JPS5978700A - 過酸化酵素測定のための、触媒作用を受けた比色定量および螢光測定用基質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、過酸化酵素、または過酸化酵素結合部分のイ
ノ１在下に、特徴的な色または螢光を発するためＫｎ用
な、改良された比色定量または螢光辿１定用基質に関す
る。さらに詳細には、それは、発色またに螢光発生反応
を高めるための促進剤を基質中に利用している基質とそ
の使用方法に関する。 大ざっばに言えば、この促進剤は、置換されたフェノー
ル化合物より成る群から選択されるべきであり、そして
同一の、促進剤を含まない基質と比べたとき有意の速度
増大をもたらさねばならない。 過酸化酵素類、特に西洋わさび過酸化酵素、は、多くの
酵素結合免疫検定系において選択される酵素となってい
た。西洋わさび過酸化酵素は極めて安定であり、高い基
質回転速度を有し、しかも種々の異なった基λ、かも色
素原および螢光発生素手り、Ｖ、　！吻の両方を得るこ
とかできる。この色素原基質は、目視による定性的６１
１１定には理想的であることが証明されたが、一方向力
の型の、１８質は器械により検査される定量的な測定に
広く適用され得ることがわかった。ニューシャーシー州
、フリーホルト、ウオーシントン・バイオケミカル社（
ＷｏｒｔｈＬｎｇｔｏｎ　Ｂｔ、ｏｃｈｅｍｉｃａｌ　
Ｇｏｒｐ、）。 Ｗｏｒｔｈ＊ｎｇｔｏｎ　Ｋｎｚｙｒｎｅｓ；　＝ニー
ヨーク、アカデミツク・プレス（ｋｃａｔｉｅｍｉｃ　
Ｐｒｅｓｓ）、ケイ・ジー・ポール（Ｋ、Ｇ、ＰａａＺ
）（１９６３）、　Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ。 第９巻、Ｂ部、７章；およびエイチ・ニス・メイソン（
Ｈ，Ｅ３．Ｍａｒｏｎ、）、　Ａｄｖａｎｃｅｓ　Ｉｔ
ｚ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、。 （１９５７）、１９．７９　　を参１ｊｊされた〜・。 おそらく、西洋わさび過酸化酵素のもつとも広く普及し
た用途は、ＥＬｉＳＡ　（酵素結合免役検定）決定と関
連しているけれども、その使用はそのように限定されて
はいない。事実、西洋わさび過酸化酵素は、それらの各
酸化酵素と関連した、グルコース、ガラクトースおよび
一定のアミノ酸の検出および定量のための組み合わせ検
定にも用いられることができる。 過酸化酵素が標識として用いられる系では、最終的測定
は、それが定性的なものであっても定量的なものであっ
ても、比色定匍：法または螢光測定法のどちらかで行な
われる。典型的には、これには、その酵素を、　＞ｒ＋
＋常、過酸化物型酸化剤、その酵素と１′Ｉｌｖ化剤と
のイア右下で反応して色または螢光を発することができ
る化合物および緩衝系、を含有する。比色定量または微
光測定用基ノ員と反応させることが含まれる。 色素原または螢光発生素化合物（ＡＨ２）　　を含有ず
Ａ通常の基質の存在下での西洋わさび過酸化酵素（ＨＲ
ＰＱ）　　の反応は： ６、化合物ｉＩ＋Ａ）１２３→）ｌ　ｉ（Ｐ　Ｏ−１−
Ａ　Ｉ　’によって５図式的にあられすことができる。 第一の生成物は、浴液中で反応する基であって、色素原
または螢光発生率である最終生成物を形成することがで
きる。普通、に７は、Ｋ４　よりはるかに大きく、その
ため％　ｌｓ二の電子引き抜きが速度を制限する。〔ビ
ー・チャｙ　ス（Ｂ、ＣＡａｒＬＣｇ　）　、　Ａｒｃ
ｈ。 Ｂｉｏｃｈｇｒｎ、　ＢｔＯｐｈ’／　　（１９５２）
