JPS59175432A - ジヒドロ葉酸溶液の安定化方法 - Google Patents
ジヒドロ葉酸溶液の安定化方法Info
- Publication number
- JPS59175432A JPS59175432A JP4893383A JP4893383A JPS59175432A JP S59175432 A JPS59175432 A JP S59175432A JP 4893383 A JP4893383 A JP 4893383A JP 4893383 A JP4893383 A JP 4893383A JP S59175432 A JPS59175432 A JP S59175432A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fah2
- solution
- cyclodextrin
- methotrexate
- dhfr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はジヒドロ葉酸の溶液の安定化に関する。
さらに本発明の他の目的はこのようにして得られたジヒ
ドロ葉酸を基質として用いることによってメントレキセ
イトの測定を簡単かつ正確に実施できるようにすること
にある。
ドロ葉酸を基質として用いることによってメントレキセ
イトの測定を簡単かつ正確に実施できるようにすること
にある。
メントキセイトはアミツブゾリンの商品名で古くから白
血病等の腫瘍に対する化学療法剤として使用されてきた
が、最近はさらにメソトレキセイトの拮抗剤であるロイ
コボリンとの併用で極めて多層のメントレキセイＩ−を
用いる治療が行なわれるようＫなった。この場合副作用
の予測あるいは防止に体液中のメントレキセイトの量を
絶えず測定することが不可欠であり、そのため従来に増
して簡便かつ正確な測定法が望まれている。従来の測定
法には、高速液体クロマトグラフィ、ラジオイムノアッ
セイ、螢光光度法等があるがいずれも検査の前処理や複
雑な操作が必要で一般の施設で簡単に実施することは困
難である。才だこれらのほかメソトレキセイトの酵素ジ
ヒドロフォレイトレダクターゼ（以下ＤＨＦＲという）
に対する阻害作用を利用してメントレキセイトを測定す
る酵素法があり次第に実用化されてきた。この方法は公
知であるが本発明の目的に係っているのでその概要を述
べる。
血病等の腫瘍に対する化学療法剤として使用されてきた
が、最近はさらにメソトレキセイトの拮抗剤であるロイ
コボリンとの併用で極めて多層のメントレキセイＩ−を
用いる治療が行なわれるようＫなった。この場合副作用
の予測あるいは防止に体液中のメントレキセイトの量を
絶えず測定することが不可欠であり、そのため従来に増
して簡便かつ正確な測定法が望まれている。従来の測定
法には、高速液体クロマトグラフィ、ラジオイムノアッ
セイ、螢光光度法等があるがいずれも検査の前処理や複
雑な操作が必要で一般の施設で簡単に実施することは困
難である。才だこれらのほかメソトレキセイトの酵素ジ
ヒドロフォレイトレダクターゼ（以下ＤＨＦＲという）
に対する阻害作用を利用してメントレキセイトを測定す
る酵素法があり次第に実用化されてきた。この方法は公
知であるが本発明の目的に係っているのでその概要を述
べる。
酵素ＤＨＰＲは次の反応を触媒する。
（ＦＡＨ２） （ＦＡＨ４）注）
ＮＡＤＰＩ（２：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸の還元型 ＮＡＤＰ ： ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸の酸化型 ここで、メソトレキセイトの存在下に本反応を行なわせ
るとメソトレキセイトの量に比例してＤＨＦＲの阻害が
起シ、メソトレキセイトと結合したＤＨＰＲは不活性化
し残存する活性Ｄ ＨＦＲによって本反応が進行する。
