月の二次的又は三次的採鉱の分野に於て用いられる場
合には、栄養生理学的には適性が小さい様な炭化水素化
合物も油相として用いることが出来る。まノ乙生体重合
体が食料品の分野に用いられる場合には、栄養生理学的
に何らの問題も生じさぜない様な油相を使用することが
好捷しいてあろう・本発明のＷ１０エマルジョンの形成
に（は、乳化−７助剤を用いることが好捷しい。油中水
型の乳化剤（Ｗ１０乳化剤）については、文献に数多く
報告が成されている。この様な乳化剤は好ましくは油相
中に溶解して使用し、水性相との処理を行なって所望の
Ｗ１０型エマルジョンを形成させる。この様な乳化剤と
して好ましい化合物（１、たとえば、ソルビタンモノオ
レエート、ソルビタンモノステアレート、ヘキザデノル
ナトリウム７タレート、セチルステアリルナトリウムフ
タレート、その他ＩＪ　１号−ＡＳ１０８９１７３に挙
げられている化合物である。捷だ、たとえばアトラス・
ヒエミー（ＡｔｌａＢＣｈｅｍｉｅ　Ｏｍｂｌｌ）社か
ら［ＡＩ（ＬＡＣＥＩ、−またはＳＩ’ＡＮ−Ｐｒｏｄ
、ｕｋｔｅＪの商標で市販されているＷ１０乳化剤系（
ｌ　ＴＷＥ　ＥＮＪ乳化剤のき量の少ないオレエート系
の化針物）も好適に用いられる。更に、同社のＷ１０乳
化剤系である［Ａｔｌａｓ−ＩＩＬＩ（−８ｙｓｔｅｍ
ｅ　ｌ　も好゛ましいものである（これに一ついては、
たとえば米国特許第、３．９９６．　ｌ　８０弓及０・
同社の説明遣参照）。ここで、エチレ／オキ／１・８モ
ルと反応したソルビタンの脂肪酸エステルが特に適して
いる。この他ｉＣ、Ｉ）、３ｔ８ｒ（７ｅｎ　ＬＳａｎ
ｄＥｍｕｌｓｉｆｉｅｒ’ｓ　Ａｎｎｕａ、］、（、ｌ
ｏｈ＋＋　Ｗ、ＡＩｃＣｕｔｃｈｅｏ＋＋、　Ｉ＋＋ｔ
：八ｌ０ｒｒｊ　ｓ　ｔｏｗｎ　Ｎ、　・Ｊ　、）に記
述されている数多くの＼し１０乳化剤も同様（（用いる
ことか出来る。

本発明（て於ける好ましい乳化助斉１：り選択は、ｔ１
用される操作方法及び／又は目的物のＦＪ：　’Ｐ（ｔ
こｉ　−Ｕで決定される。すなわち、反１心終了饅、捏
、稠な水性相からの油相の完全な分離が困（稚である隨
な安定化りだＷ１０エマルジョン（Ｌ−形成させること
も本発明の範囲に包含される。

１だ、油相と水性相との分離が比較的簡単になる様にす
ることが望ましいケースもあり、これ・；・」たとえば
反応生成物の全部又は培養器からｒＪｌ出されるＷ１０
エマルジョンの部分流を両相Ｇ′こ分離し、場合によっ
ては分離された生成物の一部分を再び培養器に戻す様な
場合である。この様な場合には、培養器中では内容物を
たえず混合しながら反応を行なうので、培養条件下では
Ｗ１０エマルジョンの状態が確保されるが反応混合物を
静置すると容易に相分１ζ１ｔが生じるのである。この
様に、個々のケースの特殊性に応じてＷ１０乳化削の選
択を行なうことが出来る。

本発明方法に於ては、必要に応じて、更に他の助剤を培
養混合物中に添加することが出来る。たとえは分散助剤
等である。

水性液体培地に対する油相の混合比は、反応開始時に於
て油相１５〜９０重量部、水性液体培地８５〜１０重敗
部であることが好ましい。特に、油相がＷ１０重合物の
総量の少なくとも２０重歇係、更には２０〜６０重量係
の範囲にあることが望−ましい。一般的には、約２５〜
５０市量係の範囲の油相量が好ましいことがｆｉ７Ｉｉ
認さＪ＋４いる。