、　　４１．　４０４＋　　同４１６−’−ジ〕。上の
反応２および６は両者とも、基質から酵素への単一電子
の移動を含んでいる。 〔ビー・ジョーク（Ｐ、Ｃｒｔｏｒｇｇ）、　Ｎａｔｗ
ｒｅ（１９５２）。 １６９．６１２；　　ビー・チャンス（Ｂ、Ｃんａｎｃ
ｅ）。 Ａｒｃｈ、Ｂｔｏｃｈｔｒｎ、Ｂ＊ｏｐｈｙ、　（１９
５２）、　４Ｌ４０４、同４１６ベージ〕。Ｋ１は、過
酸化水素が限定量存在する時のみ速度を制限し、そして
そのため見かけの速度に影響を及ばず化合物はどれでも
、たいていは、Ｋ４、すなわち第二電子引き抜きに影響
を及ぼす。上に述べた型の絆を用いる系ならどんな系で
も、生成物形成速度を促進するどんな要素または触媒を
用いても事実上、分析時間が短縮され、感度が高められ
るであろう。すなわち、酵素結合免疫検定では、速度の
倍加することによって初めの反応時間が半分となるであ
ろう。 、この議論を論理的に拡張すれば、もし時間を一定に保
つならば、そのときはこの試験系は、最初に検出１ｊ」
能であった分和物の半量を検出することがでするはずで
ある。同様の考察は、非結合の西洋わさひ過酸化酵素＾
・用いる連結反応に当−（はまる。 酵素の１＞’ｒ　’＋’Ｊにそのような望ましい増大を
ひきおこすことのできる、多くの分析条件が先に述べら
れてきた。西ｒ１：わさび過酸化酵ヌ−の活性を増大才
せることが公知の化合物には、窒素を含む配位子［アイ
・フリト９ピッチ（１，ＦｒＬｃＬｏｖＬｃｈ）、　Ｊ
。 Ｂｔ、ｏｔ、ｃｈｅｍ、＜１ｑ６６＞＊　２３８．６ｑ
２ｏ、　　パルミチン酸〔エイ・ケイ’ｆｆットー（Ａ
、　Ｋ、　Ｍａｔｔｏｏ）オヨヒウイ・ライ・モデイ（
Ｖ、Ｖ、ＭＯｄｚ）　（１９７５）Ｂｉｏｃんｅｒａ：
＊ｃａ　、Ｂｔｏｐｈｙｓ　ｋｃｔａ　３９７．３８１
　’：］、および非イオン付洗浄剤〔ビー・ボーストマ
ン（Ｂ。 ｐｏｒｓｔｍ、ａｎｙＯ外（１９８１）Ｇｌｉｎｉｃａ
　Ｇｈｇｍ　ｋｃｔａ。 １０９．１８５：］　　がある。１９６６年に、フリビ
ビツチ（Ｆｒｔｄｏｖｔｃｈ）は窒素含有配位子のアン
そニア、ピリジンおよびイミダゾールが、西洋わさび過
酸化酵先によるジアニシジンの過酸化連取を増大させる
ことを証明した。その後の研究で、クレイボーン（Ｃ６
αｔｈｏｒｎｙ）およびフリドビツチ（Ｆｒｉｄｏｖｉ
ｃｈ）は、この促進の機構には、基質基中量体からの第
二電子の引き抜きを容易にする求核性塩基が含まれるこ
とを示唆した。（Ｂｉｏｃｈｇｍ（１９７９）、１８，
２３２９）。この著者達は、また、２つの別個の段階と
しての２つの電子の引き抜きが、過酸化酵素反応中に起
こる眞の機構であることも示唆した。もしもこの提案さ
れた機構が正しいならば、この遊離基はその酵素に結び
つけラレ、そして第二電子が生成物を形成するための中
間転位とともに引き抜かれた後にのみ開放される。しか
しながら、この提案された２価の引き抜きは、その他の
１価および単純な２価の提案〔ビー・チャンス（Ｂ、Ｇ
ｈａｎｃａ）　１９５２．ビー・ジョーク（Ｐ、ＧｇＯ
ｒｙｇ）、、　１９５．２．７−／ｌ／　−ｏ　−ｒ　
ｙ　（Ｒ。 Ｒｏｒルαｎ）およびエイチ・ビー・ダンフォー）”（
）ｌ。 Ｂ、Ｄｕｎｆｏｒｄ）、　Ｂｉｏｃｈｅｒｎ　（１９７
２）　１１．２０７６゜アール・ロマン（Ｒ，Ｒｏｍａ
ル）およびエイチ・ビー・ダｙ７オード（Ｈ，Ｂ、Ｄｕ
ｔげｏｒｄ）、　Ｃａｎ、、Ｊ、　０６ｇｍ。 （１９７３）、５１．５８８１と矛盾している。しかし
、クレイボーン＜ａｔαｔ　ｂｏｒｎｅ　）およびフリ
ト゛ピッチ（ＦｒｔｄｏｖＬｃｈ）によって提案された
