JPS59171839A - 増感ルミネセンス検定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は増感ルミネセンスまたはルミツメトリー検定方
法、特に免疫検定方法、ならびにこの検定方法を芥易圧
するために設計された診断用キットに関する。 重役検定は剣法検査室においてｉｌＣも広く使”用され
る分析技術の一つである。現在免疫横７巳の大部分には
４ｓ八＾として放射は１ａｊ位元素特［１１ｇ１１が使
用される。しかし放射狂同位元累にはいくっがの大きな
欠点がある。りｊ−Ｋ　、この様渦方法には高に１に放
射性な、したがって危険のおそれのある薬剤が１街用さ
れる。ダ・、二に放射性ｂＰ　１４＋＊された物質の貯
蔵特命は、放射１土同位元埠、が４：舅的に絶えず崩壊
するためばかりでなく放射ａｈ論されたタンパク翼がし
ばしば不安定であるために、短い。艶三に１感胛良く迅
速に検出可能な反応創を得るに十分なだけタンパク債を
棟１、りすることがしばしば困難である。第四に放射江
蝶設物債の処分が不便である。 これらの欠点のため、放射性欅識に代る、寅用江のある
方法の探北が盛んに行われてきた。ある１クク質が樟薩
として適当であるため紀は少なくとも次の三要件を満す
ことが必要である二 （ａ）　　配位子例えば抗原または抗体と結合した相合
非常に少葉で、かつ迅速に検出できなければならない。 （ｂ）　　その側犀に影響を与えることなくこれを配位
子例えば抗原または抗体と結合することが可能でなけれ
ばならない。 （Ｃ）　　一旦結合した場合、配位子の註づｉに大きな
変化を与えてはならない。 代りの標譚として最も有望なものの一つ目、ルミネセン
ス発光を起す反応にそれ自体で関与し得る物質が、もし
くは、適嶋な処理によってルミネセンス反応に関与し得
る化合物を生するＱｒ　負である。ルミネセンス反応（
すなわちルミネセンス発光を起す化学反応）は−ｆｊＫ
放射された光を検出、測定しこれによって棟部゛された
材料の定坩を行うに十分な−ＲＨ時間をイ１゛する。一
方ルミネセンスの測定は迅速に行ない得る操作であって
、放荊能の測定に通常数分間を弗するのに対し６秒で完
了することができる。 ルミネセンスはこれまで次の三つの主要なルミネセンス
免役検定系において使用されてきた＝（ａｌ　　有機ル
ミネセンス免疫検定。この検定では、ルミネセンス反応
に直接関与する（すなわち励起状ｌｆｆ！［転化され次
に光子を放出して非め／ｉ起状＠；　Ｋ　４イ帰する）
化学ルミネセンス性または生物ルミネセンス社化合物が
、配位子例えばタンパク島ホルモン、ハゲテン、ステロ
イド、核覧中１＋５１代謝物、抗原および（または）抗
体を倦漸するのに１更用されてきた。過祭な化合・Ｙ′
ｙの扮１としてルミノールおよびインルミノールが挙げ
られる。 （ｂｌ　　／Ｌ−ミネセンス触媒または補助因子免疫検
定。 この検定でＶエルミネセンス反応の触ａｔたは補助因子
が植識として使ｊｔ１されてきた。適当な触媒の例とじ
てペルオキシダーゼが挙げられる。 （Ｃ）　　酵素結合免疫検定。この検定においては適渦
な基質に対する酔素標赦の作用によって生じた生成物の
測定にルミネセンス反応が使用されてきた。 この種の免役検定のｈとしては、酵素／抗体反応剤とグ
ルコースとを反応させてｙｈ代化水素を生成させ、次に
これにルミノールをｆｔ理された条件下で添加してルミ
ネセンス反応を開始させることＫより生成過刊化水素青
を沖！定する方法による、抗体結合グルコースオキシダ
ーゼの定量がある。 以上の免役検定の感度は一部、標識または標識からの生
成物の検出の下限によって決定される。 ルミネセンス免４．９Ｌ検定の場合検定系の感度は一部
は、ルミネセンス反応において標識された材料単位当り
放射される光の−によって定まる。本発明の目的の一つ
は、標識された材料または＄　’Ｊ゛からの生成物を本
発明の改良されたルミネセンス反応によって定量するこ
とＫよって達成される、高められた感度な有するルミネ
センス免疫検定方法を援供することである。 本５ｆ：明の改良されたルミネセンス反応は免役検定＠
４繊またはその生成後１の辿１定Ｋ特に上用であるが、
この用洲のみにｋられるものではない。１なわち本発明
のさらに一つの目的は、本発明の改良されたルミネセン
ス反応を検が９作に取入れることＫよって涌成される、
晶められた感度を有するルきネセンス検電方法（免役梅
定方法その他）を掃供することである。 免１桜・検定ではないが、本発明のルミネセンス反応を
組み入れ侍る検定として次σ）例が挙（１″られる。 （ａ）不浴任ペルオキシダーゼーエラスチン試料からの
ペルオキシダーゼ放出に基くエラスターゼ検電。 （ｂｌ　　共固定イヒしたグルコースオキシダーゼとペ
ルオキシダーゼ°とに基くグルコース検定。 （Ｃ）　　−Ｅ’ルオキシダーゼ、２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオン化合物、または酸化剤例えは
剌は讐化水路の検定（これらの検層でも、椰縁からの生
ＪＩＳ物でもない集合〕。 従って本発明のぎも広い観点によれば、ルミネセンス反
応がペルオキシダーゼ、酸化酌、化学ルミネセンス証の
２，６．−ジヒドロ−１，４−７タラジンシオン化合物
、および一般式 〔本式においてＲは水素原子、ハロゲン；息子、ケト基
、着像されていないかまたは１σ（もされているＣ１−
Ｃ，アルキル基、５４男されていないかまたは置樽され
ているＣ１−ｃ６アルケニル幕、（Ｈ４，、ｐ、されて
いないかまたは通換されているアリール基、總Ｉ　ＪＡ
されていないかまたは（ｂｊ　侯されているアリールア
ゾ基、直換されていないか讐たけｒ＃換されているアリ
ールオキシ基、当押されていないかまたは置換されてい
るアリールチオノ＆、およびｈ？４されていないかまた
は１ト１−便されているアリールジスルフィド基から運
ばれる１　＆＋以上の＋Ｆｌ’換基ｋ　’！（わし、Ａ
お、［びＢは同一であるかまたは互いに屓っていてそれ
ぞれ水素ＫＡ　（−、ハロゲン息子およびｒ、Ｇ　％さ
れているかまたはカ換さｒ５ていないＣ１−Ｃ，アルキ
ル鱗から選ばれる置換基な表わ１か、呼たはＡとＢとは
共同・して −ＣＷ＝ＣＸ−ＣＹ＝ＣＺ− （本式にＳいてＷ、）（、ＹおよびＺは同一であるか士
たは互いに異っていてそオＬぞれ水素原子、ハロゲン原
子およびヒドロキシル塾から選は２ＬるｔＳ置換基表わ
す） を欣わし、但しＡとＢとが別個でｆニー）シ）ときけＲ
は水素原子を衣わさずかつＯＨ：Ｘに対してバラの位ｆ
ｌｌは１％′１卿されているイ、のとし、すだＡとＢと
が共同するときはＷ、　Ｘ、　Ｙ、　ｊ’ｒｍよびＺの
少くとも二つは水メ原子を表わ丁ものとする〕 で表わされるＲｔ感剤の１１１の反応である、高められ
たルミネセンス検定方法が抄倶さハる。 検定方法は好喰しくは免役検建方法である。 本発明は公知の２．６−シヒドロー１，４−フタラジン
ジオン化合物／毛化剤／ペルオキシダーゼ系にある搾の
容易に入手し貨シ・フェノール類またはナフトール類を
添加するとルミネセンス反応の感度かに！Ａ著に高めら
れるとの驚くべき発見に基くものである。 不明Ｍ１１＊において「増感」なる１Ｈは本発明のルミ
ネセンス反応の全党放射おより（または）本発明のルミ
ネセンス反応の信号／バックグラウンド比が、増感剤の
不在における２、６−ジヒ「ロー１．４−フタラジンジ
オン化合物／酸化剤／ペルオキシダーゼ系で得られるも
のより大きいことを意味する。このように［増感Ｊされ
たルミネセンス反応を増大れた検定方法のみが本発明の
範［！１１に属する。 これらのフェノールａｔたはナフトール類の添７７［Ｉ
