JPS5925598B2 - 微生物の培養方法 - Google Patents
微生物の培養方法Info
- Publication number
- JPS5925598B2 JPS5925598B2 JP54030286A JP3028679A JPS5925598B2 JP S5925598 B2 JPS5925598 B2 JP S5925598B2 JP 54030286 A JP54030286 A JP 54030286A JP 3028679 A JP3028679 A JP 3028679A JP S5925598 B2 JPS5925598 B2 JP S5925598B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- growth
- culture
- medium
- amino acids
- microorganism
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は、微生物細胞内に特定の遺伝情報のみを選択
的に増加せしめ、その特定の遺伝情報によって生成され
る生産物の生成量を特異的に増加せしめようとするもの
である。
的に増加せしめ、その特定の遺伝情報によって生成され
る生産物の生成量を特異的に増加せしめようとするもの
である。
染色体外遺伝子（プラスミド）の一つとしてコリシンＥ
１因子等のリラックスタイプのＤＮＡデオキシリボ核酸
増殖形式をとるプラスミド（以下ＲＸ−Ｐと記す）が知
られている。
１因子等のリラックスタイプのＤＮＡデオキシリボ核酸
増殖形式をとるプラスミド（以下ＲＸ−Ｐと記す）が知
られている。
このプラスミド＆東染色体ＤＮＡとは対照的に、クロラ
ムフェニコルの存在下に培養された細胞内をこおいても
増殖し、染色体ＤＮＡに比しプラスミドＤＮＡ量が多い
細胞が得られる。
ムフェニコルの存在下に培養された細胞内をこおいても
増殖し、染色体ＤＮＡに比しプラスミドＤＮＡ量が多い
細胞が得られる。
クロラムフエニコルの存在下に培養された細胞はやがて
死滅するが、列番こ到る前にクロラムフエニコルを培養
液から除くと、蛋白合成が復活し、当該プラスミド上の
遺伝情報に基くペプチド又は蛋白質が著量生産される。
死滅するが、列番こ到る前にクロラムフエニコルを培養
液から除くと、蛋白合成が復活し、当該プラスミド上の
遺伝情報に基くペプチド又は蛋白質が著量生産される。
これを発酵工業に応用すれば特定の蛋白質又は特定の化
合物のみを著量生産することができる。
合物のみを著量生産することができる。
しかしながら上記の知見を工業的な発酵生産に応用しよ
うとする場合、クロラムフエニコルヲ培養液より取除か
なければならないが、この操作は工業的には極めて困難
である。
うとする場合、クロラムフエニコルヲ培養液より取除か
なければならないが、この操作は工業的には極めて困難
である。
またクロラムフエニコルの廃棄にも問題がある。
これに対し本発明者らは、増殖のためにアミノ酸を要求
し、ＲＸ−Ｐに外来の遺伝情報を担うＤＮＡを組み込ん
だプラスミドを有する微生物を、増殖のために要求され
るアミノ酸の制限量を含有する培地を用いて培養し、上
記微生物の増殖が実質的に停止してから１時間以上経過
して後、上記増殖のために要求されるアミノ酸を培地に
添加して更に培養を続けることにより、クロラムフエニ
コルを使用することなく前記本発明の目的を達成できる
ことを知った。
し、ＲＸ−Ｐに外来の遺伝情報を担うＤＮＡを組み込ん
だプラスミドを有する微生物を、増殖のために要求され