機構〔（上述の卸−宵、子引き俵き（ピー・ジョーク（
Ｐ、Ｃ；ｅｏｒｇす；１９５２、　　ビー・チャンス（
Ｂ、Ｃんａｎｃｇ）、　　１９５２）を参照〕は、ｔｉ
ｌ逆件の２電子酸化に関与することが公知〔ピエツデ（
Ｐｇｅｔｔｅ）外、Ａｎａｌ、　Ｇｈｅｒｎ。 （１９６２）、３傷９１６〕の、Ｏ−ジアニシジンおよ
びρ−フェニレンジアミンの２つの化合′吻の、西洋わ
さび過酸化酵素基 ついて集めた管制に基づいているので、ｔｌ−屈して評
イ曲さ第１ねはならブ、

【い。フリドビツチ（’Ｅ”ｒ
ｔｔＬｏｖｔｃｈ）（１９６３）もまた、Ｏ−ジアニシ
ジンおよびρ−フェニレンジアミンについてＲ’察され
たＪ　ｐ’ｉ″化速度論は、他の１／喧−１・わさび過
酸化酵素基＋１，４については見出されなかったと報告
した。このことは、２電子引き抜きは、基質が二ｆＩ酸
化を￥ｉ易に・Ｖけることができる場合にのみ起こるこ
とをｙ＋＜’　（１，Ｑ’す２）であろう。 窒素含負配位子に加えて、パルミチン酸が０−ジアニシ
ジンの西洋わさび過酸化酵素による過酸化の速度を増す
ことが証明された〔マツ）　−（Ｍａｔｔｏｏ）および
モデイ（Ｍｏｄｉ）、　１９７５）。　しかし、パルミ
チン酸による活性化は、低基負濃反でのみ起こり、基質
が大過剰に存在する、酵素結合免疫検定のような分析系
では、垂要な効果をもたないであろう。しかしながら、
パルミチン酸による活性化は、基質の消粁が起こる、酸
化酵素と組み合わせた反応に有用であろう。比較すると
、パルミチン＾９゛による西洋わさび過酸化酵素の活性
化は有用１１．力糟〈られるように見えるけれども、非
イオン性洗浄剤による西洋わさび過酸化酵素の活性化は
、より大きな適用性を有している。 商業上手に入れられる非イオン性洗浄剤であるトウイー
ン（ＴＷｇｇｒＬ）　　２０およびトリトｙ　（Ｔｒｉ
ｔｏｎ）Ｘ−１００は、多くの異種の基質の過酸化を増
大サセルコとが、ポーストマフ　（Ｐｏｒｚｔｒｎａｎ
ｎ）外（１９８１）によって証明された。この系では、
酵素−免疫検定における分析感度は、非イオン性洗浄剤
゛の添加によってほば倍加された。非イオン性洗浄剤に
よる活性」１９大は、西腎わさび一シ、ｓ　ｒｑυ化酵
素の不活１−１．化の減少の結沫である。時間ｔ・；よ
び１１．ＡＪ’Ｌに依存する不活付化は、多分、鍋酸化
水素と酵素との間の末端錯体の形成の結り！で漆）／〕
つ。［エイチ・ギヤ９テイ（Ｈ，Ｇａ１Ａａｔ　Ｌ　）
　、　Ｊ、　Ｇｌ　ｔ　ｎ、　Ｏｈ　ｅｍ、。 Ｂｔｏｃｈｅｍ、　（１９７７）、　１５．６９９１゜
　このことは上記の点、すなわちアンモニウム配位子を
用いる速ｙｙの増大〔フリドビツチ（Ｆｒｉｃｔｏｖｔ
ｃｈ’）（１９６３））またはＴｗｔｅｎ２０を用いる
速度保持〔ボーストマフ　（ｐｏｚｔｍａｎｎ）外（１
９８１）］により増大された分析感度が可能であること
を、はつ六り示している。 本発明は、少なくとも一部分は、一定の１Ｎ換フ工ノー
ル化合物が、基質、特に西洋わさびＡ酸化酵素のような
過酸化酵素の存在において色または螢光を発するのに有
用な基質の色素原または螢光発生素反応を大きく促進さ
せる能力を有しているという発見に基づいている。大ざ
っばに貰えば、本発明の基質は、過酸化物酸化剤、過酸
化酵素と酸化剤の存在で反応して色または螢光を発する
こＪ・、のできる化合物、およＯこの基質と混合された
促進剤、を含有するであろう。この促進剤は、置体され
たフェノール化合物より成る群から選択さｆｔ、そして
、他の点ではり一の、促進剤を含まな℃・基質を同じ条