Ｋよる増感がペルオキシダーゼ゛を使用する反応に対し
て特異的であることが本発明の糸の特に有利な点である
。 本発明の化学ルミネセンス注２，６−シヒドロー１，４
−７タラジンシオン（ＤＰＤ）化合物は、化学ルミネセ
ンス反応にλいて励起状すに転化され、次で光を放射し
て非励起状態にり帰することのできるいかなるＤＰＤ化
合物でもよい。 好ましくけ２，６−ジヒドロ−１，４−フタラゾンゾオ
ン化合物は一般式 （本式において、Ｒ１はアミノ基または置匣されている
アミノ基で矛）つてＲ２、Ｒ３ふ；よひＲ４はそれぞれ
水素胛子、ｊｌ、’！　（めされていないかヂたは置換
れているＣ　１−Ｃ、アルキル基、置トマされていない
かｔたは＠侠されているＣ１”−Ｃ６アルケニル基、ヒ
ドロキシルｇ、Ｃ１−０６アルコキシル基、カルボキシ
ル基、アミノ基、または肖ｊ史されているアミン基であ
るか、祉たはＲ２はアミツノ、（庁たは１り換されてい
るアミ７基であってＲ１、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ
水素原子、ｒ市洟されていないかまたは晒４１！ｔされ
ているＣ１−Ｃ，アルキル＆　、ｒｒ　ｇされていない
かまたは埴゛供されているＣ、−Ｃ，アルケニル偶、ヒ
ドロキシル５、ｃｌ−ｃ、アルコキシル本、カルボキシ
ル基（、アミノ駅、またはｔ漬押されているアミノ基で
あるか、またはＲ□とＲ２とは共同してベンゾ基のアミ
ノまたはｔ！を換アミ・］誘導体であってＲ３およびＲ
４はそれぞれ水素原子、置換されていないかまたは置換
されているＣ　１−Ｃ、アルキル基、置換されていない
かまたは置換されているＣ１−Ｃ。 アルケニル路、ヒドロキシル基、ｃｌ−ｃ、アルコキシ
ル基、カルボキシル基、アミン基または置換されている
アミノ基である） で表わされるものである。本発明に使用するための特に
好ましいフタラジンジオン化合物はルミノールおよびイ
ソルミノールである。 本明細書において、置換されているアミノ基にはアミド
基を含む。 本発明のルミネセンス反応における化学ルミネセンス注
ＤＰＤ化合物の形絆は対象とする検定方法の七Ｉ■よっ
て異る。フタラジンジオン化合物を標穢として使用する
検定方法例えば壱機ルミネセンス免投検定方法の場合に
は化学ルミネセンス江ＤＰＤ化合物は、そのアミノ基が
配位子ｆ１１えはタンパク負、ホルモン、へブテン、ス
テロイド、核酸、中間代謝物、抗原または抗体と結合し
た、２．６−／ｌ−ドｏ−１．４−フタラジンゾオンの
置換されたアミノ誘導体で−ある。アミン基は配位すと
［６゛接結していても架橋膜を介して結合していてもよ
い。適当な架橋膜は、例えば英国ｌ枠許第２，００８，
２４７　Ａ号明細側および米国時ｄ’（自４４，１０４
．０２９号明和１＃における論議から明かな如く当業者
にとって周知である。好ましい架橋膜としては例えばヘ
ミマレア−トか、ヘミグルタラードか、ヘミマレアート
か、カルゼキシメチルか、グルクロニドか、メルカプト
アセタートかカルボキシメチル誘導材、か、から請涛さ
れるものがある。アミノ基は公知の任−框の方法によっ
て配位子に嗣合することができ、かかる方法のいくつか
も英１も１％許鵜２，００８，２４７　Ａ−号明細巌お
よび米国特許ゆ・、４，１０４，０２９号明細４に論じ
られている。￥ｆましい結合方法の例としてはｍ合され
た１Ｉｊｉ：水物、カルボシイミド、および（または）
活性エステルを使用する方法がある。 フタラジンジオン化合物を検尋として使用するこれらの
検定用として適当な化学ルミネセンス性ＤＰＤ化合物は
、アミノ基が配位子と結合している２、３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオンの任意の置所されたアミノ赫
導体であってよめが、好ましい物穎は５−アミノ−２，
３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン（／１ノミノ
ール）および６−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−
フタラジンジオン（インルミノール）でいずれの場合も
そのアミノ基が配位子４゛♀に抗体と結合したものであ
る。 ７タラジンジオン化合物を棒片として使用する以外の検
定の場合には、化学ルミネセンス性ＤＰＤ化合物は配位
子と結′合していない、２．３−ジヒドＯ−１．４−フ
タラジンジオン化仕物、和に上に挙げた好ましい型のも
のである。この垢合化学ルミネセンス性ＤＰＤ化合物は
浴液内で透射しているか、マトリックス上にｒ古〕足さ
れていることができる。特に好ましい材料はルミノール
およびインルミノールである。 化学ルミネセンス性ＤＰＤ化合物、占什削およびペルオ
キシダーゼ１？４ｊのルミネセンス反応を増強する一般
式（１）で表わされる１１：（−のフェノール類または
ナフトール揮１を本検定に使用することができる。しか
し、特（Ｌ化う＝ルミネセンス９．　Ｉ）ＰＤ化合旬が
ルミノールまたはインルミノールである場合、次の増感
剤が特に＃ｌ、度の増感作１１を呈することかりいださ
れた。増ｈ−＆　ｉ’＋’、：　４２４−クロロフェノ
ール、４−ブロモフェノール、４−ヨードフェノール、
４−ブロモ−２−クロロフェノール、２，４−ジクロロ
フェノール、３．４−ジクロロフェノール、４−メチル
フェノール、４−第三ブチルフェノ−”、３　　（４−
ヒ）”ロキシフェニル）フ０ロビオン酸エチル、４−ベ
ンジルフェノール、４−（３’−メチルクロチル）フェ
ノール、４−スチリルフェノール、４−（２°、４−ゾ
ニトリロスチリル）フェノール、４−ヒドロキシフェニ
ル、α−シアノ−４−ヒドロキシフェニル、４−フェニ
ルフェノール、４−（４’−ヒドロキシフェニル）フェ
ノール、２−クロロ−４−フェニルフェノール、４−（
４１−ヒドロキシフェニル）ベンゾフェノン、４−（フ
ェニルアゾ）フェノール、４−（２−カルボキシフェニ
ルアゾ）フェノール、４−フェノキシフェノール、４−
（４’−ヒドロキシフェノキシ）フェノール、４−ヒド
ロキシフェニルスルフィド、４−ヒドロキシフェニルジ
スルフィド、２−ナフトール、１−ブロモ−２−ナフト
ール、６−ブロモ−２−す７トールおよび１，６−ジプ
ロモー２−ナフトールである。これら増感剤のうち、４
−ヨードフェノール、４−フェニルフェノールおよび２
−クロロ−４−フェニルフェノールは特ＫＷ効であり、
４−ヨードフェノールは「も有効である。 ２．３−ジヒドロ−１，４−７タラジンジオン化合物特
にルミノールのルミネセンス反応の＠々Ｖとなる任意の
ペルオキシダーゼ（供与体と定義さｔｔｌ。Ｊｈ酸化水
素、インタナショナルユニオンオブビオケミストリーに
よるオギシｒレグクターセ゛（Ｅｃ　Ｎｏ　１．１１．
１．７　）　　が本発明のルミネセンス灰地、に使用し
得る。例；として、殖物ペルオシダーセ１が芋げられる
。しかし好ｆしい酸素に西洋わさびペルオキシダーゼ（
Ｅｃ　Ｎｏ　１．ｔｌ、１．７　）である。 本賢明のルミ坏センス反応におけるベルオキシダーｔ′
の形態は対象とするに検定方法の楢頻によって異る。ペ
ルオキシダーゼ゛を仲識としてｆ費用する検定方法％に
免投眩５ｙ方法の場合は、ペルオキシダーゼは配位子例
えばタンパク゛に１ポルモン、ハプテン、ステロイド、
核ｊけ、中＋Ｈノ代謝唆

【、抗原またはｈｉ体と結合さ
れる。一般にペルオキシダーゼは架シに肢を介して配付
子に１−＋７される。適当な架橋６セおよび結合操作は
化学ルミネセンス憔ＤＰＤ化合物について土日［″した
ものと同じである。 ペルオキシダーゼを４．％　ｉａとして１１７・用する
