JPS59216600A - ホルマザン化合物による染着防止方法及び染着防止用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ゼラチンを有効成分とする、ホルマサン化合
物による染着防止方法及び染着防止用試薬に関するもの
である。

二トロテトラツリウムブルー（以下Ｎｏ２−ＴＢと略記
する。）等のテトラツリウム塩類は一般に酸化還元電位
が低く、還元されるとモノホルマザン化合物又はソホル
マサン化合物のようなホルマサン化合物を生じ橙色〜青
色を呈するので、臨床化於て、脱水素酵素の測定用試薬
として或は還元型補酵素やスーパーオキサイドイオンの
ような還元性物質の比色定量用試薬として広く用いられ
ている。

これらのテトラツリウム塩類は、一般に、水溶性化合物
であり、容易に非可逆的に、還元されてホルマザン化合
物となる。還元されて生成したホルマザン化合物は、一
般に有機溶媒には易ｍ性であるが、水には僅かにしかｍ
けない。又、ホルマザン化合物は、一般に、隨素に対し
て比較的安定ではあるが、抜染体に対する染着性が強く
、なかでモＮ０２−ＴＢの７ホルマナン化合物は≠学凸
奔蛙ようなホルマザン化合物による染着は、一旦染着さ
れてしまうとこれをそのような染着された被染体から取
り除くことは全く困難なことであることがよく知られて
いる。この性質は、特に組織における酵素活性の局在性
を研究する組織化学のような組織への染着性を利用する
方法には適しているが、被検試料中の体液成分例えば血
清中の酵素活性の測定や微量成分（基質）の酵素的測定
法においては、通常水溶液中で呈色反応が行なわれるた
め、これらホルマザン化合物の水に対する溶解性が小さ
い性質やガラス制質、プラスチック拐質などの被染体に
強い染着性を有する性質は、ホルマザン化合物による被
染体の染着現象を惹起し、結果として、そのようなホル
マザン化合物が吸光度測定用の被染体であるセルなどに
染着して誤差を生じるなど逆に重欠点となっている。

又、テトラゾリウム塩類の水射液は一般に安定ではある
が、チオール化合物が共存すると次第に分解し、これに
着色を生じる。

本発明者らは、これらの欠点に鑑み鋭、＠研究の結果、
セラチンが、テトラツリウム塩類から生成するホルマザ
ン化合物の染着力を効果的に抑制し、同テトラツリウム
塩類が還元されて生成する色素であるホルマザン化合物
による被染体の染着を効果的に防止することを見い出し
、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、セラチンを有効成分とする、１ 部分構造　−Ｎ　、−Ｎ　＝　Ｃ−Ｎ　＝　Ｎ−を有す
るホルマザン化合物（以下、単にホルマザン化合物とも
いう。）による染着防止方法及び染着防止用試薬である
。

モノボルマサン化合物やジホルマサン化合物のようなホ
ルマザン化合物の水に対する溶鋼性を向上させるために
、トリトン（登録商標。以下同じ。）のような界面活性
剤やセラチンの使用が効果的であることは知られている
。（酵素分相法１２４頁、昭和５６年９月１０日（株）
廣用舎店発行）しかしながら、これら溶解性を向上させ
るものが即ちこれらホルマナン化合物の染着力をも効果
的に抑制するか否かについては定見はなかった。因に、
本発明に係るＩ！クチンについては、そのような染着力
をも効果的に抑制することが本発明者らによって明らか
にされたが、トリトンについてはそのような染着力の効
果的な抑制作用が無いことは周知である。

即ち、従来、溶解性を向上させるものであってもトリト
ンのような界面活性剤はホルマザン化合物による染着を
効果的に防止す７らことができないことは知られていた
が、一体、そのような＠解性を向上させるもののなかに
ホルマザン化合物による染着を効果的に防止するような
ものがあるのだろうか、又、あったとして、とのような
ものがホルマザン化合物による染着を効果的に防止する
のか、又はそのような染着防止に効果的な物質とホルマ
ザン化合物の溶解性を向−１ニさせるものとの間に何ら
かの関係が存在するのか否かに関して（ｄ、全く研究さ
れていなかった。

本発明は、このような問題を解決するものであり、ホル
マザン化合物の水に対する溶解性を向上させるもののう
ち、ある特定のものであれは、それが、テトラゾリウム
塩類が趙元されて生成するホルマナン化合物の染着力を
効果的に抑制する、との最初の情報を開示するものであ
り、そのような特定のものとしてゼラチンが存在する、
との知見を最初に開示するものである。

本発明に於て特に効果的なセラチ／は、その平均分子量
が２０，０００〜１５０，０００であるようなぜうチン
であって、その分子量が例えば１，０００とか２，００
０であるような水晶性セラチンについてはそのような効
果は特に効果的ではないようにみえる。しかしながら、
本発明に係るセラチンは、その平均分子量が２０，００
０〜１５０，０００であるようなセラチンに限定される
ものではなく、これら、その平均分子量が２０．０００
〜１．５０，０００であるようなセラチンと同等な作用
を有するものであれは、いずれのものでもよい。なお、
その由来は、動物の骨や皮なとに由来するものが市販さ
れているが、これらに限られるものではない。

本発明は、テトラツリウム塩類が趙元されて生成する色
素であるホルマＩＪ′ン化合物による染着力を効果的に
抑制する方法及び試薬に関する発明であるので、そのよ
うな反応を利用する種々の自体公知の定損方法及び試薬
にそのままでも適用することができる。

例えは、代表的なテトラツリウム塩類の１であるＮｏ２
−ＴＢを用いる、被検試料中の体液成分の測定汐りを例
に挙けて説明すると、先ず、血清中の酵素活性を測定す
る脱水素酵素の活性の測定例とし　　　　′て、補酵素
（酸化型補酵素）の存在下、基質に脱水素酵素を作用さ
せる酵素反応により、定量的に生成する還元型補酵素で
、適当な電子伝達体Ｘはンアホターセのような酵素の存
在下に、テトラツリウム塩類を還元して生成するホルマ
ザン化合物の呈色を定量する方法及び試薬がある。又、
スーパーオキサイドイオン０７を定量的に生成する反応
があれば、このスーパーオキサイドイオンにより定量的
にテトラツリウム塩類が還元されて生成するホルマザン
化合物の呈色を定量する方法及び試薬にも適用すること
ができる。このようなスーパーオキサイドイオンの生成
反応の例として、酸化酵素を基質に作用させ、スーパー
オキサイドイオンを生成させる酵素反応がある。これは
、具体的実施に当り、好捷しくけ、チオール化合物、ベ
ルオキシダーセ、フェノール化合物の共存下で、酸化酵
素を基質に作用させ、スーパーオキサイドイオンを生成
させる酵素反応により、目的成分を定量するものである
が、このスーパーオキサイドイオンを、テトラツリウム
塩類及び適当な電子伝達体又はリボアミトテヒドロゲナ
ーセ（ノアホラーセ）の存在下に、テトラツリウム塩類
と定量的に反応させて、テトランリウム塩が還元されて
生成するホルマザン化合物の呈色を定量的に測定する場
合は、チオール化合物の存在により、それらテ１ラノリ
ウム塩が不安定となり、チオール化合物及びテトラツリ
ウム塩類を含有する溶液が着色して、目的成分の定量的
測定を妨害する問題点が生じる。

この間＠は、そのような溶液に、特定の／クロテキスト
リンを共存させることにより解決することができること
が判明した。即ち、そのような問題を解決するためには
、そのような浴液に、β−／クロテキストリン又は（−
７クロデキストリンを共存させれはよい。α−シクロテ
キストリンにはそのような作用、効果はない。β−７ク
ロデキストリン又はγ−／クロテキストリンに、そのよ
うな、即ち、チオール化合物及びテトラツリウム塩類を
含有する溶液であってもこ打にそれらβ−−シクロデキ
ストリン又はγ−ンクロテキストリンを共存させればそ
のような溶液着色は生じない、作用、効果が認められた
。