件下で反応させたものと比べて、少なくとも約５０パー
セントの促進をもたらさなイてはなｌ：）ない。 非常に多くの促進剤が、本発明に有用であるけれども、
缶も好適な促進剤は、バニリン、４−り１１ルー６−′
オチルフェノールおよび４−ヨードツーノールより成る
群から選択される。特定の場合に用いられる促進剤の量
は、用いられる色素原ま、−は螢光発生素化合物の型を
含む多くの、ｏラメ−９−に依イエするけれども、一般
に、促進剤−使用凌水準は、約１ミクロダラムから約１
ミリグラムまで変わるであろう。もちろん、埴終的な使
用禁・ｋ準は常用実験法を通じて調整を必要とするであ
ろうが、しかし一般的に貰えば、先述の範囲で本発明に
したがう大多数の基質と測定が網羅されるであろう。 本発明の基質に用いるのに最も好適な色素原または螢元
発生累化合物は、ＡＢＴＳ　、すなわち、２゜２′−ア
ジノージ−（６−エチル−ベンゾチアゾロン−６−スル
フトン酸）、であるけれども、イｌ】のそのような化合
物１も何月である。例えば、フェノールレッド、Ｏ−フ
ェニレンジアミン、ピロガロール、４−アミノ−アンチ
ピリンおよびブロムピロガロールレッドが本発明に有用
である。 第１図は、不発１−←連の促進された基ｖ１および促進
されない通常の基質に対する吸光１則の変化を２１、を
間の函数として描いているグラフであり。 第２図は、各々、本発明に従が５、イＪ１進された比色
用基質、および通常の非促進比色用基質、を用いる。一
連のグルコース合有試料に対する吸光度の飢みを示１′
グラフである。 上記した辿り、本発明の基質は、ｊ７．−１師化酵素ま
たは過酸化酵素結合部分の存在において、’Ｆ、’＋徴
的な色または螢光を発するのに有用である。本発明の基
質には、一般に、過酸化物酸化剤（最も好垂には過酸化
水素）、過酸化酵素とこの過酸化物酸化剤（例えばＡＢ
ＴＳ）との存在で反応して色または螢光を発することの
できる化合物、およびこの基質材料とｒｌｆ＝合したイ
「進剤、が含まれる。この基質は、置換されたフェノー
ル化合物類より成る群から選ぶのが有利であり、そして
、他の点では同等の、イノ１′進削を含まない＾（質を
同一条件下で反応させて比較したとぎ、少なくとも約５
０パーセントの促進をもたらさなくてはならない。 比色用基躍に対する相対的な促進度は、最も有利には、
分光光度計によって測定される。すなわち、比較試験を
、通常の基質と、本発明による置換フェノール併進剤を
混合した同一基質との間で実施する。この２つの試験は
、一方に促進剤化合物か存在することを除き、すべての
点で等しく、そして、さらに少魁の西洋わさび過酸化酵
素を加えることによって試験基Ｊ員を反応させる。その
後、与えられた波長（例えは４１５ナノメートル）での
分光光度計によって測定された吸光度を、各試験基質に
ついて時間の函数として記録する。それから、同じ１１
３間の終りでの、１市常の基質と本発明の促進された基
質とに対する吸光度のｊｂｌ’＋みを、後者をＭｉＪ者
で割って１００倍することによって、比較すイ）。実月
１のためには、通常の対１１（ｊ　！ｐ）ｌと比較して
、その仙’）　；７５．された基質に対し、少ｆ、「く
とも約５０・ξ−七ントの吸ｙｔ度の増大がｉｒｌ　、
：　’ｆ、１′、さＪ（ねＱ、［なら／、（い。 本発明の促１０　ｊ’１１は、り１′疏に＆’ｌ１、バ
ニリンおよび式 の化合物Ｊり成イ）群から選択されるべきでル、イ）こ
とかわかった、式中、Ｈｌは、ハロゲン、ハロゲン置換
されたフエノギシ化合物、ヒビロギ／フェノンまたは、
カルボン酸またはそのアルキルエステルでル）す；　１