以外の一検定方１にの阜）合は、酵素は浴液中において
もマトリックスに同地；化されたとぎも、配位子と糾合
しない透射の形シシにある。 ルミネセンス反ＩＵにおいて２．６−シヒドロー１．４
−フタラジンジオン化合物ｌｉｄ、、　［ルミノールま
たはインルミノールと反応してＤ’ＰＤ化合物の励起を
起させ発光させる任意のＩ′ｒｒ化剤を不発１．１４の
ルミネセンス孜応１ｃ　ｉｄ二用１−ることかできる。 ％に好ましい酸化剤は過ホウ酸イオンおよび過酸化水素
である。 ２．３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物、
またはペルオキシダーゼを配位子に対する債濾として使
用する検斌方法、％に免投桓・定方性においては、既知
量の酸化剤を通常その給源から反応混合物に添加する。 しかし弛のある検定方法の場合Ｋｉｉ酸化剤（通常過酸
化水素）の存在量は未知である。このη−二の型の検定
方法においてを１標識は、基質から酸化剤への転化に関
与する物質、しばしば酵素例えばグルコースオキシダー
ゼ、である。かくしてこの場合には本発明のルミネセン
ス反応は、標識された配位子をルミネセンス反応混合物
中の酸化剤濃度の測定圧よって定量するのに使用される
。 本究明υ）ルミイ、センス反応かし〕の几Ｑ）ノ双躬１
勇−にベルオキクーづ二、臥化丁１す、イ（ｆ糸ト出才
６よひ１じ♀ルミ坏センス社ＤＰＩ）化６物σノ洗択に
圧面さｉ＋るρ・、！た二次的Ｌ”Ｊ子ｔ′ｆ−は渦廖
、μｍ、灰化・ｆτｉｌ　＠　１１３、？昆ヱを速成お
よび・仙九力江により又も人足８ｔＬろ。４（卆σ）ン
ぺ度をｒ７′とイるためＶＣを工、こオ；、ら二仄的囚
子乞詠節して、杓机件の夛】る仙、建σノ谷孝ろな方法
Ｖこよ−ってイｉ−、号効バックグラウンド、Ｉ７．７
１・できる１こけ人ぎい仏！Ｊデでｈす人の発πカ・１
燵らノしるようにしブエは才ｔ（↓７．［ら１にい。 覧件の違には御飯に、酵素１１工わちベルオキク−ヤ′
の触好活←、反応し１、の父１力午、（ｑ用てる装置ｆ
ゝ：１、イ１〜づヌ［バッククラウンげ比すよひ必−安
）、

【ｌ多ルー寺Ｊ）出υ）妥Ｉが、１／Ｃよってイ°
１なわγＬる。 木兄ψ」名らは、最適Ｑ）結果に１４イるためには仝歌
−明υ）ルミネセンス反応を崗友ｇ・・＞　ｉｌｌ　Ｉ
　Ｌｊ−づＵｏＣ・−１崎囲６〜１０、ｈ・も音速には
７−ソυ）札詳１」な尉ｒ１−ドで何なうべきで々、る
こと馨稗、い１こ（７た、小）−隻」υン万ｔノ、ＶＣ
刈する府１当な緩衝乞ト串、ノ貝はリン［１・場、トリ
ス（じドロキシメチル）アミツメメン、ノーーｆミノー
２−メチル−１，６−プロパンジオール、酢酸塩、炭酸
塩および小つ酸塩である。 一般にルミネセンスダル混合物中の反応剤υ）は度は測
８１Ｊ：すべき拐科以外は一定に保たれる。可変因子は
例えは悼繊からの生成物、酸化剤または未結合ペルオキ
シダーゼ、および標識されたｂｅ、位すの＃度である。 次の反応剤＠度は本発明のルミネセンス反応に使用する
のに特に過当である： ベルオキシダー−ｒ　　　　ｏ、ｉμ、！ｌ／−５［）
Ｏｕ〜／リットル酸化剤　　　　　　　　　　　　　　
　　１０μｍｏ１−３０［）ｍｍｏ１／リット、＋１／
化学ルミネセンス性ＤＰＤ化合物 ０．５μｍｏｌ−２００ｍｍｏｌ／リットル増感剤　　
　　　　　　　　１　μｍｏ１−１０［Ｊｍｍｏ１／リ
ットル本発明のルミネセンス反応を行なうには四つの主
要反応剤のうちのいくつかくただし少くとも一つｔ除（
）乞試料管に入れる。次に、欠けていた主要反応剤を’
ＩＫ務加し又ルミネセンス反応ン開始させる。放射され
た元は標準的釦定装を縦例えは元電子壇恰管によって定
量され、それからの４８号は記録計、オツシロスコープ
またはスカラーに送られ表示または記録される。またあ
るｉ）合には元は肉眼で麩徐または４真乾セ（上に記録
される。しかし好ましくは光は英国ｔＰＦ計出願第２ｆ
Ｊ２ｂ６Ｌ＋シＡ号明＃★に６ピｗ、されている型のル
ミノメータ−ｒＣよって定量される。 不発明のルミネセンス反応は二種の主要な免疫恢定方法
に使用することかでき、そのそれぞれの顧者な％鍼はｂ
Ｃ位子に結合される標線の極類である。義歯は次の通り
である： ｆａｔ　　２１　３−ジヒドロ−１，４−ナフタリジン
ジオン化合物のアミンまたは欝換されたアミノ篩尋体で
アミノ基が配位子に結合しているもの、（ｂ）ペルオキ
シダーゼ酵；≠、および（ｃｌ　　基實の、不ルミネセ
ンス反応Ｖこよって欠三周し得る刷科（＝般に過酸化水
素またはペルオキシダーゼ）への転化に関与する６１１
記（ａｔ　、（ｂｌ以外の物質、一般に酵素ガえばグル
コースオキシダーゼ。 上記の免疫検矩方法において（工、恢足丁べき物買の標
ｗｉＣりけ、またはかかる物質の抗体の標識つけがＨＪ
能である。使用する標陳の型に応じ恢定方法は不均一系
でも均−系でもよい。前者の場合は４１雑なυを体例え
ば厘清の分析か可能であるが、俊者の場合には予価的抽
出または和製工程か必賛なことがある、 代表的な不均一系または均−系ルミ坏センス免疫検定方
法の概女を以下に述べる： １、　不均一系ルミネセンス免疫検定 この型の免役検定方法においては検定すべき物質をその
抗体と反応させる。次に遊離の抗体と結合した抗体とを
分子＠する。反応は、抗体か、検定すべき物質か、また
は遊離のもしくは結合したん分と分離後反応し得る別の
分子かケ標緑することによって定４Ｍされる。 ２、競争的不拘−系ルミネセンス兇疫検定この場合には
検定すべき未知量の物質を、標識と既知の駆足された短
のその抗体とを鮎＠させた既知量の該物質と混合する。 憚猷された物質とされていない物質との間で抗体に対す
る妙、争的反工６が起る。抗体と標絃されていない物置
との、および抗体と標陳さした物質との転体な遊離の標
θたもねた物質および標識されていない物質から分離す
る。 抗体と結合した標識された物質の並は４ｇＬ足すべき溶
液中σ）ＰＩ践さねていブよい＠質の蓋に関係する。 これらの諷は抗体に軸台した標識の重ｙ！′測疋するか
、残存する遊離の標識された物ηの五を測足することに
より足Ｓ−Ｓることができろ。ペルオキシダーゼが１ｍ
蹟であり抗体が固４（ｌすなわちガラス試験管の壁に粘
合しているこの型の侠定方法の例は英国特許第２．Ｌ＋
　４４，９２７　Ａ号明細誉に記されているー ３、′２位置′不均−系ルミネセンス免役検定この城の
免疫検定方法においては検定１べき物質を先ず標識され
ていないその抗体に結合し仄にその抗体を同相支持体た
とえばプラスチックに結合する。（抗体と物質との）錯
体は次に、標識された抗体によつ℃処理する。得らハた
固俸飴杯甲の標にされた抗体の分析は、次に固俸緒俸を
浴徹から分離し、仄で分離された固体飴体中に存在する
標識の′Ｍｉ：、または溶液中に溶解している残有−の
標識された抗体中に存在する標識の爺ン帥定すること罠
よって行なわれる。 この型の免疫検定方法の別の態様においては、検定すべ
き物質を標識された抗体、およびｗ、鍍されていない、
固体に担持した抗体に逐次軸台するか、または標識され
た抗体と柳６にされていない抗体との両方に−Ｅｆｘ−
階で結合する。 ４、均−系ルミネセンス兄疫検電 この方法は標識が、２，６−ジヒ１０−１，４−フタリ
ジンジオン化合物のアミンまたはに挾されたアミノ誘導
体である免疫検定方法に適用できる。これは対象である
遊離の標硫された物質（またはその抗体）から放射され
る元の強度または肢長が対象である結＠された標翻され
た物質（またはその抗体）から放射される元と異ること
に基いてＸ、翫る。 一例として、（プロゲステロン−イソルミノール誘導）
複合体、ヘム触媒および過酸化水素の反応により放射さ
