JPS59206766A - Ｄｎａ末端に化学的にラベルを行なうキツト - Google Patents
Ｄｎａ末端に化学的にラベルを行なうキツトInfo
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- JPS59206766A JPS59206766A JP59074800A JP7480084A JPS59206766A JP S59206766 A JPS59206766 A JP S59206766A JP 59074800 A JP59074800 A JP 59074800A JP 7480084 A JP7480084 A JP 7480084A JP S59206766 A JPS59206766 A JP S59206766A
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- JP
- Japan
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- labeled
- deoxyribonucleotide
- dna
- chemically
- chemically labeled
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は例えば５−アルキルアミノビオチンラベルされ
ｆＣｄＵＴＰのようなビオチン化ヌクレオチドでＤＮＡ
プローブの末端もしくは終端におけるラベルを行なうこ
とのようなりＮＡグローブの末端における化学的ラベル
のために提供される末端デオキシヌクレオチドトランス
ファラーゼを用いる方法と試薬キットに関するものであ
る。
ｆＣｄＵＴＰのようなビオチン化ヌクレオチドでＤＮＡ
プローブの末端もしくは終端におけるラベルを行なうこ
とのようなりＮＡグローブの末端における化学的ラベル
のために提供される末端デオキシヌクレオチドトランス
ファラーゼを用いる方法と試薬キットに関するものであ
る。
末端チオキシヌクレオチドトランス７アラーゼは既知の
ものであり、そしてポリデオキシヌクレオチド鎖もしく
は分子（ＤＮＡ）の延長のためにデオキシヌクレオシド
トリホスンエイトを重合する場合の融媒として用いられ
て来た。末端デオキシヌクレオチドトランスファラーゼ
の利用と有効性はＦ、 Ｊ、 ＢｏｌｌｕｍによってＴ
ｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ。
ものであり、そしてポリデオキシヌクレオチド鎖もしく
は分子（ＤＮＡ）の延長のためにデオキシヌクレオシド
トリホスンエイトを重合する場合の融媒として用いられ
て来た。末端デオキシヌクレオチドトランスファラーゼ
の利用と有効性はＦ、 Ｊ、 ＢｏｌｌｕｍによってＴ
ｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ。
（Ｐ、 Ｄ、Ｂｏｙｅｒ＋ ｅｄ、 ）、３ｒｄ Ｅ
ｄ、 Ｍｏ１． １０゜ｐｐ、 １４５−１７１＋
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。
ｄ、 Ｍｏ１． １０゜ｐｐ、 １４５−１７１＋
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 Ｎ、 Ｙ、 （１９７４）の中で
’ ＴｅｒｍｉｎａｌＤｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙ
ｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ“なる題の論説中に述べら
れている。この刊行物の開示はこ＼に本開示に取シ入れ
られそして本開示の一部をなす。
’ ＴｅｒｍｉｎａｌＤｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙ
ｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ“なる題の論説中に述べら
れている。この刊行物の開示はこ＼に本開示に取シ入れ
られそして本開示の一部をなす。
末端トランスファラーゼ（末端デオキシヌクレオチドト
ランスファラーゼ）とそのホモポリマーのＤＮＡの３′
末端への付加に対する利用に関する興味についての他の
刊行物はＴ、Ｎｅ１ｓｏｎ ａｎｄＤ、 Ｂｒｕｔｌａ
ｇ による−Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏ
ｇ７． Ｖｏｌ、 ６８． ｐｐ、 ４１−５０＋
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９７９）の’ Ａ
ｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆＨｏｍｐｏ１７ｍｅｒｓ ｔｏ
ｔｈｅ ３’−Ｅｎｄｓ ｏｆ ＤｕｐｌｅｘＤＮＡ
ｗｉｔｈ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
”である。また末端ヌクレオチドトランスファラーゼの
利用に関する興味については ＩＲＬ Ｐｒ’ｅｓｓＬ
ｉｍｉｔｅｄ、０ｘｆｏｒｄ、 Ｅｎｇｌａｎｄ （
１９８２）発行のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ＋ Ｖｏｌ、 １（Ｌ Ｎｏ、 ２１の中で
Ｃ，Ｖｉｎｃｅｎｔ、 Ｐ、 Ｔｃｈｅｎ、 Ｍ。
ランスファラーゼ）とそのホモポリマーのＤＮＡの３′
末端への付加に対する利用に関する興味についての他の
刊行物はＴ、Ｎｅ１ｓｏｎ ａｎｄＤ、 Ｂｒｕｔｌａ
ｇ による−Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏ
ｇ７． Ｖｏｌ、 ６８． ｐｐ、 ４１−５０＋
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９７９）の’ Ａ
ｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆＨｏｍｐｏ１７ｍｅｒｓ ｔｏ
ｔｈｅ ３’−Ｅｎｄｓ ｏｆ ＤｕｐｌｅｘＤＮＡ
ｗｉｔｈ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
”である。また末端ヌクレオチドトランスファラーゼの
利用に関する興味については ＩＲＬ Ｐｒ’ｅｓｓＬ
ｉｍｉｔｅｄ、０ｘｆｏｒｄ、 Ｅｎｇｌａｎｄ （
１９８２）発行のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ＋ Ｖｏｌ、 １（Ｌ Ｎｏ、 ２１の中で
Ｃ，Ｖｉｎｃｅｎｔ、 Ｐ、 Ｔｃｈｅｎ、 Ｍ。
Ｃｏｈｅｎ−８ｏｌａｌ ａｎｄ Ｐ、 Ｋｏｕｒｉｌ
ｓｋｙによるｗ″５ｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ８−（２
−４ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ１２−６ ａｍｉｎｏｈ
ｅｘ）’ｌ ） ａｒｎｉｎｏ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅ
５ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ： ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａ
ｌ ｕｓｅｓ ″ なる論説に述べられている。Ｖｉｎ
ｃｅｎｔ等による上記の論説は上記化合物がコウシ胸腺
デオキシヌクレオチド末端トシンスフ７ラーゼに対する
基質であること、そしてその化合物が３′末端から延長
することによってＤＮＡ分子の中に取り込まれること、
そして該取シ込まれたニトロフェニル基はその後ある酵
素に結合する抗−抗体によって検出されることが出来る
特殊な抗体によって認められ得ることを開示している。
ｓｋｙによるｗ″５ｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ８−（２
−４ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ１２−６ ａｍｉｎｏｈ
ｅｘ）’ｌ ） ａｒｎｉｎｏ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅ
５ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ： ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａ
ｌ ｕｓｅｓ ″ なる論説に述べられている。Ｖｉｎ