これは、一般的には、それらβ−７クロテキストリン又
はｒ−シクロデキストリンによるテトラノ゛リウム塩の
包接作用によるものであると考えることができる。

このようにしてβ−７クロテキストリノ又は／及びγ−
シクロテキストリンによって安定化されたテトラノ゛リ
ウム塩であっても、スーパーオキサイＩ・イオンによる
テトランリウム塩の還元反応は、充分速い反応速度で進
行し、還元反応で生成したホルマザンの呈色を測定する
ことにより、充分な−パーオキサイドイオンを定量的に
測定することができる。

本発明は、ゼラチンを有効成分とし、部分構造■］ −Ｎ−Ｎ＝Ｃ−Ｎ＝Ｎ〜　を有するホルマザン化合物に
よる染着を防止する以外、又はテトラゾリウム塩類をβ
−シクロデキストリン又は／及びｒ−シクロデキストリ
ンによって安定化させる以外は、自体公知の方法及び試
薬によっても容易に実施をすることができる。

部分構造　　Ｈ −Ｎ−Ｎ＝Ｃ−Ｎ二Ｎ−を有する ホルマザン化合物の典型の１は、有機残基Ｒ１、Ｒ２及
びＲ３をその置換基として有する、一般式（１）Ｒ’　
−Ｎ−Ｎ＝Ｃ−Ｎ＝Ｎ−Ｒ３で示されるモノホルマザン
化合物であり、そのようなモノホルマザン化合物〔Ｉ〕
として代表的なものに、一般式ＣＩＩＩ（阻しＸｌ及び
Ｘ２ば、−Ｎｏ□又は−Ｈを表わし、Ｘ３は、−０ＣＨ
３、−■又は−Ｉ（を表わす。）で示されるモノホルマ
ザン化合物や構造式（ｂ）で示されるモノホルマザン化
合物があシ、一般式〔１〕で示されるモノホルマザン化
合物の一例として構造式（ａ） で示されるモノホルマザン化合物がある。

ルマザン化合物の他の典型の１は、一般式〔１■〕（但
しＸｌ及びＸ２は、−Ｎｏ２又は−Ｈを表わし、Ｘ３は
、−０ＣＨ３、−■又は−Ｈを表わす。）で示されるジ
ポルマザン化合物であり、そのような一般式ＣＩＩ＋　
）で示されるジホルマザン化合物の例として構造式（Ｃ
）乃至（ｆ）で示されるジホルマザン化合物がある。

又、還元型補酵素やスーパーオキザイドイオンを有する
ホルマザン化合物と々るテトラゾリウムＮ−Ｎ。

ようなテトラゾリウム塩であって一般式〔１〕２ Ｈ Ｒ’−Ｎ−Ｎ＝Ｃ−Ｎ＝Ｎ−Ｒ３（ＬＢ、Ｌ、Ｒ１、Ｒ
２及びＲ３け有機残基を表わす。）で示されるモノホル
マザン化合物となるモノテトラゾリウム塩は、一般式％
式％ 又、一般式［ＩＩＤで示されるモノホ７ｔ、マザン化合
物又は一般式〔１■〕で示されるジホ／ｌ、マザン化合
物と々るテトラゾリウム塩は、各々一般式〔Ｖ）　（［
１１’：ＩＴ）、又は一般式ＣＶＩ’：ｌ　（［ｌＩＤ
　Ｔ　）で示される。

ｘ’　　ｘ’ （但し、Ｘｌ及びＸ２ば、−Ｎｏ２又は−Ｈを表わし、
Ｘ３け、−０ＣＨ３，−Ｉ又は−Ｈを表わす。）又、構
造式（ａ）乃至（ｆ）で示されるホルマザン化合物とな
るテトラゾリウム塩は、構造式（ｇ）　（（ａ）　Ｔ　
）乃至（１）　（（ｆ）　Ｔ　）で示される。

ゼラチンは通常溶液中に存在させる。溶液中で効果的な
ゼラチン濃度は、通常、−９１３，０，１〜０．７重量
／容量係、好１しくけ、−例、０２〜０．５重量／容量
係である。

本発明は、テトラゾリウム塩類が還元されてホルマザン
化合物が生成する反応を利用する種々の定量方法及び試
薬のいずれにも適用することができる。

典型的−例としては、そのような反応及びそのような定
量方法及び試薬により、溶液中で、基質又は脱水素酵素
が体液成分であるような、抜栓試料中の基質又は脱水素
酵素を定量する方法及び試薬のいずれにも本発明を適用
することができる。

例えば、溶液が、電子伝達体又はリボアミドブて成るテ
トラゾリウム塩溶液である、定量方法及び試薬、又は、
そのようなテトラゾリウム塩溶液が、更に、基質及び酸
化型補酵素と酵素反応させて還元型補酵素を生成させる
脱水素酵素及び酸化型補酵素をも含む定量方法及び試薬
にも、本発明を適用することができる。

）Ａ下 （、 このような脱水素酵素活性の測定例として、血清中の乳
酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の測定を例示する。

ＤＬ−乳酸リチウム０．１１ＶＩ　、　Ｎ　Ａ　Ｄ　０
．２％、ジアホラーゼ２００　ｕ　／ｄｅ、Ｎ０ｚ−Ｔ
　Ｂ　０１０２％を含む０．１　Ｍ　−）　！Ｊス塩酸
緩衝液にゼラチンを０．３重量／容量チ濃度に添加溶解
した溶液を体液、例えば血清０．０５ｍ１に対し０．５
−を加え３７°Ｃ恒温槽中正確に１０分間加温反応せし
めた後０．ＩＮ塩酸５．０＋ｎｌを加えて混和し試薬盲
検を対照として５６０ｎｍＶＣおける吸光度を測定し、
別に標準血清（ＬＤＨ活性値既升）を用いて同一操作を
行って得だ検量線と対比して血清中のＬＤＨ活性値を求
める。

ゼラチンを添加しない試液を用いたときは吸光度測定用
ガラスセルは数十検体の測定で染着が認められるが、本
発明のゼラチンを用いた試液では数百検体の測定でもセ
ルの染着は全く認められない。

肩して成る、安定化されたテトラゾリウム塩溶液である
、定量方法及び試薬、又は、そのようなテトラゾリウム
塩溶液が、更に、基質に作用してスーパーオキサイドイ
オンを生成させる酸化酵素をも含有する定量方法及び試
薬にも、本発明を適用することができる。

電子伝達体又はりｊポアミドデヒドロゲナーゼ（ジアホ
ラーゼ）は、還元型補酵素によってテトラゾリウム塩が
還元されてホルマザン化合物が生成する反応に、通常、
用いられる。

そのような電子伝達体の一例として、フェナジンメトサ
ルフェート（ＰＭＳ）、１−メトキシフェナジンメトサ
ルフェルト（メトキシ−ＰＭＳ　）又は９−ジメチルア
ミノベンゾ−α−７エナゾキソニウムクロライド（メル
トラブル−）４が挙ケられる。

酸化型補酵素の存仕下に基質に作用して還元型補酵素を
生成させる脱水素酵素による自体公九の酵素反応に用い
られる、酸化型補酵素の一例とじｉ、ＮＡＤ（酸化型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド）又ＵＮＡＤＰ（
ｍ化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）
が挙げられ、基質の一例として、乳酸、α−ヒドロキン
酪酸、コレそチロール、胆汁酸、グリセリン、グリセリ
フ、３＋７７酸、ｙｖフコース６−１／ン酸、アルデヒ
ド例えばホルムアルデヒド又はアセトアルデヒドが、挙
げられ、脱水素酵素の一例としては、乳酸脱水素酵素（
ＬＤＨ）、α−ヒドロキ７酪酸脱グリセリン〜３−リン
酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵′素、
アルデヒド脱水素酵素又はホルムアルデヒド脱水素酵素
等が挙げられ、そのような酵素反応では、ＮＡＤＨ（還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）又ｆｉＮ
ＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸）のような還元型補酵素が生成する。