れる元の強度は同じ反応な抗プロプステロン１ｇＧ　（
７）存在で行なうときの強度より低いことが見いだされ
た、 すなわちこの検定方法においては未知のプロゲステロン
試料Ｙ５’Ｃ丁既知量の抗グロゲステロン馳Ｇと共にイ
ンキュベートした。半田到過佐既知址のプロプステロン
−イソイルミノール酩４複合体を添加し、次に既知量の
ヘムおよび過酸化水素を加えた。放射された光ン測足し
、これにより未知試料中に存在するプロゲステロンυ）
′Ｍｙｉｌ−標早曲線から求めた。（未知試料中のプロ
プステロンの解が多い相平衡において残存する遊離１ｇ
Ｇが少くルミネセンス反応の元の収率が低い）。 このようにして、プロゲステロンのｋｎを分離工穆の必
要なしに達成することができる。 上記免役検定方法のすべてにおいて、建麺、快出および
探索の工程に不発９］のルミ坏センス反応を適用し得る
。 上記免疫検定方法に使用する抗体は市場から胴入しまた
は既知の免投写的手法によってｎ１ｉｊｊることができ
る。抗体は抗体（複ば）の４Ｘ雑な混θ物の形態であっ
ても、または一つ以上のモノクローナルな抗体であって
もよい。一般に抗体の１９ｒ太各積は僅かであり、抗体
はその活性に対して逸当なｐ）ｆ、イオン１Ｍ度および
温良条件に保たれる。 本発明σ）ルミネセンス反応ン利用する免＆検電方法に
は以ドに列挙する物質が有利に使用し侍るがこれに限ら
れるものでけ１よい：タンパク銅、例えばインシュリン
、アルファフェトタンパク貴およびフェリチン、ホルモ
ン例えば成長ホルモン、上皮小体ホルモン、卵胞刺戟ホ
ルモン、黄体形成ホルモン、甲状腺刺戟ホルモン、向Ｉ
！１」狗皮質性オルモン、グルカゴン、プロラクチン、
およびカルシトニン、ハプテン／ステロイド例えはエス
トリオール、プロゲステロンおよびコルチデル、医薬例
えばジゴキシン、抗原例えば細胞表面抗原および発がん
抗原、および抗体例えばおたふくかぜビルス抗原、ヒト
免役グロブリンＧ（工ｇｆ））、ウサギＩｇＧ　、ヒツ
ジＩｇＧ　、モルモットエｇＧ、　　ロバエｇＧおよび
ヒト免役グロブリンＥおよびＭ。 本発明のルミネセンス反応はまた」１此の兄＆恢定方法
以外の検定方法にも使用することができる、例として仄
のものヲ挙げることかできる：１、　不浴餘ペルオキ７
ダーゼエラステン試料からのペルオキシダーゼ放１ｔｌ
Ｋ基（エラスターゼの検定 この＄建方法においては、固体のエラスチンーペルオキ
シダーゼダ合体ケ他々の量のエラスターゼ゛と共にイン
キュベートする。所定時間侯禾反応の似合体を遠心分離
によって除去し、上澄欣について結合していないベルオ
キシダーセ゛ン憤足１”る。 上泄欣中に存在する不結会ベルオキシダーセ゛の匍は被
験試料中のエラスターゼの活性とμｍ係している。 ２、合成ペプチド基質からＱ）イソルミノール放出に基
（プロテイナーーｔ！″検ボ。 この検定方法においては、固定化された合成ポリヘプチ
ド基質であるアフィゲル（Ａｆｆｉｇｅｌ　）ｉ　（ｊ
　−Ａｈａ　−Ａｌａ　−Ａｌａ　−Ｐｈｅ−イソルミ
ノールな櫨々の鴛のデロテイナーセ′によって処理する
。 Ｈｒ定時ＩＭＩ佐未反応基質を遠心分離によって尿去し
、上＆敵についてイソルミノールを検定する。、上浴漱
中に存在するインルミノールの証は被験試料中のデロテ
イナーゼ活性に関係している。 ６、共（６）に化したグルコースオキシダーゼセ゛とペ
ルオキシダーゼに基くグルコースの検定。 この検定方法においてはグルコースオキシダーゼとペル
オキシダーゼとン支持体９１１えはセファロースまたは
プラスチック官上に共固建化する。これにルミノールお
よび増感剤の溶液を加える。最後にグルコースの浴液を
加え、うｔの放射を記録する。元の放射はｌ＠液液中グ
ルコース貨と直接に関係している。 本発明の＄力！方法およびルミネセンス反応の主用途は
臨床枳丘室または外科である。かかる侠食室および（筺
たは）外科においてはＤ「定の夢、定挟作に使用すべき
Ｉ料を杖足キットの形で人手１′るのが通′濱でルンる
。 従って本発明はまた ｔａｌ　　ペルオキシダーゼ （ｂｌ　　−駄犬ｆｉ＋で択わされ、式中において１（
ＸＡおよびＢは先に定義した辿りである増感剤、および （Ｃ１化学ルミネセンス性の２，６−シヒドロー１．４
−フタラジンジオン化合物 ケ含有して成る、不発明の高められたルミネセンスまた
はルミツメトリー威建川の恢にキントを提供する。 恢足キントはまた酸化剤ン含んでもよいが、多くの場合
Ｇｉ酸化剤は別個に提供されるか、または恢足丁べき物
質である。 好ましくは、ペルオキシダーゼ、醗化却」、瑣感沖」、
および化学ルミネセンス住ＤＰＤ化せ物はそれぞれ、先
に本発明の検定に位・用するに好ましいものとして列挙
した’ｌ！Ｉ負である。本笹定キットｏ）特に好ましい
一憇様においては、ペルオキシダーゼと化学ルミネセン
ス性ＤＰＤ化会物とのうち少くとも一つは＆′ＪＥ′″
ｆべぎ物質の抗体罠結合される。 必狡に応じ検定キットにはまた、作・定１ヘキ１々−買
の既知旬なそれぞれ貧有する一種以上の標準浴液および
（または）−椎以上の好ましい板伽漱が合まれていても
よい。恢足キットはまた、検矩の実施に際し放射された
元の測足に使用する装置と共用するのに適当な反応容器
ケ宮むのが便利である。また反応剤を十分に混合するの
に使用するための混合装置も検定キットに含むことかで
さる□以下不発ψ１の横尾方法、ルミネセンス反工Ｃ；
および検定キットについて説明するかこれは単に例万く
のためでスリって本発明はこれに限定さ才りるものでは
ない。 Ｌシ一応１１り 西洋わさびペルオキシダーゼ［ＥＲＰ　二ｉｆｉ度（ド
数（Ｒｅ１ｎｈｅｉｔ　Ｚａｈｌ　）　（Ａ　４０３の
Ａ２５０に対スる比、ＲＺ）約１．Ｕ〕はＨｕｇｈｅｓ
　ａｎｄ　Ｈｕｇｈｅｓ社（Ｒｏｍｆｏｒｄ、　Ｅｓ５
ｅｘ　）から入手し、２．６　ｃｍ−Ｘ　４−Ｄ　ｃｍ
のＡＯＡ　６４カラム（ＬＫＢインストルメンツ社、５
ｏｕｔｈ　０ｒｏｙｄｏｎ、　５ｕｒｒｅｙ　）　ｙ使
用するゲ／Ｉ／副過によって１７１した。カラムはＮａ
１ｌ　　Ｌｌ、１５　ｍｏｌ　／　ｌを含むＬｌ、Ｌｌ
　１５　ｍｏｂ　／　／リン酸塩敏何Ｍ、　（ｐｌ（７
−２）を狸：用して溶縮した。得られた摺装ベルオキ７
ダーゼのＢＺは約３．０であった。 アルファフェトタンパク５１　（ＡＦＰ　）　、ウサギ
抗ヒトＡＦＰ　（コード１００−０［Ｊ８　）ツ・ζよ
υ・ウサギ抗ヒトＡＦＰ　／　ＨＲＰ　核Ｏ棒はＭｅｒ
ｃｉａ　Ｂｒｏｃａｄｅｓ社ＤａｋＯｐｒｏａｕｃｔｓ
　（Ｂｒｏｃａｄｅｓ　ｋｉｏｕＢｅ、　Ｐｙｒｆｏｒ
ｄ。 Ｗｅｓｔ　Ｂｙｆｌｅｅｔ、　ＷｅｙｂｒｉｃＬｇｅ、
　５ｕｒｒｅｙ　）から入手した。 チロキシン（Ｔｔ）、ウサギ抗Ｔ４被榎宮オヨヒＴ、／
）ｉＥＰ″Ｏ合体はＢｏｅｈｒｉｎｇｅ　ｒ社（Ｌｅｗ
ｅｓ、　９ｕｓｓｓｘ。 英国）から入手した。 、ＩＡ　ｌｔ”？ビルス（ヒト）被徐ビーズおよびＤｔ
ヒト工ｇＧ　（ヤギ）　／　１（Ｉ（Ｐ　％４合体ｋｌ
　ＡｆｆＯｔｔ　Ｗｒ　Ｓｔ所、診断墨矢部（Ｂｒｉｇ
ｈｔｏｎ　Ｈｌｌｌ　Ｐａｒａｄｅ、　Ｂａｅｉｎｇｅ
ｔｏｋｅ。 Ｈａｍｐｓｈｉｒθ）から人手した。 尻重Ｅｌ　（ヤギ）被ｅＶおよび尻重ｇＥ　（ウサギ）
々ルオキノダーゼ榎合俸はＢｅｈｒｉｎｇｗθｒｋθ社
（Ｍａｒｂｕｒｇ　）から人手した。 ルミノール（５−アミノ−２，６−シヒドロー１．４−
フタラジンジオン）およびインルミノール（０−アミノ
−２，６−シヒドロー１，４−フタラジンジオン）はＳ
ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　社（ＦａｎｃｙＲｏａｄ
、　Ｐｏｏｌｅ、　Ｄｏｒｓｅｔ、英国）から入手した