ＮＡＤＰＩ（２：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸の還元型 ＮＡＤＰ ： ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸の酸化型 ここで、メソトレキセイトの存在下に本反応を行なわせ
るとメソトレキセイトの量に比例してＤＨＦＲの阻害が
起シ、メソトレキセイトと結合したＤＨＰＲは不活性化
し残存する活性Ｄ ＨＦＲによって本反応が進行する。
従ってＮＡＤＰＨ２の波長３４０ａｍにおける吸光度を
測定しその減少から本反応の進行すなわち残存ＤＨＦＲ
の活性値を求め、その割合もしくは酵素量よシメントレ
キセイトの量を求めることができる。
測定しその減少から本反応の進行すなわち残存ＤＨＦＲ
の活性値を求め、その割合もしくは酵素量よシメントレ
キセイトの量を求めることができる。
本方法によるメントレキセイトの測定の場合は血清をそ
のまま使用でき、操作も簡便で臨床検査に適しているが
、試薬の安定性に問題があシ、試薬を夫々単一のものと
して個々に分けて保存しておき使用時に調製せねば彦ら
ない不便があった。
のまま使用でき、操作も簡便で臨床検査に適しているが
、試薬の安定性に問題があシ、試薬を夫々単一のものと
して個々に分けて保存しておき使用時に調製せねば彦ら
ない不便があった。
特にＤＨＦＲの基質として使用するＦＡＨ２の水溶液の
不安定なことは従来よシ解決の方法がなく本方法の大き
な欠点となっていた。
不安定なことは従来よシ解決の方法がなく本方法の大き
な欠点となっていた。
本発明者等は種々研究の結果、β−シクロデキストリン
を添加することによって安定なＦｌ（２水溶液が得られ
ることを発見し本発明を完成すると共に本発明を利用す
ることによって従来のメントレキセイト測定の欠点を除
去することに成功した。
を添加することによって安定なＦｌ（２水溶液が得られ
ることを発見し本発明を完成すると共に本発明を利用す
ることによって従来のメントレキセイト測定の欠点を除
去することに成功した。
次にこれらについて試験例によシ説明する。
試験例１
β−シクロデキストリンの濃度とＦ Ａ Ｈ２の安定性
との関係： ＦＡＨ２の定量は前述のＤＨＦＲを用いる酵素法による
。
との関係： ＦＡＨ２の定量は前述のＤＨＦＲを用いる酵素法による
。
１、試薬
（１） １５０ ｍＭＫｃＡ
ｌ ０ ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む１００
ｍＭ ）リスーＨＣｔ緩衝液（ｐＨ７，５）（２）
ＮＡＤＰＨ２，Ｏｍ９ ＤＨＦＲＯ，０５ｕ を試薬（１）緩衝液ｌＯプに溶解する。
ｍＭ ）リスーＨＣｔ緩衝液（ｐＨ７，５）（２）
ＮＡＤＰＨ２，Ｏｍ９ ＤＨＦＲＯ，０５ｕ を試薬（１）緩衝液ｌＯプに溶解する。
２、操作
ＦＡＨ２を濃度０．０５■／−程度に試薬（１）緩衝液
に溶解して検体とする。検体０．２ ｍＡ！に試薬（２
） ２．０ ｍＡを加え２５℃、５分間加温し、反応後
波長３４０ｎｍの吸光度（０Ｄａ） を測定する。次に
試薬ブランクとして試薬（１） ０．２ ｍｌを検体の
代シに採シその他は検体測定の場合と同様に操作し吸光
度（ｏｐｂ ）を測定する。次に検体ブランクとして検
体０．２１ｎｌＫ試薬（２）の代シに蒸留水２．０ｄを
加える他は検体測定の場合と同様に操作し吸光度（ＯＤ
ｃ ）を測定する。ＦＡＨ２の量は次の式から算出する
。
に溶解して検体とする。検体０．２ ｍＡ！に試薬（２
） ２．０ ｍＡを加え２５℃、５分間加温し、反応後
波長３４０ｎｍの吸光度（０Ｄａ） を測定する。次に
試薬ブランクとして試薬（１） ０．２ ｍｌを検体の
代シに採シその他は検体測定の場合と同様に操作し吸光
度（ｏｐｂ ）を測定する。次に検体ブランクとして検
体０．２１ｎｌＫ試薬（２）の代シに蒸留水２．０ｄを
加える他は検体測定の場合と同様に操作し吸光度（ＯＤ
ｃ ）を測定する。ＦＡＨ２の量は次の式から算出する
。
ただし、ＭＷ ： Ｆ’ＡＨ２０分子量（ｙ）ε ：
ＮＡＤＰＨ、ＦＡＨ２混合時の分子吸光係数Ｖ ：全容
量（ｄ） Ｖ ：検体量（ｍ、） ｄ ：セル径（ｃｒｎ） Ｆ ：希釈倍数 上記の測定法によシβ−シクロデキストリンの種種の濃