ｃｅｎｔ等による上記の論説は上記化合物がコウシ胸腺
デオキシヌクレオチド末端トシンスフ７ラーゼに対する
基質であること、そしてその化合物が３′末端から延長
することによってＤＮＡ分子の中に取り込まれること、
そして該取シ込まれたニトロフェニル基はその後ある酵
素に結合する抗−抗体によって検出されることが出来る
特殊な抗体によって認められ得ることを開示している。
もし所望なれば該ジニトロフェニル基は８−アミンへキ
シルアデノシン５′トリホスフエイトの酵素的結合そし
て１−フルオロ−２−４−二トロベンゼンとの反応の後
にＤＮＡの中へ導入されることが出来る。この論説の開
示はとＮに本開示に取９人れられそして本開示の一部を
なす０更なる興味についてはＰ、 Ｒ，Ｌａｎｇｅｒ
、 Ａ、 Ａ。
シルアデノシン５′トリホスフエイトの酵素的結合そし
て１−フルオロ−２−４−二トロベンゼンとの反応の後
にＤＮＡの中へ導入されることが出来る。この論説の開
示はとＮに本開示に取９人れられそして本開示の一部を
なす０更なる興味についてはＰ、 Ｒ，Ｌａｎｇｅｒ
、 Ａ、 Ａ。
Ｗａ ｌ ｄ ｒ ｏ ｐおよびり、 Ｃ，Ｗａｒｄ
によるＰｒｏｃ。
によるＰｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 Ｖｏｌ、
７８． Ｎｏ、 １１．ｐｐ。
７８． Ｎｏ、 １１．ｐｐ。
６６３３−６６３７． Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９８１の
’Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂ
ｉｏｔｉｎ −１ａｂｅ１ｅｄ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅｓ： Ｎｏｖｅｌｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ
ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｏｂｅｓ”なる論説において述
べられておｐ１該論説は二重らせん構造をなすＤＮＡ中
に取り込まれることが出来、そして種々のＤＮＡやＲＮ
Ａポリメラーゼに対する基質として有用であるある種の
ビオチン化ヌクレオチドを開示する。この論説において
は開示されているビオチンラベルされたポリヌクレオチ
ドは特殊なりＮＡやＲＮＡ連鎖の検出および単離のため
の親和性グローブとして有用であろうことが示唆されて
いる。この刊行物の開示はまた本開示に取シ入れられそ
して本開示の一部をなす。
’Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂ
ｉｏｔｉｎ −１ａｂｅ１ｅｄ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅｓ： Ｎｏｖｅｌｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ
ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｏｂｅｓ”なる論説において述
べられておｐ１該論説は二重らせん構造をなすＤＮＡ中
に取り込まれることが出来、そして種々のＤＮＡやＲＮ
Ａポリメラーゼに対する基質として有用であるある種の
ビオチン化ヌクレオチドを開示する。この論説において
は開示されているビオチンラベルされたポリヌクレオチ
ドは特殊なりＮＡやＲＮＡ連鎖の検出および単離のため
の親和性グローブとして有用であろうことが示唆されて
いる。この刊行物の開示はまた本開示に取シ入れられそ
して本開示の一部をなす。
本発明の実施に関する特別な興味はＳ、Ｆａｌｋｏｗと
８．Ｍｏ５ｌｅ）’の特徴的微生物学における特殊ＤＮ
Ａプローブと題する発行された米国特許第４ 、３５８
、５３５号において述べられている。したがってＦａ
ｌｋｏｗ等の米国特許第４．３５８，５３５号の開示は
また本開示に取シ入れられそして本開示の一部をなす。
８．Ｍｏ５ｌｅ）’の特徴的微生物学における特殊ＤＮ
Ａプローブと題する発行された米国特許第４ 、３５８
、５３５号において述べられている。したがってＦａ
ｌｋｏｗ等の米国特許第４．３５８，５３５号の開示は
また本開示に取シ入れられそして本開示の一部をなす。
本発明の一つの目的はＤＮＡグローブとして有用な特に
末端においてラベルされたＤＮＡ分子を提供することで
ある。
末端においてラベルされたＤＮＡ分子を提供することで
ある。
本発明の他の目的は末端において化学的にラベルされた
ＤＮＡプローブの調製のための材料、試薬、そして手法
を提供することである。
ＤＮＡプローブの調製のための材料、試薬、そして手法
を提供することである。
本発明に付随する他の目的は次にか＼げる詳細な説明に
照らして明らかにされるであろう。
照らして明らかにされるであろう。
例えばＤＮＡグローブのようなりＮＡ分子の末端に化学
的ラベルを行なうことは末端デオキシヌクレオチドトラ
ンスファラーゼ（ＴｄＴ）を用いることによってもたら
される。ＤＮＡ分子の末端に化学的ラベルを行なうこと
において、それらのだめの基質としてのＴｄＴとの結合
において例えば２′−デオキシウリジントリホヌフェイ
ト５−アリルアミンピオチンのようなビオチン化ヌクレ
オチドのような化学的にラベルされたヌクレオチドが用
いられ、またピオチン−１１−ｄＵＴＰもしくは該ＤＮ
Ａの末端に結合するためにＴｄＴに対して基質として作
用することの出来る他のビオチン化ヌクレオチドとして
同定される。本発明の実施においてはＴｄＴに対する基
質として有用なセしてＴｄＴを介してラベルされている
該ＤＮＡの末端に結合することが出来、望甘しくけ化学
的にラベルされたいかなるヌクレオチドも有益に用いら
れる。このようにＤＮＡの末端に結合しているヌクレオ
チドは少くとも一個のビオチン化ヌクレオチドからなる
ことが望ましいけれとも、ＤＮＡの末端に結合している
ヌクレオチドはビオチン化ヌクレオチドの個数として５
０饅以上からなることが望ましい。
的ラベルを行なうことは末端デオキシヌクレオチドトラ
ンスファラーゼ（ＴｄＴ）を用いることによってもたら
される。ＤＮＡ分子の末端に化学的ラベルを行なうこと
において、それらのだめの基質としてのＴｄＴとの結合
において例えば２′−デオキシウリジントリホヌフェイ
ト５−アリルアミンピオチンのようなビオチン化ヌクレ
オチドのような化学的にラベルされたヌクレオチドが用
いられ、またピオチン−１１−ｄＵＴＰもしくは該ＤＮ
Ａの末端に結合するためにＴｄＴに対して基質として作
用することの出来る他のビオチン化ヌクレオチドとして
同定される。本発明の実施においてはＴｄＴに対する基
質として有用なセしてＴｄＴを介してラベルされている
該ＤＮＡの末端に結合することが出来、望甘しくけ化学
的にラベルされたいかなるヌクレオチドも有益に用いら
れる。このようにＤＮＡの末端に結合しているヌクレオ
チドは少くとも一個のビオチン化ヌクレオチドからなる
ことが望ましいけれとも、ＤＮＡの末端に結合している
ヌクレオチドはビオチン化ヌクレオチドの個数として５
０饅以上からなることが望ましい。
しかしながらＴｄＴを介して該ＤＮＡの末端に結合して
いるヌクレオチドはビオチン化ヌクレオチド、即ちピオ
チン化デオキシリボヌクレオチドの個数として約２チか
ら約４０％の範囲の小さい部分もしくはパーセンテージ
のみからなるものであろう。
いるヌクレオチドはビオチン化ヌクレオチド、即ちピオ
チン化デオキシリボヌクレオチドの個数として約２チか
ら約４０％の範囲の小さい部分もしくはパーセンテージ
のみからなるものであろう。
上記のこと、即ち末端デオキシヌクレオチドトランスフ
ァラーゼＴｄＴを介するＤＮＡグローブの終端もしくは
末端ビオチン化のようなりＮＡグローブの末端ラベルを
遂行することにおいて、本発明の実施によれば、高ビオ
チン含量のＤＮＡグローブの試験管的調製のためのいく
らかの試薬と方法が提供される。ＴｄＴを用いることに
よって、ポリマーはＴＴＰのビオチン含量類似物によっ
て興味ある該ＤＮＡの３′末端上に形成される。本発明
の実施によれば、非放射性の化学的にラベルされた安定
なりＮＡグローブの合成のために試薬が一式まとめた形
で提供される。該グローブを構成する特殊ガヌクレオチ
ドは例えば該ＤＮＡプローブに結合されている末端にお
いて結合された特殊なヌクレオチドに結合された抗体に
向けられた抗−抗体の使用のような手法、もしくは例え
ば該ＤＮＡグローブの末端に結合しているビオチン化さ
れた特殊なヌクレオチドにそれ自体結合しているであろ
う酵素結合されたアビジンもしくはストレプトアビジン
の使用によって検出可能である。
ァラーゼＴｄＴを介するＤＮＡグローブの終端もしくは
末端ビオチン化のようなりＮＡグローブの末端ラベルを