（２ｋｌ水素、ヒドロキシ基、ハロゲン、１−６個の炭
素原子を有する１置換および装置ｍのアルギル、ＩｉＱ
　、アミノ基、または、カルボン酸またはそのアルキル
エステルであり；そして、１う、Ｒ４および１（５は、
各々ハロゲンまたは水素である、上記式中、「ｌ（」置
換基からの引込線は、各成分がフェノール環のどの位１
ｉｊｉにあってもよいということを７１＜−す。 本発明にＩｒ（ｉ　ウ、比較的好適な化合物が以下の表
に示されて、ｈ；す、この表にはずだ、他の点では同等
の、促進剤を含まないＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２／緩衝剤基ノ
ｌｆと比較したどき達成されろ名促進度も記紀されてい
る。 第１表 ２．５−ジクロルフェノール　　　　　　　　　　４５
２．６−ジフルオルアニリン　　　　　　　　　４５６
′、ろ、５−トリヨービーＬ−チロニン　　　　　５０
ｍ−ブロムフェノール　　　　　　　　　　　　６００
−クロルフェノール　　　　　　　　　　　　６０４．
４’−ジヒドロキシ−ベンゾフェノン　　　　　６６４
−フルオルフェノール　　　　　　　　　　　８６６．
５−ジョー１ｌ−Ｄ−チロニン　　　　　　　８６２．
６−ジクロルフェノール　　　　　　　　　　９０４−
クロル−２−メチルフェノール　　　　１６７６．４−
ジクロルフェノール　　　　　　　　　１８４６−ヨー
ド−Ｌ−チロシン　　　　　　　　　２７９２．４−ジ
ブロムフェノール　　　　　　　　４４０ｐ−クロルフ
ェノール　　　　　　　　　　　５２［１ｐ−ブロムフ
ェノール　　　　　　　　　　　５７０２．４−ジクロ
ルフェノール　　　　　　　　　６５０バニリン　　　
　　　　　　　　　　　　　　９００４−クロル−６−
メチルフェノール　　　１００Ｄ４−ヨードフェノール
　　　　　　　　　　　１［）ＤＯｌ　上記促進剤は、
１．７ｍｈＡの過酸化水素を含有する、０．１Ｍ酢１１
１．％、燐酸ｋＭｔ＃１Ｍ１ｎｌ）　（７’８６．０　
）中の０．８２１ＬＭ２，２′−アジノージ−（６−エ
チル−ベンゾチアゾロン−６−スルホンＡ１２）ヲ用い
て試験された。反応は、０．１１１　ｇのわさび過酸化
酵素の清加によって始められた。 ４１５ナノメートルでの吸光度（Ａ４１５）が記録され
た。増加鯖は： 促進剤を用いたＡ４１５ Ｘ１００−％増大 促進剤なしのＡ４１５ によって決定した。 以下の名実節制は本発明による基質および方法を具体的
に＋ｉＷ、明するものである。しかしながら、これらの
実１６１１例は、表、明の目的のためだけのものであっ
て、本発明の全体的な卸、囲についての限度と考えられ
シ）べきではないこと、は、理解されねばならない。 実施例１ １．７ｍｂＡの過酸化水素を含自する、０．１Ｍ酢酸ナ
トリウム、０．ＩＭｍ酸ナトリウム（ｐＨ６）中に、ｏ
、ａｍｑｉｍｌの２．２’　−７ジノージー（３−エチ
ル−ベンゾチアゾロン−６−スルホン酸）を各々含有す
る、一連のノ＋＊′Ｒ＃液を訓；製した。促進却」を含
まない比較対照基質を除いて、各基質に、０．０５　ｍ
９７　ｍｌのｐ−ハロゲン化フェノール＆Ｊ剤（ｐ　−
ヨー。 −ド、−ブロム、−クロルまたは一フルオルのいずれか
）を加えた。０．１ミクロダラムのわさび過酸化酵素を
それらに加えることによって、各々の基質を試験し、そ
して４１５ナノメートルでの吸光度を時間の函数として
Ｈｔｊ録した。この試験の結果は、第１図にグラフで示
されており、それによれば、ｐ−ハロゲン化フェノール
はすべて、実質的に発色反応を促進することがわかるで