るアミノ酸の制限量を含有する培地を用いて培養し、上
記微生物の増殖が実質的に停止してから１時間以上経過
して後、上記増殖のために要求されるアミノ酸を培地に
添加して更に培養を続けることにより、クロラムフエニ
コルを使用することなく前記本発明の目的を達成できる
ことを知った。
本発明において用いられる微生物は、要はＲＸ−Ｐに外
来遺伝子を組み込んだプラスミドを有することができる
ものならば、その微生物が分類学上域する「属」又は「
種」にかかわることなくいずれでもよい。
来遺伝子を組み込んだプラスミドを有することができる
ものならば、その微生物が分類学上域する「属」又は「
種」にかかわることなくいずれでもよい。
即ち、ＲＸ−Ｐ、ＤＮＡを抽出し、これを本来の宿主で
あるエシェリヒア・コリ以外の微生物への形質転換によ
り移入せしめることも可能と考えられるからである。
あるエシェリヒア・コリ以外の微生物への形質転換によ
り移入せしめることも可能と考えられるからである。
ＲＸ−Ｐとしては、よく知られているように天然に存在
するもののうち一部のＤＮＡが欠落していても、増殖す
ることができるので（Ｊ、 ＢａｃｔｅｒｉｏＬ１２９
３５８−３６６（１９７７）、Ａｖｎｔ Ｈ−＞Ｂｅ
ｒｇ Ｐ、 Ｅ、 、Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ Ａ、 ）
ＲＸ−ＰＤＮＡのうち増殖に必須な部分以外のＤＮＡの
一部が欠落しているものも含まれる。
するもののうち一部のＤＮＡが欠落していても、増殖す
ることができるので（Ｊ、 ＢａｃｔｅｒｉｏＬ１２９
３５８−３６６（１９７７）、Ａｖｎｔ Ｈ−＞Ｂｅ
ｒｇ Ｐ、 Ｅ、 、Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ Ａ、 ）
ＲＸ−ＰＤＮＡのうち増殖に必須な部分以外のＤＮＡの
一部が欠落しているものも含まれる。
ＲＸ−Ｐとしては具体的（こは以下のものが知られてい
る。
る。
コリシンＥ１因子、Ｃ１ｏＤＦ（クロアシン産生因子）
、Ｒ６Ｋ（薬剤耐性因子）、Ｒ８ＦＩＯ３０（薬剤耐性
因子）、ＲＭＢｌおよびその系列としてのＰＢＲ３１３
、ＰＢＲ３２２など多数がある。
、Ｒ６Ｋ（薬剤耐性因子）、Ｒ８ＦＩＯ３０（薬剤耐性
因子）、ＲＭＢｌおよびその系列としてのＰＢＲ３１３
、ＰＢＲ３２２など多数がある。
これらのプラスミド、もしくはそれを土台とする合成プ
ラスミドのいずれについても本発明の技術は有効である
。
ラスミドのいずれについても本発明の技術は有効である
。
ＲＸ−Ｐに外来遺伝子ＤＮＡを組み込む方法は知られて
いるいずれの方法も採用することができる。
いるいずれの方法も採用することができる。
即ち、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｄ、Ａ、らのＰｏ１ｙ ｄＡ。
Ｐｏ１ｙ ｄ螢をＤＮＡ端に付加して接続させる方法（
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ
、Ａ、 ６９２９０４−２９０９（１９７２））や、
後の接続の便利を考慮して、適当な匍以酵素を選択して
ＤＮＡを切断し、ついで再結合する方法 （Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ Ｖ、 ｅｔ ａｌ、 、Ｐｒ
ｏｃ 、Ｎａｔｌ 。
Ｐｏ１ｙ ｄ螢をＤＮＡ端に付加して接続させる方法（
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ
、Ａ、 ６９２９０４−２９０９（１９７２））や、
後の接続の便利を考慮して、適当な匍以酵素を選択して
ＤＮＡを切断し、ついで再結合する方法 （Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ Ｖ、 ｅｔ ａｌ、 、Ｐｒ
ｏｃ 、Ｎａｔｌ 。
Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、 Ｕ、 Ｓ、 Ａ、７１ ３４５
５−３４５９（１９７４））などを用いればよい。
５−３４５９（１９７４））などを用いればよい。
外来遺伝子ＤＮＡはこれを特定するものではなく、又有
用な物質の生成に関する遺伝情報を担うものならばＤＮ
Ａの大小を問わない。
用な物質の生成に関する遺伝情報を担うものならばＤＮ
Ａの大小を問わない。
増殖のために要求されるアミノ酸は、特に特定のもので
ある必要はない。
ある必要はない。
これらのアミノ酸要求性は、所定の微生物に通常の変異
処理を施すことにより容易に付与することができる。
処理を施すことにより容易に付与することができる。
本発明の微生物を培養する培地は、制限量の増殖のため
に要求されるアミノ酸を含有する以外は、特に特定のも
のではないが、−１にＲＸ−Ｐに外来情報を組み込んだ
プラスミドが有する遺伝情報によって生成されるペプチ
ドもしくは蛋白質（酵素蛋白等）及びこの蛋白質の機能
によって生成される物質の生産に適した培地が適宜選択
される。
に要求されるアミノ酸を含有する以外は、特に特定のも
のではないが、−１にＲＸ−Ｐに外来情報を組み込んだ
プラスミドが有する遺伝情報によって生成されるペプチ
ドもしくは蛋白質（酵素蛋白等）及びこの蛋白質の機能
によって生成される物質の生産に適した培地が適宜選択
される。
増殖のために要求されるアミノ酸の制限量とは、微生物
の最大増殖を与えるに必要なアミノ酸の量に等しい量か
あるいはそれより少い量をいう。
の最大増殖を与えるに必要なアミノ酸の量に等しい量か
あるいはそれより少い量をいう。
培養方法は、酸素供給量、ｐＨ１温度等、使用する微生
物の増殖又は生産物の収量を上げるのに適した条件が適
宜選択される。
物の増殖又は生産物の収量を上げるのに適した条件が適
宜選択される。
微生物の増殖は増殖のためζこ要求されるアミノ酸が使
い尽されると停止する。
い尽されると停止する。
増殖が停止して後生くとも１時間以上、微生物は当該ア
ミノ酸の飢餓状態におかれる。
ミノ酸の飢餓状態におかれる。
飢餓状態におかれる時間が短い場合にはＲＸ−Ｐ／Ｉこ
外来遺伝子を組み込んでいるプラスミドの増殖が充分で
なく、又、飢餓状態におかれる時間が長すぎる場合は、
当該微生物は死滅する。
外来遺伝子を組み込んでいるプラスミドの増殖が充分で
なく、又、飢餓状態におかれる時間が長すぎる場合は、
当該微生物は死滅する。
増殖のために要求されるアミノ酸が培地に添加されると
、ＲＸ−Ｐに外来遺伝情報を組み込んだプラスミドが有
する遺伝情報によって生成されるペプチドもしくは蛋白
質及びこの蛋白質の機能によって生成される物質の生産
が開始される。
、ＲＸ−Ｐに外来遺伝情報を組み込んだプラスミドが有
する遺伝情報によって生成されるペプチドもしくは蛋白
質及びこの蛋白質の機能によって生成される物質の生産
が開始される。
従ってこれらの生産に必要な炭素源、窒素源、エネルギ
ー源等が適宜培地に追補添加されることもある。
ー源等が適宜培地に追補添加されることもある。
培養は目的とされるペプチド、蛋白質又はこれらのペプ