遂行することにおいて、本発明の実施によれば、高ビオ
チン含量のＤＮＡグローブの試験管的調製のためのいく
らかの試薬と方法が提供される。ＴｄＴを用いることに
よって、ポリマーはＴＴＰのビオチン含量類似物によっ
て興味ある該ＤＮＡの３′末端上に形成される。本発明
の実施によれば、非放射性の化学的にラベルされた安定
なりＮＡグローブの合成のために試薬が一式まとめた形
で提供される。該グローブを構成する特殊ガヌクレオチ
ドは例えば該ＤＮＡプローブに結合されている末端にお
いて結合された特殊なヌクレオチドに結合された抗体に
向けられた抗−抗体の使用のような手法、もしくは例え
ば該ＤＮＡグローブの末端に結合しているビオチン化さ
れた特殊なヌクレオチドにそれ自体結合しているであろ
う酵素結合されたアビジンもしくはストレプトアビジン
の使用によって検出可能である。
本発明の実施、即ち末端デオキシヌクレオチドトランス
ファラーゼを用いるＤＮＡプローブの末端をラベルする
ために用いられるキットにおいて、該キットは下記の成
分もしくは試薬もしくはチューブを含んでいる。
ファラーゼを用いるＤＮＡプローブの末端をラベルする
ために用いられるキットにおいて、該キットは下記の成
分もしくは試薬もしくはチューブを含んでいる。
１、末端デオキシヌクレオチドトランスファラーゼ
１００ｍＭ カコジレート 中２０単位／μβｐＨ
７，０； ５ｍＭ ２−メルカプトエタノール；５
０体積多グリセロール ２、末端デオキシヌクレオチドトランスファラーゼ希釈
緩衝液 ５０ ｍＭ 力コジレ−）ｐＨ７，０５ｍＭ ２
−メルカプトエタノール；１１屏ｔウシ血清アルブミン
（酵素安定斉ｊグレードＥＲＴ−７０１）。
７，０； ５ｍＭ ２−メルカプトエタノール；５
０体積多グリセロール ２、末端デオキシヌクレオチドトランスファラーゼ希釈
緩衝液 ５０ ｍＭ 力コジレ−）ｐＨ７，０５ｍＭ ２
−メルカプトエタノール；１１屏ｔウシ血清アルブミン
（酵素安定斉ｊグレードＥＲＴ−７０１）。
３、ＤＮアーゼ
０．１ Ｍ ＭｇＣｎ２中０．５ Ｑ／ｍ１４、ＤＮア
ーゼｌ希釈緩衝液 １０ｍＭ）リスＨｃ１１ ｐＨ７，５１翫／ｌｔ、ｌ
ウシ血清アルブミン（ＥＲＴ−７０１）５、 ３．３
ｘ 末端５ベル化反応緩衝液、６６Ｍ 力コジレート
ｐＨ７，。
ーゼｌ希釈緩衝液 １０ｍＭ）リスＨｃ１１ ｐＨ７，５１翫／ｌｔ、ｌ
ウシ血清アルブミン（ＥＲＴ−７０１）５、 ３．３
ｘ 末端５ベル化反応緩衝液、６６Ｍ 力コジレート
ｐＨ７，。
。００３３Ｍ ｌ−メルカプトエタノ６、デオキ
シヌクレオチド溶液 ａ． ９ｍＭ ａ’ｒ’ｒｐ ｂ．９ｍＭ ｄｃＴＰ ７、 Ｂｉｏ−プローブ（ Ｂｉｏ −ｄＵＴＰ ）
溶液２．５ ｍＭ Ｂｉｏ ｄＵＴＰ８．
ＣｏＣＡ！２ ０、ＯＩＭ ９、 ３ＨｄＴＴＰ （４０〜６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ ）
５０％エタノール水溶液中〔メチル−５Ｈ）チミジン−
ｇ−トリホスフェイトアンモニア塩、０．２５μＣｉ／
μｌ （該３ＨｄＴＴＰは結合を監視するために単独で
用いられ、そして Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ、により供給される。）１
０、対照ＤＮＡ 、ＤＮアーゼ処理 ５０ｍＭ ）リスＨＣＩ中０．５ ｒ４／ｙ；ｘｌ
ｐＨ７，４。
シヌクレオチド溶液 ａ． ９ｍＭ ａ’ｒ’ｒｐ ｂ．９ｍＭ ｄｃＴＰ ７、 Ｂｉｏ−プローブ（ Ｂｉｏ −ｄＵＴＰ ）
溶液２．５ ｍＭ Ｂｉｏ ｄＵＴＰ８．
ＣｏＣＡ！２ ０、ＯＩＭ ９、 ３ＨｄＴＴＰ （４０〜６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ ）
５０％エタノール水溶液中〔メチル−５Ｈ）チミジン−
ｇ−トリホスフェイトアンモニア塩、０．２５μＣｉ／
μｌ （該３ＨｄＴＴＰは結合を監視するために単独で
用いられ、そして Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ、により供給される。）１
０、対照ＤＮＡ 、ＤＮアーゼ処理 ５０ｍＭ ）リスＨＣＩ中０．５ ｒ４／ｙ；ｘｌ
ｐＨ７，４。
５ ｍＭ ＭｇＣｎ２ｃｚ
ーゼ（末端ラベル対照として用いられる）。
本発明におけるキットのＤＮアーゼ成分を用いる末端ラ
ベル付のだめの該ＤＮＡの調製のために望ましい方法は
次の通りである。
ベル付のだめの該ＤＮＡの調製のために望ましい方法は
次の通りである。
一般的な目的に対して、ＤＮアーセＩによって導入され
る３′ＯＨ末端は末端トランスファラーゼのための予備
的末端としての役目をする。ＤＮＡはＤＮアーゼによっ
て分解されて２００〜５００塩基対のサイズ（もしくは
望まれる如何なるサイズ）を有する断片になる。該ＤＮ
アーゼは次いで熱によって不活性化されそして分解され
たＤＮＡは容易に末端ラベルされるようになる。分解に
おいてはいくらかの副成物が生じ、そしてこ＼で記載さ
れる一般的な概要に従かいそれからアガローズ（および
／またはアクリルアミド）ゲル上で該ＤＮＡのサイズを
観察することが最良である。
る３′ＯＨ末端は末端トランスファラーゼのための予備
的末端としての役目をする。ＤＮＡはＤＮアーゼによっ
て分解されて２００〜５００塩基対のサイズ（もしくは
望まれる如何なるサイズ）を有する断片になる。該ＤＮ
アーゼは次いで熱によって不活性化されそして分解され
たＤＮＡは容易に末端ラベルされるようになる。分解に
おいてはいくらかの副成物が生じ、そしてこ＼で記載さ
れる一般的な概要に従かいそれからアガローズ（および
／またはアクリルアミド）ゲル上で該ＤＮＡのサイズを
観察することが最良である。
プラスチックチューブ中において
ａ、５ｔｔｌ もしくはそれ以下中５１１ｙＤＮＡｂ、
２．５μｍ ０．０４ Ｍ ＭｇＣｎ２ｃ、
８、ＯｐｌにするためのＨ２Ｏこのチーープへ下記の
方法で新しく希釈された２、０μ４のＤＮアーゼを添加
する：１μｌのＤＮプアーセフス９９μｌＤＮアーゼ希
釈銭衝液：この溶液の１マイクロリツターはそれから４
９μｌのＤＮアーゼ希釈緩衝液によって希釈される。Ｄ
Ｎアーゼを添加した後、該チューブは３７℃、２乃至１
０分（一般的に５分が最適）装置され、それから該ＤＮ
アーゼを不活性化するために６８℃５分間胛置を装る。
２．５μｍ ０．０４ Ｍ ＭｇＣｎ２ｃ、
８、ＯｐｌにするためのＨ２Ｏこのチーープへ下記の
方法で新しく希釈された２、０μ４のＤＮアーゼを添加
する：１μｌのＤＮプアーセフス９９μｌＤＮアーゼ希
釈銭衝液：この溶液の１マイクロリツターはそれから４
９μｌのＤＮアーゼ希釈緩衝液によって希釈される。Ｄ
Ｎアーゼを添加した後、該チューブは３７℃、２乃至１
０分（一般的に５分が最適）装置され、それから該ＤＮ
アーゼを不活性化するために６８℃５分間胛置を装る。
もし該ＤＮＡ溶液が希釈されそしてＥＤＴＡを宮んでお
り、そして分解に先立って凍結乾燥によって濃縮される
ならば’Ｉ ＥＤＴＡの濃度はＭｇ（光２濃度が分解反
応の間少なくとも５ｍＭであるようにてれるべきである
ことを注意すること１９１である。
り、そして分解に先立って凍結乾燥によって濃縮される
ならば’Ｉ ＥＤＴＡの濃度はＭｇ（光２濃度が分解反
応の間少なくとも５ｍＭであるようにてれるべきである
ことを注意すること１９１である。
該ＤＮＮアーマ不活性化後、該ＤＮアーゼで処理さね、
たＤＮＡは末端ラベル付が容易である。
たＤＮＡは末端ラベル付が容易である。
末端ラベル付のための該ＤＮＡを調製するために該ＤＮ
ＡをＤＮＮアーマ処理した後は、下記の方法が用いられ
る。
ＡをＤＮＮアーマ処理した後は、下記の方法が用いられ
る。
Ａ、末端）ランスファラーゼの希釈
末端トランス７アラーゼ（チューブ１）は各々使用され
るに先立って１．５μＣ乃至４．５μｌのＴｄＴ希釈緩
衝溶液を添加することによって希釈されるべきである。
るに先立って１．５μＣ乃至４．５μｌのＴｄＴ希釈緩
衝溶液を添加することによって希釈されるべきである。
Ｂ、 ３ＨｄＴＴＰの凍結乾燥
その中で反応が行われるプラスチノクチー−プ中の８μ
の３Ｈ−ｄＴＴＰを凍結乾燥する。
の３Ｈ−ｄＴＴＰを凍結乾燥する。
Ｃ１末端ラベル反応
凍結乾燥によってエタノールを除去した上で、残存する
試薬は下記の順序で３ＨｄＴＴＰに加えられる。
試薬は下記の順序で３ＨｄＴＴＰに加えられる。
５、 ３．３ＸＴｃｔＴ
１５μｌ反応緩衝溶液 ６ａまたＨ６ｂ ９ｒｎＭｄＴＴＰまたｔｒｉ９ｍＭ
ｄＣＴＰ ５μｌもしくは ６ａ ＋ ６ｂ ９ｒｎｌｖＬｄＴＴＰ ＋９ｍＭｄ
ＣＴＰ ２．５μｍ！６ａ＋２．５μ１６ｂ ７、 ２．５ｍＭＢｉｏ ｄＵＴＰ
２１１（Ｊ末端ラベルされるべぎ実験ＤＮＡ １
Ｍｇもしくは ＤＮアーゼ処理標準ＤＮＡ ２μｌ添加する前に
無菌類溜水で容量を４０μｌに調節１＋２ 希釈され
たＴｄＴ ５μ１８、 ＣｏＣ，ｇ