Ｗ１０乳化剤の使用量は通常Ｗ／　ｌ　）　混合物の総
量の約０１〜１０重量％であり、特１／？−１約１〜５
重量係の範囲が好ましい。まだ、油相イ二対する乳化剤
の使用量は３〜２０重計％、特に約０〜１０重量ヂであ
ることが好ましい。この場合、乳化助剤の化学構造に基
つくそのアト１ヒ１り能を考ノ・どして、前述の様に安
定性の大きいＷ　／　（−１エマルジヨン光形成させる
のか或いは安定Ｖ１・小さいものを形１）ｙさぜるかに
よって乳化剤ト［１を決定することが出来る。

細胞外へテロ多糖類ン：生産Ｊ゛ることのでへる１改生
物として好寸しいものは、たとえは次に挙げる菌ｔだは
酵旬種あるいは属である 菌゛ ＢａｃｉｌｌｕＳＳＴ）［１ ｌ−ｊｅＬ］ｃＯｎＯ６ｔＯｃＥｔｐｐ。

Ｓｔｒθｐ’ｔ、ｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓＳｔｒ
ｅｐしｏｃｏｃｃｕｓ　　８ｐｐ。

Ａｚｏｔｏｂａ、ｃｔｅｒ　ｓｐｐ。

Ｒｂ１ｚｏｂｊ、ｕｍ　ｓｐｐ。

Ｅｓｃｈｅｒｊ、ｃｈｉａ　ｃｏｌ　ｊＫｌ　ｅｋ）ｒ
；　１．ｅｌ、］、ａ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓＡｚｏｔｏ
ｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍＡｒｔｈｒｏｂａｃｔθ
ｒ　　ｖｉｓｃｏｓｕｓＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅ
ｒｕｇｌｎｏｓａＡＣｈｒＯＩＴｌＯｂａＣｔｅｒ　　
Ｓｐｐ。

Ａｌｃａｌ、ｉｇｅｎｅｓ　ｆａ、ｅｃａｌ、ｉｅ　ｖ
ａ、ｒ、　　ｍｙｘｏｇｅｎｅｓＡｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｊｕｍ　８ｐｐ。

聞ｗｉ、ｎｉａ　ｓｐｐ。

５ｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ　ｎａｔａｎｓ酵母： ＋ｕ＋ｏｄ、ｏｔｏｒｕｌ−ａ、　　ｓｐｐ。

Ｐ］ｃｈｉａ　ｓｐｐ。

１’ａＣｈｙｓｏｌｅｎ　ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓＬｌ
、ｐＯｍｙＣｅＳＳｐｐ。

ｆｂ、ｎ８１９ｎｕｌａ　　ｃａｐｓｕｌａｔａｌｌａ
ｎｓｅｎｕｌａ　　ｈｏｌ、５ｔｉｉＣｒｙｐｔｒ＋ｃ
ｏｃｃｕｓ　８Ｊ）１）。

Ｔｏｒｕｌｏｐｓｊ　ｓ　　ｍｏｌｉｓｃｈｉ、ａｎａ
Ｔｏｒｕｌｏｐｓｔｓ　ｐｌｎｕｓ Ａｕｒｅｏｂａｅｉｄｉｕｍ　ｐｕｌ、１ｕｌａｎｓＷ
１０エマルジヨン中で培養するのンこ同しく好ましいの
は真菌である。特に糸状増殖１υ１の、たとえばＳｃ〕
−ｅｒｏ目ｕｍ　ｄｅｌｐｈｉｎｉｉ　Ｉｒ、ｒ、１木
しＤｉｅ　ｔもたらす１１細胞外多糖類を生産する藻類
も、仔い増殖、・べ１）ｙシ・よび光要求性の故に、本
発明方法（＝Ｃおける好１し合体に応じて行われる。し
かし、ヒト、動物しＩ・−２収（物に対して病源性であ
る微生物は、閉鎖回路中で扱う必要がある。同熔しこ変
更を行う（場合、増炉速度などの経済的要素ケ考ｆｉＩ
ｃ　ｌ、、て行・）。

培養器中・・−の酸素含有ガス、４７．に空気の導入は
通′帛の手段によって行なうこと力咄来る、培ルーの為
あ酸素必要１１ｔは、培佇方法及Ｏ・酸素ｆ４ゾ２の条
１′１に応じて、毒を十の酸性副産物の蓄１１′は抑Ｈ
ｉｌｌする様に決定することができる。