。ルミノールのモノナトリウム塩は既に報告されている
方法（Ｈａｍら、Ａｎａｌ、　Ｌｅｔｔ、、　１９７シ
、１２．５ろ５）によって調製した。 ７−ジメテルアミノナ７タレンー１．２−ジカルボン酸
ヒドラジド（式（［１において、Ｒ１とＲ２とは共同し
てジメチルアミノでｌｔｍされたベンゾ基を表わし、Ｆ
ｉ３−Ｒ４−Ｅである化せ物）はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
゛社（Ｍａ、ｎｎｈｅｉｍ　）から入手した。 Ｎ−（６−アミノヘキシル）−１４−エチルインルミノ
ールはフィンランドのＬＫＢから入手した。 フェノール類Ｊづよびす７トール類は、２−クロロフェ
ノールおよび２，４．６−ドリクロロフエノール（Ｆｌ
ｕｋａ社、Ｃｈｅｍｉａｃｈｅ　Ｆａｂｒｉｋ　（ＯＥ
９４７０、Ｂｕｃｈｓ、スイス）〃・ら人手〕、２−ナ
フトール（ＢＤＨＣｈｅｍｉｃａｌｓ社、（Ａｔｈｅｒ
ｓｔｏｎｅ　。 Ｗａｒｗｉｃｋｓｈｉｒｅ　）から入手〕および４−ヒ
ドロキシフェニルスルフィド（ｐｌｕｏｒＯｃｈｅｔｎ
社（Ｇｌｏｅｓｏｐ。 Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ　）から人手Ｊケ除き１べてＡｌ
ｄｒｉｃｈＯｈｅｕ＋１ｃａ１社から人手した。 エラスチン、エラスターゼ、およびクルコースオキシダ
ーゼはＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（Ｄｏｒｓｅｔ
　）から入手した。 分析装置 化学ルミネセンス反応、は１０ｍｍＸ　１０ｉＭで容積
４廐のプラスチック＆ｆす１いｆ＋ａてキュベツト（青
。 ５ａｒｓｔｅｄｔ社、Ｌｅｉｃｅｓｔｓｒ　ＩＪ　３　
　ｉ　ＵＱ、英国）中で行なった。放射光は既に＠ｉ皆
されているルミノメータ−（Ｃａｒｔｅｒら、英し！ｉ
ｔイ＋　ｉｔ”Ｉ−出願第ン（Ｊ２５６０９Ａ号明細書
参照）に、数個のキュベツトを元部°子増倍°Ｈの元宛
、し伶の前に正確にかつ丹机性良（順次位置できるよう
改変を加えて足先、した。 結果は簡速蓋位差御１足式チャート記録計（ＰＭ８２０
２型、ＰｈｌｌｉｐＯ社（ｇｌｎａｈｏｖｅｎ、オラン
ダ）、全目盛ふれ時ｔＨ，ｉＬ１．２５秒以１〕上に表
示した。 例　　１ ルミノールおよび４−ヨードフェノールヲ使用するペル
オキシダーゼσ）ルミ坏センス挾足ナトリウムルミノー
ル（５０１１／）：Ｍよび過酸化水素　（６２μＪ、３
０　％ｗ／ｖ　　）　Ｙ　　ト　リ　スｍａｙ（０，１
モル濃度、ｓ８．５）２ｕｏ紅に加える。浴液は使用の
数時ＩＭＪ前に′ｆＡ製し、ルミネセンス反応を開始す
せるのに使用した。１０μｌの４−ヨードフェノールの
ジメチルスルホキシド溶液（４，５４ｍｍｏｌ　７リツ
トル）をキュベツトの一隅に入れ、ウサヤ抗ＡＦＰ　−
１４ＦＦ複合体（ＩＬＩＬＩＯ倍希釈）１０μｌｔ別の
隅に入れた。ルミノール／Ｈ２Ｑ２反応剤（０，９Ｉｔ
）を注入して反応ケ開始させた。放射光を測定した結果
を第１表に示す。信号／バックグラウンド比の改善も測
定し、結果を第２表に示す。 例２−６ ４−ヨードフェノール溶液の添加１１Ｙそれぞれ２０μ
ｇおよび！０μ１Ｆｃｉｑｑ加した以外はｅｌ：　１と
同様に操作した。放射光を創建した結果を第１次に示す
。信号／バックグラウンド比の改善も測足し、結果を第
２衣に示す。 例゛４−８ ４−ヨードフェノールの代りに次の増感剤ン使用した以
外は例１と同様に操作した： ４−ブロモフェノール ４−クロロフェノール ４−ブロモ−２−クロロフェノール ２．７１−ジクロロフェノール ６．４−ジクロロフェノール に、呆を第１表および第２表に示づ一０？Ｉ＋９−１３ 増感剤浴数の添加菫ン９ＤμｌＫ段ｒ　７ＪＯした以外
は例４−８と同様に操作した。鯉、来￥−に１表および
第２六に示す。 例１４−１８ ４−ヨードフェノールの代りに次のｔｔｌ感匍を仮・用
した以外はｉ／１１　ｉと同様に操作した：４−ヒドロ
キシケイヒ酸 ２−ナフトール ６−ブロモ−２−ナフトール ４−ステリルフェノール ４−（４−ヒドロキシフェニル）フェノール結果を第１
表および第２衣に示す。 例１１９−２１ ４−ヨードフェノール１０μｌの代りに次の増感剤５μ
ｌ’を使用した以外は例１と同様に操作した： Ａ−フェニルフェノール １．６−ジプロモー２−ナフトール １−ブロモ−２−ナフトール 結果ＹｉＩ表および第２表に示す。 例２２−２６ ４−ヨードフェノール１０μｇの代りにスの増感剤５μ
ｌを使用した以外は例１と同様に操作した： ４−ヒドロキシフェニルスルフィド ４−ヒドロキシフェニルジスルフィド ４−（２’ｙ４’−ジニトロスチリル）フェノール４−
　（４’−ヒドロキシフェニル）ベンゾフェノン ４−　（４’−ヒドロキ７フェノキシ）フェノールＧｓ
号／バックグラウンド比の改善ｙｔ　ｓ＋ｊｗし、結果
を第３赤に示１−０ 例２７−３０ ４−ヨードフェノール１０μｌσノ代りにＱ１σ）増感
剤２０μｌＸ懐用した以夕Ｙは例、１と同様に法外した
： ４−（フェニルア・戸）フェノール ４−　（２’−カルボキシフェニルアゾ）フェノール ４−ベンジルフェノール ３−（４−ヒドロキシフェニル）２１′ロピオン赦エチ
ル ＋ｉ号／バックグラウンド比の改告欠沖１足した結果を
第６表に示す。 比軟例 ルミネセンス反応混合物に増感剤乞奈７ＪＩＪ　Ｌな力
・つた以外は例１と同様に操作した。結果ン第１衣およ
び躬２表に示−ｆ、。 第　　１　　表 ２０　　１．６−シプロ七−２→フトール　　　　　　
　５　　　　２４（Ｊ１２１　　１−プロ七−２−ナフ
トール　　　　　　　　　５　　　　６５１注：光放射
は光電子増倍管（ＰＭ）の〜、圧７０Ｌｌボルトにおけ
る出力（ｍＶ）として創建 紀　　２　　表 ７ＬＩ １０ ６９７ Ｕ ５ ７６ ５７ ５８ ４ ９３５ ６９８ ２６８ ８７ ４ ４８２ ０５５ ９６１ ６ 一ドフエノールの代りに他の拙々のフェづよびナフトー
ルぶ４（１０μｉｓ　　Ｄｕｓ□中１液）を使用した以
外は例１と同様に操Ｖ射光−を増感Ａｌｌなしのルミネ
センス反ご比較した、フェノールｌたはナフト−王にお
いて放射元麺がその不在の場合よオれはルミネセンス反
応は工ｖ４％されたも結果ン第４表に示１゜ 第　　４　　表 ３１　　　２，３．４−）リクロロフェノール　　　　
　　　あり３２　　　４−クロロ−２−メチルフェノー
ル　　　　　　　ｋ〕す６６　　４−タロロー５−メチ
ルフェノール　　　　　　　あり３４　　　４−クロロ
−３，５−ジメチルフェノール　　　　あり３５　　　
４−−ｆコモ−６、ら−ジメチルフェノール　　　ア９
６６　　４−メチルフェノール　　　　　　　　　　　
　　　あり３７　　　２．４−ジメチルフェノール　　
　　　　　　　　あり３８　　　３．４−ジメチルフェ
ノール　　　　　　　　　　あり３９　　４−ｉ三級ブ
チルフェノール　　　　　　　　あり４０　　　４−（
３’−メチルクロチル）フェノール　　　　　あり４１
　　　α−ノンアノ−４−ヒドロケイヒ酸　　　　　　
　あり４２　　　４−フェノキシフェノール　　　　　
　　　　　アリ４３　　　２、．７−シヒドロキシナフ
トール　　　　　　　　あり＋Ａｌ４４ ルミノールの代りにＮ−（６−アミンへキシ／Ｌ／）−
Ｎ−エチルインルミノールｔ＆用した以外は例１と同様
に煉作した。 し」４５ ルミノールの１（り洗インルミノールを使用した以外は
例１と同殊に操作した。 例４６ ルミノールの代りに７−シメチルアミノナ７タレンー１
．２−ジカルボン際ヒｒラゾド（′ｙ＋−ゾメチルアミ
ノー２，６−シヒドロペンゾ〔ｆ］７タリジンー１．４
−ジオン）ヲセニ用し、フタラジンジオン仕付４１／１