２ ５／Ｊ反応物は３７℃、１時間
載置する。反応物は０℃に冷却しそして結合を測定する
（以下参照）０もし更に結合させることが菫まれるなら
ば、反応物の３７′Ｃにおける載置を続ける。殆んどの
環境下において、充分な結合が１〜２時間の載置の後に
得られる。ＤＮアーゼによって導入された３’ＯＨ予備
末端を用いて、全ヌクレオチドの１０〜３０十１モルが
結合して取り込まれる０６５℃５分間の加熱もしくは１
／１ｏ容量の０．１Ｍ ＥＤＴＡを添加することによ
って反応を停止する。
１５μｌ反応緩衝溶液 ６ａまたＨ６ｂ ９ｒｎＭｄＴＴＰまたｔｒｉ９ｍＭ
ｄＣＴＰ ５μｌもしくは ６ａ ＋ ６ｂ ９ｒｎｌｖＬｄＴＴＰ ＋９ｍＭｄ
ＣＴＰ ２．５μｍ！６ａ＋２．５μ１６ｂ ７、 ２．５ｍＭＢｉｏ ｄＵＴＰ
２１１（Ｊ末端ラベルされるべぎ実験ＤＮＡ １
Ｍｇもしくは ＤＮアーゼ処理標準ＤＮＡ ２μｌ添加する前に
無菌類溜水で容量を４０μｌに調節１＋２ 希釈され
たＴｄＴ ５μ１８、 ＣｏＣ，ｇ
２ ５／Ｊ反応物は３７℃、１時間
載置する。反応物は０℃に冷却しそして結合を測定する
（以下参照）０もし更に結合させることが菫まれるなら
ば、反応物の３７′Ｃにおける載置を続ける。殆んどの
環境下において、充分な結合が１〜２時間の載置の後に
得られる。ＤＮアーゼによって導入された３’ＯＨ予備
末端を用いて、全ヌクレオチドの１０〜３０十１モルが
結合して取り込まれる０６５℃５分間の加熱もしくは１
／１ｏ容量の０．１Ｍ ＥＤＴＡを添加することによ
って反応を停止する。
Ｄ、結合したヌクレオチドの測定
１、マイクロリゞツタ−ずつに分割して１０マイクログ
ラムのポリ ｒＡ が加えられている５Ｍｌプラスチッ
クチューブに移す。
ラムのポリ ｒＡ が加えられている５Ｍｌプラスチッ
クチューブに移す。
２、 １ｓｔ冷５％（Ｗ／Ｖ ） トリクｏｏ酢酸（Ｔ
ＣＡ）、２５ｍＭ燐酸ソーダを加える。
ＣＡ）、２５ｍＭ燐酸ソーダを加える。
３、少くとも１０分間水中にチーーブを置く。
４、 ガラス繊維フィルターを通して濾過する０５、
２．５％ＴＣＡ、１０ｍＭピロ燐酸ソーダで完全に洗滌
する。
２．５％ＴＣＡ、１０ｍＭピロ燐酸ソーダで完全に洗滌
する。
６、完全に乾燥する。
７、トルエンベースの液体シンチレーション混合物を加
えてフィルターを被覆して液体シンチレーション計数器
により計数を行なう。
えてフィルターを被覆して液体シンチレーション計数器
により計数を行なう。
８、該反応混合物の全放射能を測定するために、第二番
目に１５０マイクロリツターから２マイクロリツターず
つに分割したものを直接に（Ｐ遇することなく）ガラス
繊維フィルター上に移す０乾燥しそして計数する。
目に１５０マイクロリツターから２マイクロリツターず
つに分割したものを直接に（Ｐ遇することなく）ガラス
繊維フィルター上に移す０乾燥しそして計数する。
Ｅ、結合されたデオキシヌクレオチドの＋１モルの計算
とビオチン化ｄＵＴＰ含有量の測定上記した方法とパー
トＣに記載したよう々反応を用いて次式により結合され
取込まれたヌクレオチドの＋１モルを剖４享する。
とビオチン化ｄＵＴＰ含有量の測定上記した方法とパー
トＣに記載したよう々反応を用いて次式により結合され
取込まれたヌクレオチドの＋１モルを剖４享する。
結合ヌクＶオテド＋１モル 沈澱されたＴＣＡｃｐｍＸ
５０グローブＤＮＡのμｇに対するビオチン化ｄＵＴＰ
の含有量を測定するために全結合ヌクレオチドを０．１
０’Ｅでに堆加させる（反応中のＢｉｏ −ｄＵＴＰの
フラクション）０ ＤＮＡのμｇに対するＢｉｏ ｄＵＴＰ の、量は１か
ら３＋１モルであるべきである。
５０グローブＤＮＡのμｇに対するビオチン化ｄＵＴＰ
の含有量を測定するために全結合ヌクレオチドを０．１
０’Ｅでに堆加させる（反応中のＢｉｏ −ｄＵＴＰの
フラクション）０ ＤＮＡのμｇに対するＢｉｏ ｄＵＴＰ の、量は１か
ら３＋１モルであるべきである。
Ｆ、ビオチン化ＤＮＡの回収
１．１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ （ｐｉ−Ｉ７．５ ）
、１ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化されたセファデックスＧ−
５０カラム（約３．５Ｍり上に停止せしめられた末端ラ
ベル付反応混合液を載置する。
、１ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化されたセファデックスＧ−
５０カラム（約３．５Ｍり上に停止せしめられた末端ラ
ベル付反応混合液を載置する。
２．７ラクシヨンに対し５滴ずつ集める。液体シンチレ
ーション計数によって各々の７ラクシヨンから２マイク
ロリツターずつ分割したものを計数する。
ーション計数によって各々の７ラクシヨンから２マイク
ロリツターずつ分割したものを計数する。
３、 ビオチン化ＤＮＡを含む最初のピークにおけるフ
ラクションをプールする。ヌクレオチドを含む第二番目
のピークを捨てる。
ラクションをプールする。ヌクレオチドを含む第二番目
のピークを捨てる。
４．４℃もしくは一２０℃で貯蔵する。
これに代えて、ＤＮＡは下記する“スビン力２ム“法を
用いて結合されていないヌクレオチドから分離されるで
あろう。
用いて結合されていないヌクレオチドから分離されるで
あろう。
１．１０ｍＭ ）リスＨＣＩ（ｐＨ７，５） 、１ｍＭ
ＥＤＴＡ甲においてセファデックスＧ−５０を予備膨潤
し、シリコン化ガラスクールによって栓をされている１
ｍｌツベルクリンシリンジの中ヘビペットにより注入
した。重力によって沈澱せしめる。
ＥＤＴＡ甲においてセファデックスＧ−５０を予備膨潤
し、シリコン化ガラスクールによって栓をされている１
ｍｌツベルクリンシリンジの中ヘビペットにより注入
した。重力によって沈澱せしめる。
シリンジの上端まで樹脂を充填する。
２、ホールカットを通して充填されたシリンジを１５ｍ
？のプラスチックコニカル遠心分離チューブのキャンプ
の中へ設置する。該コニカル遠心分離チューブの底に紙
タオルかぬぐいの詰め物を置きそして１．５ ｙｒｌの
エノペンドルフテユープを挿入する。シリンジの先端が
エッペンドルフテユーブの開口部の中へ適嵌するように
嵌着されるシリンジのキャップをコニカル遠心分離チュ
ーブの中へ置く。
？のプラスチックコニカル遠心分離チューブのキャンプ
の中へ設置する。該コニカル遠心分離チューブの底に紙
タオルかぬぐいの詰め物を置きそして１．５ ｙｒｌの
エノペンドルフテユープを挿入する。シリンジの先端が
エッペンドルフテユーブの開口部の中へ適嵌するように
嵌着されるシリンジのキャップをコニカル遠心分離チュ
ーブの中へ置く。
８、ベンチトップ型遠心分離器において該チューブーシ
リンジ組合わせ物を低速で３〜４分間回転する。遠心分
離後はシリンジ中に詰め込まれたベッドボリュームは０
．８５．乃至０．９ ｔｘｔになる筈である。
リンジ組合わせ物を低速で３〜４分間回転する。遠心分
離後はシリンジ中に詰め込まれたベッドボリュームは０
．８５．乃至０．９ ｔｘｔになる筈である。
４、 シリンジを取除いてそれからピペットによってエ
ッペンドルフ中の液体を除去する。
ッペンドルフ中の液体を除去する。
５、ホールの中へ再びシリンジを挿入しそして樹脂ベッ
ドの上端に末端ラベル付反応物の５０マイクロリツター
をピペットでのせるＯ該シリンジはそれから最初詰め込
捷れたカラムを作成するために用いられたと同様な速度
で３〜４分間再遠心分離される。
ドの上端に末端ラベル付反応物の５０マイクロリツター
をピペットでのせるＯ該シリンジはそれから最初詰め込
捷れたカラムを作成するために用いられたと同様な速度
で３〜４分間再遠心分離される。
６、エッベ／ドルフ中に保持さハ、ている液体は用いら
れた（５０マイクロリツター）と等しい量もしくは僅か
にそれよりも少ない量で非結合ヌクレオチドのＤＮＡグ
ローブフリーのものを含む。該試料の量は調節さオアー
で２０マイクログラム／ ｍｌの最終的グローブ濃度を
与える０他の改変としては、ＤＮＡは下記の方法でエタ
ノール沈澱によって単離式れることか出来る０１、終端
ラベル付に続いて、停止された反応物に対して等容量の
４Ｍ酢酸アンモニウムと２０μｇキャリアー核酸（２０
μｌ）を添加する。混合しそれから２容量の水冷エタノ
ールを添加する。
れた（５０マイクロリツター）と等しい量もしくは僅か
にそれよりも少ない量で非結合ヌクレオチドのＤＮＡグ
ローブフリーのものを含む。該試料の量は調節さオアー
で２０マイクログラム／ ｍｌの最終的グローブ濃度を
与える０他の改変としては、ＤＮＡは下記の方法でエタ
ノール沈澱によって単離式れることか出来る０１、終端
ラベル付に続いて、停止された反応物に対して等容量の
４Ｍ酢酸アンモニウムと２０μｇキャリアー核酸（２０
μｌ）を添加する。混合しそれから２容量の水冷エタノ
ールを添加する。