チド又は蛋白質の活動の結果生産される物質の生産が実
質的に停止する迄続けられる。
チド又は蛋白質の活動の結果生産される物質の生産が実
質的に停止する迄続けられる。
本発明の方法によりアミノ酸、核酸、核酸塩基、ヌクレ
オシド、ヌクレオチド、有機酸、単糖類、多糖類、ビタ
ミン類、抗生物質、酵素蛋白、その他の発酵産物を、従
来の方法に比べより多量に生産することができる。
オシド、ヌクレオチド、有機酸、単糖類、多糖類、ビタ
ミン類、抗生物質、酵素蛋白、その他の発酵産物を、従
来の方法に比べより多量に生産することができる。
またインシュリン、ソマトスフチン等のホルモンζこ代
表されるペプチド、インターフェロン、抗体等に代表さ
れる生理活性蛋白などの大量生産瘉こも有効である。
表されるペプチド、インターフェロン、抗体等に代表さ
れる生理活性蛋白などの大量生産瘉こも有効である。
実施例 １
コリシンＥ１因子瘉こ、大腸菌に−１２（ＡＴＣＣ１０
７９８）の５／−ＸＭＰ−アミナーゼ（５１−ＸＭＰ：
キサントシンー５′−モノフォスフェート）の構造遺伝
子（ｇｕａＡ）をつないで造成したＣｏ１３ Ｅｌ−Ｃ
Ｏｓλ−ｇｕａＡプラスミド（Ｍｕｋａ ｉ Ｔ。
７９８）の５／−ＸＭＰ−アミナーゼ（５１−ＸＭＰ：
キサントシンー５′−モノフォスフェート）の構造遺伝
子（ｇｕａＡ）をつないで造成したＣｏ１３ Ｅｌ−Ｃ
Ｏｓλ−ｇｕａＡプラスミド（Ｍｕｋａ ｉ Ｔ。
Ｍａｔｓｕｂａｒａ Ｋ、 ａｎｄ Ｔａｋａｇｉ Ｙ
、 ：Ｐｒｏｃ、Ｊａｐ。
、 ：Ｐｒｏｃ、Ｊａｐ。
Ａｃａｄ、５１．３５３−３５７（１９７５） ）をも
つ菌株へのアミノ酸の飢餓培養の効果を調べた。
つ菌株へのアミノ酸の飢餓培養の効果を調べた。
使用菌株はＫＳ−１８９０−６（ＦＥＲＭ−Ｐ４７９８
）で、大腸菌に−１２、Ｈｆ ｒＨａ ｙｅｓ 。
）で、大腸菌に−１２、Ｈｆ ｒＨａ ｙｅｓ 。
（ｇａｌ−ａｔｔλ−ｂｉｏ ）ｄｅｌ、 （ｇｕａＡ
−Ｂ）ｄｅｌｔｈｉａｍｉｎ ａ（ＫＳ−１６１６
）＃こ、 Ｃｏ１Ｅ１−Ｃｏｓλ−ｇｕａ Ａプラスミ
ドを保有せしめた株（ＫＳ−１８９０）からニトロソグ
アニジンによる変異処理を施して得たトリプトファン要
求株である。
−Ｂ）ｄｅｌｔｈｉａｍｉｎ ａ（ＫＳ−１６１６
）＃こ、 Ｃｏ１Ｅ１−Ｃｏｓλ−ｇｕａ Ａプラスミ
ドを保有せしめた株（ＫＳ−１８９０）からニトロソグ
アニジンによる変異処理を施して得たトリプトファン要
求株である。
培養培地（総量ＩＪ）はグルコース３０ｇ、硫安１０
ｇｌＭｇＳＯ，−７Ｈ２０１Ｅ１ＦｅＳ０４−７Ｈ２０
１０■、ＭｒＩＣ１２・４Ｈ２０７〜、チアミンＨＣｌ
１〜、グアノシン２０〜、ビオチン０．３〜及びＫ Ｒ
２Ｐ ０４２ 、ｉｉ’を含みｐＨ７，０！？−調節シ
タものである。
ｇｌＭｇＳＯ，−７Ｈ２０１Ｅ１ＦｅＳ０４−７Ｈ２０
１０■、ＭｒＩＣ１２・４Ｈ２０７〜、チアミンＨＣｌ
１〜、グアノシン２０〜、ビオチン０．３〜及びＫ Ｒ
２Ｐ ０４２ 、ｉｉ’を含みｐＨ７，０！？−調節シ
タものである。
これを５０ｍ／！づつ５００ｒｒｌｌフラスコに人ね、
３７℃で振盪した。
３７℃で振盪した。
本培地におけるＬ−）ＩＪブトファンの必要量は２０■
／ｌであった。
／ｌであった。
アミノ酸すなわちＬ−１−リプトファンの飢餓培養は、
培養開始時に４η／ｌのＬ−１−ＩＪブトファンを与え
て行ない、生育がほぼ終了した時点（５，５時間）より
１．５時間後の時点で、１６■／ｌを補添し、さらに４
時間培養したのち集菌して酵素活性を測定した（酵素源
Ｂ） 対照として１６η／ｌのＬ−トＩＪブトファンのかわり
に等量Ｑ水を添加したものを酵素源Ｃとした。