、１；）ろう。 同様の速度増大は、フェノールレッド、ｏ−フェニレン
ジアミン、１０ガロール、４−アミノアンチピリンおよ
びブロムピロガロールレッドよりｂ父る載置を包含１−
るその他の基Ｔ走について、観、狩されブこ。 実施例２ この実施例し゛よ、酵素結合免疫分セ−１における促進
剤としてのρ−ヨードフェノールの使）１μ′具体的に
説明し、そしてその促進剤が、対１１（λと比較して実
質的により低い濃度での検出を可能にずイ）ことをＮｉ
ｌ二明する。 山羊の抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ルＣｅ）　　を、
；Ａ￥酸塩緩衝剤中の水醪性カルボジイミビを伴なうラ
テックスビーズに共有結合させた。５００ｍＩＵ／ｎｔ
ｌ　　のｈｃＸ：Ｔ　　を含有する標準ｔ１ｋを、Ａｃ
Ｃ。 陰性の人間の尿中で製造した。４木の試験管を用意し、
各試験管内に、抗体で被瞳したビーズの１０％スラリー
ｉｏｏマイクロリットルをピはットで加えた。その後各
試験−′ｆ！に１ｍｌの尿を加えたが試験管のうちの２
本は賜−１ｉ４−（ｈ　ｃ　Ｇを含む）であり、２本は
陰性（ＡＣＧなし）であった。続い又、西洋わさび過ｉ
化酵素を結合させた山羊の抗−ｈｃＧ２ＤＯＰｌを加え
た。この酪゛系−抗体結合は、ナカネ（Ｎａｋａｎｅ　
）、ビー・ケイ（）’、に、）およびエイ（Ａ、）カワ
オイ（ＫａＷａＯＬ）　（１９７４）　Ｊ、　Ｈｔｓｔ
ｏｃｈｅｍ。 Ｇｙｔｏｃｈｔｒｎ　２２．１０８４．の過沃素酸ナト
リウム法によった。すべての試験管をその彼、６０分間
室温でインキュベートしてから、ビーズを洗浄し、そし
て２組の試験物（１本は、陽性、１本は陰性）を、比較
のための比色用ＡＢＴＳ基質を用いてインキュベートさ
せた。一方の基質は５０μｇ／ｒｒＬｌのｐ−ヨードフ
ェノールを合有し、（Ｖがの基質はヨービフェノールを
含有しないか、他の点では等しかった。各々の基質を用
いて１０分インキュベートさせた後、試験管を目視によ
って検査し、それらの吸光度を、バリア　ｙ　（Ｖａｒ
ｔａｎ）　ＤＭＳ　−９０分光測光器中で、４１５ナノ
メートルで決定した。 次の表は、この試験の結果を示す： 第■表 ヨードフェノール 目視による読み　趣　色　　無　色　　無　（ｒ−　暗
緑色Ａ４１５の読み　０．０５　　　　０．０６０．Ｃ
１０　　０．９８これらの結果は、この促進剤がより低
い（１ｒ１の検出を可能にすることをはっきりと証明し
ている。促進された基質については、陽性と陰性との間
に実質的な差があるが、一方促進剤を含まｔ６（い対照
におい゛（は、こわはあてはまらない。 実施例に の実施例は、試料中のグルコース緋ル゛°の定量のため
の比色定量系を記載するものであイ）。 各組について、水中にＯ、０．５、１、２、６、４、５
ミリモルのグルコースな加えることによって、２組のグ
ルコース濃度用標準液を製造した。 ０、１Ｍ酢酸ナトリウム（７）Ｈ６．０）中に１ミリリ
ツトルあたり、２．２′−アジノージ−（６−エチル−
ベンゾチアゾロン−６−スルホン酸→４００マイクログ
ラム、グルコース酸化酵素１０マイクログラム、わさび
過酸化酵素０．１マイクログラム、Ｐ−ヨードフェノー
ル１０マイクログラム、を含有する基質溶液を、一方の
組の各試験試料に対して調製し、一方ヨードフェノール
を含まない、他の点では等しいノー、・質を、もう一方
の組の各試験試料に対してバ周製した。各基質溶液１ミ
リリツトルに、各々１０マイクロリツトルのグルコース
試料を添加することに上って反応を開始させ、そしてこ