２、乾燥氷−エタノールバス中で５分間冷却することに
より該ＤＮＡ断片を沈澱する。冷間において１２．００
０ ｘｇ で５分間遠心分離してＤＮＡをベレット状に
する。パスツールパイプによって注意深く上澄みを除去
して棄てる。
より該ＤＮＡ断片を沈澱する。冷間において１２．００
０ ｘｇ で５分間遠心分離してＤＮＡをベレット状に
する。パスツールパイプによって注意深く上澄みを除去
して棄てる。
８、 ０．３Ｍ酢酸ンーダの２５０μｌを加えて該ＤＮ
Ａベレットを安定化する。７ ｓ ｏ ｔｔｌの冷エタ
ノールを加える：冷却し、遠心分離し、そしてステップ
２で述べたと同様に上澄みを除く。
Ａベレットを安定化する。７ ｓ ｏ ｔｔｌの冷エタ
ノールを加える：冷却し、遠心分離し、そしてステップ
２で述べたと同様に上澄みを除く。
４、ステップ１ ｆ、繰返す。
５．３′終端ラベル付されたＤＮＡ断片を含むベレット
を１ゴエタノールで穏やかに被覆する０上澄みを注意深
く取除きそして数分間真空下にベレットを乾燥する。
を１ゴエタノールで穏やかに被覆する０上澄みを注意深
く取除きそして数分間真空下にベレットを乾燥する。
６、所望の緩衝浴液中に再分散して回収率を測定する。
ビオチン化ＤＮＡ試料のフェノール抽出はフェノール層
の中へ抽出されるかもしくはフェノール−水塊界面に保
持されるために避けられなければならない。
の中へ抽出されるかもしくはフェノール−水塊界面に保
持されるために避けられなければならない。
本発明の実施においてＤＮＡの末端ラベル付に対する化
学的にラベルされたヌクレオチドとして前記に引用され
ているビオチン−１１−ｄＵＴＰもしくはｂｉｏ−ｄＵ
ＴＰのようなビオチン化ヌクレオチド２デオキシウリジ
ントリホスフエイト５−アリルアミン−ビオチンを用い
ることが望ましい。
学的にラベルされたヌクレオチドとして前記に引用され
ているビオチン−１１−ｄＵＴＰもしくはｂｉｏ−ｄＵ
ＴＰのようなビオチン化ヌクレオチド２デオキシウリジ
ントリホスフエイト５−アリルアミン−ビオチンを用い
ることが望ましい。
該ＤＮＡの末端ラベル付に用いられる化学的にラベルさ
れたヌクレオチドの量は通常用いられる全デオキシヌク
レオチド含有量の約１０％である。
れたヌクレオチドの量は通常用いられる全デオキシヌク
レオチド含有量の約１０％である。
ｂｉｏ−ｄＵＴＰのパーセンテージはもし所望なれば夫
々より高いかもしくはより低い固有活性の末端２べ＃付
ＤＮＡグローブを生成するために１００％まで増加せら
れもしくは約１係程度まで減小せられることが出来る。
々より高いかもしくはより低い固有活性の末端２べ＃付
ＤＮＡグローブを生成するために１００％まで増加せら
れもしくは約１係程度まで減小せられることが出来る。
通常、１０％ｂｉｏ−ｄＵＴＰ含有量が殆んどの末端ラ
ベル付の目的のために適当である。
ベル付の目的のために適当である。
前記したように、ｂｉｏ−ｄＵＴＰは前記に記載されも
しくは引用された化学的にラベルされ特に変性されたデ
オキシヌクレオチドのいかなるものによっても置き換え
られ得る。
しくは引用された化学的にラベルされ特に変性されたデ
オキシヌクレオチドのいかなるものによっても置き換え
られ得る。
３ＨｄＴ’ＬＰのオＵ用の点から、この成分は他の如何
なる放射性ラベルされたデオキシヌクレオシドトリホス
フェイトで置き換えられるかもしくは所望なれば放射性
ラベルされたヌクレオシドは完全に省くことが出来る。
なる放射性ラベルされたデオキシヌクレオシドトリホス
フェイトで置き換えられるかもしくは所望なれば放射性
ラベルされたヌクレオシドは完全に省くことが出来る。
また反応物に対してより多い末端トランス７アラーゼの
使用はより速い合成をもたらし、そして逆に云えばより
少ない末端トランスフエラーゼの使用は末端ラベル化Ｄ
ＮＡの反応もしくは合成の速匿を減小させる。
使用はより速い合成をもたらし、そして逆に云えばより
少ない末端トランスフエラーゼの使用は末端ラベル化Ｄ
ＮＡの反応もしくは合成の速匿を減小させる。
反応物中の成分や構成物の濃度は結果として得られる末
端ラベル化グローブに著しく影響していることが見出さ
れた。例えば、多かれ少なかれデオキシヌクレオチドを
添加することはやがて末端トランスフエラーゼが添加さ
れたｄＣＴＰもしくはｄＴＴＰの９０チまでを重合させ
るであろう。したがって添加されたヌクレオチドの量を
増やせば増やす程より長い尾部が形成される。また、も
しラベルされるべきＤＮＡの濃度が変化するならば結合
されるヌクレオチドのモル数も変化する０例えば、反応
物中のＤＮＡの量が増加するにつれて全ヌクレオチドの
結合が一定であるところの平坦域に到達するが例えばｂ
ｉｏ−ｄＵＴＰのような取り込まれた化学的にラベルさ
れたヌクレオチドの尾部の絶対長きおよび個数は減小す
る。更に例えばｃｏ＋＋および／′または絢セのような
メタルイオンの含有量もしくは濃＃ば末端ラベル付操作
および得られる末端ラベル付ＤＮＡに影響する０化学的
にラベルされもしくは変性されたヌクレオチドで末端ラ
ベル付された該ＤＮＡは、例えば末端に結合された特殊
ヌクレオチドに向けられる抗−抗体、もしくはそれら自
体がビオチン成分もしくは化学的にラベルされたヌクレ
オチドの部分に結合する例えばアビジンまたはストレプ
トアビジンもしくは酵素に結合しているアビジンもしく
は酵素に結合しているストレプトアビジンのような検出
剤の使用のような非放射性手法によって検出されること
が出来ることは前記されている。もし所望なれば、末端
に結合された特殊ヌクレオチドは本発明の実施による末
端に結合されたビオチン化ヌクレオチドを検出もしくは
位置決めするために例えば放射性アビジンの使用のよう
な放射能手法によって検出され得るであろう。
端ラベル化グローブに著しく影響していることが見出さ
れた。例えば、多かれ少なかれデオキシヌクレオチドを
添加することはやがて末端トランスフエラーゼが添加さ
れたｄＣＴＰもしくはｄＴＴＰの９０チまでを重合させ
るであろう。したがって添加されたヌクレオチドの量を
増やせば増やす程より長い尾部が形成される。また、も
しラベルされるべきＤＮＡの濃度が変化するならば結合
されるヌクレオチドのモル数も変化する０例えば、反応
物中のＤＮＡの量が増加するにつれて全ヌクレオチドの
結合が一定であるところの平坦域に到達するが例えばｂ
ｉｏ−ｄＵＴＰのような取り込まれた化学的にラベルさ
れたヌクレオチドの尾部の絶対長きおよび個数は減小す
る。更に例えばｃｏ＋＋および／′または絢セのような
メタルイオンの含有量もしくは濃＃ば末端ラベル付操作
および得られる末端ラベル付ＤＮＡに影響する０化学的
にラベルされもしくは変性されたヌクレオチドで末端ラ
ベル付された該ＤＮＡは、例えば末端に結合された特殊
ヌクレオチドに向けられる抗−抗体、もしくはそれら自
体がビオチン成分もしくは化学的にラベルされたヌクレ
オチドの部分に結合する例えばアビジンまたはストレプ
トアビジンもしくは酵素に結合しているアビジンもしく
は酵素に結合しているストレプトアビジンのような検出
剤の使用のような非放射性手法によって検出されること
が出来ることは前記されている。もし所望なれば、末端
に結合された特殊ヌクレオチドは本発明の実施による末
端に結合されたビオチン化ヌクレオチドを検出もしくは
位置決めするために例えば放射性アビジンの使用のよう
な放射能手法によって検出され得るであろう。
前記したように、本発明の実施においては末端に結合さ
れたヌクレオチドとしてもしくは末端トランスファラー
ゼビオチン化ヌクレオチドに対する基質としてビオチン
もしくはイミノビオチンでラベルされたヌクレオチドを
用いることが望ましい。前記の開示および前記のＬａｎ
ｇｅｒ等の刊行物Ｐ、Ｎ−Ａ−Ｓ、Ｖｏ １．７８．
Ｎｏ、 １１．第６６３３〜６６３７頁（１９８１）に
おいて開示されているヌクレオチドを参照のこと。特に
化学的にラベルされたヌクレオチドとして興味あるのは
グリコジル化ヌクレオチドである。また二重らせん構造
のＤＮＡの中へ取シ込まれることが出来、そしてこ＼に
開示されるようにＤＮＡに対する末端トランスファラー
ゼもしくは末端結合のだめの基質として用いられるこれ
ら特殊ヌクレオチドはＤＮＡ末端に結合された時例えば
コンカナバリンＡのようなレクチンによって容易に検出
されることが出来る。このようなグリコジル化され末端
に結合されたデオキシヌクレオチドの測定もしくは検出
は放射性ジベルされたレクチンを用いることによっても
しくは抗体または抗−抗体によってもしくは酵素に結合
しているレクチ／によって前記した方法においてビオチ
ンでラベルされ末端に結合されているヌクレオチドの検
出もしくは測定に関して行われることが出来る。
れたヌクレオチドとしてもしくは末端トランスファラー
ゼビオチン化ヌクレオチドに対する基質としてビオチン
もしくはイミノビオチンでラベルされたヌクレオチドを