培養開始時に４η／ｌのＬ−１−ＩＪブトファンを与え
て行ない、生育がほぼ終了した時点（５，５時間）より
１．５時間後の時点で、１６■／ｌを補添し、さらに４
時間培養したのち集菌して酵素活性を測定した（酵素源
Ｂ） 対照として１６η／ｌのＬ−トＩＪブトファンのかわり
に等量Ｑ水を添加したものを酵素源Ｃとした。
更に対照としてアミノ酸を培養当初より充分（２０〜／
ｌ）与えたものを酵素源Ａとした。
ｌ）与えたものを酵素源Ａとした。
接種用前培養は、酵母エキス５ｇ／ｌ：、ペプトン１０
ｇ／ｌ及びＮａＣ１５ｇ／ｌを含み、ｐＨ７，０に調節
し、その５０ｙｄを５００−フラスコに入れた培地を用
い培養は２４時間３０℃にて行ない、この培養液の０．
５ｍｌを５０７７＃）前記培養培地に接種した。
ｇ／ｌ及びＮａＣ１５ｇ／ｌを含み、ｐＨ７，０に調節
し、その５０ｙｄを５００−フラスコに入れた培地を用
い培養は２４時間３０℃にて行ない、この培養液の０．
５ｍｌを５０７７＃）前記培養培地に接種した。
酵素活性の測定は、トリス・塩酸バッファー１００μｍ
ｏｌｅ （ｐＨ８，５） 、 ＭｇＣｌ２１５ μｍｏ
ｌｅ。
ｏｌｅ （ｐＨ８，５） 、 ＭｇＣｌ２１５ μｍｏ
ｌｅ。
（ＮＨ４）２ＳＯ４８０μｍｏｌｅ、ＡＴＰ４μｍｏｌ
ｅ 。
ｅ 。
５／−ＸＭＰ２又は０μｍｏｌｅおよび酵素源を含む反
応液（総量１ｒｒｌｌ）を用いて行った。
応液（総量１ｒｒｌｌ）を用いて行った。
酵素源は、前記本培養の培養１１時時間上り集菌した菌
体を※（水に懸濁しトルエンを加えて激しく攪拌し、一
夜−２０℃に凍結した。
体を※（水に懸濁しトルエンを加えて激しく攪拌し、一
夜−２０℃に凍結した。
解凍ののち、これを酵素源とした。
５’−ＸＭＰを加えて反応を開始し、３７℃にて１５分
間静止した。
間静止した。
反応終了後１００℃に５分間力烏して反応を停止せしめ
、遠心上清を得て、高速液体クロマトグラフィーにて、
５’−ＸＭＰアミナーゼ活性により生成した５’−ＧＭ
Ｐを測定した。
、遠心上清を得て、高速液体クロマトグラフィーにて、
５’−ＸＭＰアミナーゼ活性により生成した５’−ＧＭ
Ｐを測定した。
結果は表１のようであった。
蛋白量はＦｏｌｉｎ法で測定した。
表１の結果から、アミノ酸の十分与えられた状態（酵素
源Ａ）のものにくらべ、アミノ酸、すなわち、トリプト
ファンを飢餓状態にしたのち、しばらくしてから、アミ
ノ酸を補添すると（酵素源Ｂ）、生育の回復と同時ｔこ
、酵素活性の顕著な増大がみられ、比活性で約６倍、全
活性で約３倍となった。
源Ａ）のものにくらべ、アミノ酸、すなわち、トリプト
ファンを飢餓状態にしたのち、しばらくしてから、アミ
ノ酸を補添すると（酵素源Ｂ）、生育の回復と同時ｔこ
、酵素活性の顕著な増大がみられ、比活性で約６倍、全
活性で約３倍となった。
表１゜
飢餓培養による５’−ＸＭＰ−アミナーゼの増産生育は
５６２ｍμにおける吸光度を測定して生育量とした。
５６２ｍμにおける吸光度を測定して生育量とした。
５’−ＸＭＰ−アミナーゼの比活性は、５／−ＧＭＰの
生成量μｍ ｏ ｌ ｅ ／Ｋｎ／、ｉｎ９ Ｐ ｒｏ
ｔ ｅ ｉｎで表示し、Ａの量（０，００４４）を１と
して表示した。
生成量μｍ ｏ ｌ ｅ ／Ｋｎ／、ｉｎ９ Ｐ ｒｏ
ｔ ｅ ｉｎで表示し、Ａの量（０，００４４）を１と
して表示した。
全活性は、本培養プロス１７！当りの比活性を示し、Ａ
の量０．０００５３ ｐｍｏ ｌ ｅ 、４６ＩＬ／ゴ
ｂｒｏｔｈを１として表示した。
の量０．０００５３ ｐｍｏ ｌ ｅ 、４６ＩＬ／ゴ
ｂｒｏｔｈを１として表示した。