ｈｏｚ　ｋ使用Ｒ１ノ１　：　１０に祁釈した以外Ｇ’
ｊ、　ｆ＋＋　１と１ＩＪ１様に操作した。 例４７ 過酸化水素の代りに過小・２か・ナトリウムを使用した
以外は例１と同様に操作した。 １？１１４８ アルファ７エトタンパクｊＡ（ＡＦＰ　）の恨矩（ａｌ
仇ＡＦＰによる小すスチレンビーズの１及抄（１１５０
０ａｔσ）広口カラスひんにグリノン／ＮａＯＨｙｍｒ
ａ　（Ｌｌ、１　＋ｎｏ１７１　、　ｐｉｔ　８．８　
）　１２ｂｔｎＬおよびＢＳＡ　Ｏ，２ｂ　＆を゛硝〃
１１シた。次に削成を２０　′Ｃでローラーミキサー上
で２吋１ｂ〕混名した。終−１後ひん（およびふた〕を
ダリシン板＃Ｔ欣（５０駐×６し１）ですづ°いで未結
性アルブミンぞ除さ、髭後に流しぬし℃水を切った、（
２）　　ポリスチレンビーズ１００１１　Ｇｉｉをリプ
ソール（Ｌ４ｐｅｏ１、追録商標、１％、ｂＬＩ０７１
）で３Ｕ分１’ＨＩ洸沖した。蒸留水で況Ｎｆ’抜ヒー
スをグリシン緩衝ＩＫ　２００　ｒａｔと共にブフナー
フラスコに入２を脱ガスした。 （６）　　グリシン緩悼Ｉ液４０［ＪＩＩＩＬ′馨予め
斗ンシ伐したカラス旭に７惨し、つ°ナイＵｉヒトＡＦ
Ｐ　ｉ、５ｍ／＋ケカロえた。’ａ”＋　＃　ｖよく７
昆台した＆）況カスしたビーズを研加した。全体ぞロー
フ−ミキサー上で６時間、２（Ｊ’Ｃで混合し、た・ ｆ４＋　　６１）、Ｔｌ１ｊｌイオグリシンＡｔ術故−
仇坏にす欣乞Ｕγｇし、ビーズ％ｒ：４Ｃ＋０ｔｎｔの
ＰＢＳ　（すｙ　ｋ−１＝。 Ｌｌ、０１５　ｍｏｌ　／’ｌｊ、　Ｎａ１ｌ　　［１
，１５＋ｒ＋ｏｌ　／　ｌ。 ｐ）１７．２’）で２し１抗汗した。第２回のｌ”Ｂｓ
仇欣ｗ９ｃ　　して除（、たのち、ＢＳＡσ＞　ＰＢＳ
　（４０（Ｊｍｊ）溶液（０，５％）ン添〃口した。作
１体を再びローフ−ミキサーにでンＵ“Ｃで面付した。 ６１」分後ｐｎｓ−アルブミンｆｃｉ’ＩＬ　％　４す
Ｔｗｅｅｎ　２０（宿録間標、ＬＪ、ｌｊ１％）を官有
１゛る自ト帥琳板”ｍｊ　？＆（Ｃ１，Ｉ　ｌ１Ｉｏ１
／　ｌ　、　ｐｔｉ　４．２．４ＵＬＩＩｊ）’Ｙ征加
した。１０分１ド・混υヶ灯ったのｂ　１．ｆ′Ｆｍ、
塊緩僅液ンＴｗθθｎ　＋、、＋、ｕ　５％ンへ哲する
Ｆｉｌｓ級備ｋ　（４ｔＪ　Ｄ　ａｔ　Ｘン）で帥挾え
た。Ｋｊ　ｍ　７ＣＰＢＳン傾瀉して〆ｆき、ヒ“〜ズ
ン助献上でンＯ−Ｃで６Ｕ分１ｉｉ４所詠し、た。ビー
ズ（プねじぷた乞しｋひんに４℃で貯蔵した。 １〕ｌ　（１１ｐＩ５ｓ甲の十分な仇割１ルビーズ（ｆ
４＋１　Ｒｔ：　（ａｌ工程〕を１５−ろ０分間脱ガス
した。 （２１ＡＰＩ−を含有−ｉ−る試料５０μ杉乞Ｐ１３Ｓ
　／ＢＳνＴＷｓｅｎ（リンｍｌ’Ａａｌ−１，［）１
％ｍｏｌ／Ａ’５Ｎａｉｌｆ）、１５　ｍｏ１／　ｌ　
、　　ＢＯＡ　Ｌｌ、２％、Ｔｗｑｅｎ　２　Ｕｏ、ｕ
　５％、Ｐｒ１７−２　）　０．９５　ｍｔと共にキュ
ベツトに加えた。浴漱乞６７＝Ｃに温めたのちビーズと
共に１時１ｄ）インキュベートした。 （６）　　次に討故を類潟して除き、ビーズをＰＢＳ　
／ＴＷｅｅｉｎで抗浄しｒ、＝（２０Ｕ紅で１５秒１１
で七、仄に２００　ａｔテ５　分ＩＪ　）。 （４）　　久にビーズンウサキ゛抗ヒトＡＦＰ　／　Ｈ
ＲＩ’す、合体１：’ＩＵＯｔＪ布釈敲０．９脂、と１
時−１インキユベートした。＜複ｅ９ｈはＰＢＳ／Ｓｂ
＊／ＴｗｅｅｎＫ希夛髪シ、ビーズへの酌歳力ｏｈ万に
６／１Ｃに２品めた）。 （ｃｌ（１１浴数を丹ひ額瀉して除き、ビーズを脱イオ
ン蒸拍水で２分間洗伊した。水馨細瀉により除いたのち
ビーズをａ意採くキュベツト＆こ躾した（キュベツト当
り１１内）。 （２）各キュベツトの隅にはプた、１Ｕμｊの４−ヨー
ドフェノールのトリスＫｒ　＞　ｆＬ１！Ｌ（０，１ｍ
ｏｌ／＆ｐｉ−１８，［Ｊ）溶ｆｉ　（１ａｙ／＋ｏ　
）　Ｙ入Ｊ’Ｌり。ルミ／−ル／　Ｈｓ＋Ｏａ　％　Ｑ
　（ナトリウムルミノール（５０１１１＆）、Ｈ２Ｏ２
（６２μＢ、６０’Ａ”／ｖ）、トリス（０，１ｍｏｌ
／／、　ｐＨ８，０，２０υｍｔ　）　）（Ｊ、ｑｒｎ
ｔを注入してルミネセンス反ニーらを開始させた。３０
抄仮の光放射を側疋し、夛）らかじめθ・＋４敦した標
準曲線と比較してＡＰ’Ｐ　ｌ？艮欠＊めた。 ［・１４９ Ｔ４の４ｇ足 Ｔ４を胴争的阿累起ち゛免疫吸水便足を使用して快足し
た、扮爵、２１シていないＴ４　、’：　Ｔ４　／旧Ｅ
Ｐイル合体とを官有する試料尻せ物乞、比定さ１した足
のりＬ１２　＜ウサギ）で被移した愉とインキュベート
した。 十劣到が佐禾粕合υ】旧科を０から仇い去９．１Ｕμの
４−ヨードフェノールのトリス輌・画成（Ｃ１，１［１
０１／　ｌ　、　　ｐａｌ　８．Ｕ　）給液（１Ｂ／　
／　ｍｔ　）　Ｙ　％′粁に入れた、ルミノール／　Ｈ
２−（１２浴液〔ナトリウムルミノール（５ＬＪ　１％
’　＞、ｋｉ２０２（乙２μＥ、６ＬＩ’／′Ｏｗ／ｙ
　　’Ｉ　　、　　ト　リ　ス　（０−１ｍｏｌ　　／
　　ｌ　　％　　　Ｐ’ｌ　　ｂ−Ｌｌ−２０Ｕｍｉ）
’ＪＱ、９＋＋＋ＪＹθ人してルミネセンスレエ［１、
ンロｒ１妬させた□５０移佐の光放射を飽疋し、々）ら
かしめ鉤トした悴辿囲線と比較してＴ４跋度乞氷に・た
、例５〔］ 抗ＰＡ珍工（（Ｇの修犀 仇風炒工ｇＧＹ貧有する試を、試料ｒ１ｂビルス（ヒト
＞ｕｎビーズとトリス験体ｒ　＝甲でインキュベートし
た。況？゛ｐして未反応成分を除いたのち・ビーズを抗
ヒ）　ＸｇＧ　（山手）　／　ＢＲＰ俵甘坏せ、丹びト
リスＬａｘ　ａｓ　液中でインキュベートした。 溶液を傾瀉し、ビーズは脱イオン蒸留水で抗浄した。抗
浄し１こビーズケ水から分酢したり）ちキュベツトに移
した（キュベツト当り１１ｈ：　）。 各キュベツトの胸にはまた、１［Ｊμｌのヨードフェノ
ールのトリス緩イ向ａ　’　１１　、Ｉ　Ｉｏｏｌ　／
　ｌ　％　ｐｔｌ　’ｔ：３　、ＣＩ　）浴数（１〜／
ｍｔ）火入れた。ルミノール／　Ｈ２Ｏ２佑欣〔ナトリ
ウムルミノール（５０〜）、Ｈ２Ｏ２（６２μＪ、３（
Ｊ％ｗ／ｖ　）、トリス（Ｌｌ、１　ｍｏ１／ｌ。 ｐＨ８，０，２ＣＩ　Ｏｍｔ）　）　０．９ｍｚ’Ｙｆ
ｌ入Ｌテルミ不セしス反応を開始させた。３０抄侯の光
放射を体層し、あらかじめ調製した俤ｌも曲届と比較し
て仇必疹ＩｇＧ覗度を氷めた。 例５１ 工ｇＥｏ）＋ｌｉ＋２定 ヒトエｇＥを含南する試Ｖ８＋を尻重ｇＥ　（ヤギ）択
舖官に添加し２０℃で２　ｈ　ＩＭＩインキュベートし
た５、起ｒ後官を抗Ｈ１シて未反応成分７昨さ、既知艮
のすＬ工ｇＥ　（ウサキ゛゛）ペルオキ／ター七“伝台
捧を官に加え、２０℃でさらに２田：）　１ｉｊＩイン
キユヘートシ１こ。 次に遍判の酢系と板付した仇体を洸い去り粕七師索活む
を次のようにして也ノ）足した：各ヤの四に１（Ｊμの
４−コードフェノールσ）トリ　ス會４　Ｔｈ　Ｑ　　
（（）、１　　ｒｎｏｌ　　／　　Ａ’　、　Ｐ”　　
Ｂ−（Ｊ　　）　　浴　ｉａ　（１ｉ”＆Ａｊ　）２人
ｇだ。ルミノール／ｋｉ２０２（ルミノール（５０ｔｒ
ｒｃｔ　）、”２０２　（６２μｉ　％　６０　ｏｌｏ
　ｗ／ｖ　）、トリ　ス　（０，１ｍｏ　１　／　　ｌ
　　％　　　Ｐ”’　　ｄ、ＬＪ　　％　　　ｌ　　［
Ｊ　　Ｏｍｔ　　）　　〕（Ｊ−”ｌ”ン比大してルミ
坏センス反応を開始させた。６０抄後の光放射ン測定し
、あらかじめ声表した伸準曲迦と比軟して工号Ｅ浪度を
不めた、 作５２ エラスターゼの伏足 西洋わさひベルオキシターゼを（ｊ、０．８ａｕｎＣＬ
ｅｒｓらの方法（Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１９　
Ｂ　２．１２６．１２２）により粉末エラスチンと複合
させた。エラスチンペルオキシダーゼ！−渕准１Ｌを仇