又、基質に作用してスーパーオキサイドイオン０？ヲ生
成させる酸化酵素による酵素反応の一例とシテハ、基質
カクルコース、コレスアロール、りリセロール、グリ七
四−ル燐酸エステル、コリン、アシルＣ０Ａ１　ピルビ
ン酸、尿酸、キサンチン又は乳酸であシ、それらの基質
に作用する酸化酵素が各々グルコースオキシダーゼ、コ
レステロールオキンダーゼ、グリセロールオキシダーゼ
、グリセロール燐酸エステルオキ／ダーゼ、コリンオキ
シダーゼ、アンルＣＯＡオキシダーゼ、ピルビン酸オキ
／ダーセ、ウリカーゼ、キサ、ンチン杖キンダーゼ又は
乳酸オキ７ダーゼ等が埜げられる。こめとき、共存させ
るチオール化合物の一例として、還元型グルタチオン、
チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオサリチ
ル酸、システアミン、ンステイン又はジメ≠ルカプトコ
）Ｓり酸痔が挙げられる。

テトラゾリウム塩を安定化するβ−７タロデキストリ／
又はγ−ンクロテキストリンの碇度について述べると、
溶液中、β−７クロデキストリンを用いる濃度の一例と
しては、溶液中、通常、０．０１〜１５重！／容＠’％
、ｒ−シクロデキストリンを用いる濃度の一例としては
、同じく、溶液中、通常、００１〜１０重量／容量チで
あり好捷しい一例としては、通常、β−／クロデキスト
リンは０１〜０５重量／答量チ、ｒ−７クロテキストリ
ンは０．１〜３Ｍ量／容量チが用いられる。又、β−７
クロデキストリンとｒ−ンクロデキストリンを上記濃度
で任意の比率で混合して用いてもよい。

本発明は、テトラゾリウム塩類溶液にゼラチンを共存さ
せることによシ、アトラゾリウム塩類が還元されて生成
する色素であるホルマザン化合物による染色を防止する
方法及び試薬を提供するものであり、具体的測定に於て
、セルブランク値の上昇をきださない、使用後のセル、
試験管等の洗浄が容易である等の利点を有し、従来、そ
のような染着防止の技術が存在しなかったために、その
適用をあきらめていたといっても過言ではない。

テトラゾリウム塩類が還元されて生成するホルマザン化
合物の呈色を測定する測定法及び試薬の、臨床診断薬、
製薬、化学、生化学、良品化学の分野に於ける、適用を
極めて容易ならしめ及びその適用対象を一埜に拡大する
技術を提供するものであり、この点に於て斯業に貢献す
るＰＪｉ、極めて犬なるものがある。

以下に本発明に係る実施例を述べるカニこれに１恨実施
例　１　血清胆汁酸の測定 発色試液：０．ＩＭＦリス緩衝液（ｐＨ７，５）中にＮ
Ｏ，−Ｔ　Ｂ　０．０４係、ＮＡＤｏ、２チ、ジアホラ
ーゼ　２．２５　ｕ／ｄ１２　、３α−ヒドロキシステ
ロイドデヒドロケナーゼ（３α−ＨＳ　Ｄ　）　４　ｕ
／ｄｅ、ピルビン酸ナトリウム０．０１％、ゼラチン０
３％、を溶解させ、検体用発色試液ｆ：調製する。

別に、上記検体用発色試液から３α−Ｈ８Ｄを除いた検
体盲検用発色試液を調製する。

血清胆汁酸の測定：２本の試験管に各々血清０、２　ｍ
ｌをとり、１本ｖＣ１ｄ検体用発色試液２ｍｌを。

他の１本には検体盲検用発色試液２ゴを加えて、３７℃
恒温槽中１０分間加温後、直ちに、水を対照として５４
０ｎｍＫおける吸光度を測定する。別に、血清の代りに
イオン交換水を用いて同様の操作を行い、水を対照とし
て５４．　Ｏｎｍにおける吸光度を測定する。

別に、血清の代りにグリココール酸５０μｍｏＶｌを含
む標準液を用いて血清の場合と同一操作を行う。次式に
より血清中の胆汁酸濃度を算出する。

（Ｅ　Ｓ　　Ｅ　ｎ　）　−（Ｆ、ｓ　Ｂｇ　ＢＢ）ｘ
　　５０　　（μｍｏｌ／７） （Ｅｓｔｄ−ＥＢ）　−（ＥｓｔＢ−ＥＢＢ）Ｅｓ　：
　（血清＋検体用発色試液）の吸光度ＥＢ：（イオン交
換水＋検体用発色試液）の吸光度ＥＳＢ　：　（血清」
−検体１検用発色試液）の吸光度ＥＢＢ　：　（イオン
交換水子検体盲検用発色試液）の吸光度 Ｅ３ｔｄ：　（標準７仮＋・を英体用元色試液）の吸光
度Ｅｓｔｎ：　（標準液＋検体ｉ検用発色試液）の吸光
度 比較例　１　血清胆汁１波の測定 発色試液、実施例１０発色試液からゼラチンを除いた検
体用発色試液と検体盲検用発色試液を調製する。

血ｍ胆汁酸の測定　　実施例　１　に同じ。

以下７ＪｆＡ （′ （ｊ＋ 実施例１と比較例１の測定結果比較表 比較表　１ 比較衣　３ ポリスチレン製セルに対する染着性 標準液の呈色液をポリスチレンセルに入れ１６時間室温
に放置抜液を捨てて水洗し乾燥して染着度を観測した。

試液を安定化し、呈色液によるポリスチレンセルの染着
を効果的に防止する。

実施例　２　血清クレアチンホスホキナーゼ（ＣｊＫ）
の測定 基質発色試液：　０．０５　Ｍ　ＩＪ　ン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，４）中ＶｃＮｏ２−ＴＢ　　Ｏ，０６％、　Ｄ−
クルコース８０ｒｒＭ／ｄ１．　　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　　
Ｏ，０８ｍＭ／ｄｉｒ酢ｄマグネシウム　３　ｒｎＭ／
　ｄｅ　、クレアチンリン酸　２　ｍＭ／ｄｅ　、　　
ＡＤＰ　　０．２ｍＭ／ｄｅ＋　ＡＭＰ　　１ｍＭ／ｄ
ｅ、ヘキソキナーゼ　６　（Ｉ　Ｔｕ／ｄｇ　、グルコ
ース−６−リン酸脱水素酵素　３　（ｌ　Ｉｕ／ｄｉ！
、グルタチオ７０５ｍＭ／ｄｅ　、ジアホラーゼ　１０
　ｕ／ｄｅゼラチン０．３％を含む溶液を調製する。

血清ＣＰＫの測定　基質発色試液０．５　ｍｅをとり、
３７℃恒温槽中で３分間加温後血清０．０５−を加えて
混和し、恒温槽中３７℃で正確に１０分間加温し、その
鏝直ちに、０．１Ｎ塩酸５ｒｎｌを加えて混和する。試
薬盲検（血清の代りにイオン交換水を用いて血清の場合
と同一操作を行ったもの。）ｒ対照として５６０　ｎｍ
の吸光度を測定する。

ＣＰＫ活性既知の標準血清を用いて同一操作を行い吸光
度を測定する。次式より血清中のＣＰＫ活性度を算出す
る。

□×標準血（冴のＣＰＫ活性値（ｍｕ／ｍｅ）１（Ｓｔ
ｄ ＥＳ、検体（血清）の吸光度 Ｅｓｔｄ　　標準血清の吸光度 比較例　２　血清ＣＰＫの測定 基質発色試液：実施例２の基質発色試液からゼラチンを
除いた基質発色試液をｉｉＭＪ製する。

血清ＣＰＫの測定：実施例２に同じ。

実施例２と比較例２の測定結果比較表 比較表　１゜ 血清測定値の比較 比較表　２ 室温保存に於ける基質発色試液の経時変化室温、　２５
℃　、容器：褐色ガラスビン比較光　３ ガラスセルに対する染着性 標準血清の呈色液をガラスセルに入れ１６時間室温に放
置抜液を捨てて水洗し乾燥し、染着度を観測した。