藻類を用いる場合、さらにバ」え射が区、′汐１−博・
ｈる。これは、たとえば水中ランプまだはＦｔ（ましい
形状のガラス製培養容器を用いることにより可能である
。

従来の生体重合体製造り法し・こ比較して、〜Ｖ／（１
エマルジヨン中で培養を行なう本発明方法は、反応条件
及び結果の改善を目的として、種々多様な１作ＩＦ変形
が可能である。以下に本発明方法を具体的に説明する。

本発明方法に於て用いられる微生物の予備培養は、種々
の組成の培地中で多段階的に行なうことが出来る。これ
は、たとえばＩ）　Ｅ　　ＯＳ　２９４７７４０に記載
されており、当該技術分野に於て一般的に公知の事柄で
ある、この様に処理された微生物は次に生体重合体製造
の為の液体培地中に移され、培養される。

本発明の実施形態に於ては、この初期の段階で既にＷ１
０エマルジョンの形成を行なうことが出来、（断続的方
法について述へると）このエマルジョン中で微生物増殖
が行なわれ、培養による細胞外物質代謝産物が生成する
。

１だ、本発明の好ましい実施形態（（於ては、微生物を
、捷ず油相を含まない水１イ１．培地中で培養した後（
この段階では微生物増殖をごく僅かに抑える）、この水
Ｖ１−培養物液をＷ　／　Ｃ）エマルジョンに移行させ
る様にすることが出来る。この実施１［／態（で於ては
、水性相の確実な流動性がなお保持さＪｌでいる時点で
、油相中・＼の水性相の乳化又は分散を行なう様にする
のが好ましい。すなわち、この場合には、Ｗ１０エマル
ジョノの形成の前に、水性相中での微生物培養を少なく
とも０１重量係、好−ましくに少なくとも０５重ト〒；
′係の生体重合体が生成する寸で継続することか９ｆ斗
しい。ここで小される数値（１Ｆ叶係）　（−Ｊ、、そ
、１ｔそ）を水Ｖ１培培養台物の重用にχ・１する乾燥
物ｆノｔ、ｌ：　しての７１体中介イ（・１））比率を
表わす。この場合、一段階法に於ては、Ｗ１０エマルジ
ョンの形成の前に水性液体培地中−この微生物増殖を、
少なくとも３０係、場合に」、つては少なくとも５０チ
までＪａ行させることかり能である。１だ、エマルジョ
ノ形成＋１ｉｕＣ做牛物ｂ゛）　１＋、’（７殖期を終
了し、次いでＷ１０エマルジョン中ＣＧ’）生産相に移
行することができる。簡−屯なｆ　Ｉ＋ｉｉｉ試１験に
より、不発明方、去の条件丁て閉鎖油相中への水性相の
分散分配が確実に行なわれる最適の時間で１決定するこ
とが出来る。

Ｗ１０エマルジョンの形成にｔユ、水性培養物液及び油
相（好ましくは先に乳化剤を溶解しておく）を混合して
機（成約（（十分に擢拌或い（１混線する。

本発明方法の好ましい実施形態に於ては、効果的な混合
装置全備えた培養器の中でＷ／（］エマルジョン中での
培養を行なうこ一＝が１１目（る。本発明によれに、こ
の様な攪拌装置の効用的４・混合作用により、培養器内
でＷ１０エマルジョノの状態を保持する１−とが出来、
培養器の内容物え・静置すると比較的簡単に相分離が生
じる様な場合Ｇ′こもこれが保証されるのである。

この様な振盪下にある培養器の内容物中に、通常の方法
により酸素又は酸素含有カス、特に空気が通気さＪしる
。酸素は油相を１再過して、微生物を含有する水性分散
相の個々の小滴中に導入されるので、培養期間中の遅い
段階に於ても従来法に比べて酸素移送の障害ははるかに
少なくなる。

必要な場合には、液体培地の増殖促進成分を断続的に又
は連続的に培養器中に添加することが出来る。たとえば
、同化性炭素含有化合物（たとえはグルコース）を徐々
に培養混合物に添加していくことが可能である。

均一な分配を確保する為（′こ（は、これらの栄に成分
を強度の振盪下にある培養器中（・こ直接シこ添加する
ことが好ましい５．液体培地の他の成分、／（−と］；
−ば微量元素等或いは他の必要な反応成分、だノルソー
ばｐｌ＋値調整の為の塩基等（でついても同様である。

培養の継続時間は、所望の収）、１−か↑！Ｉられる°
土で或いは生体重合体生成が減少又は停止トする一；Ｆ
てとする。培養゛終了後、断続的Ｊｊ法（・（二於て（
・τＦ、／１−酸物の使用目的に応じて、通常油相と重
合体１オ有水１′１相との分離が行なわれ、その後、通
常の方法で多糖類を水性相から分離し精製することも出
来る。