度におけるＦＡＨ２の活性を測定した。β−シクロデキ
ストリンは０．１５ ＭＫＣ４，０，１４ＮａＮ３を含
む０．１Ｍ！−リスー ＨＣ１緩衝液（ｐ’４７．５）
にＷ／Ｖ ％ テ添加した。またＦ’ＡＨ２は濃度０．
５■／ｒａｌに調製したものを用いた。２５℃で、１〜
３日間保存した後のＦＡＨ２の残存活性を測定しその割
合を第１図に示す。
ＮＡＤＰＨ、ＦＡＨ２混合時の分子吸光係数Ｖ ：全容
量（ｄ） Ｖ ：検体量（ｍ、） ｄ ：セル径（ｃｒｎ） Ｆ ：希釈倍数 上記の測定法によシβ−シクロデキストリンの種種の濃
度におけるＦＡＨ２の活性を測定した。β−シクロデキ
ストリンは０．１５ ＭＫＣ４，０，１４ＮａＮ３を含
む０．１Ｍ！−リスー ＨＣ１緩衝液（ｐ’４７．５）
にＷ／Ｖ ％ テ添加した。またＦ’ＡＨ２は濃度０．
５■／ｒａｌに調製したものを用いた。２５℃で、１〜
３日間保存した後のＦＡＨ２の残存活性を測定しその割
合を第１図に示す。
この結果から明らかなようにβ−シクロデキストリンの
添加の効果はその濃度に比して増加し溶解限度の２．０
〜２．５ ｑ６ｗ、”ｖで最大となるが実質的には０．
５〜２．５４ Ｗ／Ｖの範囲で使用可能である。
添加の効果はその濃度に比して増加し溶解限度の２．０
〜２．５ ｑ６ｗ、”ｖで最大となるが実質的には０．
５〜２．５４ Ｗ／Ｖの範囲で使用可能である。
試験例２
β−シクロデキストリンと他の安定化剤：ＦＡＨ２の安
定化剤としてアスコルビン酸等の還元剤が知られておシ
、その還元性によってＦＡＩ２の酸化を防いで安定化剤
の働きをしているが、アスコルビン酸は濃度を高くする
とたしかに安定効果は増進するが同時にＦＡＨ２の溶解
性を著しく損なうので実際には濃度０．０５％程度で使
用せざるを得ない。
定化剤としてアスコルビン酸等の還元剤が知られておシ
、その還元性によってＦＡＩ２の酸化を防いで安定化剤
の働きをしているが、アスコルビン酸は濃度を高くする
とたしかに安定効果は増進するが同時にＦＡＨ２の溶解
性を著しく損なうので実際には濃度０．０５％程度で使
用せざるを得ない。
アスコルビン酸０．０５％とβ−シクロデキストリン１
％の添加による夫々の場合のＦＡＨ２の安定性を測定し
た結果を第２図に示す。試験は試験例ＩＶＣ準じて行な
った。この結果がらβ−シクロデキストリンがアスコル
ビン酸に較べ極めて有効であることが明らかである。
％の添加による夫々の場合のＦＡＨ２の安定性を測定し
た結果を第２図に示す。試験は試験例ＩＶＣ準じて行な
った。この結果がらβ−シクロデキストリンがアスコル
ビン酸に較べ極めて有効であることが明らかである。
次に本発明を実施して行なわれるメソトレキセイトの測
定方法およびその効果について参考例等によシ説、明す
る。
定方法およびその効果について参考例等によシ説、明す
る。
参考例
メントレキセイトの測定
１、 試薬
（１）トリス緩衝液 １５０ ｍＭＫｃＬｏ、１４ Ｎ
ａＮ３ をｌｏＯｒｎＭ ）リス−ＨＣＡに溶解して−を７．
５とする。
ａＮ３ をｌｏＯｒｎＭ ）リス−ＨＣＡに溶解して−を７．
５とする。
（２）酵素液 ０．２５ ｍＭ ＮＡＤＰＨ５１
１／１ＤＨＦＲ をトリス緩衝液に溶解する。
１／１ＤＨＦＲ をトリス緩衝液に溶解する。
（３）基質液 １．１ ｍＭ ＦＡＨ２１，０係
β−シクロデキストリンをトリス緩衝液に溶解す
る。
β−シクロデキストリンをトリス緩衝液に溶解す
る。
（４） メントレキセイト標準液
Ｉ Ｘ １０−７Ｍメソトレキセイト水溶液（表示値を
付す） ２、 操作 酵素液１ｍ１ｉ２５℃に予加温する。検体０．１ ｒ／
Ｌｌまだはメソトレキセイト標準液０．１コを加え２５
℃、１分加温後、基質液０．１ ｍを加え反応を開始す
る。基質液添加２分後から２分間の波長３４０ｎｍの吸
光度の差を測定する。次に対照として検体の代シに蒸留
水０．１ ｍｌを用い同様に測定を行なう。
付す） ２、 操作 酵素液１ｍ１ｉ２５℃に予加温する。検体０．１ ｒ／
Ｌｌまだはメソトレキセイト標準液０．１コを加え２５