比較表１．２．３から明らかなように、ゼラチンはＣＰ
Ｋ活性には全く影響を与えず、しかも基質発色試液を安
定化し、呈色液によるガラスセルの染着を効果的に防止
する。

実施例　３　血清遊離コレステロールの測定発色試液：
各々、Ｎｏ、　−Ｔ　Ｂが２０　ｍＷｉｄｅ　、　７１
ノールが０．０１％、トリトンＸ−１００が０１％、パ
ーオキシダーゼ（東洋紡績■１１）が３００ｕ／ｄ１．
コレステロールオキ／ダーゼ（大野製薬６１製）が１５
ｕ／ｄ／！、グルタチオン（還元型）が２０　ｍｙｌｄ
７！。

ゼラチンが０．５％、β−シクロデキストリンが０．２
係の濃度になるように、０．１　Ｍ　ｌ−ＩＪス緩衝液
（ｐＨ８，０）にこれらを溶解した液を発色試液とする
。

槽中１０分間加温後水を対照として波長５６０ｎｍにお
ける吸光度を測定する。別に、血清の代りにイオン交換
水を用いて同様に操作して求めた吸光度を試薬盲検値と
する。

血清の代りに、コレステロールの２００〜／　ｃｉｅな
るイノグロバノール溶液（標準液）を用いて同様に操作
して標準の吸光度を求める。次式により血Ｆｆ中の遊離
コレスプロール濃度を算出する。

Ｅｓｔｄ−ＥＢ ＥＳ：血清を用いたときの吸光度 ＥＢ　ｉ試薬直検値 Ｂｓｔｄ：標準液を用いたときの吸光度比較例　３　血
清遊離コレステロールの測定発色試液°実施例３の発色
試液からゼラチンとβ−シクロデキストリンを除いた発
色試散をＡ製する。

血清遊離コレステロールの測定：実施例３に同じ。

以下り 実施例３と比較例３の測定結果比較表 比較表　１ 比較表　２ 試薬盲検値の比較 比較表　３ コレステロール標準液呈色度の比較 比較表　４ 室温保存に於ける発色試液の経時変化 比較表　５ ガラスセルに対する染着性 コレステロール標準液の呈色液をガラスセルに入れ１８
時間室温に放置抜液を捨てて水洗し乾燥して染着度ｆ：
観測した。

比較表１．２，３，４．５から明らかなように、ゼラチ
ンも、β−シクロデキストリンも、酵素法によるコレス
テロールの定量には全く影響を馬えず、これらは、試薬
盲検値の上昇を効果的に抑制し、かつ発色を試液を安定
化し及び１、呈、′色液によるガラスセルの染着を効果
的に防止する。

実施例　４　血清遊離コレステロールの測定発色試液：
実施例３の発色試液からセラチンを除いた発色試液を調
製する。

血清遊離コレステロールの測定、実施例３に同じ。

実施例３と実施例４の測定結果比較表 比較表　１ 試薬盲検値の比較 比較光　２ 室温保存に於ける発色試液の経時変化 比較衣　３ ガラスセルに対する染着性 比較光１．２．３から明らかなようＶこ、β−シクロデ
キストリンは試薬盲検値の上昇を効果的に抑制し、かつ
発色試液の安定化の効果を有するが、ガラス−′七］・
ル、の染着を防止する効果は無い。

実施例　５　血清遊離コレステロールの測定発色試薬：
実施例３の発色試液からβ−ゾクロデキス）　ＩＪンを
除いた発色試液を調製する。

血清遊離コニ／ステロールの測定　実施例３に同じ。

実施例４と実施例５の測定結果比較表 比較表　１ 試薬・盲検値の比較 比較光　２ ガラスセルに対する染着性 比較光】、２から明らかなようにゼラチンには試薬盲検
饋の上昇抑制効果は無いが、ガラスセルに対する染着防
止効果がある。

実施例　６　血清遊離コレステロールの測定、実施例３
の発色試液の調製法に従い、β−シクロデキストリンの
代りにγ−シクロデキストリンを用い、これを０．３％
の濃度に調製する。

血清遊離コレステロールの測定・：・実施例３に同じ。

実施例６と比較例４の測定結果比較表 比較表　１ 比二表　２ 試薬盲　値の比較 比較光　３ コレステロール標準液鼠色度の比較 比較表　４ 室温保存に於ける発色試液の経時変化 比絞表　５ ガラスセルに対する染着性 実験法は実施例　３　Ｉｆ（同じ。

実施例７　セラチンの神頌による染着防止効果及び沈殿
生成防止無効果 実施例３の調製法に従い、各種ゼラチン（株式会社ニノ
ピ製）を用いて測定試液を調製する。実施例３のコレス
テロール標準液を用いて実施例３の方法に従い発色させ
た呈色成金、ポリスチレンセルに夫々入れ、室温１７時
間放置後、沈殿又は濁りの発生の有無を観緊したのち、
水洗し、風乾し、セルの染着の有無？観、察した。結果
を表にして示粘度：　６．６６　％のｍｉ　ｌ　ｌ　１
ｐｏｉｓｃ　ａｔ　６０　Ｃゼリー弓１ｆｆｉｌｉ　：
　６．６６％のＢｌｏｏｎ　　ｇｒる効果の差は認めら
れない。

特に′［出願人　十［１光純薬工業株式会社手続補正書 昭和６７年　す月　２日 特許庁長官　殿 ｌ　事件の表示 刻が５８／＋材許願偶イ２７／ｑ号 ２　発明の名称 ３　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 Ｍ路装置　０３−２７０−８５７１ ５、　補正の対象 願書、明細書の発明の名称の「、特許請求の範囲の１２
Ｍ、発明の詳細な説明の欄。

６、補正の内容 （１）表題「特許局（特許法第３８条ただし書の規定に
よる特許出願）」を「特許局」と補正する。

（２）願書の「２、特許請求の範囲に記載された発明の
数　２」を削除する。

（３）発明の名称の欄に記載の「ホルマザン化合物によ
る染着防止方法及び染着防止用試薬」を「ホルマザン化
合物による染着防止方法」と補正する。

（４）　ＩｆｉＦｆｆ請求の範囲な・別紙のとおり補正
する。

（６）明朴Ｊ裏３　ｓ　Ｒｔ　９行目から同頁２００行
目かけて記載の「測定例を例に挙げて」を「測定を例に
挙げて」と補正する。

（６）明細書３６頁７行目から同頁８行目にかけて記載
の「スーパーオキサイドイオン０７」を［スーパーオキ
サイドイオンＯｒＪと補正する。

（７）明細書３６頁２０行目から３７負４行目にかけて
記載の［このスーパーオキサイドイオンを、・・・・・
定量的に反応させて、」を「このスーパーオキサイドイ
オンを、テトラゾリウムＬｍ　Ｌと定量的に反応させて
、」と補正する。

（８）明細用４０頁１６行目から同頁２０行目にかけて
記載の一般式ＣＩＩＩ　）を以下のとおシ補正する。

」 （９）明細書４１頁五行目から同頁２行目にかけて記載
の［（但しｘ’及びＸ２は、−Ｎｏ、又は−Ｈを表わし
、Ｘ３は、−０ＣＨ，、−Ｉ又は−■を表わす。）」を
「（但しＸ４及びＸ５は、−ＮＯ２又は−Ｈを表わし、
Ｘ６は、−０ＣＨい一工又は−Ｈを表わす。）」と補正
する。

０１明細１°４３　Ｍ　１６行目から同頁２００行目か
けて記載の一般式（Ｖｌ　）　（〔ｔｏ　）　ｑ゛）を
以下のとおシ補正する。

」 Ｑ１１明＃ｔＢ　４４：　４４頁１行目から同頁２行目
にかけて記載の［（但し、Ｘｌ及びＸ２け、−Ｎｏ、又
は−Ｈを表わし、Ｘ３は、−０ＣＨ３、−■又は−Ｈを
表わす。）」を［（但し、Ｘ４及びでは、−ＮＯ３又は
−Ｈを表わし、）二６は、−０ＣＦｉ８、−■又は−Ｈ
を表わす。）」と補正する。