Ｗ１０エマルジョンの分解には、ｊｆｉ　７にの手段１
−ＪＩＩいることが出来る（たとえばＩＩＩ　１ｍ；ｎ
＋　ｌ’Ａ＋ＺｙｋＮ＋ｌ：Ｅｄ　１ｔｄｅｒ　ｔｅｃ
ｈｒ＋ｊｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｊｅｌ　９７５．　　第
４巻４５３臼Ｉノ下、及びＩＩＯｕｔ）ｅｌｆ−Ｍ’ｅ
、ｙｌ、八Ｉｅｔｌ＋ｏｄｅ＋＋　ｄｅｒ　Ｏｒｌ、＋
；＋＋＋１ｉ＋：ｃｌｔ１１Ｃｈｅｍｉｅ　ｌ　９５８
　、　　第１，７１巻２＋９／２２０白ｉ参照）。すな
わち、エマルショア分解物質の添１１１１、機械的力の
作用（たとえば振（Ｉ）、月撃、加圧な、９温度に眉、
表面層の希釈又は蒸発濃縮、その他公知の方法によって
エマルジョンの分解が行なわれるが、特に、いわゆるエ
マルジョン分解剤と呼ばれる適当な化学物質の添加によ
るエマルジョン分解が一般的であり、現在数多くのエマ
ルジョン分解剤が１発されている（たとえば１１０ｕｂ
ｅｎ−ｗｅｙ］前掲ｔ＝　−ｉ−参照）。エマルジョン
分解の後−１生体重合体含有水性相を通常の精製方法、
たとえば適当な溶媒での洗浄に付すことが出来る。

本発明方法の特別な実施形態に於ては、培養器内容物の
部分流を断続的に又は連続的に分流、処理し、所望の場
合に（は少なくともその一部分を再び培養器内に戻すこ
とが出来る。この様な分流した部分流については、たと
えば反応助剤の添加や或いは新鮮微生物の添加さえも行
なうことか出来る。同時に１だ、その様な分流した部分
流シこついて、培養器からの反応生成物の断続的又は連
続的回収を行なうことも出来る。これにより、本発明方
法は連続的に進行させることが出来るのであり、特に、
生体重合体含有水性相の規則的コントロールによって反
応経過を所望の方向Ｕこ管理することが可能となる。こ
の様に、本発明（でよって、従宋の断続的に操作を行な
う一段階法に比へ−Ｃ１技術的に進歩した改良法が開発
されたと視えるのである。

水性相からの多糖類の分離は公知の方法、たとえば沈殿
及び乾固によって行なわれる。これＶこは、まず水性相
を、たとえばｌ　００　（Ｅ以上の温ＩＷで十分に加熱
した後、直ちに再冷却し−Ｃ微生物を殺し、場合によっ
ては生体重合体粘度の調整を行なう、次に、たとえばア
ルコールを用いての沈殿、ｌ］Ｉｊ、局及び乾燥を行な
うことにより目的物質がイ（ｌられ；（、。

この生成物を精製する為の洗浄操作は公知の方法で行な
うことができる。

次に本発明の実施例を示Ｊ−０ 実施例１ Ａ）菌株Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｅｌ、ａｎｄ
ｉｉ　ｌ）８八１８５　含−２６培養器（充填容量１５
ｅ）に於てＦ記培肋中、２６°Ｃで好気的に培養する。

液Ａ　：　クルーｙ−ス１．００　％ ＣａＣｌ２．２１１２０　　　　　０．０１１ＭｇＳＯ
４・７１Ｔ２０　　　　　０．０．１　量減１（：　Ｋ
２１１１）（’）、　　　　　　０．０７係Ｋｌｌ　２
Ｐ（−）、　　　　　　　　　　　　　　　０．　Ｏｌ
　　％Ｎａ、２ＭｏＯ４−２）１２０　　　　　ｏ、　
ＯＯ５％を夜Ｃ：　　Ｆｅ５０．．７１１２０　　　　
　　　　０．０　０　１　３　　％液Ａ、１３およびＣ
を別個に殺菌する。殺菌後、液を混合し、ｐＨを６６に
調節する。