℃、１分加温後、基質液０．１ ｍを加え反応を開始す
る。基質液添加２分後から２分間の波長３４０ｎｍの吸
光度の差を測定する。次に対照として検体の代シに蒸留
水０．１ ｍｌを用い同様に測定を行なう。
メントレキセイト含量は次の計算式により算出する。
検体のメソトレキセイト値＝
次にメソトレキセイト標準液を用いて同様の方法で作成
したメソトレキセイトの検量線を第３図に示す。これに
よると濃度１．５Ｘ１０−７Ｍまで直線性が得られるこ
とが分る。
したメソトレキセイトの検量線を第３図に示す。これに
よると濃度１．５Ｘ１０−７Ｍまで直線性が得られるこ
とが分る。
次に本発明を実施した参考例の基質液（ＦＡＨ２）の安
定性を調べた試験結果は第４図の通シである。
定性を調べた試験結果は第４図の通シである。
この試験では基質液を２５℃で１日、３日、６日間保存
したものを用い保存期間中に変化したＦＡＪ（２の量お
よびその量の変化がメ ソトレキセイト測定に及ばず影
響について調べた。
したものを用い保存期間中に変化したＦＡＪ（２の量お
よびその量の変化がメ ソトレキセイト測定に及ばず影
響について調べた。
上記基質液を用い、夫々新鮮なトリス緩衝液、酵素液を
用いて参考例の操作法に従って当該例の対照に相当する
試験を行ない、その吸光度差をＤＨＦＲ感度とする。ま
た基質液中の基質の量を試験例１の方法によって測定し
ＦＡＨ２とする。第４図ではＦＡＨ２の量を残存活性の
最初の濃度（１，１ｍＭ）に対する１００分率で表わし
である。この図の２及び４からβ−シクロデキストリン
を添加した場合は３日保存のものでもＦＡＨ２の量が５
０チを越えているのに反し、無添加の場合は３日保存の
ものは殆ど残存活性がなくなることが分る。このことは
β−シクロデキストリンの添加が基質の安定化に極めて
有効であることを示している。まだ、メントレキセイト
の測定の場合、ＤＨＰＲ感度は第４図の１及び３からＦ
ＡＨ２の量が５０％を切ると急激に低下することが明ら
かで、この面からもβ−シクロデキストリンの添加はＤ
ＨＦＲの感度を３倍延ばすことになる。いずれにしても
β−シクロデキス） ＩＪンの安定剤としての添加が極
めて有用であることが分る。また本発明の基質液は凍結
乾燥品とすることが可能で他の試薬と共にキット製品と
する場合便利である。
用いて参考例の操作法に従って当該例の対照に相当する
試験を行ない、その吸光度差をＤＨＦＲ感度とする。ま
た基質液中の基質の量を試験例１の方法によって測定し
ＦＡＨ２とする。第４図ではＦＡＨ２の量を残存活性の
最初の濃度（１，１ｍＭ）に対する１００分率で表わし
である。この図の２及び４からβ−シクロデキストリン
を添加した場合は３日保存のものでもＦＡＨ２の量が５
０チを越えているのに反し、無添加の場合は３日保存の
ものは殆ど残存活性がなくなることが分る。このことは
β−シクロデキストリンの添加が基質の安定化に極めて
有効であることを示している。まだ、メントレキセイト
の測定の場合、ＤＨＰＲ感度は第４図の１及び３からＦ
ＡＨ２の量が５０％を切ると急激に低下することが明ら
かで、この面からもβ−シクロデキストリンの添加はＤ
ＨＦＲの感度を３倍延ばすことになる。いずれにしても
β−シクロデキス） ＩＪンの安定剤としての添加が極
めて有用であることが分る。また本発明の基質液は凍結
乾燥品とすることが可能で他の試薬と共にキット製品と
する場合便利である。
第１図はβ−シクロデキストリン（β−ＣＤ）添加濃度
とジヒドロ葉酸の残存活性（安定性）との関係を示すグ
ラフであシ、第２図はβ−ＣＤと他の安定化剤とのソヒ
ドロ葉酸安定性に関する比較結果を示すグラフである。 ｌ・・・無添加、２・・・０．５ ｍｙ／ｒｒｔｌアス
コルビン酸、３・・・１％β−ＣＤ０ 第３図はメソトレキセイトの検量線を示す。第４図はβ
−ＣＤ添加によるジヒドロフォレイトレダクターゼの感
度及びジヒドロ葉酸の安定性を示すＯ １・・・無添加ＤＨＰＲ感度、２・・・無添加ＦＡＨ２
，３・・・ｌチβ−ＣＤＤＨＦＲ感度、４・・・１チβ
−ＣＤＦＡＨ２゜第１図 第２図 第３図 第４図
