JPH07194398A - 核酸標識のための安定な組成物 - Google Patents
核酸標識のための安定な組成物Info
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- JPH07194398A JPH07194398A JP6257160A JP25716094A JPH07194398A JP H07194398 A JPH07194398 A JP H07194398A JP 6257160 A JP6257160 A JP 6257160A JP 25716094 A JP25716094 A JP 25716094A JP H07194398 A JPH07194398 A JP H07194398A
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
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- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
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- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6846—Common amplification features
Abstract
(57)【要約】
【構成】 核酸を標識するための酵素および反応緩衝液
を含有する組成物であって、反応に必要な成分が混合さ
れた形態でかつ液体として室温から約−２０℃の間にて
容器に存在することを特徴とする組成物および核酸を標
識するための酵素、少なくとも１つのヌクレオシドトリ
ホスフェートおよび反応緩衝液を含有する組成物であっ
て、成分が混合された形態でかつ液体として室温から約
−２０℃の間にて反応容器に存在することを特徴とする
組成物。 【効果】 本発明によれば、−２０℃から室温の温度範
囲で保存すると長期間安定である、核酸またはヌクレオ
チドを酵素的に放射性または非放射性標識するための成
分からなる組成物が提供される。
を含有する組成物であって、反応に必要な成分が混合さ
れた形態でかつ液体として室温から約−２０℃の間にて
容器に存在することを特徴とする組成物および核酸を標
識するための酵素、少なくとも１つのヌクレオシドトリ
ホスフェートおよび反応緩衝液を含有する組成物であっ
て、成分が混合された形態でかつ液体として室温から約
−２０℃の間にて反応容器に存在することを特徴とする
組成物。 【効果】 本発明によれば、−２０℃から室温の温度範
囲で保存すると長期間安定である、核酸またはヌクレオ
チドを酵素的に放射性または非放射性標識するための成
分からなる組成物が提供される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸を標識する反応に
必要な成分のすべてが混合物中に液体の状態で存在する
組成物に関する。
必要な成分のすべてが混合物中に液体の状態で存在する
組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】放射
性（たとえば、32Ｐ、35Ｓまたは 3Ｈなどを用いて）ま
たは非放射性（たとえば、ジゴキシゲニン（以下、ＤＩ
Ｇと略す）、ビオチン、フルオレセイン、ローダミンま
たは７−アミノ−４−メチルクマリン−３−カルボン酸
（７−ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ
−３−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（以下、ＡＭ
ＣＡと略す）などを用いて）に標識した核酸（ＤＮＡま
たはＲＮＡ）の調製については多くの方法が知られてい
る。たとえば、ニック トランスレーション（リグバイ
ピー ダブリュー ジェイ（Ｒｉｇｂｙ，Ｐ．Ｗ．
Ｊ．）ら、ジャーナル オブ モレキュラー バイオロ
ジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１３３、２３７〜２５
１頁（１９７７）参照）、ランダムプライムＤＮＡ標識
（フェインバーグ エイ ピーおよびボーゲルスタイン
ビー（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ Ｖｏｇｅ
ｌｓｔｅｉｎ，Ｂ）、アナリティカル バイオケミスト
リー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１３２、６〜１３
頁（１９８３）ならびにフェインバーグ エイ ピーお
よびボーゲルスタイン ビー、アナリティカル バイオ
ケミストリー １３７、２６６〜２６７頁（１９８４）
参照）、ポリメラーゼ チェイン リアクション（以
下、ＰＣＲと略す）（サイキアール ケイ（Ｓａｉｋ
ｉ，Ｒ．Ｋ．）ら、サイエンス ２３９、４８９〜４９
１頁（１９８５）ならびにリオン ティーおよびハッス
オー エイ（Ｌｉｏｎ，Ｔ．ａｎｄ Ｈａａｓ，Ｏ．
Ａ．）、アナリティカル バイオケミストリー１８８、
３３５〜３３７頁（１９９０）参照）、５′末端標識お
よび３′末端標識（ロイコンドハーリー アール（Ｒｏ
ｙｃｈｏｎｄｈｕｒｙ，Ｒ）ら、ヌクル．アシッズ．レ
ス．（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ）６、１３２３〜
１３３３頁（１９７９）参照）ならびにｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ−ＲＮＡ標識（メルトン ディー エイ（Ｍｅｌｔｏ
ｎ，Ｄ．Ａ．）プロシーティング オブ ナショナル
アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユナイテッ
ド ステイト オブ アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８２、１４４〜１４８頁（１
９８５）参照）などがあげられる。
性（たとえば、32Ｐ、35Ｓまたは 3Ｈなどを用いて）ま
たは非放射性（たとえば、ジゴキシゲニン（以下、ＤＩ
Ｇと略す）、ビオチン、フルオレセイン、ローダミンま
たは７−アミノ−４−メチルクマリン−３−カルボン酸
（７−ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ
−３−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（以下、ＡＭ
ＣＡと略す）などを用いて）に標識した核酸（ＤＮＡま
たはＲＮＡ）の調製については多くの方法が知られてい
る。たとえば、ニック トランスレーション（リグバイ
ピー ダブリュー ジェイ（Ｒｉｇｂｙ，Ｐ．Ｗ．
Ｊ．）ら、ジャーナル オブ モレキュラー バイオロ
ジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１３３、２３７〜２５
１頁（１９７７）参照）、ランダムプライムＤＮＡ標識
（フェインバーグ エイ ピーおよびボーゲルスタイン
ビー（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ Ｖｏｇｅ
ｌｓｔｅｉｎ，Ｂ）、アナリティカル バイオケミスト
リー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１３２、６〜１３
頁（１９８３）ならびにフェインバーグ エイ ピーお
よびボーゲルスタイン ビー、アナリティカル バイオ
ケミストリー １３７、２６６〜２６７頁（１９８４）
参照）、ポリメラーゼ チェイン リアクション（以
下、ＰＣＲと略す）（サイキアール ケイ（Ｓａｉｋ
ｉ，Ｒ．Ｋ．）ら、サイエンス ２３９、４８９〜４９
１頁（１９８５）ならびにリオン ティーおよびハッス
オー エイ（Ｌｉｏｎ，Ｔ．ａｎｄ Ｈａａｓ，Ｏ．
Ａ．）、アナリティカル バイオケミストリー１８８、
３３５〜３３７頁（１９９０）参照）、５′末端標識お
よび３′末端標識（ロイコンドハーリー アール（Ｒｏ
ｙｃｈｏｎｄｈｕｒｙ，Ｒ）ら、ヌクル．アシッズ．レ
ス．（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ）６、１３２３〜
１３３３頁（１９７９）参照）ならびにｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ−ＲＮＡ標識（メルトン ディー エイ（Ｍｅｌｔｏ
ｎ，Ｄ．Ａ．）プロシーティング オブ ナショナル
アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユナイテッ
ド ステイト オブ アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８２、１４４〜１４８頁（１
９８５）参照）などがあげられる。
【０００３】前記方法を行うために必要な物質、たとえ
ば酵素、緩衝液、安定剤、ヌクレオチド、界面活性剤な
どは商業的に利用されうる。
ば酵素、緩衝液、安定剤、ヌクレオチド、界面活性剤な
どは商業的に利用されうる。
【０００４】さらに、ＤＮＡの配列決定またはＲＮＡ合
成が行われるばあいには、ＤＮＡの配列決定のばあいに
は産生物による抑制（ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔ
ｉｏ）を少なくすることによってレーンを一様に濃く
し、ＲＮＡ合成のばあいには高生産とするために無機ピ
ロホスファターゼもまた時々用いられてもよい（テーバ
ー エスおよびリチャードソン シー シー（Ｔａｂｏ
ｒ，Ｓ．ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｃ．）ジ
ャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６５、８３２２〜８３２８頁
（１９９０）ならびにカンニンガム ピー アールおよ
びオフンガード ジェイ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｐ．
Ｒ．ａｎｄ Ｏｆｅｎｇａｒｄ，Ｊ．）バイオ テクニ
ックス（Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｓｅ）９、７１３〜