用いることが望ましい。前記の開示および前記のＬａｎ
ｇｅｒ等の刊行物Ｐ、Ｎ−Ａ−Ｓ、Ｖｏ １．７８．
Ｎｏ、 １１．第６６３３〜６６３７頁（１９８１）に
おいて開示されているヌクレオチドを参照のこと。特に
化学的にラベルされたヌクレオチドとして興味あるのは
グリコジル化ヌクレオチドである。また二重らせん構造
のＤＮＡの中へ取シ込まれることが出来、そしてこ＼に
開示されるようにＤＮＡに対する末端トランスファラー
ゼもしくは末端結合のだめの基質として用いられるこれ
ら特殊ヌクレオチドはＤＮＡ末端に結合された時例えば
コンカナバリンＡのようなレクチンによって容易に検出
されることが出来る。このようなグリコジル化され末端
に結合されたデオキシヌクレオチドの測定もしくは検出
は放射性ジベルされたレクチンを用いることによっても
しくは抗体または抗−抗体によってもしくは酵素に結合
しているレクチ／によって前記した方法においてビオチ
ンでラベルされ末端に結合されているヌクレオチドの検
出もしくは測定に関して行われることが出来る。
前記したような本発明の実施は末端にラベルされた単一
らせん構造および二重らせん構造を有するＤＮＡの調製
に適用され得る。
らせん構造および二重らせん構造を有するＤＮＡの調製
に適用され得る。
また前記したように、本発明によるＤＮＡ分子もしくは
グローブの化学的にラベルされた末端部分もしくは尾部
は例えば放射能検出手法、酵素にもとつく手法、そして
免疫検定もしくは抗体にもとづく手法のような種々の手
法によって検出されることが出来る。例えば該ＤＮＡ分
子の尾部分を構成する化学的にラベルされたヌクレオチ
ドがビオチン部分を含む時、該化学的にラベルされた尾
部（ビオチン部分）の存在もしくは位置は例えばアビジ
ン−ビオチン−アルカリホスファターゼもしくはストレ
プトアビジン−ビオチン−ホースラディツシュパーオキ
シダーゼからなる複合体のようなビオチン化酵素に結合
せられる放射性アビジンもしくはストレストアビジンを
用いることによって検出され得るであろう。化学的にラ
ベルされたヌクレオチドのビオチン部分に対して該複合
体が結合した後、例えばその存在は適当な色を生成もし
くは色を変化する基質上で酵素ホースラディツシュパー
オキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼの作用に
よる適当な色の応答もしくは変化によって明らかにされ
るであろう。史にまた化学的にラベルされたヌクレオチ
ド中のビオチンのような化学的なラベルをしている部分
は例えばヤギ抗体のような抗体とビオチンとが接触しそ
れから酵素と結合するであろうウサギ抗−ヤギ抗体と接
触することによって明らかにされもしくは検出されるこ
とが出来るであろう。同様なアプローチは尾部を構成し
ているラベル付ヌクレオチドがグリコジル化されるかも
しくはグルコシド結合を含んでいる化学的にラベルされ
たヌクレオチドの検出に適用され得るであろう。このよ
うなグリコジル化ヌクレオチドは例えば放射性コンカナ
バリンＡのような放射性レクチンもしくはレクチンまた
はレクチンと結合されている酵素と反応を示す他の化合
物もしくは抗体によって検出され得るであろう。レクチ
ンはアビジンがそれ自体ビオチン台β分に容易に結合す
るようにそれ自体がグリコジル部分に容易に結合するの
で本発明によりグリコジル化ヌクレオチドの存在を明ら
かにするであろう。
グローブの化学的にラベルされた末端部分もしくは尾部
は例えば放射能検出手法、酵素にもとつく手法、そして
免疫検定もしくは抗体にもとづく手法のような種々の手
法によって検出されることが出来る。例えば該ＤＮＡ分
子の尾部分を構成する化学的にラベルされたヌクレオチ
ドがビオチン部分を含む時、該化学的にラベルされた尾
部（ビオチン部分）の存在もしくは位置は例えばアビジ
ン−ビオチン−アルカリホスファターゼもしくはストレ
プトアビジン−ビオチン−ホースラディツシュパーオキ
シダーゼからなる複合体のようなビオチン化酵素に結合
せられる放射性アビジンもしくはストレストアビジンを
用いることによって検出され得るであろう。化学的にラ
ベルされたヌクレオチドのビオチン部分に対して該複合
体が結合した後、例えばその存在は適当な色を生成もし
くは色を変化する基質上で酵素ホースラディツシュパー
オキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼの作用に
よる適当な色の応答もしくは変化によって明らかにされ
るであろう。史にまた化学的にラベルされたヌクレオチ
ド中のビオチンのような化学的なラベルをしている部分
は例えばヤギ抗体のような抗体とビオチンとが接触しそ
れから酵素と結合するであろうウサギ抗−ヤギ抗体と接
触することによって明らかにされもしくは検出されるこ
とが出来るであろう。同様なアプローチは尾部を構成し
ているラベル付ヌクレオチドがグリコジル化されるかも
しくはグルコシド結合を含んでいる化学的にラベルされ
たヌクレオチドの検出に適用され得るであろう。このよ
うなグリコジル化ヌクレオチドは例えば放射性コンカナ
バリンＡのような放射性レクチンもしくはレクチンまた
はレクチンと結合されている酵素と反応を示す他の化合
物もしくは抗体によって検出され得るであろう。レクチ
ンはアビジンがそれ自体ビオチン台β分に容易に結合す
るようにそれ自体がグリコジル部分に容易に結合するの
で本発明によりグリコジル化ヌクレオチドの存在を明ら
かにするであろう。
化学的にラベルされたヌクレオチドの検出に対しての本
発明の実施に適用出来る酵素にもとづく手法は１９８３
年１月２７日出願の共に継続し共に譲渡された米国特許
出願第４６１．４６９号に記載されている。！４＋許出
願第４６１．４６９号の開示はこ＼に取り入れられそし
てこの開示の一部をなす。特許出願第４６１，４６９号
に記載されているＤＮＡグローブのようにこ＼に記載さ
れている末端にラベルされたＤＮＡもしくはＲＮＡ分子
はまた例えばガラスのような透明な基材に固定されそし
て特許出Ｍ第４６１．４６９号に記載されている方法で
利用することが可能である。
発明の実施に適用出来る酵素にもとづく手法は１９８３
年１月２７日出願の共に継続し共に譲渡された米国特許
出願第４６１．４６９号に記載されている。！４＋許出
願第４６１．４６９号の開示はこ＼に取り入れられそし
てこの開示の一部をなす。特許出願第４６１，４６９号
に記載されているＤＮＡグローブのようにこ＼に記載さ
れている末端にラベルされたＤＮＡもしくはＲＮＡ分子
はまた例えばガラスのような透明な基材に固定されそし
て特許出Ｍ第４６１．４６９号に記載されている方法で
利用することが可能である。
こ＼に述へられている本発明の実施においては末端にジ
ベルされるべきＤＮＡの調製のために酵素ＤＮアーゼが
用いられて来たけれども、他の酵素も丑だ有利に用いら
れる。例えば、限定エンドヌクレアーゼは本発明のこの
実施において末端トランスファラーゼによる後続の末端
化学ラベル付のために３’−ＯＨ生成に対して用いられ
ることが出来る。突出している３’−ＯＨ末端を生成す
る限定エンドヌクレアーゼＰｓｔ １および引込んでい
る３′−０Ｈ末端を生成する限定エンドヌクレアーゼＢ
ａｍＨＩはこの目的に対して用いられて来た０約２乃至
４重に延長された載置を必要とする好結果を収めたラベ
ル付は各々の反応物における末端トランスファラーゼの
量を増加する。殆んどの限定エンドヌクレアーゼによっ
て生成される引込んでいる３’−ＯＨ末端を曝露するラ
ムダニクンヌクレアーゼは更に末端トランスファラーゼ
に対する予備剤としてこれらＤＮＡの効力を増力する。
ベルされるべきＤＮＡの調製のために酵素ＤＮアーゼが
用いられて来たけれども、他の酵素も丑だ有利に用いら
れる。例えば、限定エンドヌクレアーゼは本発明のこの
実施において末端トランスファラーゼによる後続の末端
化学ラベル付のために３’−ＯＨ生成に対して用いられ
ることが出来る。突出している３’−ＯＨ末端を生成す
る限定エンドヌクレアーゼＰｓｔ １および引込んでい
る３′−０Ｈ末端を生成する限定エンドヌクレアーゼＢ
ａｍＨＩはこの目的に対して用いられて来た０約２乃至
４重に延長された載置を必要とする好結果を収めたラベ
ル付は各々の反応物における末端トランスファラーゼの
量を増加する。殆んどの限定エンドヌクレアーゼによっ
て生成される引込んでいる３’−ＯＨ末端を曝露するラ
ムダニクンヌクレアーゼは更に末端トランスファラーゼ
に対する予備剤としてこれらＤＮＡの効力を増力する。
例えばＨａｅｌｌｌのような酵素によって生成される突
出しても引込んでもいない３’−ＯＨ末端はまた適当で
ある。しかしながら限定酵素で分解されたＤＮＡは末端
ラベル付に先立ちフェノール抽出およびエタノール沈澱
によって精製されなけれはならない。
出しても引込んでもいない３’−ＯＨ末端はまた適当で