れらの反応Ｇ４、パリアン（ＶａｙｚａｒＬ）ＤｈＡＳ
　−　９　０　分光ｉ１＋１１　光：器を月１いて４１
５ナノメートルで検査した。 わさび過酸化酵素か過酸化水素検出のための酵素対であ
ることは公知であるか、この後者は、グルコース酸化酵
素とグルコースとの反応生成物であり；；のため、これ
らの反応の結果は、グルコース濃度によって変化するで
あろう。 これらの結果は、第２図にグラフで不されて〜・る。図
で示した通り、Ｐ−ヨードフェノールなしに行なった標
準液に対する１１μは、災買上、ヨードフェノールを用
いて行なった仲よりも低〜・。比較すると、ヨードフェ
ノールを含有する基質の速度は、１０線であって、容易
に読みとれる。 今のこの方法とグルコース決定の欅垢法とを比較するた
めに、２つの未知のグルコース（■および１１）を用意
上そして、上Ｉｉｑのヨートリエノールを金力する基質
のイ！右下、およびカリフォルニア州フラートン山のベ
ックマン・インストルメンツ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓ
ｔｒｕｍｅｎｔｓ）のベックマン１グルコース■分析器
を用いて、検定した。この２つの未知物の相対濃１視は
、見かけの濃ルーが比較的低い目盛からであるときは、
４１．５ナノメートルで分光ｊｌｉｌｌ光を行ない、そ
して第２図を用いることにより決定した。この決定法に
よって得られた仙、およびベックマンの器械を用いた仙
は、；Ｊ’．　Ｉｌｌ−、Ｎに示されている。 第１ＩＩ表 グルコース■分析器　　　本　発　明 未知物１　　　　１．８　５　ｍＭ　　　　　　　１．
９　Ｌｌ　ｍ．Ｍ未知物ＩＩ　　　４．１＋７ＬＭ　　
　　　　　　３。９ｍＭ両方の方法で得られた結果は、
非常に近く、実験誤差の範囲内にあり、その上、本発明
の促進された基質の有用性を証明している。 ４、〔図イ１１σ）簡単な説明〕 第１図は、本発明の一連の実ｅＬ！Ｌされた基質、およ
び促進されかい通常の９盾負、に対する吸光度の変化を
、時間の函数として招いているグラフであり、そして 第２図は、各々本発明に征が５併走ユされた比色雉基用
土負、および通常の促進されない比色定量用基質を用い
る、一連のグルコースき有試料に対する吸光度のｅＬみ
を示しているグラフである。 第１図中の各線は下記の意味を有する。 Ａ：ｐ−ヨード９フエノール存在下のグラフＢ：ｐ−ノ
ロムフェノール　　　〃 Ｃ：ｐ−クロルフェノール　　　″ Ｄ二ｐ−フルオルフェノール　　″ Ｅ：基員のみのグラフ 第２図中の各線は次の老体を自する。 Ｆ：ヨード９フエノール存在下のグラフＧ：ヨート１フ
ェノール非存在下のグラフ。 鷹１ １　　　　ン　　　　８　　　４　　　５　ｃミリモル
ングコレフー、ス５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）過酸化物酸化剤、および過酸化酵素とこの酸化剤と
   の存在下に反応して色または螢光を発することのできる
   化合物を含有する、過酸化酵素の存在下に特徴的な色ま
   たは螢光を発するための基質であって、置換されたフェ
   ノール化合物類より成る群から選択され、しかも、（Ｊ
   ｉ進剤を含まないが他の点では同一の基質を同一条件下
   で反応させたときと比較して少な（とも約５０％の促進
   をもたらすような促進剤を混合したことを特徴とする基
   質。 ２）上記促進剤が、バニリンおよび式 （式中、Ｒ１はハロゲン、ハロゲン置換されたフェノキ
   ７化合物、ヒドロキシフェノン、またはカルボッ酸また