７１４頁（１９９０）参照）。
成が行われるばあいには、ＤＮＡの配列決定のばあいに
は産生物による抑制（ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔ
ｉｏ）を少なくすることによってレーンを一様に濃く
し、ＲＮＡ合成のばあいには高生産とするために無機ピ
ロホスファターゼもまた時々用いられてもよい（テーバ
ー エスおよびリチャードソン シー シー（Ｔａｂｏ
ｒ，Ｓ．ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｃ．）ジ
ャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６５、８３２２〜８３２８頁
（１９９０）ならびにカンニンガム ピー アールおよ
びオフンガード ジェイ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｐ．
Ｒ．ａｎｄ Ｏｆｅｎｇａｒｄ，Ｊ．）バイオ テクニ
ックス（Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｓｅ）９、７１３〜
７１４頁（１９９０）参照）。
【０００５】しかしながら、前記酵素的標識法のすべて
に共通する欠点は、種々の反応成分が個々に販売されて
おり（または使用者よって調製され）、別個の容器に保
存されなければならないということである。したがっ
て、各試薬およびキットの使用者は所望の標識実験に必
要な多種の成分をまず解凍し、すべての成分を反応容器
にピペッティングしなければならない（すなわち、実際
の実験の開始が遅れる）。ランダムプライム標識実験で
は、たとえば標識される基質のＤＮＡに対して３種のさ
らなる成分（ヌクレオチド、緩衝化したヘキサヌクレオ
チドミックス（ランダムプライマー）およびクレノー酵
素）を個々に加えなければならない。ＤＮＡに対して通
常は３種の成分（ヌクレオチド、緩衝液および酵素）を
個々に添加する必要のある、前記のほかの酵素的反応に
も同様のことがあてはまる。各々比較的少量（１〜５μ
ｌ）のピペッティングを再現することが困難なので、こ
の手順によれば作業および時間が集中的にならないばか
りでなく、誤差の影響も受けやすくなる。したがって、
各々きわめて少量の成分がヒペッティングによって添加
されるばあいは、標識された核酸の産生量は大きくばら
ついてしまう（±５０％）。
に共通する欠点は、種々の反応成分が個々に販売されて
おり（または使用者よって調製され）、別個の容器に保
存されなければならないということである。したがっ
て、各試薬およびキットの使用者は所望の標識実験に必
要な多種の成分をまず解凍し、すべての成分を反応容器
にピペッティングしなければならない（すなわち、実際
の実験の開始が遅れる）。ランダムプライム標識実験で
は、たとえば標識される基質のＤＮＡに対して３種のさ
らなる成分（ヌクレオチド、緩衝化したヘキサヌクレオ
チドミックス（ランダムプライマー）およびクレノー酵
素）を個々に加えなければならない。ＤＮＡに対して通
常は３種の成分（ヌクレオチド、緩衝液および酵素）を
個々に添加する必要のある、前記のほかの酵素的反応に
も同様のことがあてはまる。各々比較的少量（１〜５μ
ｌ）のピペッティングを再現することが困難なので、こ
の手順によれば作業および時間が集中的にならないばか
りでなく、誤差の影響も受けやすくなる。したがって、
各々きわめて少量の成分がヒペッティングによって添加
されるばあいは、標識された核酸の産生量は大きくばら
ついてしまう（±５０％）。
【０００６】したがって、このような試薬およびキット
の製造の際には、反応成分を個々に存在させるために、
数種の成分を含有するキットおよびセット（複数のボト
ルまたは容器）が製造され、集められそして保存されな
ければならないこととなる。このことにより、材料、包
装、保存および作業に対する要求が増大する。また、使
用者は保存に必要な収容能（通常、−２０℃の冷凍装
置）を備えなければならない。
の製造の際には、反応成分を個々に存在させるために、
数種の成分を含有するキットおよびセット（複数のボト
ルまたは容器）が製造され、集められそして保存されな
ければならないこととなる。このことにより、材料、包
装、保存および作業に対する要求が増大する。また、使
用者は保存に必要な収容能（通常、−２０℃の冷凍装
置）を備えなければならない。
【０００７】ランダムプライム標識法では「レディー−
トゥー−ゴー（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｇｏ）」キット（フ
ァルマシア製）を用いることが知られている。このキッ
トは前もって混合された形態ですべての反応成分を含有
し、個々の反応混合物を調製するために成分はすでに一
定量に分割されており、乾燥して安定になっている（ガ
ラス状または無定形の状態で）。しかしながら、この形
態には、調製される混合物のサイズおよびガラス状また
は無定形の成分が溶解するのに必要な時間に対して順応
性がないという欠点がある。この欠点により操作全体が
遅れ、その再現性も失われる。
トゥー−ゴー（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｇｏ）」キット（フ
ァルマシア製）を用いることが知られている。このキッ
トは前もって混合された形態ですべての反応成分を含有
し、個々の反応混合物を調製するために成分はすでに一
定量に分割されており、乾燥して安定になっている（ガ
ラス状または無定形の状態で）。しかしながら、この形
態には、調製される混合物のサイズおよびガラス状また
は無定形の成分が溶解するのに必要な時間に対して順応
性がないという欠点がある。この欠点により操作全体が
遅れ、その再現性も失われる。
【０００８】また、以下のようなほかの欠点もある。放
射性標識が用いられるばあいには（放射性ヌクレオチド
の６０％より多くが３０分間以内に取り込まれる）、ラ
ンダムプライム反応がすでに完全に有効であり、さらに
再現性、反応速度および収量も最適化されることができ
た。しかしながら鋳型ＤＮＡが自然に復元することによ
り、標識産物が少量となってしまうことが理論的には可
能である。復元は時間と温度に依存する。数種の成分を
添加するには時間が必要であり、したがって復元の危険
が伴なう。
射性標識が用いられるばあいには（放射性ヌクレオチド
の６０％より多くが３０分間以内に取り込まれる）、ラ
ンダムプライム反応がすでに完全に有効であり、さらに
再現性、反応速度および収量も最適化されることができ
た。しかしながら鋳型ＤＮＡが自然に復元することによ
り、標識産物が少量となってしまうことが理論的には可
能である。復元は時間と温度に依存する。数種の成分を
添加するには時間が必要であり、したがって復元の危険
が伴なう。
【０００９】したがって、本発明の目的は前記欠点を排
除し、使用者が１回のピペッティング操作で一定量のＤ
ＮＡの標識混合物を加えるだけとするために、すでに前
もって混合されたすべての反応成分を液体の形態で提供
することを目的とする。すなわち、本発明は最適な混合
比で１つの容器に入っている成分からなる組成物を提供
することを目的とする。
除し、使用者が１回のピペッティング操作で一定量のＤ
ＮＡの標識混合物を加えるだけとするために、すでに前
もって混合されたすべての反応成分を液体の形態で提供
することを目的とする。すなわち、本発明は最適な混合
比で１つの容器に入っている成分からなる組成物を提供
することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、核酸を標識す
るための酵素および反応緩衝液を含有する組成物であっ
て、反応に必要な成分が混合された形態でかつ液体とし
て室温から約−２０℃の間にて容器に存在することを特
徴とする組成物および核酸を標識するための酵素、少な
くとも１つのヌクレオシドトリホスフェートおよび反応
緩衝液を含有する組成物であって、成分が混合された形
態でかつ液体として室温から約−２０℃の間にて反応容
器に存在することを特徴とする組成物を提供する。
るための酵素および反応緩衝液を含有する組成物であっ
て、反応に必要な成分が混合された形態でかつ液体とし
て室温から約−２０℃の間にて容器に存在することを特
徴とする組成物および核酸を標識するための酵素、少な
くとも１つのヌクレオシドトリホスフェートおよび反応
緩衝液を含有する組成物であって、成分が混合された形
態でかつ液体として室温から約−２０℃の間にて反応容
器に存在することを特徴とする組成物を提供する。
【００１１】
【実施例】前記目的は、最適な混合比、安定な形態およ
びすでに混合された状態で、前記標識方法に必要な成分
をすべて含有する組成物を提供することによって達成さ
れる。好ましい方法としては、３０％（ｖ／ｖ）のグリ
セリンをこの混合物に添加することがあげられる。４０
〜５０％（ｖ／ｖ）のグリセリンの添加がとくに適する
こが証明されている。この混合物は、室温（〜２５℃）
から−２０℃のあいだで保存すると安定であり、−２０
〜４℃で保存するばあいにはとくに高い安定性を示す。
びすでに混合された状態で、前記標識方法に必要な成分
をすべて含有する組成物を提供することによって達成さ
れる。好ましい方法としては、３０％（ｖ／ｖ）のグリ
セリンをこの混合物に添加することがあげられる。４０
〜５０％（ｖ／ｖ）のグリセリンの添加がとくに適する
こが証明されている。この混合物は、室温（〜２５℃）
から−２０℃のあいだで保存すると安定であり、−２０
〜４℃で保存するばあいにはとくに高い安定性を示す。
【００１２】個々の成分は本質的には、標識するための
酵素、反応緩衝液、ヌクレオシドトリホスフェート（ヌ
クレオシドトリホスフェートとはリボヌクレオシドトリ
ホスフェート、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェ
ートまたはジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェー
トを意味する）を含有し、要すれば酵素反応に通常用い
られるほかの添加物を含有する。
酵素、反応緩衝液、ヌクレオシドトリホスフェート（ヌ
クレオシドトリホスフェートとはリボヌクレオシドトリ
ホスフェート、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェ
ートまたはジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェー
トを意味する）を含有し、要すれば酵素反応に通常用い
られるほかの添加物を含有する。
【００１３】標識するための酵素としては、種々のＤＮ
Ａポリメラーゼ（クレノー、大腸菌のＤＮＡポリメラー
ゼ ホロ酵素、Ｔ４、Ｓｐｎ、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｔ
ｈ、Ｂｃａなど）、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ３、Ｔ７ま
たはＳＰ６など）または末端トランスフェラーゼなどが
あげられる。
Ａポリメラーゼ（クレノー、大腸菌のＤＮＡポリメラー
ゼ ホロ酵素、Ｔ４、Ｓｐｎ、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｔ
ｈ、Ｂｃａなど）、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ３、Ｔ７ま
たはＳＰ６など）または末端トランスフェラーゼなどが
あげられる。
【００１４】反応緩衝液を調製するにはｐＨ約７．０で
緩衝作用を有する緩衝物質を用いるのが好ましい。
緩衝作用を有する緩衝物質を用いるのが好ましい。
【００１５】とくに適する緩衝物質はｐＨ６．５〜８．
５の緩衝能を有するＨＥＰＥＳ、トリス（ＴＲＩＳ）、
ＣＡＰＳおよびＴＡＰＳなどであり、緩衝液としてはリ
ン酸緩衝液も適する。
５の緩衝能を有するＨＥＰＥＳ、トリス（ＴＲＩＳ）、
ＣＡＰＳおよびＴＡＰＳなどであり、緩衝液としてはリ
ン酸緩衝液も適する。
【００１６】２価の陽イオンとの塩もこのましい。
【００１７】ヌクレオシドトリホスフェートとしては、
たとえばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、Ａ
ＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴ
Ｐ、ｄｄＴＴＰまたは適切に修飾されたヌクレオシドト
リホスフェート、たとえば対応するデアザ化合物などが
あげられる。
たとえばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、Ａ
ＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴ
Ｐ、ｄｄＴＴＰまたは適切に修飾されたヌクレオシドト
リホスフェート、たとえば対応するデアザ化合物などが
あげられる。
【００１８】さらに、混合物は、ウシ血清アルブミン
（以下、ＢＳＡと略す）もしくはゼラチン、スペルミジ
ン、ジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと略す）（ジチ
オエリトリトール（以下、ＤＴＥと略す）またはメルカ
プトエタノールでもよい）などの安定剤および／または
トリトン Ｘ−１００、テシット（Ｔｈｅｓｉｔ）、ト
ウィーン２０、ＮＰ４０およびＢｒｉｊ３５などの界面
活性剤、またはＲＮアーゼ阻害剤のような阻害物質を含
有してもよい。標識反応の特異性に依存して、ランダム
プライマー（とくに１２−ｍｅｒ、１５−ｍｅｒ、９−
ｍｅｒおよび６−ｍｅｒ）もしくは配列に特異的なプラ
イマー、標識されたヌクレオシドトリホスフェート、た
とえば、ＤＩＧ、ビオチン、フルオレセイン、ローダミ
ンまたはＡＭＣＡなどで標識されたヌクレオシドトリホ
スフェートまたは32Ｐ、35Ｓもしくは 3Ｈなどで放射性
に標識されたヌクレオキドトリホスフェートを添加する
ことが可能である。
（以下、ＢＳＡと略す）もしくはゼラチン、スペルミジ
ン、ジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと略す）（ジチ
オエリトリトール（以下、ＤＴＥと略す）またはメルカ
プトエタノールでもよい）などの安定剤および／または
トリトン Ｘ−１００、テシット（Ｔｈｅｓｉｔ）、ト
ウィーン２０、ＮＰ４０およびＢｒｉｊ３５などの界面
活性剤、またはＲＮアーゼ阻害剤のような阻害物質を含
有してもよい。標識反応の特異性に依存して、ランダム
プライマー（とくに１２−ｍｅｒ、１５−ｍｅｒ、９−
ｍｅｒおよび６−ｍｅｒ）もしくは配列に特異的なプラ
イマー、標識されたヌクレオシドトリホスフェート、た
とえば、ＤＩＧ、ビオチン、フルオレセイン、ローダミ
ンまたはＡＭＣＡなどで標識されたヌクレオシドトリホ
スフェートまたは32Ｐ、35Ｓもしくは 3Ｈなどで放射性
に標識されたヌクレオキドトリホスフェートを添加する
ことが可能である。
【００１９】本発明の組成物は、好都合にも一定の濃度
範囲で種々の成分を好都合に含有する。
範囲で種々の成分を好都合に含有する。
【００２０】標識するための酵素は０．２０〜５ｋＵ／
ｍｌの濃度で用いるのが好ましく、０．５〜２．５ｋＵ
／ｍｌの濃度はさらに好ましい。とくに、反応混合物中
に０．５ｋＵ／ｍｌの標識するための酵素が含まれると
好都合であることが証明されている。末端標識のための
末端トランスフェラーゼは本発明の混合物中で約５０〜
５００Ｕ／ｍｌで用いられる。ＰＣＲ用混合物では、適
するポリメラーゼの濃度は５０〜５００Ｕ／ｍｌであ
り、１２５Ｕ／ｍｌが好ましい。
ｍｌの濃度で用いるのが好ましく、０．５〜２．５ｋＵ
／ｍｌの濃度はさらに好ましい。とくに、反応混合物中
に０．５ｋＵ／ｍｌの標識するための酵素が含まれると
好都合であることが証明されている。末端標識のための
末端トランスフェラーゼは本発明の混合物中で約５０〜
５００Ｕ／ｍｌで用いられる。ＰＣＲ用混合物では、適
するポリメラーゼの濃度は５０〜５００Ｕ／ｍｌであ
り、１２５Ｕ／ｍｌが好ましい。
【００２１】緩衝物質の好ましい濃度範囲は５０〜５０
０ｍＭであり、とくに適する濃度は約２５０ｍＭであ
る。ＭｇＣｌ2 のような２価の塩を少なくとも０．１ｍ
Ｍ加えるのもまた好都合である。用いる塩によって最適
濃度は２５〜１００ｍＭであり、ＰＣＲのためには約１
〜２０ｍＭである。
０ｍＭであり、とくに適する濃度は約２５０ｍＭであ
る。ＭｇＣｌ2 のような２価の塩を少なくとも０．１ｍ
Ｍ加えるのもまた好都合である。用いる塩によって最適
濃度は２５〜１００ｍＭであり、ＰＣＲのためには約１
〜２０ｍＭである。
【００２２】ＢＳＡおよびゼラチンは、反応用混合物に
０．１〜５ｍｇ／ｍｌ含まれるのが好ましい。とくに好
ましい濃度は約１ｍｇ／ｍｌである。
０．１〜５ｍｇ／ｍｌ含まれるのが好ましい。とくに好
ましい濃度は約１ｍｇ／ｍｌである。
【００２３】スペルミジンは最大３０ｍＭまでの濃度、
好ましくは１０ｍＭで添加される。メルカプトエタノー
ルまたはほかのＳＨ試薬の濃度は０．１〜３００ｍＭが
可能である。メルカプトエタノールは５〜５０ｍＭの濃
度が好ましく、ジチオスレイトールは１００〜３００ｍ
Ｍが好ましい。
好ましくは１０ｍＭで添加される。メルカプトエタノー
ルまたはほかのＳＨ試薬の濃度は０．１〜３００ｍＭが
可能である。メルカプトエタノールは５〜５０ｍＭの濃
度が好ましく、ジチオスレイトールは１００〜３００ｍ
Ｍが好ましい。
【００２４】前述の界面活性剤の適する濃度は０．０５
〜１．０％であり、とくに０．２５〜０．７５％が好ま
しい。
〜１．０％であり、とくに０．２５〜０．７５％が好ま
しい。
【００２５】種々のランブムプライマーには約１５〜８
０ＯＤ／ｍｌ（ＯＤ：光学密度）の濃度が選ばれる。プ
ライマーの長により、最適の含量は３０〜６０ＯＤ／ｍ
ｌから選ばれる。
０ＯＤ／ｍｌ（ＯＤ：光学密度）の濃度が選ばれる。プ
ライマーの長により、最適の含量は３０〜６０ＯＤ／ｍ
ｌから選ばれる。
【００２６】ヌクレオチドは約２０ｍＭの濃度まで好都
合に添加される。適する濃度は０．０１〜２０ｍＭであ
る。ＲＮＡ標識をのぞくすべての反応には、とくに０．
１〜１．０ｍＭが好ましい。
合に添加される。適する濃度は０．０１〜２０ｍＭであ
る。ＲＮＡ標識をのぞくすべての反応には、とくに０．
１〜１．０ｍＭが好ましい。
【００２７】核酸標識または核酸の合成の際にピロホス
ファターゼを添加することにより、ほかの既知の反応に
対して、反応速度および収量がきわめて増大するという
さらなる利点がもたらされる。１〜１００Ｕ／ｍｌ、好
ましくは１〜５０Ｕ／ｍｌ、とくに好ましくは１．５Ｕ
／ｍｌの酵素が添加される。ＲＮＡ標識では２５Ｕ／ｍ
ｌが適することが証明された。
ファターゼを添加することにより、ほかの既知の反応に
対して、反応速度および収量がきわめて増大するという
さらなる利点がもたらされる。１〜１００Ｕ／ｍｌ、好
ましくは１〜５０Ｕ／ｍｌ、とくに好ましくは１．５Ｕ
／ｍｌの酵素が添加される。ＲＮＡ標識では２５Ｕ／ｍ
ｌが適することが証明された。
【００２８】本発明の組成物にはｐＨ６．５〜８．５お
よび反応温度２５〜４５℃が最適である。熱に安定な酵
素、たとえばＴａｑまたはＴｔｈ−ＤＮＡポリメラーゼ
などが用いられるばあいは、６５〜７５℃が最適温度で
ある。
よび反応温度２５〜４５℃が最適である。熱に安定な酵
素、たとえばＴａｑまたはＴｔｈ−ＤＮＡポリメラーゼ
などが用いられるばあいは、６５〜７５℃が最適温度で
ある。
【００２９】多数の異なる成分の混合物が全く安定であ
ることは驚くべきことであった。とくに、放射性および
非放射性ランダムプライム標識法のための混合物はより
長期間（１２カ月）にわたって安定であることが証明さ
れた。このばあいの保存温度は−２０〜４℃である。
ることは驚くべきことであった。とくに、放射性および
非放射性ランダムプライム標識法のための混合物はより
長期間（１２カ月）にわたって安定であることが証明さ
れた。このばあいの保存温度は−２０〜４℃である。
【００３０】また、安定で液体の「レディー−フォー−
ユース（ｒｅａｄｙ−ｆｏｒ−ｕｓｅ）」である本発明
の組成物は酵素を用いる核酸標識法、すなわちニックト
ランスレーション、３′−末端または５′−末端標識Ｐ
ＣＲ反応ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏトランスクリプショ
ンのために調製することもできる。
ユース（ｒｅａｄｙ−ｆｏｒ−ｕｓｅ）」である本発明
の組成物は酵素を用いる核酸標識法、すなわちニックト
ランスレーション、３′−末端または５′−末端標識Ｐ
ＣＲ反応ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏトランスクリプショ
ンのために調製することもできる。
【００３１】個々の反応のためには、通常４〜２０μｌ
の反応用溶液がＤＮＡサンプルに対して通常分注され
る。反応体積は２０〜１００μｌがとくに適する。ＤＮ
Ａサンプルは直線状および高次らせん状とされうるＤＮ
Ａを５０００ｎｇまで含有することができる。ランダム
プライム標識が用いられるばあいは、１００〜７０００
０ベース（ｂ）が好ましい。
の反応用溶液がＤＮＡサンプルに対して通常分注され
る。反応体積は２０〜１００μｌがとくに適する。ＤＮ
Ａサンプルは直線状および高次らせん状とされうるＤＮ
Ａを５０００ｎｇまで含有することができる。ランダム
プライム標識が用いられるばあいは、１００〜７０００
０ベース（ｂ）が好ましい。
【００３２】以下に実施例をあげて本発明をさらに詳細
に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるもの
ではない。
に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるもの
ではない。
【００３３】実施例１ ＤＮＡの放射性標識に用いる高プライム（Ｈｉｇｈ ｐ
ｒｉｍｅ）の調製 放射性標識のための組成物（５倍濃縮混合物（以下、高
プライムと称する））を以下の組成で調製した。
ｒｉｍｅ）の調製 放射性標識のための組成物（５倍濃縮混合物（以下、高
プライムと称する））を以下の組成で調製した。
【００３４】 組 成 成 分 濃 度 Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０） ２５０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５０ｍＭ ＤＴＥ ０．５ｍＭ スペルミジン １０ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ 各０．１２５ｍＭ トリトン Ｘ−１００ ０．５％ 無機ピロホスファターゼ ２．５Ｕ／ｍｌ ウシ血清アルブミン １ｍｇ／ｍｌ （分子生物学的に（ｍｏｌ．ｂｉｏｌ）高純度のもの） ランダムプライマー ３１．４ＯＤ／ｍｌ クレノーポリメラーゼ １０００Ｕ／ｍｌ グリセリン ４５％（ｖ／ｖ） 調製は通常の手順で行われた。
【００３５】試験例１ 通常のランダムプライム反応と高プライムを用いる反応
との比較 ２５ｎｇの ＤＮＡを１１μｌの滅菌水の入ったサルス
テット（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）試薬容器中で煮沸し、短時
間氷冷することによって変性させた。溶液を少し遠心分
離したのちに、実施例１で調製した高プライム４μｌと
５μｌ（５０μＣｉ）のα−32ＰｄＣＴＰ（３０００Ｃ
ｉ／ｍｍｏｌ）を加え、３７℃でインキュベートした。
反応混合液から１μｌを取り出し、トリクロロ酢酸で沈
澱させたのち、新たに合成されたＤＮＡへの放射能の取
り込みを測定した。
との比較 ２５ｎｇの ＤＮＡを１１μｌの滅菌水の入ったサルス
テット（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）試薬容器中で煮沸し、短時
間氷冷することによって変性させた。溶液を少し遠心分
離したのちに、実施例１で調製した高プライム４μｌと
５μｌ（５０μＣｉ）のα−32ＰｄＣＴＰ（３０００Ｃ
ｉ／ｍｍｏｌ）を加え、３７℃でインキュベートした。
反応混合液から１μｌを取り出し、トリクロロ酢酸で沈
澱させたのち、新たに合成されたＤＮＡへの放射能の取
り込みを測定した。
【００３６】ＢＭランダムプライムＤＮＡラベリングキ
ット（ベーリンガー マンハイムゲゼルシャフト ミッ
ト ベシュレンクテル ハフツング製、ドイツ国、カタ
ログ番号 １００４７６０）を用いて、通常のランダム
プライム反応を参照のために行なった。これを行うため
に２５ｎｇのＤＮＡを９μｌの水中で前述と同様に変性
させた。続いて、３μｌの前もって混合されたｄＡＴ
Ｐ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（各０．１６６ｍＭ）、１
０倍濃縮の反応用緩衝液中のヘキサヌクレオチド混合物
２μｌ、５μｌ（５０μＣｉ）のα−32ＰｄＣＴＰ（３
０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および１μｌ（２単位）のクレ
ノーポリメラーゼを混合した。前述のように一定量を取
り、取り込まれた放射能を測定した。
ット（ベーリンガー マンハイムゲゼルシャフト ミッ
ト ベシュレンクテル ハフツング製、ドイツ国、カタ
ログ番号 １００４７６０）を用いて、通常のランダム
プライム反応を参照のために行なった。これを行うため
に２５ｎｇのＤＮＡを９μｌの水中で前述と同様に変性
させた。続いて、３μｌの前もって混合されたｄＡＴ
Ｐ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（各０．１６６ｍＭ）、１
０倍濃縮の反応用緩衝液中のヘキサヌクレオチド混合物
２μｌ、５μｌ（５０μＣｉ）のα−32ＰｄＣＴＰ（３
０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および１μｌ（２単位）のクレ
ノーポリメラーゼを混合した。前述のように一定量を取
り、取り込まれた放射能を測定した。
【００３７】表１、図１および２に測定結果を示す。図
１は高プライムを用いてＤＮＡを放射性標識で標識した
ばあいと通常のランダムプライマー法を用いて同様にＤ
ＮＡの標識を行ったばあいのそれぞれの放射能の取り込
み率（％）とインキュベーション時間（分）との関係
を、図２はそれぞれの放射能の取り込み量（×１０9 ｄ
ｐｍ／μｇ）とインキュベーション時間（分）との関係
を示すグラフである。高プライムを用いる反応の方がよ
り早くおこり、放射能の取り込みが増加した。
１は高プライムを用いてＤＮＡを放射性標識で標識した
ばあいと通常のランダムプライマー法を用いて同様にＤ
ＮＡの標識を行ったばあいのそれぞれの放射能の取り込
み率（％）とインキュベーション時間（分）との関係
を、図２はそれぞれの放射能の取り込み量（×１０9 ｄ
ｐｍ／μｇ）とインキュベーション時間（分）との関係
を示すグラフである。高プライムを用いる反応の方がよ
り早くおこり、放射能の取り込みが増加した。
【００３８】
【表１】
【００３９】実施例２ ＤＮＡの非放射性標識に用いる高プライムの調製 非放射性標識（ＤＩＧ、ビオチン、フルオレセイン、ロ
ーダミンおよびＡＭＣＡ）を用いてＤＮＡを標識するた
めの各組成物（各高プライム）を以下の組成で調製し
た。
ーダミンおよびＡＭＣＡ）を用いてＤＮＡを標識するた
めの各組成物（各高プライム）を以下の組成で調製し
た。
【００４０】 組 成 成 分 濃 度 Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０） ２５０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５０ｍＭ ＤＴＥ ０．５ｍＭ スペルミジン １０ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ 各１ｍＭ ｄＴＴＰ ０．６５ｍＭ ＤＩＧ−ｄＵＴＰ、ビオチン−ｄＵＴＰ、 フルオレセイン−ｄＵＴＰ、ローダミン− ｄＵＴＰまたはＡＭＣＡ−ｄＵＴＰ ０．３５ｍＭ トリトン Ｘ−１００ ０．５％ 無機ピロホスファターゼ ２．５Ｕ／ｍｌ ウシ血清アルブミン １ｍｇ／ｍｌ （分子生物学的に高純度のもの） ランダムプライマー ３１．４ＯＤ／ｍｌ クレノーポリメラーゼ １０００Ｕ／ｍｌ グリセリン ４５％（ｖ／ｖ） ＤＮＡ量 約１０００ｎｇ 調製は通常の手順で行われた。
【００４１】試験例２ 通常のＤＩＧ−ランダムプライム法とＤＩＧ−高プライ
ムを用いる反応との比較１μｇのλＤＮＡを１６μｌの
滅菌水の入ったサルステット反応容器中で煮沸し、つい
で氷冷することによって変性させた。溶液を少し遠心分
離したのちに、実施例２で調製したＤＩＧを含有する高
プライム（ＤＩＧ−高プライム）４μｌを加え、３７℃
でインキュベーションした。これを定量化するめに、１
μｌ（１０μＣｉ）のα−32ＰｄＣＴＰを平行するバッ
チに加えた。異なる時間間隔で反応混合液から１μｌを
取り、トリクロロ酢酸で沈澱させたのち、新たに合成さ
れたＤＮＡへの放射能の取り込みを測定した。
ムを用いる反応との比較１μｇのλＤＮＡを１６μｌの
滅菌水の入ったサルステット反応容器中で煮沸し、つい
で氷冷することによって変性させた。溶液を少し遠心分
離したのちに、実施例２で調製したＤＩＧを含有する高
プライム（ＤＩＧ−高プライム）４μｌを加え、３７℃
でインキュベーションした。これを定量化するめに、１
μｌ（１０μＣｉ）のα−32ＰｄＣＴＰを平行するバッ
チに加えた。異なる時間間隔で反応混合液から１μｌを
取り、トリクロロ酢酸で沈澱させたのち、新たに合成さ
れたＤＮＡへの放射能の取り込みを測定した。
【００４２】通常のＤＩＧ−ランダムプライマー反応
を、ＢＭ ＤＩＧ ＤＮＡ 標識キット（ベーリンガー
マンハイム ゲゼルシャフト ミット ベシュレンク
テルハフツング製、カタログ番号１１７５０３３）を用
いて行なった。これを行なうために１μｇのＤＮＡを前
述と同様にして１４μｌの水中で変性させた。続いて、
２μｌの前もって混合されたＤＩＧ−ｄＮＴＰ標識混合
物（１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄ
ＧＴＰ、０．６５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．３５ｍＭ ＤＩ
Ｇ−ｄＵＴＰ）、１０倍濃縮反応用緩衝液中のヘキサヌ
クレオチド混合物１２μｌおよび１μｌ（２単位）のク
レノーポリメラーゼを混合した。ほかの平行するバッチ
は放射性トレーサーを用いて調製した。前述のように一
定量を採り、取り込まれた放射能を測定した。
を、ＢＭ ＤＩＧ ＤＮＡ 標識キット（ベーリンガー
マンハイム ゲゼルシャフト ミット ベシュレンク
テルハフツング製、カタログ番号１１７５０３３）を用
いて行なった。これを行なうために１μｇのＤＮＡを前
述と同様にして１４μｌの水中で変性させた。続いて、
２μｌの前もって混合されたＤＩＧ−ｄＮＴＰ標識混合
物（１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄ
ＧＴＰ、０．６５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．３５ｍＭ ＤＩ
Ｇ−ｄＵＴＰ）、１０倍濃縮反応用緩衝液中のヘキサヌ
クレオチド混合物１２μｌおよび１μｌ（２単位）のク
レノーポリメラーゼを混合した。ほかの平行するバッチ
は放射性トレーサーを用いて調製した。前述のように一
定量を採り、取り込まれた放射能を測定した。
【００４３】表２および３ならびに図３、４、５および
６に測定結果を示す。表２には各インキュベート時間に
おける放射能の取り込み率を、表３には各インキュベー
ト時間における標識されたＤＮＡ量を示す。図３および
４は本発明の組成物であるＤＩＧ−高プライムを用いて
ＤＮＡを標識したばあいと通常のＤＩＧ−ランダムプラ
イム法を用いて同様にＤＮＡを標識したばあいのそれぞ
れについて放射能の取り込み率（％）とインキュベーシ
ョン時間（分）との関係を示す折れ線グラフおよび棒グ
ラフである。図５および６は、図２および図３の縦軸を
標識されたＤＮＡ量に置換したものである。高プライム
を用いる反応がより速く生じ、通常の反応に比べて相当
増量したＤＮＡが生じた。
６に測定結果を示す。表２には各インキュベート時間に
おける放射能の取り込み率を、表３には各インキュベー
ト時間における標識されたＤＮＡ量を示す。図３および
４は本発明の組成物であるＤＩＧ−高プライムを用いて
ＤＮＡを標識したばあいと通常のＤＩＧ−ランダムプラ
イム法を用いて同様にＤＮＡを標識したばあいのそれぞ
れについて放射能の取り込み率（％）とインキュベーシ
ョン時間（分）との関係を示す折れ線グラフおよび棒グ
ラフである。図５および６は、図２および図３の縦軸を
標識されたＤＮＡ量に置換したものである。高プライム
を用いる反応がより速く生じ、通常の反応に比べて相当
増量したＤＮＡが生じた。
【００４４】
【表２】
【００４５】
【表３】
【００４６】トレーサーを用いた実験からえられたデー
タはスポットテストにより確かめられた。このスポット
テストとは、希釈された標識反応混合液１μｌの一部を
ナイロン膜にスポットし、ＵＶ光で固定し、抗−ジゴキ
シゲニン アルカリホスファターゼおよびニトロブルー
テトラゾリウム（ＤＩＧ核酸検出キット、ベーリンガマ
ンハイム ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル
ハフツング製、カタログ番号１１７５０４１）を用い
て行われ、ＤＩＧで標識された核酸が検出された。
タはスポットテストにより確かめられた。このスポット
テストとは、希釈された標識反応混合液１μｌの一部を
ナイロン膜にスポットし、ＵＶ光で固定し、抗−ジゴキ
シゲニン アルカリホスファターゼおよびニトロブルー
テトラゾリウム（ＤＩＧ核酸検出キット、ベーリンガマ
ンハイム ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル
ハフツング製、カタログ番号１１７５０４１）を用い
て行われ、ＤＩＧで標識された核酸が検出された。
【００４７】ＤＩＧ−高プライムを用いる反応と通常の
ＤＩＧ−ランダムプライム反応とを直接比較すると、Ｄ
ＩＧ−高プライムを用いる反応の方がより強いシグナル
を産生することがわかる。このことは本発明の組成物で
ある高プライムを用いる反応のほうが、より多くの標識
されたＤＮＡを合成しているということを証明してい
る。
ＤＩＧ−ランダムプライム反応とを直接比較すると、Ｄ
ＩＧ−高プライムを用いる反応の方がより強いシグナル
を産生することがわかる。このことは本発明の組成物で
ある高プライムを用いる反応のほうが、より多くの標識
されたＤＮＡを合成しているということを証明してい
る。
【００４８】前記スポットテストのための標識反応は１
μｇの鋳型ＤＮＡを用いて、２０時間、３７℃で行なわ
れた。エタノール沈殿はなかった。一連のスポットはＢ
Ｍナイロン膜（ベーリンガー マンハイム ゲゼルシャ
フト ミット ベシュレンクテル ハフツング製）を用
い、膜へのＵＶの暴露は約１５分間行った。検出は化学
反光により行われた（ヘールケ エイチ ジェイ（Ｈｏ
ｅｌｔｋｅ Ｈ．Ｊ．）ら、バイオ テクニックス１
２、１０４〜１１３頁（１９９２）参照）。
μｇの鋳型ＤＮＡを用いて、２０時間、３７℃で行なわ
れた。エタノール沈殿はなかった。一連のスポットはＢ
Ｍナイロン膜（ベーリンガー マンハイム ゲゼルシャ
フト ミット ベシュレンクテル ハフツング製）を用
い、膜へのＵＶの暴露は約１５分間行った。検出は化学
反光により行われた（ヘールケ エイチ ジェイ（Ｈｏ
ｅｌｔｋｅ Ｈ．Ｊ．）ら、バイオ テクニックス１
２、１０４〜１１３頁（１９９２）参照）。
【００４９】実施例３ ＤＮＡの放射性標識のためのニックトランスレーション
に用いる組成物（５倍濃縮混合物）の調製 ニックトランスレーション法によるＤＮＡの標識を行な
うために、以下の組成からなる組成物を調製した。
に用いる組成物（５倍濃縮混合物）の調製 ニックトランスレーション法によるＤＮＡの標識を行な
うために、以下の組成からなる組成物を調製した。
【００５０】 組 成 成 分 濃 度 トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８） ２５０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ２５ｍＭ ＤＴＴ ５０ｍＭ ＢＳＡ ０．２５ｍｇ／ｍｌ ヌクレオチド： ｄＡＴＰ ０．１ｍＭ ｄＧＴＰ ０．１ｍＭ ｄＴＴＰ ０．１ｍＭ トリトン Ｘ−１００ ０．５％ 無機ピロホスファターゼ ２．５Ｕ／ｍｌ 酵素： ＤＮＡポリメラーゼＩ（温度１５℃で使用） １ｋＵ／ｍｌ ＤＮアーゼＩ ０．１μｇ／ｍｌ グリセリン ４５％ 反応体積 ２０μｌ ＤＮＡ量 １００ｎｇ 調製は通常の手順で行なわれた。
【００５１】試験例３ 放射性標識反応のためのｈｉｇｈニックトランスレーシ
ョン（５倍濃縮された反応用組成物を用いるニックトラ
ンスレーション） 実施例３で調製した５倍濃縮のｈｉｇｈニックトランス
レーション用組成物４μｌと２μｌ（２０μＣｉ）のα
−32ＰｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｏｌ）とを１４μｌ
の滅菌水および１００ｎｇのλＤＮＡの入った反応容器
中に加え、１５℃でインキュベーションを行なった。取
り込みの反応速度は、異なるインキュベーション時間に
反応溶液１μｌを採り、トリクロロ酢酸で沈殿しうるパ
ーセントを測定した。一方、ＢＭニックトランスレーシ
ョンキット（ベーリンガー マンハイム ゲゼルシャフ
ト ミット ベシュレンクテル ハフツング製、カタロ
グ番号９７６７７６）を用いる通常の反応を製造業者の
指示にしたがって参照のために行なった。
ョン（５倍濃縮された反応用組成物を用いるニックトラ
ンスレーション） 実施例３で調製した５倍濃縮のｈｉｇｈニックトランス
レーション用組成物４μｌと２μｌ（２０μＣｉ）のα
−32ＰｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｏｌ）とを１４μｌ
の滅菌水および１００ｎｇのλＤＮＡの入った反応容器
中に加え、１５℃でインキュベーションを行なった。取
り込みの反応速度は、異なるインキュベーション時間に
反応溶液１μｌを採り、トリクロロ酢酸で沈殿しうるパ
ーセントを測定した。一方、ＢＭニックトランスレーシ
ョンキット（ベーリンガー マンハイム ゲゼルシャフ
ト ミット ベシュレンクテル ハフツング製、カタロ
グ番号９７６７７６）を用いる通常の反応を製造業者の
指示にしたがって参照のために行なった。
【００５２】結果は前記試験例１の高プライム試験の結
果と一致した。本発明の組成物である５倍濃縮した混合
物を用いる反応の方がより速く、より高い放射能の取り
込みを行うことがわかる。
果と一致した。本発明の組成物である５倍濃縮した混合
物を用いる反応の方がより速く、より高い放射能の取り
込みを行うことがわかる。
【００５３】実施例４ ＤＮＡの非放射能標識のためのニックトランスレーショ
ンに用いる組成物（５倍濃縮混合物）の調製 以下の組成からなる組成物を調製した。
ンに用いる組成物（５倍濃縮混合物）の調製 以下の組成からなる組成物を調製した。
【００５４】 組 成 成 分 濃 度 トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８） ２５０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ２５ｍＭ ＤＴＴ ５０ｍＭ ＢＳＡ ０．２５ｍｇ／ｍｌ ヌクレオチド： ｄＡＴＰ １ｍＭ ｄＣＴＰ １ｍＭ ｄＧＴＰ １ｍＭ ｄＴＴＰ ０．６５ｍＭ ＤＩＧ−ｄＵＴＰ、ビオチン−ｄＵＴＰ、 フルオレセイン−ｄＵＴＰ、ローダミン− −ｄＵＴＰまたはＡＭＣＡ−ｄＵＴＰ ０．３５ｍＭ トリトン Ｘ−１００ ０．５％ 無機ピロホスファターゼ ２．５Ｕ／ｍｌ ＤＮＡポリメラーゼＩ １ｋＵ／ｍｌ ＤＮアーゼＩ ０．１μｇ／ｍｌ グリセリン ４５％ ＤＮＡ量 １０００ｎｇ 調製は通常の手順で行われた。
【００５５】試験例４ ＤＩＧ−ｈｉｇｈニックトランスレーション：典型的な
反応混合物 試験例３と同様にしてすべてのピペッティング操作を行
った。標識された産物を検出するために、ｄＣＴＰの放
射性化合物を各反応用混合物あたり１μｌ（１０μＣ
ｉ）まで減らして用いた。
反応混合物 試験例３と同様にしてすべてのピペッティング操作を行
った。標識された産物を検出するために、ｄＣＴＰの放
射性化合物を各反応用混合物あたり１μｌ（１０μＣ
ｉ）まで減らして用いた。
【００５６】実施例５ ＰＣＲ用組成物（５倍濃縮混合物（非標識））の調製 以下の組成でＰＣＲ用組成物を調製した。
【００５７】 組 成 成 分 濃 度 トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３） ５０ｍＭ ＴＡＰＳ ＫＣｌ ２５０ｍＭ ヌクレオチド： ｄＡＴＰ １ｍＭ ｄＣＴＰ １ｍＭ ｄＧＴＰ １ｍＭ ｄＴＴＰ １ｍＭ ＭｇＣｌ2 ７．５ｍＭ 安定剤： ０．５％ トウィーン−２０ トリトン Ｘ−１００ Ｔｈｅｓｉｔ ＮＰ（Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ）４０ Ｂｒｉｊｉ３５ オクチルグリコシド Ｔａｑ−ポリメラーゼ １２５Ｕ／ｍｌ グリセリン ５０％ 反応体積 １００μｌ ＤＮＡ量 １０〜１００ｎｇ プライマー 各１μＭ 調製は通常の手順で行われた。