ある。しかしながら限定酵素で分解されたＤＮＡは末端
ラベル付に先立ちフェノール抽出およびエタノール沈澱
によって精製されなけれはならない。
このためにＤＮＮアゼ分解の方が望ましいのである。ま
た音波もしくは他の手段によってランダムに切除された
ＤＮＡはまた末端にラベルさｎ、ることか出来る０しか
しながら予備末端を生成するためにはＤＮアーゼの使用
より以上の利点はこの方法においては殆んどないか全く
ない０ 上述の開示に照らして述べらノ１．た技術で明きらかな
ように、本願の実施にあたっては多くの変更、改変およ
び置き換えが可能であり、こわらは本願の精神及び範囲
から離ねるものではない。
た音波もしくは他の手段によってランダムに切除された
ＤＮＡはまた末端にラベルさｎ、ることか出来る０しか
しながら予備末端を生成するためにはＤＮアーゼの使用
より以上の利点はこの方法においては殆んどないか全く
ない０ 上述の開示に照らして述べらノ１．た技術で明きらかな
ように、本願の実施にあたっては多くの変更、改変およ
び置き換えが可能であり、こわらは本願の精神及び範囲
から離ねるものではない。
特許出願人 エンシー バイオケム。
インコーボＩ／イティド
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、試薬として（１）末端デオキシリボヌクレオチドト
２ンス７７ラーゼＴｄＴ、 （２）デオキシリボヌクレ
アーゼ（ＤＮアーゼ）、および（３）該ＴｄＴに対する
基質として作用することが出来る化学的にラベルされた
デオキシリボヌクレオチドからなる末端に結合されもし
くはラベルされたＤＮＡ分子もしくはプローブの調製の
ために有用な試薬キット。 ２．１−特許請求の範囲１．」に記載の試薬キットにお
いて、該化学的にラベルされたデオキシリボヌクレオチ
ドはあるＤＮＡ分子中に含まれる時、該化学的にラベル
されたデオキシリボヌクレオチドは該ＤＮＡ分子が二重
らせん構造を有するＤＮＡを形成することを妨げないよ
うに特徴づけられている。 ３、「特許請求の範囲１．」に記載の試薬キットにおい
て、該化学的にラベルされたデオキシリボヌクレオチド
の化学的ラベル部分は物理的、物理化学的、化学的もし
くは免疫学的手法によって検出されることが出来る。 ４、「特許請求の範囲１．」に記載の試薬キットにおい
て、該化学的にラベルされたデオキシリボヌクレオチド
はビオチン化されたデオキシリボヌクレオチドである。 ５、［特許請求の範囲１．］に記載の試薬キットにおい
て、該化学的にラベルされたデオキシリボヌクレオチド
は２′−デオキシウリジントリホスフェイト５−アリル
アミン−ビオチンである。 ６、「特許請求の範囲１．」に記載の試薬キットにおい
て、該試薬キット・には更にＣｏＣ／１２および／また
はＭｇＣｌ２水溶液が追加される。 ７、「特許請求の範囲１．」に記載の試薬キットにおい
て、該試薬キットには更にｐＨ約７．５の１０ｍμトリ
スＨＣ１からなるＤＮアーゼ希釈緩衝溶液が追加される
。 ８、「特許請求の範囲１．」に記載の試薬キットにおい
て、該試薬キットには更に該ＤＮアーゼを安定化するた
めに約１ ｑ／ｙｔｔｌのウシの血清を含む溶液が追加
される。 ９、該ＤＮアーゼで処理された後、末端に結合もしくは
ラベルされるべきＤＮＡを該ＴｄＴ存在下において該化
学的にラベルされたデオキシリボヌクレオチドと接触せ
しめ、該ＤＮＡによって提供される３７ＯＨ位置もしく
は該ＤＮＡに予め結合しているいかなる化学的にラベル
されたデオキシリボヌクレオチドに対する該化学的にラ
ベルされたデオキシリボヌクレオチドの末端結合を該Ｔ
ｄＴを介してもたらすことからなる「特許請求の範囲１
．」の試薬キットを用いる末端に結合もしくはラベルさ
れたＤＮＡを調製する方法。 １０、試薬として（１）末端デオキシリボヌクレオチド
トランスフ７ラーゼＴｄＴ、（２） Ｄ Ｎ Ａの３′
−〇Ｈ末端を生成もしくは露出することが出来る酵素、
および（３） ＴｄＴに対する基質として作用すること
が出来る化学的にラベルされたデオキシリボヌクレオチ
ドからなる末端に結合されもしくはラベルされたＤＮＡ
分子もしくはプローブの調製のために有用な試薬キット
。 １１、該酵素で処理された後、末端に結合もしくはラベ
ルされるべきＤＮＡを該ＴｄＴ存在下において該化学的
にラベルされたデオキシリボヌクレオチドと接触せしめ
、該ＤＮＡによって提供される３’ＯＨ位置又は末端も
しくは該ＤＮＡに予め結合しているいかなる化学的にラ
ベルされたデオキシリボヌクレオチドに対する該化学的
にラベルされたデオキシリボヌクレオチドの末端結合を
該ＴｄＴを介してもたらすことからなる「特許請求の範
囲１０．」の試薬キットを用いる末端に結合もしくはラ
ベルされたＤＮＡを調製する方法。 １２、末端にラベルされたＤＮＡ分子もしくはプローグ
であ多、該ＤＮＡ分子もしくはプローブは非放射性の化
学的にラベルされたデオキシリボヌクレオチドによって
末端において結合もしくはラベルされている。 １３、「特許請求の範囲１２．」に記載の末端にラベル
されたＤＮＡ分子もしくはグローブにおいそ、該ＤＮＡ
分子もしくはノーローブは一個もしくはそれ以上の非放
射性の化学的にラベルされたデオキシリボヌクレオチド
に末端において結合もしくはラベルされている。 １４、「特許請求の範囲１２．」に記載の末端にラベル
されたＤＮＡ分子もしくはグローブにおいて、該非放射
性の化学的にラベルされたデオキシリボヌクレオチドは
末端デオキシリボヌクレオチドトランスファラーゼＴｄ
Ｔに対する基質として作用することが出来る。 １５、「特許請求の範囲１２．」に記載の末端にラベル
されたＤＮＡ分子もしくはグローブにおいて、該非放射
性の化学的にラベルされたデオキシリボヌクレオチドは
末端デオキシリボヌクレオチドトランスファラーゼＴｄ
Ｔに対する基質として作用することが出来、該末端にラ
ベルされたＤＮＡ分子もしくはグローブもしくは該末端
にラベルされたＤＮＡ分子の末端ラベル部分が二重らせ
ん構造を有するＤＮＡを形成することを妨げない。 １６、「特許請求の範囲１２．」に記載の末端にラベル
されたＤＮＡ分子もしくはプローブにおいて、該化学的
にラベルされたデオキシリボヌクレオチドは物理的、物
理化学的、化学的もしくは免疫学的手法によって検出さ
れることが出来る。 １７、［特許請求の範囲１２．］に記載の末端にラベル
されたＤＮＡ分子もしくはグローブにおいて、該化学的
にラベルされたデオキシリボヌクレオチドはビオチン化
されたデオキシリボヌクレオチドである。 １８、「特許請求の範囲１２．」に記載の末端にラベル
されたＤＮＡ分子もしくはグローブにおいて、該化学的
にラベルされたデオキシリボヌクレオチドは２７−デオ
キシウリジントリホスフェイト５−アリルアミン−ビオ
チンである。 １９、「特許請求の範囲１２．」に記載の末端にラベル
されたＤＮＡ分子もしくはグローブにおいて、該化学的
にラベルされたデオキシリボヌクレオチドはグリコジル
化されたデオキシリボヌクレオチドである。 ２０、末端にラベルされたＤＮＡもしくはグローブであ
択該ＤＮＡ分子もしくはグローブはある単一らせん構造
のポリデオキシリボヌクレオチドで末端において結合も
しくはラベルされ、該単−らせん構造のポリデオキシリ
ボヌクレオチドは一個もしくはそれ以上の非放射性の化
学的にラベルされたデオキシリボヌクレオチドを含んで
いる。 ２１、「特許請求の範囲２０．」に記載の化学的にラベ
ルされたデオキシリボヌクレオチドにおいて、該化学的
にラベルされたデオキシリボヌクレオチドはビオチン化
されたデオキシリボヌクレオチドである。 ２２、特許請求の範囲２０．」に記載の化学的にラベル
されたデオキシリボヌクレオチドにおいて、該化学的に
ラベルされたデオキシリボヌクレオチドはグリコジル化
されたデオキシリボヌクレオチドである。 ２３、「特許請求の範囲２０．」に記載の化学的にラベ
ルされたデオキシリボヌクレオチドにおいて、該化学的
にラベルされたデオキシリボヌクレオチドは２′−デオ
キシウリジントリホスフェイト５−アリルアミン−ビオ
チンである。 ２４、「特許請求の範囲２０．」に記載の化学的にラベ
ルされているデオキシリボヌクレオチドにおいて、該化
学的にラベルされたデオキシリボヌクレオチドは該単−
らせん構造をなすポリデオキシリボヌクレオチドを構成
するヌクレオチドの約１％から１００％までからなる。 ２５、「特許請求の範囲２０．」に記載の化学的にラベ
ルされているデオキシリボヌクレオチドにおいて、該化
学的に２ベルされたデオキシリボヌクレオチドは該単−
らせん構造をなすポリデオキシリボヌクレオチドを構成
するヌクレオチドの約２チから４０俤までからなる
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US48458383A | 1983-04-13 | 1983-04-13 | |