   はそのアルギルエステルであす＋　ｆ’２は水素、ヒド
   ロギシ基、ハロゲン、１−６個の炭素原子を有する（置
   換または非置換アルキル基、“アミノ基、またはカルボ
   ン酸寸たはそのアルキルエステルであり；そしてＲ３，
   Ｒ４および１（５は各々、ハロゲンまたは水素である）
   の化合物、より成る基から選択されろ、特許請求の範囲
   第１項に記ルＶした基質。 ３）上記促進剤が、２，５−ジクロルフェノール、２．
   ６−ジヲルオルアニリン、６′、ろ、５−トリヨード９
   −Ｌ−チロニン、ｍ−ブロムフェノール、Ｏ−クロルフ
   ェノール、４，４′−シヒト９０キシーベンゾフェノン
   、４−フルオルフェノール、６゜５−ショート−Ｄ−チ
   ロニン、２．６−ジクロルフェノール、４−クロル−２
   −メチルフェノール、６．４−ジクロルフェノール、６
   −ヨード−Ｌ−チロシン、２，４−：）ブロムフェノー
   ル、ｐ−クロルフェノール＋　ｐ−ブロムフェノール、
   ２．４−ジクロルフェノール、ノζニリン、４−クロル
   −３−メチルフェノールおよび４−ヨードフェノールよ
   り成る群から選択される、ｌ）４πＦ請求の範囲第２項
   に記載の基質。 ４）上記促進剤が、バニリン、４−りｒｌ　／しづ一メ
   チルフェノールおよび４−ヨードフェノールより成る群
   から選択される、特許請求の範囲第６項にｄ己載の込１
   ｊ　Ｉｔす。 ５）上記酸化剤がｊｌ＋”−ｔ　ｔｅｌ化水素である、
   ｌｌ’、’ｒ￥＋−，ｉｒ（求の卸、四組１Ｊ１１に記
   載の基質。 ６）上ｊｆｌ−：基質が： ２．２′−アジノー（６−エチル−ベンゾチアゾロン−
   ６−スルホンｔ１１／）； 震酵化水索； ４−ヨードフェノール；および 緩衝剤； より成る、特許請求の範囲第１項に記載の基質。 ７）上記の化合物が、２，２′−アジノー（６−エチル
   −ベンゾチアゾロン−６−スルホン酸〕、フェノールレ
   ッド、ｏ−フェニレンジアミン、ピロガロール、４−ア
   ミノアンチピリンおよびブロムピロガロールレッド、よ
   り成る群から選択される、特許請求の範囲第１項に記載
   の基質。 ８）試料を１過酸化物酸化剤、この酸化剤と過酸化酵素
   との存在下に反応して色または螢光を発することのでき
   る化合物、および、置換されたフェノール化合物ｌより
   成る群から選ばれ、他の点では同一で、その促進剤を含
   まない基質を同一条件下で反応させたときと比べて、少
   な（とも約５０％の速度促進をもたらす促進剤、を含有
   する基質と接触させるという段階より成る、試料中のｊ
   ／’４酸化酵素の存在を測定する方法。 ９）上記促進剤が、２．５−：５クロルフエノール、２
   ．６−ジフルオルアニリン、３’、３．５−　トリヨー
   ド−Ｌ−チロニン、ｍ−ブロムフェノール、０−クロル
   フェノール、４．４’−１ヒトゝロキシーペンゾフエノ
   ン、４−フルオルフェノール１、ろ、５−ジヨート”−
   Ｄ−チロニン、２．ろ−ジクロルフェノール、４−クロ
   ル−２−メチルフェノール、３．４−ジクロルフェノー
   ル、３−ヨード−Ｌ−チロシン、２．４−シ／’ロムフ
   ェノール、ｐ−クロルフェノール、ｐ−−１０ムフエノ
   ール、２．４−ジクロルフェノール、バニリン、４−ク
   ロル−６−メチルフェノールおよび４−ヨードフェノー
   ルより１成る群から選択される、特許請求の範囲第８項
   に記載の方法。