【００５８】試験例５ 標識なしのＰＣＲ反応 ヒトゲノムＤＮＡ１００ｎｇを、特異的なＰＣＲプライ
マー、ヒト遺伝子（のう胞性繊維症、第ＩＸ因子）に対
するプライマー各１μＭおよび実施例５で調製した５倍
濃縮ＰＣＲ用組成物２０μｌが加わった８０μｌの再蒸
留水の入ったサーモサーキュラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃ
ｌｅｒ）中でインキュベートした。
マー、ヒト遺伝子（のう胞性繊維症、第ＩＸ因子）に対
するプライマー各１μＭおよび実施例５で調製した５倍
濃縮ＰＣＲ用組成物２０μｌが加わった８０μｌの再蒸
留水の入ったサーモサーキュラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃ
ｌｅｒ）中でインキュベートした。
【００５９】サイクルのプログラムは、たとえば９５℃
で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間など３０サ
イクルにセットし、最後の５分は７２℃にセットした。
一定量の反応溶液をエチジウムブロミドアガロースゲル
で分析した。
で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間など３０サ
イクルにセットし、最後の５分は７２℃にセットした。
一定量の反応溶液をエチジウムブロミドアガロースゲル
で分析した。
【００６０】試験例６ 非放射性標識（ＤＩＧ）を用いるＰＣＲ １ｍＭｄＴＴＰおよび０．３５ｍＭ ＤＩＧ−ｄＵＴＰ
のかわりに０．６５ｍＭ ｄＴＴＰを含有することのほ
かは前記実施例５と同様の組成の５倍濃縮ＰＣＲ標識用
組成物を調製した。ＤＩＧ−ｄＵＴＰ／ｄＴＴＰの割合
は、０．０５ｍＭのＤＩＧ−ｄＵＴＰと０．９５ｍＭの
ｄＴＴＰを混合するというように変えることができる。
ＰＣＲ反応は試験例５と同様に行なった。ＤＩＧが標識
されたＰＣＲ産物はハイブリダイゼーションサンプルと
して用いるかまたはゲル電気泳動用の膜（ナイロン製、
陽イオンを帯びている）に移して色素または化学発光を
用いる通常のＤＩＧ−検出方法にしたがって検出した。
のかわりに０．６５ｍＭ ｄＴＴＰを含有することのほ
かは前記実施例５と同様の組成の５倍濃縮ＰＣＲ標識用
組成物を調製した。ＤＩＧ−ｄＵＴＰ／ｄＴＴＰの割合
は、０．０５ｍＭのＤＩＧ−ｄＵＴＰと０．９５ｍＭの
ｄＴＴＰを混合するというように変えることができる。
ＰＣＲ反応は試験例５と同様に行なった。ＤＩＧが標識
されたＰＣＲ産物はハイブリダイゼーションサンプルと
して用いるかまたはゲル電気泳動用の膜（ナイロン製、
陽イオンを帯びている）に移して色素または化学発光を
用いる通常のＤＩＧ−検出方法にしたがって検出した。
【００６１】実施例６ ３′末端標識 ＤＮＡ３′末端の放射性標識のための組成物の調製 以下の組成からなる組成物（５倍濃縮混合物）を調製す
る。
る。
【００６２】 組 成 成 分 濃 度 ＣｏＣｌ2 ２５ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ６．６） １２５ｍＭ ＢＳＡ １．２５ｍｇ／ｍｌ 末端トランスフェラーゼ １２５００Ｕ／ｍｌ グリセリン ４５％ ＤＮＡ量 １０ｐｍｏｌ 調製は通常の手順で行った。
【００６３】試験例７ 通常の反応による３′末端の放射性標識 実施例６で調製した５倍濃縮混合物４μｌ、４μｌの５
倍濃縮カコジル酸カリウム（１Ｍ）および５μｌのα−
32ＰｄｄＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を全体積が
２０μｌとなるように反応容器にいれ、そこに１０ｐｍ
ｏｌ３′−ＯＨ末端（すなわち０．２６ｍｇ／ｍｌのコ
ントロールＤＮＡ、ｐＢＲ３２２、５μｌ）を加える。
３７℃で６０分間インキュベーションを行なった。取り
込み率は、トリクロロ酢酸を用いる実施例１と同様に決
定された。結果の評価は試験例１と一致した。
倍濃縮カコジル酸カリウム（１Ｍ）および５μｌのα−
32ＰｄｄＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を全体積が
２０μｌとなるように反応容器にいれ、そこに１０ｐｍ
ｏｌ３′−ＯＨ末端（すなわち０．２６ｍｇ／ｍｌのコ
ントロールＤＮＡ、ｐＢＲ３２２、５μｌ）を加える。
３７℃で６０分間インキュベーションを行なった。取り
込み率は、トリクロロ酢酸を用いる実施例１と同様に決
定された。結果の評価は試験例１と一致した。
【００６４】実施例７ ３′末端標識のためのＤＩＧ−オリゴヌクレオチドの調
製 以下の組成からなる組成物（５倍濃縮混合物）を調製し
た。
製 以下の組成からなる組成物（５倍濃縮混合物）を調製し
た。
【００６５】 組 成 成 分 濃 度 ＣｏＣｌ2 ２５ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ６．６） １２５ｍＭ ＢＳＡ １．２５ｍｇ／ｍｌ 末端トランスフェラーゼ １２５００Ｕ／ｍｌ ＤＩＧ ｄｄＵＴＰ ０．２５ｍＭ グリセリン ４５％ オリゴヌクレオチド量 １００ｐｍｏｌ 調製は通常の手順で行われた。
【００６６】試験例８ 通常の反応によるＤＩＧオリゴヌクレオチド３′末端標
識 試験例７の放射性３′末端標識の手順において、32Ｐｄ
ｄＡＴＰを用いずに実施例７で調製した組成物を用い
て、３７℃で１５分間インキュベートした。結果の評価
は試験例２と一致した。
識 試験例７の放射性３′末端標識の手順において、32Ｐｄ
ｄＡＴＰを用いずに実施例７で調製した組成物を用い
て、３７℃で１５分間インキュベートした。結果の評価
は試験例２と一致した。
【００６７】実施例８ ＤＩＧオリゴヌクレオチドテイリング 以下からなる組成の組成物（５倍濃縮混合物）を調製し
た。
た。
【００６８】 組 成 成 分 濃 度 ＣｏＣｌ2 ２５ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ６．６） １２５ｍＭ ＢＳＡ １．２５ｍｇ／ｍｌ 末端トランスフェラーゼ １２５００Ｕ／ｍｌ ｄＡＴＰ ２．５ｍＭ ＤＩＧ−ＩＩ−ｄＵＴＰ ０．２５ｍＭ グリセリン ４５％ オリゴヌクレオチド量 １００ｐｍｏｌ 調製は通常の手順で行われた。
【００６９】試験例９ 通常の反応によるＤＩＧ−オリゴヌクレオチドテーリン
グ 試験例８のＤＩＧ−オリゴヌクレオチド３′末端標識に
したがい、実施例８で調製した組成物を用いて全体積２
０μｌにて行なった。
グ 試験例８のＤＩＧ−オリゴヌクレオチド３′末端標識に
したがい、実施例８で調製した組成物を用いて全体積２
０μｌにて行なった。
【００７０】インキュベーションは３７℃で１５分間行
なった。結果の評価は試験例２と一致した。
なった。結果の評価は試験例２と一致した。
【００７１】実施例９ ＲＮＡ標識（トランスクリプション） ＳＰ６／Ｔ７トランスクリプションによる放射性ＲＮＡ
標識 以下の組成からなる組成物（５倍濃縮混合物）を調製し
た。
標識 以下の組成からなる組成物（５倍濃縮混合物）を調製し
た。
【００７２】 組 成 成 分 濃 度 Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．６） ４００ｍＭ ＭｇＣｌ2 ６０ｍＭ ＤＴＴ ２００ｍＭ スペルミジン １０ｍＭ ＲＮアーゼ阻害剤 ２．５ｋＵ／ｍｌ 無機ピロホスファターゼ ２５Ｕ／ｍｌ ＡＴＰ ２．５ｍＭ ＧＴＰ ２．５ｍＭ ＵＴＰ ２．５ｍＭ ＳＰ６ ＲＮＡ−ポリメラーゼ ２０００Ｕ／ｍｌ Ｔ７ ＲＮＡ−ポリメラーゼ ２０００Ｕ／ｍｌ Ｔ３ ＲＮＡ−ポリメラーゼ ２０００Ｕ／ｍｌ グリセリン ４５％ ＤＮＡ量 １μｇ 調製は通常の手順で行われた。
【００７３】試験例１０ 通常の反応を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏトランスクリプシ
ョンによる放射性ＲＮＡ標識 実施例９で調製した５倍濃縮組成物４μｌおよび５μｌ
のα−32ＰＣＴＰ（４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を全体積が
２０μｌとなるようにし、そこにＳＰ６、Ｔ７またはＴ
３プロモーターとともに１μｇのＤＮＡを加える。イン
キュベーションを３７℃で２０分間行なった。取り込み
率はトリクロロ酢酸を用いる実施例１と同様に決定され
た。結果の評価は試験例１と一致した。
ョンによる放射性ＲＮＡ標識 実施例９で調製した５倍濃縮組成物４μｌおよび５μｌ
のα−32ＰＣＴＰ（４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を全体積が
２０μｌとなるようにし、そこにＳＰ６、Ｔ７またはＴ
３プロモーターとともに１μｇのＤＮＡを加える。イン
キュベーションを３７℃で２０分間行なった。取り込み
率はトリクロロ酢酸を用いる実施例１と同様に決定され
た。結果の評価は試験例１と一致した。
【００７４】実施例１０ ＤＩＧを用いるＲＮＡ標識 以下の組成からなる組成物（５倍濃縮混合物）を調製し
た。
た。
【００７５】 組 成 成 分 濃 度 Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．６） ４００ｍＭ ＭｇＣｌ2 ６０ｍＭ ＤＴＴ ２００ｍＭ スペルミジン １０ｍＭ ＲＮアーゼ阻害剤 ２．５ｋＵ／ｍｌ 無機ピロホスファターゼ ２５Ｕ／ｍｌ ＡＴＰ １５ｍＭ ＣＴＰ １５ｍＭ ＧＴＰ １５ｍＭ ＵＴＰ １０ｍＭ ＤＩＧ−１１−ＵＴＰ ５ｍＭ ＳＰ６ ＲＮＡ−ポリメラーゼ ４０００Ｕ／ｍｌ Ｔ７ ＲＮＡ−ポリメラーゼ ４０００Ｕ／ｍｌ Ｔ３ ＲＮＡ−ポリメラーゼ ４０００Ｕ／ｍｌ グリセリン ４５％ ＤＮＡ量 １μｇ 調製は通常の手順で行った。
【００７６】試験例１１ 通常の反応によるＤＩＧ−ＲＮＡ標識 実施例１０で調製した組成物を用いて、放射能を用いな
いことのほかは試験例１０と同様にし、インキュベーシ
ョンを３７℃で１２０分間行なった。取り込み率の決定
は１μｌの32ＰＵＴＰトレーサーを加えることによって
行った。評価結果は試験例２に一致した。
いことのほかは試験例１０と同様にし、インキュベーシ
ョンを３７℃で１２０分間行なった。取り込み率の決定
は１μｌの32ＰＵＴＰトレーサーを加えることによって