沖し、０ａＣ１２（２ｍｎ＋ｏｌ／Ｖ　　）　　Ｙ　含
７１’　　Ｌｉ、ＩＪ　　１　　ｍｏｌ　　／　　ｌ　
　）　　リス妖衝敵＜Ｆ”９）２ｍｔ中で平自贋ゼた。 俵台し・ケ遠心分離して上直液を屏采した、４ｔ々σ）
獣（（ノー１　［，１０ｎｇ／ｌ１ｌＩ／；　）のエラ
スターゼσ】トリス−〇ａＯ１２緩伽准浴液を加え、エ
ラスチン−ＢＲＰと共に３７℃でインキュベートした。 ６［１Ｇ後禾反応σノエラスチンーＭｌ（Ｐを速心分断
りこより除去し、上亀沿のアリコート娑移して再遠心分
離した。Ｌ市電２００μｌをとってキュベツトに入れ、
ルミノール／　Ｈ２Ｏ２／　４−　Ｅｌ−ドフェノール
俗液〔ナトリウムルミノール（５０ＪｊＪｇ）、Ｈ２０
ｚ　（６２μ１１６υ％ｗ／ｖ　）、４−ヨードフェノ
ール（２ｍｌ、　　Ｉ）ＭＳＯ中Ｉ　　Ｉｎ９／ｌｌ１
ｇ）　　、　　ト　リ　スｌｔｍ　衝Ｎ　　（（Ｊ、１
　　ｒｎｏｌ／Ｊｓ　　ｐ）１８．０）２００１１７８
中〕肌９ｍｔン続加して光放射をＣ；ｊ紺さセた。３０
秒後の光放射を伸；足した。 例５６ 共固定化したグルコースオキ７ダーセ゛とペルオキシダ
ーゼ°によるグルコース検定 グルコースオキシダーゼ（５ＩＩｖ、　Ｓｉｇｍａ社）
および西洋わさびペルオキシダーゼ（５■、Ｓ　ｉ　ｇ
ｍａ社）　Ｙ　ＦｏｒｄおよびＤｅｌｕｃａの方法（Ａ
ｎａｌ−Ｂｉｏｃｈ＠ｍ、＋　１９８１．１１０．ｚＬ
５）Ｖこより、臭化シアンで？６ｕ化したセファロース
上に共固疋化した。Ｌ６Ｉ短化した酵木はリン酸塩級両
液（Ｕ、１瞬専、μｍ７．ｃｌ）甲に熱□した、固た化
酵素縁濁故（１００ｍ９／ｌ、りＵｔｔｌ　＞Ｙ、キュ
ベツトに入れたルミノール水浴液（ン５ｎ〕／１（Ｊｕ
ｌ）１鮭と４−ヨードフェノール（ＤＭＥ３０甲１〜／
就）５０μｌに６）加した、仄にグルコース貧有の水性
溶成試料１ＵμｇをＪＪｆｌえ、キュベント内容物ン混
合し、充放＃ｇをに録した。ピークの光放射はグルコー
ス５０　５　［Ｊ　Ｑ　ｍｍｏｌの間でＩｆ　＋Ｗ的で
あった。カリの方法として、グルコースオキシダーゼと
ベルオキ／り′−ゼをプラスチック支持体」二に固定化
することもできろく例えはＬｅａｎら、０１ｉｎ、　Ｃ
ｈｅｗ、。 １９７７．２５．１５５６参照）。 手　　続　　補　　正　　１１Ｆ（方式）％式％ １′ｊＳ件のに示　　　昭和５９年特許願第２２０５７
号３　補ＩＦをする者　　事件との関係　　　特許出願
人イ　　　　ギ　　　　リ　　　　ス　　　　国４　代
　理　人　　東京都港区赤坂１丁目１番１１１号・溜池
東名１５　補正命令の日付　　　　　自　　　　発６　
補正により増加する発明の数 −２４（

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ベルオキシダーセ゛と、酸化剤と、２，３−ジヒ
   ドロ−１，４−フタラジンジオン化合４＾ｌと、一般式 〔本式においてｆ（は水、４−、原子、ハロゲン！！；
   １子、ケト基、六ルきされていないかまたは１１’；ｊ
   ’　；’−さ７してぃ２・ｃニーＣ，アルキル革’、ｆ
   ｉ４搗箋さ才していないかまたげｉ内１爪されているａ
   ｘ−ｃｓアルケニル某、１〜゛俣されていないか寸たは
   ｆｔｔ３ｇＨされているアリール−ｊ、＋　、９＜　換
   されていないかまたは（Ｒ：す＋されているアリールア
   ゾ卑；％　！Ｍ、ｆ’４％さｉｌていないがまたは１＾
   ４ｊｌ’：、されているアリールオキシ基、■ｒＦ＠さ
   ｉｌてぃないがまたは向神されているアリールチオ基、
   および折部されていないかまたはｌＮ！７搏さオｔ【い
   るアリールジスルフィド基から運ばれＺ）１　！ｉば以
   上の置換基を表わし、ＡおよびＢは１ｎｊ−であるかま
   たは互いに丘っていてそれぞれ水素原子、ハロゲン原子
   および置換されていないかまたは蓋部されているＣ１−
   ｃ６アルキル系から選ばれる置換基を表わすか、または
   ＡとＢとは共同して−ＣＷＣχ−ＣＹ−ＣＺ− （本式においてＷ、Ｘ、Ｙおよび２は向−であるかまた
   は互いに異っていてそれぞれ水素ｆｊＡ子、ハロゲン原
   子およびヒドロキシル基から剥ばれる肖゛稙基を表すす
   ） を表わし、…しＡとＢとが別個であるときはＲは水素流
   子を表わさず、かつＯＨ基に対してバラの位置は幌俟さ
   れているものとし、捷だＡとＢとが共同しているときは
   ＷｌＸ、ＹｌおよびＺの少くとも二つは水素原子を表わ
   すものとする〕で表わされる’１９！　ｌｅｔ　ｊｔｌ
   ；’との間の１台められたルミネセンス反応を利用する
   ことを倚Ｃとする、ルミネセンスまたげルミツメトリー
   検定方法。 （２１増感削カ４−クロロフェノール、４−ブロモフェ
   ノール、４−ヨードフェノール、４−−１０モー２−１
   ０ロフエノール、２．４−ジクロロ７ｚノール、６．４
   −ジクロロフェノール、４−メチルフェノール、４−ｍ
   三ブチルフェノール、３−（４−ヒドロキシフェニル）
   ７″′ロビオン酸エチル、４−ベンシルフェノール、４
   −（３１メチルクロ”チル）フェノール、４−スチリル
   フェノール、４−（２１１４′−ジニトロステリル）フ
   ェノール、４−ヒドロ・キシケイヒ酸、α−シアノ−４
   −ヒドロキシフェニル、４−フェニルフェノール、４−
   （４−ヒドロキシフェニル）−フェノール、２−クロロ
   −４−フェニルフェノール、４（４’−ヒドロキシフェ
   ニル）ベンゾフェノン、４−（フェニルアゾ）フェノー
   ル、４−（２−カルボキシフェニルアゾ）フェノール、
   ４−フェノキシフェノール、４−（４−ヒドロキシフェ
   ノキシ）フェノール、４−ヒｒロキシ゛フェニルスルフ
   ィド、４−ヒ「ロキシフェニルジスルフイド、２−ナフ
   ）　−ル、１−ブロモー２−ナフトール、６−ブロモー
   ２−ナフトールおよび１，６−ゾプロモー２−ナフトー
   ルから選ｉ」れる、前項（１）にＲ［ｊ　４１の検定方
   法。 （３１増！ぐ、却１か４−ヨードフェノール、４−フェ
   ニルフェノールオヨひ２−クロロ−４゛−フェニルフェ
   ノールから選ばれ、好ましく　ｔ：！　４−ヨードフェ
   ノールである、ｔｉｉｉ項（２）に１掃の検定方法。 ＋４１　　（５学ルミネセンス性２，３−ジヒドロ−１
   ，４−フタラゾンジメン化合物が−だ／式　　　　−１
   Ｏ （本式において、Ｒ１はアミノ〃、または名゛３１へさ
   れていシ、アミノ基であってＲ２、’Ｒ３およびＲ４は
   それぞれ水素原子、仙俟されていｌ工いかまたは置換さ
   れているＣ１−Ｃ，アルキル基、置Ｉ免されていないか
   簀たけに’ＱされているＣ１−Ｃ，ｌアルケニルフロ、
   ヒドロキシルｇ、Ｃ１−０６ア茅コキシル〃；、カル・
   Ｋキシルノん、アミノ基または置１〜されているアミノ
   基であるか、またはＲ２はアミノたまたはｉｊ’を背さ
   れているアミン基であってＲ１１Ｒ３およびＲ４はそれ
   ぞれ水素原子、置換されていないかまたは儀’　％され
   ているＣ１−Ｃ，アルキル糸、置換されていないかまた
   はｆｉ７［されているｃｌ−ｃ、フルヶニル基、ヒドロ
   キシル基、Ｃ１−Ｃ，アルコキシル基ｒ１　カルボキシ
   ル苓、アミノ４またはｔ＃ｍされているアミンｈ（であ
   るか、またはＲ１とＲ２とは共同してベンゾ基のアミノ
   または的換アミノ間導体であってＲ３およびＲ４はそれ
   ぞれ水＞ｌ♀子、塔′換されていないかまたは首都され
   ているＣ１−Ｃ，アルキル基、置換されていないか丁た
   はｒｊＩｔ偽されているＣ　ｌ　−Ｃ、アルケニル基、