ａｚ明細＄４ｓ頁１９行目に記載の［ゼラチンは通常溶
液中に」を［ゼラチンは通常測定溶液中に−ｉと補止す
る。

（ｌ壕明細書４５頁２０行目から４６頁２行目Ｋかけて
記載の「通常、−例、・・・・・・・・・・・・０．５
ｍｔ／容量チである。」イｉｒ通常、０．１〜０．７重
量／容ｉｔチ、好ましくは、０．２〜０．５重量／容量
チである。」と補正する。

０４）明細書４８頁１９行目に記載の「テトラゾリウム
塩」を「テトラゾリウム塩」と補正する。

０噴明細書５０頁９行目に記載の［（α−ＨＢｂ　）　
Ｊを［（α−ＩＩＢＤ）Ｊと補正する。

（１１１９明細書５０頁１８行目から同頁１９９行目か
けて記載の「スーパーオキサイドイオンＯ−Ｊを［スー
パーオキサイドイオン０ン］と補正する。

αη明明細９５負 する方法」を［染着を防止する方法」と補正する。

以上 別　　　　　紙 ２、特許請求の範囲 （１）ゼラチンを有〃１成勺として用いる　部分構造■
［１ −ＰＩ−Ｎ＝Ｃ−Ｎ　＝Ｎ−を有するホルマザン化合物
による染ヲ１１防１ヒ方法。

１）１ （２）部分構造　−Ｎ−Ｎ＝Ｃ−Ｎ　＝Ｎ　−’；ヒ有
するホルマザン化合物カニ、−・般式［Ｕで示されるモ
ノホルマザン化合物−１，あ、−斜〆）誇釆の計１囲ｔ
ｒ１項記載の染着防止方法。

Ｒ” Ｒ’　−Ｎ　−Ｎ　＝　Ｃ−Ｎ　＝　Ｎ　−Ｒ”　　　
ＣＩ　）（但し、Ｒ１、■（２及びＩＬ３は有機残基を
表わす。）（３）一般式Ｃｌ）で示されるモノホルマザ
ン化合物が、一般式（ＩＩ）で示されるモノホルマザン
化合物（但しＸｌ及びＸ２は、−Ｎｏ２又は−１■を表
わし、Ｘ３は、−０ＣＨ，、−■又は−Ｈを表わす。）
（４）一般式〔■〕で示されるモノホルマザン化合物が
構造式（ａ）で示されるモノホルマザン化合物である特
許請求の範囲第３項記載の染着防止方法。

（５）一般式〔■〕で示されるモノホルマザン化合物が
、構造式（ｂ）で示されるモノホルマザン化合物である
特Ｆｉ　請求の範囲第２項記載のｈｔ着防止方法。

ＣＨ。

マザン化合物が、一般式［１１’Ｔ）で示されるジホル
マザン化合物である特許請求の範囲第を項記載の染着防
止方法。

（イ）４しで及び■け、−ＮＯ，又Ｂ　−Ｈを表わ１７
、）二は、−０ＣＨｓ、−■又は−Ｈを表わす。）（カ
一般式（＋Ｕ）で示されるジホルマザン化合物が、イ１
？造式（Ｃり乃至（ｆ）で示されるジホルマザン化合物
の１である特許請求の範囲第６項記載の染着防止方法。

（８）溶液中にゼラチンを存在させる、特許請求の範囲
第１頂、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項又は
第７謂記載の染着防止方法。

（９）溶液中のゼラチン濃度が、０．ｔ〜０．７重量／
容Ｆ１．係である７ｊ：１・許請求の範囲第８項記載の
染着防止方法。

（！９溶７１゛Ｃが電子仮性（Ａ’：又（「１リボアミ
ドデヒドロゲナーゼ（ジアホラーゼ）及び部分構造 を有するテトラゾリウム塩を含有して成るテトラゾリウ
ム塩溶液で；ｂる、特許請求の範［ｉｌｌ　ａｔ　ｓ項
又は第９項記載の染着防止方法。

００電子伝達体又はリボアミドデヒドロゲナーゼ（ジア
ホラーゼ）及び部分ｔｆ！ｆ造 １１ Ｎ　　−−Ｎ− を有ゴるテトラゾリウム塩を自重して成るテトラゾリウ
ム塙１￥１溶が、基質乃び酸化（！′１１補酵叱補酵素
反応させて還元へ１１袖酵素を生成させる脱水素酵素及
び酸化型補酵素を含む特許請求の範囲第１０項記載の染
着防止方法。

０）電子伝達体が、フェナジンメトサルフェート（ＦＭ
Ｓ）、１−メトキシフェナジンメトサルフェート°（メ
トキシ−ＰＭＳ　）又は９−ジメチルアミノベンゾ−α
−フェナゾキソニウムクロライド（メルトラブル−）で
ある特許請求の範囲第１０項又は第１１項記載の染着防
止方法。

α漕脱水素酵素が、コレステロール脱水素酵素、ワセリ
ン−３−９ン酸脱水素酵素、グルコ−上−６−リン酸脱
水素酵素、アルデヒド脱水素酵昔又はホルムアルデヒド
脱水素酵素である、特許請求の範囲第１１項記載の染着
防止方法。

（１４１酸化型補酵素がＮＡＤ（酸化型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド）又はＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　（酸化
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）であ
り、還元型補酵素がＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドア
デニンジヌク゛レオチド）又はＮ　Ａ　Ｄ　）’　１４
（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
）である特許請求の範囲第１１項記載の染着防止方法。

（１基質がコレスプロール、胆汁酸、グリセリン、クリ
セリン−３−リン酸、クルコース−６−リン酸、ホルム
アルデヒド又はアセトアルデヒド、酸化型補酵素がＮＡ
Ｄ　（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）
又はＮＡＤＰ（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドリン酸）であって、基質及び酸化型補酵素と酵素
反応させて還元型補酵素を生成させる脱水素酵素が各々
コレステロール脱水素酵素、胆汁酸脱水算酵素り火シニ
ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ）、グリセリン
脱水素酵素、グリセリン−３−リン酸脱水素酵素、グル
コース−６−リン酸脱水素酵素、夾ルムアルデヒド脱水
素酵素又はアルデヒド脱水素酵素である、特許請求の範
囲第１１項記載の染着防止方法。

（Ｉｌ１９基質が乳酸又はα−ヒドロキシ酪酸であり、
酸化型補酵素がＮＡＤ　（ｔＷ化型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド）又けＮＡＤＰ（ｐ体型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドリン酸）であって、基質及
び酸化型補酵素と酵素反応させて還元型補酵素を生成さ
せる脱水素酵素が各々乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、又は
α−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（α−ＨＢＤ）である、
特許請求の範囲第１１項記載の染着防止方法。

（ｌ′Ｉｌ基質又は脱水素酵素が被検試料中の基質又は
脱水素酵素である、特許請求の範囲第１５項又は第１６
項記載の染着防止方法。

ａＥ！Ｊ基質又は脱水素酵素が体液成分である、特許請
求の範囲卯１７項記載の染着防止方法。

ｕ９溶液がチオール化合物及び部分構造ＶＮ〜ン ＩＩ　　　＋ Ｎ−□Ｎ− を有するテトラゾリウノ、堵：及びβ−ジクロデキスト
リンスはγ−シクロデキストリンを含有して成る、安定
化されたテトラゾリウム塩溶液である、特許請求の範囲
第８項又は第９項記載の染着防止方法。

■チオール化合物及び部分構造 Ｎ□− Ｖ′Ｎ′ １１ −−Ｎ−− を有するテ）・ラゾリウム塩及びβ−シクロデキストリ
ン又はγ・−シクロデキストリンを含有して成る、安定
化されたテトラゾリウム塩溶液が、基質に作用してスー
パーオキサイドイオンを生成させる酸化酵素を含有する
特許請求の範囲第１９項記載の染着防止方法。