実施例 ２
エシェリヒア・コリに−１２（ＡＴＣＣ１０７９８）の
変異株Ｃ−６００（Ｌ−ロイシン要求性、Ｌ−スレオニ
ン要求性、チミン要求性、ストレプトマイシン耐性）Ｉ
！こＲ８Ｆ２１２４プラスミド（コリシンＥ１プラスミ
ドにアンピシリン耐性遺伝子が天然において転移したも
の）を存在させたＣ−６００（Ｒ８Ｃ−６００（Ｒ８Ｆ
２１２４）（ＦＥＲのプラスミド上の遺伝子産物として
のアンピシリン耐性遺伝子由来のβ−ラクタマーゼの生
産を検討した。
変異株Ｃ−６００（Ｌ−ロイシン要求性、Ｌ−スレオニ
ン要求性、チミン要求性、ストレプトマイシン耐性）Ｉ
！こＲ８Ｆ２１２４プラスミド（コリシンＥ１プラスミ
ドにアンピシリン耐性遺伝子が天然において転移したも
の）を存在させたＣ−６００（Ｒ８Ｃ−６００（Ｒ８Ｆ
２１２４）（ＦＥＲのプラスミド上の遺伝子産物として
のアンピシリン耐性遺伝子由来のβ−ラクタマーゼの生
産を検討した。
まず本菌のＬ−ロイシン要求量を予備実験の結果から、
５０γ／ｒｒＩｌとした。
５０γ／ｒｒＩｌとした。
培養方法は下記Ａ培地（５０〇−容肩付フラスコに５〇
一人れた）に予めＢ培地にて２４時間培養した培養液を
５係量接種し、３０℃で振盪培養した。
一人れた）に予めＢ培地にて２４時間培養した培養液を
５係量接種し、３０℃で振盪培養した。
１０γ／ｆｎｌのＬ−ロイシンを加えたＡ培地５０ｙｄ
（５００７７２７！容肩付フラスコに入れた）にＢ培地
に生育した菌２．５７７２７！を接種し３０℃にて９時
間振盪培養したのち、さらにＬ−ロイシンを加えて、計
５０γ／ｙｄとし、アンピシリン・ナトリウム塩１００
γ／ｍ／！を加え、培養を続けて、接種後１１１時間目
、β−ラクタマーゼ活性（アンピシリン耐性遺伝子の産
物）を測定した。
（５００７７２７！容肩付フラスコに入れた）にＢ培地
に生育した菌２．５７７２７！を接種し３０℃にて９時
間振盪培養したのち、さらにＬ−ロイシンを加えて、計
５０γ／ｙｄとし、アンピシリン・ナトリウム塩１００
γ／ｍ／！を加え、培養を続けて、接種後１１１時間目
、β−ラクタマーゼ活性（アンピシリン耐性遺伝子の産
物）を測定した。
当初よりＬ−ロイシン５０γ／Ｗｌｌを与えて培養し、
９時間目にアンピシリン・ナトリウム塩１００γ／ｒＩ
ｌｌを加えた場合と比較したところ、前者（５６，５）
は後者（２４，１）の２．３倍の比活性を示した。
９時間目にアンピシリン・ナトリウム塩１００γ／ｒＩ
ｌｌを加えた場合と比較したところ、前者（５６，５）
は後者（２４，１）の２．３倍の比活性を示した。
β−ラククマーゼ活性の測定は、 Ｓａｒｇｅｎｔ法
（蛋白質、核酸、酵素ヱ３３９２（１９７８）澤井哲夫
、高橋郁子のヨウ素比色法参照）によった。
（蛋白質、核酸、酵素ヱ３３９２（１９７８）澤井哲夫
、高橋郁子のヨウ素比色法参照）によった。
比活性は、菌液を１／２６に稀釈し、５６２ｎｍの吸光
度を測定し、その値で全活性を除したものである。
度を測定し、その値で全活性を除したものである。
さらに菌体をリゾチームで処理し、３０．００Ｏｒｐｍ
、６０分の遠心上清を得て、アカ和−スゲル電父泳動を
行い、エチジウムプロミドで染色して該プラスミドＤＮ
Ａの存在量を比較したところ、β−ラクタマーゼの比活
性に対応する量が検出された。
、６０分の遠心上清を得て、アカ和−スゲル電父泳動を
行い、エチジウムプロミドで染色して該プラスミドＤＮ
Ａの存在量を比較したところ、β−ラクタマーゼの比活
性に対応する量が検出された。
実施例 ３
実施例１の方法に準じたうｉＬ−ロイシン添加時に、酵