培養器に、７２時間前培養物１０容敗％を接種した。さ
らにグルコース溶液を連続的に添加して培養期間中宮に
糖濃度を１％に作一つ／ニーｏＩ６８時間培養後、縮歪
液粘度は１４００　ｍｌ’＋＋ｔ＋に達した。

多糖類の収用は１６ｇ／ｅであった。

Ｂ）Ｗ１０条件での培養を次の１ダｐに１−ｊ゛つだ：
菌株は、前述の条件で捷ず培養した。、１２０時間培養
後、ｌ５ｏｐａｒ　Ｍ　３０％およびＳｐａ、ｎ８０　
１％を混合して培養器内に〜′１０エマルジョンを調製
し、そ。培養液の粘度を著しく低下させることができた
。１９２時間培養継続後、粘度は７５ｍＰａ５であった
。沈殿した多糖類の濃度は２０．５ｇ／ｌであった。

１’−１６０ｐａｒ　Ａ４Ｊ　は、次の特性を有するＩ
餡ｓｏ　から市販のイソパラフィン溶媒である゛ 密度（１２°Ｃ）　　　　０．７８　Ｌ３ゾ／ｍ（：□
粘度（２５°（：り　　　　２４Ｌうｌｎｌ’ａ６沸点
範囲　　　　　　２０４〜２４７Ｃ芳香族含量　　　　
　０．３１′ｒｒｉｑｉ：　％引火点　　　　　　　７
５（： ［Ｓｐａ、ｎ　８０１　ＦＪ、Ａｔ１ａｓ　Ｃｂａｍｉ
ｅ　　製潰のノルヒタンモノオレエートから成る１１１
・Ｉｔ　（（ｔｊ　４．３の込７・′〇−乳化剤である
・ 実施例２ Ａ）菌株Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏ
ｊｄｅｓ　１１８５１２０２４０　ヲ２６　培養Ｒ？＝
　（充填容ｉ１ｉ」、　５　（り　＆Ｃ於ＴＪ−Ｆ記培
地中、２６゛Ｃで好気的に培養する：ザツカロース（別
に殺菌）　１００係 酵母エキス　　　　　　　　０２５係 トウモロコシ膨＋Ｉ′ｊＪ水　　　　０．２０％に２１
１１’０．　　　　　　　　　　０．０８係Ｎａ１１２
１’（）＋　　　　　　　　　　　ｏ、　０４％Ｎｔｌ
、Ｃ１０，０５係 Ｍ、８０．．７Ｈ２０Ｑ、　０２％ ＣａＣ］２・２Ｊ：１２０　　　　　　　　　　ｏ、　
Ｏｌ　％（ｐＨ６，５） 培養器に４８時間前培養物を１０容量係接種した。ザツ
カロース濃度は、全培養期間にわたって連続的に添加し
て１優に保った。１９２時間培養後、培養液の粘度は２
７５０　ｍＰａ５に達した。比重測定によるデキストラ
ン含有州は５９９／、ｌであった。

Ｂ）上に述べたのと同じ培養条件においてＳＶ　／　（
→エマルジョン中の培養を行った。１２０時間培養後、
Ｔｅｏｐａ、ｒ　Ｍ　３０％および５ｐａｎ　８０１　
％を混合して培養器内にＷ１０エマルジョンを調製した
。

培養後の粘度を著しく低下させることができだ。

さらに培養を行い、１９２時間後培養物を採集した。粘
度は２００　ｍＰａ５であり、デキストランの含有沿は
６８　ｇ／ｌであった。

特許出願人　ヘンケル・コマンデイットゲゼルシャフト
・アウフ・アクチェン 第１頁の続き ＠発明者　　ミアヒエル・バーン ドイツ連邦共和国４０１０ヒルデン ・フランス−ハルスーベーク１９ 番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　水性培地中でのキサントモナス属微生物の好気的培
   養によりキサントモナス菌産生重合体物質を製造するに
   あたり、該微生物を培養条件下で安定す油中水型エマル
   ジョン（Ｗ１０エマルジョン）中で培養する方法の改良
   であって、水性培地に対して濃厚化作用を有する細胞外
   生体重合体を生成す、る他の微生物種を培養することを
   特徴とする方法。 ２　細胞外親水性コロイド生産性ダラム陽性もしくは陰
   性菌、酵母、真菌または藻類を培養する前記第１項記載
   の方法。 ３　培養に際して微生物の増殖期を油相の不存在下に少
   くとも大部分行い、次いでＷ１０エマルジョンを形成す
   る前記第１項捷だに第２項記載の方法。