ｅυグルコース、コレステロール、グリセロール、グリ
セロール灼酸エステル、コリン、アシルＣｏＡ、ピルビ
ン酸、尿酸、キサンチン又は乳酸を基質とし、それらの
基質に作用する酸化酵素が各々グルコースオキシダーゼ
、コレステロールオキシダーゼ、グリセロールオキシダ
ーゼ、グリセロール燐酸エステルオキシダーゼ、コリン
オキシダーゼ、アシルＣｏＡオキシダーゼ、ピルビン酸
オキシダーゼ、ウリカーセ、キサンチンオキシダーゼ又
は乳酸オキシダーゼである、特許請求の範囲第２０項記
載の染着防止方法。

（ハ）チオール化合物が、還元型グルタチオン、チオグ
リコール酸、メルカプトエタノール、チオサリチル酸、
システアミン、システィン、ジメルカプトコハク酸であ
る特許請求の範囲第１９項又は第２０項記載の染着防止
方法。

（ホ）部分構造 を有するテトラゾリウム塩が、一般式（ＩＶ）（（１、
、ｌＴ）で示されるモノテトラゾリウム塩でおる、特許
請求の範囲第１０項、第１１項、第１９項又は４５２０
項記載の染着防止方法。

（ホ）一般式Ｑｖ〕（［１”ｌＴ）で示されるモノテト
ラゾリウム塩が、一般式〔Ｖ〕（〔■〕Ｔ）で示される
モノテトラゾリウム塩である特許請求の範囲第２３項記
載の染着防止方法。

（但し、了及びｙａは、−Ｎｏ□又は−Ｈを表わし、Ｘ
９は、−０ＣＨ９、−ｒ又は−Ｈを表わす。）（ハ）一
般式［Ｖ〕（（Ｉｆ）Ｔ）で示されるモノテトラゾリウ
ム塩が構造式（ｇＸ（−）Ｔ）で示されるモノテトラゾ
リウム塩である特許請求の範囲第２４項記νヶの染着防
止方法。

（ホ）一般式（ｒ、’）　（ＣＩ　）’Ｉ’）で示され
るモノテトラゾリウム塩が、構造式（ｈＸ（ｂ）Ｔ）で
示されるモノテトラゾリウム塩である特Ｎ′＋−堕求の
範囲ｗ！：　２３項記載ム塩が、一般式［ｖ＋）（（ｔ
＋Ｏｒ）で示されるジテトラゾリウム塩である特許請求
の範囲第１０項、第】１項、第１９項又は第２０項記載
の染着防止方法。

（但し、ア及びでは、−Ｎｏ、又は−Ｈを表わし、Ｘ１
２は一０ＣＨ３、−Ｉ又は−Ｈを表わす。）（イ）一般
式［ＶＩ）］（Ｉｌｔｔ″ＩＴ）で示されるジテトラゾ
リウム塩が、構造式（＋Ｘ（（りＴ）乃至Ｃ１’）　（
（ｆ　）Ｔ）で示されるジテトラゾリウム塩の１である
特許請求の範囲第２７暉ｌ記載の≧（′：着防止方法。

（（支）β−シクロデキストリンの濃度が０．０１〜１
．５重量／容量チである％ｉ！’Ｆ藺求の範囲第１９項
又は第２０項記載の染着防止方法。

に）γ−シクロデキストリンの濃度が０．０１〜１（）
■４゛／容輩係である特許請求の範囲第１９項又は第２
０項記載の染着防止方法。

（２）β−シクロデキストリン及びγ−シクロデキスト
リンの濃度が、β−シクロデキストリン０．０１〜１．
５重ＩＩ−／容景係、γ−シクロデキストリン０．０１
〜１０重引／容量係の範囲で任意の比率に混合した濃度
である特１−１−請求の範囲第１９項又は第２０項記載
の染着防止方法〇 （財）基質又は酸化酵素がｗ、検試隼゛１中の基）Ｊｌ
［又は酸什酵外合でｚ９る、殖訂訓求の範囲第２１項記
載の染５Ｆｔ防止力法。