行った。評価結果は試験例２に一致した。
【００７７】
【発明の効果】本発明によれば、酵素的に核酸またはヌ
クレオチドを放射性または非放射性標識するための成分
を含有する、安定な液体状の組成物が提供される。本発
明の組成物は−２０℃から室温の温度範囲で保存する
と、長期間安定であることが可能となる。
クレオチドを放射性または非放射性標識するための成分
を含有する、安定な液体状の組成物が提供される。本発
明の組成物は−２０℃から室温の温度範囲で保存する
と、長期間安定であることが可能となる。
【図１】本発明の組成物を用いるＤＮＡ標識および通常
のランダムプライマー法を用いるＤＮＡ標識におけるそ
れぞれの放射能の取り込み率とインキュベーションの時
間との関係を示すグラフである。
のランダムプライマー法を用いるＤＮＡ標識におけるそ
れぞれの放射能の取り込み率とインキュベーションの時
間との関係を示すグラフである。
【図２】本発明の組成物を用いるＤＮＡ標識および通常
のランダムプライマー法を用いるＤＮＡ標識におけるそ
れぞれの放射能の取り込み量とインキュベーションの時
間との関係を示すグラフである。
のランダムプライマー法を用いるＤＮＡ標識におけるそ
れぞれの放射能の取り込み量とインキュベーションの時
間との関係を示すグラフである。
【図３】本発明の組成物を用いるＤＮＡ標識および通常
のランダムプライマー法を用いるＤＮＡ標識におけるそ
れぞれの放射能の取り込み率とインキュベーションの時
間との関係を示すグラフである。
のランダムプライマー法を用いるＤＮＡ標識におけるそ
れぞれの放射能の取り込み率とインキュベーションの時
間との関係を示すグラフである。
【図４】本発明の組成物を用いるＤＮＡ標識および通常
のランダムプライマー法を用いるＤＮＡ標識におけるそ
れぞれの放射能の取り込み率とインキュベーションの時
間との関係を示す棒グラフである。
のランダムプライマー法を用いるＤＮＡ標識におけるそ
れぞれの放射能の取り込み率とインキュベーションの時
間との関係を示す棒グラフである。
【図５】本発明の組成物を用いるＤＮＡ標識および通常
のランダムプライマー法を用いるＤＮＡ標識におけるそ
れぞれの放射能の取り込み量とインキュベーションの時
間との関係を示すグラフである。
のランダムプライマー法を用いるＤＮＡ標識におけるそ
れぞれの放射能の取り込み量とインキュベーションの時
間との関係を示すグラフである。
【図６】本発明の組成物を用いるＤＮＡ標識および通常
のランダムプライマー法を用いるＤＮＡ標識におけるそ
れぞれの放射能の取り込み率とインキュベーションの時
間との関係を示す棒グラフである。
のランダムプライマー法を用いるＤＮＡ標識におけるそ
れぞれの放射能の取り込み率とインキュベーションの時
間との関係を示す棒グラフである。
【手続補正書】
【提出日】平成７年１月９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項２】 核酸を標識するための酵素、少なくとも
１つのヌクレオシドトリホスフェートおよび反応緩衝液
を含有する組成物であって、成分が混合された形態でか
つ液体として室温から約−２０℃の間にて反応容器に存
在することを特徴とする組成物。
１つのヌクレオシドトリホスフェートおよび反応緩衝液
を含有する組成物であって、成分が混合された形態でか
つ液体として室温から約−２０℃の間にて反応容器に存
在することを特徴とする組成物。
【請求項３】 組成物が、非放射性の検出されうる基で
標識されたヌクレオシドトリホスフェートまたは放射性
のヌクレオシドトリホスフェートを含有することを特徴
とする請求項２記載の組成物。
標識されたヌクレオシドトリホスフェートまたは放射性
のヌクレオシドトリホスフェートを含有することを特徴
とする請求項２記載の組成物。
【請求項４】 組成物が少なくとも３０％（ｖ／ｖ）の
グリセリンを含有することを特徴とする請求項１、２ま
たは３記載の組成物。
グリセリンを含有することを特徴とする請求項１、２ま
たは３記載の組成物。
【請求項５】 請求項１、２、３または４記載の組成物
を含有するのみならず、分離した容器にさらなる成分を
含有する反応用混合物。
を含有するのみならず、分離した容器にさらなる成分を
含有する反応用混合物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１１】
【実施例】前記目的は、最適な混合比、安定な形態およ
びすでに混合された状態で、前記標識方法に必要な成分
をすべて含有する組成物を提供することによって達成さ
れる。好ましい組成物としては、組成物が、ポリメラー
ゼ、少なくとも３つのヌクレオシドトリホスフェート、
ランダムプライマー、適切な緩衝液ならびに必要ならば
ＭｇＣｌ2 、ジチオスレイトール、スペルミジン、ＢＳ
Ａおよび非イオン性界面活性剤を含有する組成物、組成
物が、無機ピロホスファターゼをさらに含有する組成
物、組成物が、非放射性の検出されうる基で標識された
ヌクレオシドトリホスフェートまたは放射性のヌクレオ
シドトリホスフェートを含有する組成物、組成物が、少
なくとも３０％（ｖ／ｖ）のグリセリンを含有する組成
物、または組成物が、３０〜６０％（ｖ／ｖ）のグリセ
リンを含有する組成物があげられ、また、前記の核酸ま
たはオリゴヌクオチドの標識用組成物、前記組成物を含
有するのみならず、分離した容器にさらなる成分を含有
する反応用混合物またはコントロールおよび／またはさ
らなる成分としての放射性標識試薬を含有する反応混合
物も好ましい。前記グリセリンについては、４０〜５０
％（ｖ／ｖ）のグリセリンの添加がとくに適するこが証
明されている。この混合物は、室温（〜２５℃）から−
２０℃のあいだで保存すると安定であり、−２０〜４℃
で保存するばあいにはとくに高い安定性を示す。
びすでに混合された状態で、前記標識方法に必要な成分
をすべて含有する組成物を提供することによって達成さ
れる。好ましい組成物としては、組成物が、ポリメラー
ゼ、少なくとも３つのヌクレオシドトリホスフェート、
ランダムプライマー、適切な緩衝液ならびに必要ならば
ＭｇＣｌ2 、ジチオスレイトール、スペルミジン、ＢＳ
Ａおよび非イオン性界面活性剤を含有する組成物、組成
物が、無機ピロホスファターゼをさらに含有する組成
物、組成物が、非放射性の検出されうる基で標識された
ヌクレオシドトリホスフェートまたは放射性のヌクレオ
シドトリホスフェートを含有する組成物、組成物が、少
なくとも３０％（ｖ／ｖ）のグリセリンを含有する組成
物、または組成物が、３０〜６０％（ｖ／ｖ）のグリセ
リンを含有する組成物があげられ、また、前記の核酸ま
たはオリゴヌクオチドの標識用組成物、前記組成物を含
有するのみならず、分離した容器にさらなる成分を含有
する反応用混合物またはコントロールおよび／またはさ
らなる成分としての放射性標識試薬を含有する反応混合
物も好ましい。前記グリセリンについては、４０〜５０
％（ｖ／ｖ）のグリセリンの添加がとくに適するこが証
明されている。この混合物は、室温（〜２５℃）から−
２０℃のあいだで保存すると安定であり、−２０〜４℃
で保存するばあいにはとくに高い安定性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 イルムガルト オーベルマイヤー ドイツ連邦共和国、デー−82377 ペンツ バーク、ビルケンシュトラーセ 102 (72)発明者 ゲオルク ネッシュ ドイツ連邦共和国、デー−82399 ライス チング−セルプ、ザンクト マルガレータ −ベーク １
Claims (12)
- 【請求項１】 核酸を標識するための酵素および反応緩
衝液を含有する組成物であって、反応に必要な成分が混
合された形態でかつ液体として室温から約−２０℃の間
にて容器に存在することを特徴とする組成物。 - 【請求項２】 組成物が酵素反応において通常用いられ
る添加物を含有する請求項１記載の組成物。 - 【請求項３】 核酸を標識するための酵素、少なくとも
１つのヌクレオシドトリホスフェートおよび反応緩衝液
を含有する組成物であって、成分が混合された形態でか
つ液体として室温から約−２０℃の間にて反応容器に存
在することを特徴とする組成物。 - 【請求項４】 組成物が酵素反応において通常用いられ
る添加物を含有する請求項３記載の組成物。 - 【請求項５】 組成物が、ポリメラーゼ、少なくとも３
つのヌクレオシドトリホスフェート、ランダムプライマ
ー、適切な緩衝液ならびに必要ならばＭｇＣｌ2 、ジチ
オスレイトール、スペルミジン、ＢＳＡおよび非イオン
性界面活性剤を含有することを特徴とする請求項２記載
の組成物。 - 【請求項６】 組成物が、無機ピロホスファターゼをさ
らに含有することを特徴とする請求項２または３記載の
組成物。 - 【請求項７】 組成物が、非放射性の検出されうる基で
標識されたヌクレオシドトリホスフェートまたは放射性
のヌクレオシドトリホスフェートを含有することを特徴
とする請求項２、３または４記載の組成物。 - 【請求項８】 組成物が少なくとも３０％（ｖ／ｖ）の
グリセリンを含有することを特徴とする請求項１、２、
３、４または５記載の組成物。 - 【請求項９】 組成物が３０〜６０％（ｖ／ｖ）のグリ
セリンを含有することを特徴とする請求項１、２、３、
４または５記載の組成物。 - 【請求項１０】 請求項１、２、３、４、５、６、７、
８または９記載の核酸またはオリゴヌクオチドの標識用
組成物。 - 【請求項１１】 請求項１、２、３、４、５、６または
７記載の組成物を含有するのみならず、分離した容器に
さらなる成分を含有する反応用混合物。 - 【請求項１２】 コントロールおよび／またはさらなる
成分としての放射性標識試薬を含有することを特徴とす
る請求項１１記載の反応混合物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4336266A DE4336266A1 (de) | 1993-10-23 | 1993-10-23 | Stabilisierte flüssige Mischungen für die Markierung von Nukleinsäuren |
| DE4336266.4 | 1993-10-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07194398A true JPH07194398A (ja) | 1995-08-01 |
Family
ID=6500897