   ヒドロキシル基、Ｃ１−Ｃ，アルコキシル基、カルリζ
   ヤシルヵ（、アミノ基または隔伊されているアミノ基で
   あり、好筐しくけ本式においてＲ１はＮＨ２であってＲ
   ２、Ｒ３および穐はそ才１．ぞｊＨであるか、またはＲ
   ２はＮＨ２てあって８１％Ｒ３およびＲ４はそれぞれＨ
   である） で表わされる、前項（１）−（３）のいず、れかに配４
   をの検定方法。 （５）ペルオキシダーゼが西洋わさび（ｈｏｒｓｅｒａ
   ｄｄｉｓｈ　）ペルオキシダーゼである、ｎｌｌ　、Ｉ
   ｊ−！（１）−（４）のいずれかＫｍｌ帷の枳定方法。 （す１　計化剤が過ｒイ化水＃および１１Ｖ・ホウｆ屑
   イオンから選ｋｉ　ｎ　６、ｍ　ｆＡ　ｆｌｉ　−＋う
   ；ノイずｉｆＬ　ｂ’　Ｋ　＃Ｉ”、　Ａ／、の悩定方
   法。 （７）ペルオキシダーゼか化学ルミネセンス性２．３−
   ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合４Ｆかσ）い
   ずれかをｒ：＋：　Ｃ１子、姓ましくはわ１り・と結合
   させる、ｒＦ＋　９目（１１−ｆ６；のいすｔ（かＫ　
   Ｒｌｆ　；！（ｔの検定方法。 （８）免役検定である１４ｉ１項ｆｌＪ　−（７＋のい
   ずれかに紀載の検定方法。 ｊｐｊｌ（ａｔ　　ペルオキシダーゼ′（匈　一般式 〔本式においてＢは水系原子、ハロヶ９ンｊ仝子、ケト
   基、置換されていないかまたは１１′（撥されているＣ
   １−ｃ６アルキル％、ｊｊ％含・されていないがまたは
   臂換されているＣ　ｌ−Ｃ６アルケニル基、置換されて
   いないかまたはｊ通停さ７′１ているアリール基、＋ｉ
   ｔ’ＪｆＸＩさ才してい１工いかまたは置換されている
   アリールアゾ偕、Ｉｓｐされていないかまたは１埒蛯さ
   れているアリールオキシ基、ＩｆＹｉ？されていないか
   または固装されているアリールチオ基、およびｒＫ　４
   ｐ４されていないかまたは晒へされているアリールジス
   ルフィド基から選ばれる１飼以上の置換井を表わし、Ａ
   ｊｒｉよびＢ＆−【同一であるかまたは互いに放ってい
   てそれぞれ水路原子、ハロゲン原子および置換されてい
   ないかまたは置神されているＣ’ｌ−Ｃ，アルキル基か
   ら選ばれる＠、換〃、を表わすか、またはＡとＢとは共
   同して −ＣＷ−ＣＸ−ＣＹ＝ＣＺ− （本式においてＷ、Ｘ、、ＹおよびＺは同一であるかま
   たは互いに異っていて水矛、原子、ハロゲン原子および
   ヒドロキシル系から４ばれるｊ、１′・１も基を云わず
   ） を表わし、１〔］シＡとＢとが別個であるときはＲけ水
   系！９子を表わさず、かつＯＨ基忙対してパラの位置は
   占ｙ′さハてい６．ものとし、またＡとＢとが共同して
   いるときはＷ、Ｘ、Ｙ、およびＺσ）少くとも二つは水
   素原子をイ、わすものとする〕で衣わされる増都縮、お
   よび （Ｃ）　　化￥ルミネセンス性２，６−シヒドロー１．
   ４−フタラジンジオン化合９夕η を含イｊして成る、（ａ）と（ｂｌとｔｃ＋との間のｍ
   １１められたルミネセンス反応を利用する、ルミネセン
   スまたにルミツメトリー検定用の検定キ遣ット。 Ｑ（１＋　　ｊ？７感（（ｌ力４−クロロフェノール、
   ４−ブロモフェノール、４−ヨード９フェノール、４−
   プロ七−２−クロヮフェノール、２．４−ジクロロフェ
   ノール、６．４−ジクロロフェノール、４−メチルフエ
   、／−ル、４−９．　三’７”チルフェノール、６−（
   ４−ヒドロキシフェニル）７′ロビオン酸エチル、４−
   ベンジルフェノール、４−（３’−メチルクロチル）フ
   ェノール、４−ステリルフェノール、４（２１，４１−
   ソニトロスチリル）フェノール、４−ヒドロキシフェニ
   ル、α−シアノ−４−ヒｒロギンケイヒ１ハ　４−フェ
   ニルフェノール、４−（４−ヒドロキシフェニル）フェ
   ノール、２−クロロ−４−フェニルフェノール、４−　
   （４’−ヒドロキシフェニル）ベンゾフェノン、４−（
   フェニルアゾ）フェノール、４−（２°−カルざキシフ
   ェニルアゾ）フェノール、４−フェノキシフェノール、
   ４−（４’−ヒドロキシフェノキシ）フェノール、４−
   ヒドロキシフェニルスルフィド、４−ヒドロキシフェニ
   ルスルフィド、２−ナフトール、１−ブロモ−２−ナフ
   トール、６−ブロモ−２−ナフトールおよび１，６−ジ
   プロモー２−ナフトール力ら選＆Ｔ、　ｉｔ　６、）＋
   ｊ！　ｎ’ｊ　（９１Ｋ　＆：　？１（７）　検５’ｒ
   ｉ　＃　ツ）。 （１１）　　増ｇ　１ｒｌＪ　カ４−ヨードフェノール
   、４−７エ二ルフエノール、および２−クロロ−４−フ
   ェニルフェノールから選ばれ、好ましく　＋ｊ、　４−
   ヨードフェノールである、前項（１Ｇに８１シ載の検定
   キット。 圓　化学ルミネセンス性の２．６−ジヒドロ−１，４−
   フタラジンジオン化合物が一般式（本式において、Ｒ１
   はアミノ基またはＩＫ換されているアミノ基であってＲ
   ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水：Ａ原子、１酎押され
   ていないかまたは置換されているＣ１−Ｃ６アルキル基
   、ＩＬＬ俟されていないかまたはｌ；ｉ′？曽されてい
   るｃｌ−Ｃ，アルケニル革、ヒドロキシル４、Ｃ１−Ｃ
   ，アルコキシルｐ１、カルボキシル基、アミノ基、また
   は１４換されているアミノにであるか、ｆたはＲ２はア
   ミノへマたはＩＩｊｒ　’Ｉｔｉさｉｔているアミノ基
   であってＲ１％Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素〕京す、
   ％：換されていないかまたは償佃さ才ｌているＣ　１−
   Ｃ、アルキル−品、ｉｃ゛イ伊さＲていないかまたはｔ
   ＃゛ｐｂされているＣ１−Ｃ６アルケニル甚、ヒドロキ
   シ／Ｌ−４、Ｃ１−ｃ６アルコキシル基、カルボキシル
   基、アミノ基、または置換されているアミノ基であるか
   、またはＲ１とＲ２とは共同してベンゾ基のアミノまた
   は置換アミノ誘導体であってＲ３およびＲ４はそれぞれ
   水素原子、置換されていないかまたはｔｆｔ、換されて
   いるＣ１−ｃ、アルキル基、置換されていないかまたは
   置換されているＣ　、−Ｃ６アルケニル基、ヒドロキシ
   に基、ｃｌ−ｃ、アルコキシル基、カルボキシル基、ア
   ミノ基、または置換されているアミン基であり、好まし
   くは本式においてＲ１はＮ１（２であつでＲ２、Ｒ３お
   よびＲ４はそれぞれＨであるか、またはＲ２はＮＨ２で
   あってＲ□、Ｒ３およびＲ４はそれぞれＨである） Ｋよって表わされる、前瑣（９ｉ　−Ｑυのいずれかに
   記載の検定キット。 ０９　　ペルオキシダーゼが西洋わさび（ｈｏｒｓｅｒ
   ａｃｌｄｉｓｈ　）　４ルオキシダーセ１である前項ｔ
   ９１−０２）のいずれかに記載の検定キット。 ０（）　　さらに１好ましくはｉＡ酸化水累および過ホ
   ウ酸イオンから選ばれる酸化ハ１」を含有して成る、Ｑ
   ｌｌＪＪ！＋（９Ｉ−ａｘのいずれかに記載の検定キッ
   ト。 Ｇ！ｊ　　ペルオキシダーゼか、化学ルミネセンス性の
   ２．５−ジヒドロ−１，４−７タラジンシオン化合物か
   を検定すべき物頂に対する抗体と結合する、１ｒｔＪ　
   ｕｓ　ｔ９１−　（１、υのいずれかに記載の検定キッ
   ト。