とジヒドロ葉酸の残存活性（安定性）との関係を示すグ
ラフであシ、第２図はβ−ＣＤと他の安定化剤とのソヒ
ドロ葉酸安定性に関する比較結果を示すグラフである。 ｌ・・・無添加、２・・・０．５ ｍｙ／ｒｒｔｌアス
コルビン酸、３・・・１％β−ＣＤ０ 第３図はメソトレキセイトの検量線を示す。第４図はβ
−ＣＤ添加によるジヒドロフォレイトレダクターゼの感
度及びジヒドロ葉酸の安定性を示すＯ １・・・無添加ＤＨＰＲ感度、２・・・無添加ＦＡＨ２
，３・・・ｌチβ−ＣＤＤＨＦＲ感度、４・・・１チβ
−ＣＤＦＡＨ２゜第１図 第２図 第３図 第４図
Claims (1)
- β−シクロデキストリンを添加することを特徴とするジ
ヒドロ葉酸溶液の安定化方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4893383A JPS59175432A (ja) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | ジヒドロ葉酸溶液の安定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4893383A JPS59175432A (ja) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | ジヒドロ葉酸溶液の安定化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59175432A true JPS59175432A (ja) | 1984-10-04 |
| JPH0328200B2 JPH0328200B2 (ja) | 1991-04-18 |
Family
ID=12817056
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4893383A Granted JPS59175432A (ja) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | ジヒドロ葉酸溶液の安定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59175432A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4931442A (en) * | 1987-12-07 | 1990-06-05 | Holger Blum | Stabilized aqueous folic acid preparation |
| US5455236A (en) * | 1992-07-13 | 1995-10-03 | Eprova Aktiengesellschaft | 5,10-methylenetetrahydrofolic acid-cyclodextrin inclusion compounds |
-
1983
- 1983-03-25 JP JP4893383A patent/JPS59175432A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4931442A (en) * | 1987-12-07 | 1990-06-05 | Holger Blum | Stabilized aqueous folic acid preparation |
| US5455236A (en) * | 1992-07-13 | 1995-10-03 | Eprova Aktiengesellschaft | 5,10-methylenetetrahydrofolic acid-cyclodextrin inclusion compounds |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0328200B2 (ja) | 1991-04-18 |
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