母エキスとペプトン各１０％の水溶液５−を無菌的に加
え、培養を続けたところ表２の結果を得た。
母エキスとペプトン各１０％の水溶液５−を無菌的に加
え、培養を続けたところ表２の結果を得た。
９時間目にＬ−ロイシンを追補したものがもつとも高い
活性を示した。
活性を示した。
表２゜
Ｌ−ロイシンおよび酵母エキス、ペプトンの添加時期と
β−ラクタマーゼ活性 アンピシリン酵母エキスおよびペプトンの添加時期は、
実験区１，２では７時間目、３では９時間目。
β−ラクタマーゼ活性 アンピシリン酵母エキスおよびペプトンの添加時期は、
実験区１，２では７時間目、３では９時間目。
Claims (1)
- １ 増殖のためにアミノ酸を要求し、リラックスタイプ
のＤＮＡ増殖形式をとるプラスミドに外来の遺伝情報を
担うデオキシリボ核酸を組込んだプラスミドを有するエ
シェリヒア・コリに属する微生物を、講のために要求さ
れるアミノ酸の制限量を含有する培地を用いて培養し、
上記微生物の増殖が実質的に停止してから１時間以上経
過して後、上記増殖のために要求されるアミノ酸を培地
ｌこ添加して更ｌこ培養を続けることを特徴とする微生
物の培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP54030286A JPS5925598B2 (ja) | 1979-03-15 | 1979-03-15 | 微生物の培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP54030286A JPS5925598B2 (ja) | 1979-03-15 | 1979-03-15 | 微生物の培養方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS55124495A JPS55124495A (en) | 1980-09-25 |
| JPS5925598B2 true JPS5925598B2 (ja) | 1984-06-19 |
Family
ID=12299467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP54030286A Expired JPS5925598B2 (ja) | 1979-03-15 | 1979-03-15 | 微生物の培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5925598B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0076037B1 (en) * | 1981-09-02 | 1988-12-07 | Biogen, Inc. | Amplified expression of dna sequences |
| WO1985004187A1 (en) * | 1984-03-12 | 1985-09-26 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for preparing 5'-guanylic acid |
-
1979
- 1979-03-15 JP JP54030286A patent/JPS5925598B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS55124495A (en) | 1980-09-25 |
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