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6257160A Pending JPH07194398A (ja) | 1993-10-23 | 1994-10-21 | 核酸標識のための安定な組成物 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5814502A (ja) |
| EP (1) | EP0649909A3 (ja) |
| JP (1) | JPH07194398A (ja) |
| DE (1) | DE4336266A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010233504A (ja) * | 2009-03-31 | 2010-10-21 | Toyobo Co Ltd | 保存安定性に優れた核酸増幅検出試薬キット |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2264045B1 (en) * | 1996-08-14 | 2015-10-21 | Life Technologies Corporation | Stable compositions for nucleic acid amplification and sequencing |
| DE19647055A1 (de) * | 1996-11-14 | 1998-05-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Stabilisierte wässrige Nukleosidtriphosphat-Lösungen |
| US6365349B1 (en) | 1997-07-22 | 2002-04-02 | Qiagen Genomics, Inc. | Apparatus and methods for arraying solution onto a solid support |
| US6140086A (en) * | 1997-08-15 | 2000-10-31 | Fox; Donna K. | Methods and compositions for cloning nucleic acid molecules |
| WO2004013305A2 (en) * | 2002-08-05 | 2004-02-12 | Quanta Biosciences, Inc. | Improved compositions for in vitro amplification of nucleic acids |
| DE60329853D1 (de) | 2002-09-03 | 2009-12-10 | Quanta Biosciences Inc | Verbesserte zusammensetzungen und verfahren für die cdna-synthese |
| WO2012018638A2 (en) | 2010-07-26 | 2012-02-09 | Biomatrica, Inc. | Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures |
| US9845489B2 (en) | 2010-07-26 | 2017-12-19 | Biomatrica, Inc. | Compositions for stabilizing DNA, RNA and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures |
| EP4249603A3 (en) | 2011-06-08 | 2024-01-03 | Life Technologies Corporation | Design and development of novel detergents for use in pcr systems |
| WO2012170907A2 (en) | 2011-06-08 | 2012-12-13 | Life Technologies Corporation | Polymerization of nucleic acids using proteins having low isoelectric points |
| WO2014100755A2 (en) | 2012-12-20 | 2014-06-26 | Biomatrica, Inc. | Formulations and methods for stabilizing pcr reagents |
| CN106458885B (zh) | 2013-10-25 | 2019-12-10 | 生命技术公司 | 用于聚合酶链式反应系统的新颖化合物及其应用 |
| ES2786373T3 (es) | 2014-06-10 | 2020-10-09 | Biomatrica Inc | Estabilización de trombocitos a temperaturas ambiente |
| ES2946184T3 (es) | 2015-12-08 | 2023-07-13 | Biomatrica Inc | Reducción de la velocidad de eritrosedimentación |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59206766A (ja) * | 1983-04-13 | 1984-11-22 | エンゾー バイオケム，インコーポレイテッド | Ｄｎａ末端に化学的にラベルを行なうキツト |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4762780A (en) * | 1984-04-17 | 1988-08-09 | The Regents Of The University Of California | Method and composition for screening and diagnosing "HCMV" |
| US4749647A (en) * | 1984-06-22 | 1988-06-07 | Genetic Systems Corporation | Polymerization-induced separation assay using recognition pairs |
| US4769319A (en) * | 1985-05-31 | 1988-09-06 | Salk Institute Biotechnology Industrial Associates, Inc. | Nucleic acid probes for prenatal sexing |
| CA1338457C (en) * | 1986-08-22 | 1996-07-16 | Henry A. Erlich | Purified thermostable enzyme |
| DE69002826T2 (de) * | 1989-02-06 | 1994-03-31 | Eastman Kodak Co | Reaktionskonzentrat zur dna-sequenzierung mit thermostabiler dna-polymerase. |
| US5198543A (en) * | 1989-03-24 | 1993-03-30 | Consejo Superior Investigaciones Cientificas | PHI29 DNA polymerase |
| AU638246B2 (en) * | 1989-04-12 | 1993-06-24 | President And Fellows Of Harvard College | Improved primer extension reactions |
| US5108892A (en) * | 1989-08-03 | 1992-04-28 | Promega Corporation | Method of using a taq dna polymerase without 5'-3'-exonuclease activity |
| US5256555A (en) * | 1991-12-20 | 1993-10-26 | Ambion, Inc. | Compositions and methods for increasing the yields of in vitro RNA transcription and other polynucleotide synthetic reactions |
-
1993
- 1993-10-23 DE DE4336266A patent/DE4336266A1/de not_active Withdrawn
-
1994
- 1994-10-18 EP EP94116385A patent/EP0649909A3/de not_active Withdrawn
- 1994-10-21 JP JP6257160A patent/JPH07194398A/ja active Pending
-
1996
- 1996-03-11 US US08/613,997 patent/US5814502A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59206766A (ja) * | 1983-04-13 | 1984-11-22 | エンゾー バイオケム，インコーポレイテッド | Ｄｎａ末端に化学的にラベルを行なうキツト |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010233504A (ja) * | 2009-03-31 | 2010-10-21 | Toyobo Co Ltd | 保存安定性に優れた核酸増幅検出試薬キット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0649909A3 (de) | 1999-03-31 |
| EP0649909A2 (de) | 1995-04-26 |
| US5814502A (en) | 1998-09-29 |
| DE4336266A1 (de) | 1995-04-27 |
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