（ロ）基質又は酸化酵素が体液成分でちる、特許請求の
範、Ｐｌ（第３２項記載の染着防止方法。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ゼラチンを有効成分として用いる　部分構造１ −Ｎ−１″Ｖｌ＝Ｃ−Ｎ＝Ｎ　−葡有するホルマザン化
   合物による染着防止方法。 １１ （２）部分構造　−Ｎ−Ｎ＝Ｃ−Ｎ＝Ｎ−を有するホル
   マリ゛ノ化合物が、一般式〔１〕で示さＩ９．るモノホ
   ルマザン化合物である特許請求の範囲第１項記載の染層
   防１］二方法。 １尤２ １１ ｔ（’−Ｎ−Ｎ＝Ｃ−Ｎ＝Ｎ−Ｒ３ＣＩ）（但し、１工
   １、Ｉｔ’及びＲ３は有機残基全表わす。）（３）一般
   式Ｃ１，）で示さＩ’するモノホルマザン化合物が、一
   般式〔１１〕で示さ１するモノホルマザン化合物である
   特許請求の範囲第２項記載の染着防止方法。 （但しＸｌ及びＸ２は、−ＮＯ２又は−Ｈを表わし、Ｘ
   ３は、−０ＣＲ３、−■又は−Ｈを表わす。）（４）一
   般式［ＩＩ）で示されるモノホルマザン化合物が構造式
   （ａ）で示されるモノホルマザン化合物である特許請求
   の範囲第３項記載の染色防止方法。 （５）一般式１［で示さオフるモノホルマザン化合物が
   、構造式（ｂ）で示されるモノホルマザン化合物である
   特許請求の範囲第２項記載の染着防止方法。 ＣＩ（３ マサン１ヒ金物が、一般式［１１１〕で示されるジポル
   マサン化合物である特許請求の範囲第１項記載の染着防
   止方法。 （但しＸｌ及びｘ２は、−Ｎｏ２　又は　−Ｈを表わし
   、Ｘ′は、−０ＣＨ３、−■　又は　−Ｈを表わす。）
   （７）一般式〔■〕で示されるジホルマサン化合物が、
   構造式（Ｃ）／′！Ｉ至（ｆ）で示されるジホルマサン
   化合物の１である特許請求の範囲第６項記載の染着防止
   方法。 （８）　＠ａ中にセラチンを存在させる、特許請求の範
   囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項又
   は第７項記載の染着防止方法。 （９）溶液中のセラチン濃度が、０．１〜０．７重量／
   答情チである特許請求の範囲第８項記載の染着防止方法
   。 ０Ｑｍ液が量子伝達体又はリボアミ１へデヒドロゲナー
   ゼ（ジアホラーゼ）及び部分構造 含有するテトラゾリウム塩を含有して成るテトラソリワ
   ム塩溶液である、特許請求の範囲第８項又は第９項記載
   の染着防止方法。 αυ電子伝達体又はリボアミドテヒ１〜ロケナーゼ（ジ
   アホラーゼ）及び部分構造 含有するテトラゾリワム塩ケ宮有して成るテ１−ラゾリ
   ウム塩溶液が、基質及び酸化型補酵素と酵素反応させて
   還元型補酵素を生成させる脱水素酵素及び酸化型補酵素
   を含む特許請求の範囲第１０項記載の染着防止方法、 α４電子伝達体が、フェナジンメトサルフェート（ＰＭ
   Ｓ）、１−メトキノフェナジンメトサルフェート（メト
   キシ−ＰＭＳ）又は９−ジメチルアミノベンゾ−α−フ
   ェナノ゛キソニウムクロライト（メルトラフルー）であ
   る特許請求のｑｉｉｌｊ囲第１（）項又は第１１項記載
   の采庸防＋ｈ方法。 ■脱水素酵素が、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸脱
   水素酵素、クリセリン脱水素ｍ累、クリセリン−３−１
   １ン酸脱水素酵素、クルコ〜スー６＋１ン酸脱水素酵素
   、アルデヒド脱水素酵素又はポルムアルテヒト脱水素酵
   素である、特許請求の範囲第１１項記載の染着防止方法
   。 ａ＋酸化型補酵素がＮＡＩ）（ＩＶ化梨型ニコチンアミ
   １アテニンシヌクレオチド）又はＮＡＤＰ（酸化型ニコ
   チンアミドアテニンジヌクレオチドリン酸）であり、還
   元型補酵素がＮ　ＡＩＪ　ＨＣｋ元型ニコチンアミ］・
   アテニンノヌクレオ千ド）又はＮＡＤＰｌｌ（還元型ニ
   コチンアミトアテニンジヌクレオチトリン酸）である特
   許請求の範囲第１１項記載の染着防止方法。 （１１基質がコレステロール、胆汁酸、クリセリン、ク
   リセリノー；う−リン１設、クルコース−６−１１ン酸
   、アルデヒド例えはホルムアルデヒド又はアセトアルデ
   ヒＩ・であり、酸化型補酵素がＮＡ　Ｄ　（酸化型ニコ
   チンアミトアテニンジヌクレオチド）又はＮ　Ａ　ＩＪ
   　Ｐ　（酸化型ニコチンアミドアデニンンヌクレオチ１
   〜リン酸）であって、基質及び酸化型補酵素と酵素反応
   させて還元型補酵素ヶ生成させる脱水素酵素が各々コレ
   ステロール脱水素酵素、胆汁酸脱水素酵素、グリセリン
   脱水素酵素、クリセリン−３−１１ン酸脱水素酵素、り
   ゛ルフースー６−リン酸脱水素酵素、アルデヒド脱水素
   酵素又はホルムアルデヒド脱水素酵素である、特許請求
   の範囲第１１項記載の染着防止方法。 四基質が乳酸又はα−ヒドロキン酪酸であり、酸化型補
   酵素がＮＡＤ　（［化型ニコチンアミドアテニンジヌク
   レオチド）又はＮ、Ａ・Ｄ、・Ｐ（ｄ化型ニコ千ンアミ
   ドアデニンジヌクレオチトリン酸）であって、基質及び
   酸化型補酵素と酵素反応させて還元型補酵素を生成させ
   る脱水素酵素が各々乳酸脱水素酵素（、Ｌ　Ｄ　Ｈ’＋
   、又はα−ヒドロキシ陥酸脱水素Ｉ＃累（α−１−Ｉ　
   Ｂ　Ｄ　）である、特許請求の範囲８Ｆ！１１項記載の
   染着防止方法。 αカ基質又は脱水素酵素が被検試料中の基質又は脱水素
   酵素である、特許請求のＩｌｉ目囲第１５項又は第１６
   項記載の染着防止方法。 （１８１基質又は脱水素酵素が体液成分である、特許　
   　　　□請求の範囲第１７項記載の染着防止方法。 （１呻浴液が千オール化合物及び部分構造を有するテト
   ラゾリウム塩及びβ−ンクロテキスト１１ン又はγ−／
   クロテキストリンを含有して成る、安定化されたテトラ
   ツリウム塩浴液である、特許請求の範囲第８項又は第９
   項記載の染着防止方法。 シリチオール化合物及び部分構造 を有するテトラゾリウム塩及びβ−シクロデキストリン
   又はｒ−’ｙクロテキストリノを含有して成る、安定化
   されたテトラツリウム塩浴液が、基質に作用してスーパ
   ーオキサイドイオンを生成させる酸化酵素？含有する特
   許請求の範囲第１９項記載の染着防止方法。 （２ｊＪクルコース、コレステロール、クリセリール、
   クリセロール燐酸エステル、コリン、アンルＣＯＡ。 ピルビン酸、尿酸、キザ７千］又は乳酸を基質とし、そ
   れらの基質に作用する酸化酵素が各々ゲルコースオキン
   ダーゼ、コレステロールオキンターゼ、クリセロールオ
   キシクーセ、クリセロール燐酸エステルオキンダーゼ、
   コリンオキンターセ、アシルＣｏＡオキシラーゼ、ピル
   ヒン酸オキシダーゼ、クリカーゼ、キサンチノオキシダ
   ーセ又は乳酸オキシダーセである、特許請求の範囲第２
   ０項記載の染着防止方法。 ？４チオール化合物が、還元型クルタチオン、チオクリ
   コール酸、メルカプトエタノール、チオサリチル酸、シ
   ステアミン、システィン、ジメルカプトコハク酸である
   特許請求の範囲第１９項又は第２０項記載の染着防止方
   法。 （ハ）部分構造 れるモノテトラゾリウム塩である、特許請求の範囲第−
   ｌＯ項、第１１項、第１９項又は第２０項記載の染着防
   止方法。 である特許請求の範囲第２３項記載の染着防止方法。 （但し、Ｘ′及びＸ２は、−ＮＯ□又は−Ｈを表わし、
   が構造式ε≠Ｗｒされるモノテトラゾリウム塩である特
   許請求の範囲第２４項記載の染着防止方法。 が、構造式＜’ＥＹＥ示されるモノテトラゾリウム塩で
   ある特許請求の範囲第２３項記載の染着防正方ゾリウム
   塩が、一般式とチ奇示されるジテトラソリウム塩である
   特許請求の範囲第１０項、第１１項、第１９項又は再２
   ０項記載の染着防止方法。 ｘ’　　　ｘ’ （但し、ｘｉ及びＸ２は、−Ｎｏ２又は−Ｈを表わし塩
   の１で（Ａ特許請求の範囲第２７項記載の染着第２０項
   記載の肉着防止方法。 （ト））γ−シクロテキストリンの濃度が０．０１〜１
   ０重量／容量係である特許請求の範囲第１９項又は第２
   ０項記載の染着防止方法。 θυβ−ンクロデキス１−リ／及びγ−シクロデキスト
   リンの濃度が、β−シクロテキストリン０．０１〜１．
   ５重量／容量チ、γ−ンクロデキストリン１）、０１〜
   １０重量／容量係の範囲で任意の比率に混合した一度で
   ある特許請求の範囲第１９項又は第２０項記載の染着防
   止方法。 ０４基實又は酸化酵素が被検試料中の基質又は酸化酵素
   である、特許請求の範囲第２１項ｄ己載の染着防止方法
   。 ０３基質又は酸化酵素が体数成分である、特許請求の範