| US484583 | 1983-04-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59206766A true JPS59206766A (ja) | 1984-11-22 |
| JP2595201B2 JP2595201B2 (ja) | 1997-04-02 |
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ID=23924744
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59074800A Expired - Lifetime JP2595201B2 (ja) | 1983-04-13 | 1984-04-12 | Ｄｎａ分子もしくはプローブおよび該ｄｎａ分子もしくはプローブの調製方法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0122614B1 (ja) |
| JP (1) | JP2595201B2 (ja) |
| AT (1) | ATE91508T1 (ja) |
| AU (2) | AU2677584A (ja) |
| CA (1) | CA1254525A (ja) |
| DE (1) | DE3486175T2 (ja) |
| DK (1) | DK185884A (ja) |
| ES (1) | ES531549A0 (ja) |
| IL (1) | IL71519A (ja) |
| NO (1) | NO841404L (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62502357A (ja) * | 1985-03-15 | 1987-09-10 | サマ−トン，ジエ−ムス | ポリヌクレオチド測定試薬と方法 |
| JPH07194398A (ja) * | 1993-10-23 | 1995-08-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | 核酸標識のための安定な組成物 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU3844485A (en) * | 1984-02-09 | 1985-08-15 | Enzo Biochem Inc. | Heterologous detection of cabeled dna |
| US4957858A (en) * | 1986-04-16 | 1990-09-18 | The Salk Instute For Biological Studies | Replicative RNA reporter systems |
| US4670379A (en) * | 1984-12-19 | 1987-06-02 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Polynucleotide hydridization assays employing catalyzed luminescence |
| CA1278755C (en) * | 1985-03-15 | 1991-01-08 | William J. Knowles | Labelling of oligonucleotides |
| US5082830A (en) * | 1988-02-26 | 1992-01-21 | Enzo Biochem, Inc. | End labeled nucleotide probe |
| US5047523A (en) * | 1988-08-02 | 1991-09-10 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Nucleic acid probe for detection of neisseria gonorrhoea |
| US5099011A (en) * | 1988-08-02 | 1992-03-24 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Nucleic acid probe for detection of Neisseria gonorrhoea |
| US5324829A (en) * | 1988-12-16 | 1994-06-28 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | High specific activity nucleic acid probes having target recognition and signal generating moieties |
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| AU661347B2 (en) * | 1991-10-11 | 1995-07-20 | Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Of The Academy Of Sciences Of The Czech Republic | Antiviral acyclic phosphonomethoxyalkyl substituted, alkenyl and alkynyl purine and pyrimidine derivatives |
| US6613516B1 (en) | 1999-10-30 | 2003-09-02 | Affymetrix, Inc. | Preparation of nucleic acid samples |
| US7759469B2 (en) | 2005-03-10 | 2010-07-20 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Labeling reagent |
| EP1700922B1 (en) | 2005-03-10 | 2016-08-24 | Roche Diagnostics GmbH | 3-Substituted 5-Nitroindole derivatives and labeled oligonucleotide probes containing them |
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|---|---|---|---|---|
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| FR2519005B1 (fr) * | 1981-12-29 | 1985-10-25 | Pasteur Institut | Fragments d'adn marques a l'une au moins de leurs extremites par des ribonucleotides modifies reconnaissables par des molecules affines et procede pour realiser une analyse de tels fragments d'adn |
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-
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- 1984-04-12 DE DE84104165T patent/DE3486175T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-12 JP JP59074800A patent/JP2595201B2/ja not_active Expired - Lifetime
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-
1988
- 1988-12-20 AU AU27091/88A patent/AU2709188A/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| THE JOURNAL OF CELL BIOLOGY=1982 * |
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| JPS62502357A (ja) * | 1985-03-15 | 1987-09-10 | サマ−トン，ジエ−ムス | ポリヌクレオチド測定試薬と方法 |
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