   囲第３２項記載の染看防正方法。 図ゼラチン全有効成分として含有する、部分構−Ｎ−Ｎ
   　＝　Ｃ−Ｎ　＝　Ｎ　− 化合物による染着防止用試薬。 るホルマザン化合物が、一般式〔１〕で示されるモノホ
   ルマザン化合物である特許請求の範囲第３４項記載の染
   着防止用試薬。 ２ Ｉ Ｒ’−Ｎ−Ｎ＝Ｃ−Ｎ＝Ｎ−Ｒ”　　　　　　　ＣＩ）
   （但し、ｌ（’ＳＲ２及びＲ３は有機残基ヲ表わす。）
   ＯＱ一般式ＣＩ）で示されるモノホルマザン化合物が、
   一般式〔■〕で示されるモノホルマザン化合物である特
   許請求の範囲第３５項記載の染着防止用（但しＸｌ及び
   Ｘ２は、−Ｎ０２　又は−Ｈを表わし、Ｘ３は、　０Ｃ
   Ｈｓ、−１又は−Ｈを表わす。）６力一般式［１１）で
   示されるモノホルマザン化合物が構造式（ａ）で示され
   るモノホルマザン化合物である特許請求の範囲第３６項
   記載の染着防正用試（９）一般式〔１〕で示さイ′１．
   るモノホルマザン化合物が、構造式（ｂ）で示さ３する
   モノホルマザン化合物である特許請求の範囲第３５項記
   載の染着防止用Ｈ３ マサン化合物が、一般式（ＩＩＩ〕で示されるノホルマ
   ザン化合物である特許請求の範囲第３４項記載の染着防
   止用試薬。 （但り、Ｘ’及ヒＸ２ｉ４、−Ｎｏ２又ｕ　−Ｈｆ：　
   表ｂ　ｔ、、Ｘｓは、−０ＣＨ３，−ｒ又は−■を表わ
   す。）（４０）一般式ＣＩＪＪ〕で示されるノポルマザ
   ン仕合物が、構造式（Ｃ１乃至（ｆ）で示されるソホル
   マサン化舎物の（４】）溶液中にセラチンを存在させる
   、特許請求の範囲第３４項、第３５項、第３６項、第３
   ７項、第３８項、第３９項又は第４０項記載の染着防止
   用試薬。 （４２）溶液中のセラチン濃度が、０１〜０．７　車Ｍ
   ：／容量係である特許請求の範囲第４１項記載の染着防
   止用試薬。 （４３）溶液が、電子伝達体又−リポアミトテヒトロケ
   ナーセ（ソアホターセ）及び部分構造を有するテトラツ
   リウム塩を含有して成るテトラツリウム塩溶液である、
   特許請求の範囲第４１項又は第４２項記載の染着防止用
   試薬。 （４４）電子伝達体又はリホアミトテヒドロゲナーセ（
   ノアホラーセ）及び部分構造 を有するテトラツリウム塩を含有して成るテトラツリウ
   ム塩溶液が、基質及びｎ化型袖酵素と酵素反応させて還
   元型補酵素を生成させる脱水素酵素及び酸化型補酵素を
   含む特許請求の範囲第４３項記載の染着防止用試薬。 （４５）電子伝達体が、フエナノンメトサルフエートＣ
   ＰＭＳ）　、１−メトキ／フエナノンメトサルフェ−ト
   　（メトキシ−ＰＭ　Ｓ）又は９−ジメチルアεノヘン
   ノーα−フエナノ゛キソニウムクロライド（メルトラブ
   ル−）である特許請求の範囲第４３項又は第４４項記載
   の染着１）ｊ井用試薬。 （４６）脱水素酵素が、コレステロール脱水素酵素、胆
   汁酸脱水素酵素１、クリセリン脱水素酵素、グリセリン
   −３−リン酸脱水素酵糸、クルコース−６−リン酸脱水
   素酵素、アルテヒト脱水素酵素又はホルムアルテヒＩ・
   脱水素酵素である、特許請求の範囲第４４項記載の染着
   防止用試薬。 （４７）酸化型補ＩＩｌ＋素がＮＡ１）（酸化型ニコチ
   ンアミトアテニンノヌクレオチト）又はＮＡＤＰ　（酸
   化型ニコナンアミトアテニンソヌクレオチトリン酸）で
   あり、還元型袖ＩＳそ素がＮＡＤＨ（還元型ニコチンア
   ミトアテニンジヌクレオチト）又はＮＡＤＰＨ１元型ニ
   コチンアミドアテニンシヌクレオチドリン酸）である特
   許請求の範囲第４４項記載の染着防止用試薬。 （４８）基質がコレステロール、胆汁酸、クリセリン、
   グリセリン−３−リン酸、グルコース−６−リン酸、ア
   ルデヒド例えはホルムアルデヒド又はアセトアルデヒド
   であり、酸化型補酵素かＮＡＤ　（酸化型ニコチンアミ
   ドアテコ／ジヌクレオチド）又はＮＡＤＰ　（酸化型ニ
   コチンアミトアテニンジヌクレオチドリン酸）であって
   、基質及び酸化型補酵素と酵素反応させて還元型補酵素
   を生成させる脱水素酵素が各々コレステロール脱水素酵
   素、胆汁酸脱水素酵素、グリセリン脱水素酵素、クリセ
   リン−３−リン酸脱水素酵素、クルコース−６−リン酸
   脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素又はホルムアルデヒ
   ド脱水素酵素である、特許請求の範囲第４４項記載の染
   着防止用試薬。 （４９）基質が乳酸又はα−ヒＩ・ロキ／酪酸であり、
   酸化型補酵素がＮＡＤ（酸化型ニコチンアミトアデニノ
   ソヌクレオチ１−）又はＮＡＤＰ　（ｅ化ｆｍニコチン
   アミトアデニンシヌクレオチトリノ酸）であって、基質
   及び酸化型補酵素と酵素反応させて還元型補酵素を生成
   させる脱水素酵素が各々乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）　、
   又はα−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（α−ＨＢＤ）であ
   る、特許請求の範囲第４４項記載の染着防止用試薬。 （５０）基質又は脱水素酵素が被検試料中の基質又は脱
   水素酵素である、特許請求の範囲第４８項又は第４９項
   記載の染着防止用試薬。 （５１）基質又は脱水素酵素が体液成分である、特許請
   求の範囲第５０項記載の染着防止用試薬。 （５２Ｒ＃液が、チオール化合物及び部分構造を有する
   テトラツリウム塩及Ｏ・β−シクロテキストリン又はγ
   −／クロテキストリンを含有して成る、安定化されたテ
   トラツリウム塩溶液である、特許請求の範囲第４１項又
   は第４２項記載の染着防止用試薬。 （５３）チオール化合物及Ｏ・部分構造を有するテトラ
   ゾリウム塩及びβ−シクロテキストリン又はγ−シクロ
   デキストリンを含有して成る、安定化されたテトラツリ
   ウム塩溶液が、基質に作用してスーパーオキザイドイオ
   ンを生成させる酸化酵素を含有する特許請求の範囲第５
   ２項記載の染着防止用試薬。 （５４）クルコース、コレステロール、クリセロール、
   クリセロール燐酸エステル、コリン、アンルＣＯＡ。 ピルビン酸、尿酸、キサンチン又は乳酸を基質とし、そ
   れらの基仙に作用する酸化酵素が各々グルコースオキン
   ターゼ、コレステロールオキ／クーセ、クリセロールオ
   キンダーセ、クリセロ−ル燐酸エステルオギ７グーゼ、
   コリンオキンクーセ、アシルＣＯＡオキシダーゼ、ピル
   ヒノ酸オキ７ターゼ、ウリカーゼ、キザンチンオキンダ
   ーセ又は乳　　　　　１酸オキシダーゼである特許請求
   の範囲第５３項記載の染着防止用試薬。 （５５）チオール化合物が、ｉ゛１元型グルタチオ／、
   チオクリコール酸、メルカプトエタノール、チオサリチ
   ル酸、システアミン、ンステイン、ソメルカプトコハク
   酸である特許請求の範囲第５２項又は第５３項記載の染
   着１ｉ／ｉ止用試薬。 （５６）部分構造 れるモノテトラツリウム塩である、特許請求の範囲第４
   ３項、第４４項、第５２項又は第５３項記載の染着防止
   用試薬。 が、一般式％されるモノテトラハウム塩である特許請求
   の範囲第５６項記載の染着防止用試薬。 （但し、Ｘｌ及びＸ２は、−Ｎｏ２又は−Ｈを表わし、
   る特許請求の範囲第５７項記載の染着防止用試薬。 ある特許請求の範囲第５６項記載の染着防止用試薬。 （６０）部分構造 れる／テトラツリウム塩である特許請求の範囲第４３項
   、第４４項、第５２項又は第５３項記載の染着防止用試
   薬。 ｘ’　　ｘ’ （但しＸｌ及びＸ２は、−Ｎｏ２又は−Ｈを表わし、Ｘ
   ３は一０ＣＨ３、−Ｉ又は−Ｈを表わす。）１である特
   許請求の範囲第６０項記載の染着防止用試薬。 ＞す９人？ ） （６２）β−／クロテキストリンの濃度が００１〜１．
   ５重量／容量係である特許請求の範囲第５２項又は第５
   ３項記載の染着防止用試薬。 （６ｒｓ）・を−シクロデキストリンの濃度が０．０１
   〜１０！ｊ知／容和チである特許請求の範囲第５２項又
   は第５３項記載の染着防止用試薬。 ストリンの一濃度が、β−シクロテキストリフ０．０１
   〜１．５１量／容量チ、・Ｃ−／クロデキストリノ０．
   ０１〜１０重量／容量チの範囲で任意の比率に混合した
   濃度である特許請求の範囲第５２項込↓第５３項記載の
   染着防止用試薬。 （６５）基質又は酸化酵素が被検試料中の基質又は酸化
   酵素である、特許請求の範囲第５４項記載の染着防止用
   試薬。 （６６）基質又は酸化酵素が体液成分である、特許請求
   の範囲第６５項記載の染着防止用試薬。