JPH0775555B2 - スーパーオキシドジスムターゼ活性の測定方法 - Google Patents
スーパーオキシドジスムターゼ活性の測定方法Info
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- JPH0775555B2 JPH0775555B2 JP28877188A JP28877188A JPH0775555B2 JP H0775555 B2 JPH0775555 B2 JP H0775555B2 JP 28877188 A JP28877188 A JP 28877188A JP 28877188 A JP28877188 A JP 28877188A JP H0775555 B2 JPH0775555 B2 JP H0775555B2
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- reaction
- superoxide dismutase
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Description
【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ この発明は、体液中の微量のスーパーオキシドジスムタ
ーゼ（以下SODという）活性の測定方法に関するもので
ある。
ーゼ（以下SODという）活性の測定方法に関するもので
ある。
＜従来の技術と発明が解決しようとする問題点＞ SODは、次の反応を触媒する酵素である。
2O2 -＋2H+−−−→O2＋H2O2 ……（１） 生体内に過剰のスーパーオキシドアニオン（O2 -）が生
成すると、脂質過酸化反応、カルシウムイオン動態の変
化、混合ジスルフィド生成等が惹起され、種々の疾病が
誘発されるので、これを分解するSODの活性を高感度に
測定する方法の開発が望まれている。
成すると、脂質過酸化反応、カルシウムイオン動態の変
化、混合ジスルフィド生成等が惹起され、種々の疾病が
誘発されるので、これを分解するSODの活性を高感度に
測定する方法の開発が望まれている。
SOD活性の測定は、当初は一定量のO2 -（一般にO2 -産生
反応によって生じさせる）に検体（SOD）を作用させ、
そのSOD含量に対応するO2 -の減少量を測定するものであ
ったが、試薬盲検値が高いため非常に精度が高く、また
測定範囲が狭いという欠点があった。
反応によって生じさせる）に検体（SOD）を作用させ、
そのSOD含量に対応するO2 -の減少量を測定するものであ
ったが、試薬盲検値が高いため非常に精度が高く、また
測定範囲が狭いという欠点があった。
これに対し最近、前記（１）の反応式によって生ずるH2
O2を測定する方法が公表された（特開昭61−199799号公
報）。
O2を測定する方法が公表された（特開昭61−199799号公
報）。
すなわち前記公報の記載によれば、（１）の反応は、SO
Dが存在しなくてもそれ自体の不均化反応により徐々に
右に進行するものであるが、この系に電子伝達体が存在
すると、自体の不均化反応によるH2O2の生成は起こら
ず、この系にSODが存在するときにのみその活性値に比
例してH2O2が生成する。従って、このH2O2を測定（一般
にペルオキシダーゼと共に発色試薬を添加して発色の度
合を測定する）すればSOD活性値を測定することができ
るので、前記の試薬盲検値が高いため精度が悪く、測定
範囲が狭いという欠点を解消することができる、という
ものである。
Dが存在しなくてもそれ自体の不均化反応により徐々に
右に進行するものであるが、この系に電子伝達体が存在
すると、自体の不均化反応によるH2O2の生成は起こら
ず、この系にSODが存在するときにのみその活性値に比
例してH2O2が生成する。従って、このH2O2を測定（一般
にペルオキシダーゼと共に発色試薬を添加して発色の度
合を測定する）すればSOD活性値を測定することができ
るので、前記の試薬盲検値が高いため精度が悪く、測定
範囲が狭いという欠点を解消することができる、という
ものである。
発明者等は、後者の方法について更に詳細に検討を加え
たところ、該反応系に電子伝達体が存在すれば、自体の
不均化反応は幾分抑制されるものの、かなりの量のH2O2
（SODに無関係）が生成し、発色試薬を添加すると高い
盲検値（ブランク）しか得られず、それ故に精度が悪
く、測定範囲が狭いという欠点を完全に解消するに至っ
ていないという結論を得た。
たところ、該反応系に電子伝達体が存在すれば、自体の
不均化反応は幾分抑制されるものの、かなりの量のH2O2
（SODに無関係）が生成し、発色試薬を添加すると高い
盲検値（ブランク）しか得られず、それ故に精度が悪
く、測定範囲が狭いという欠点を完全に解消するに至っ
ていないという結論を得た。
そこで更に、ブランクを低下させるべく鋭意研究したと
ころ、ベルオキシダーゼ（POD）を発色反応の際にで
はなく、予じめH2O2の生成反応系に最初から添加してお
けば、不均化反応による盲検値（ブランク）が著るしく
低下し、極めて微量のSODでも精度よく測定することが
できること、また前記ペルオキシダーゼは、H2O2を分
解する際には、2O2 -を必ず消費するが、SOD存在下には
（１）の反応が速みやかに進行するため、生成されるH2
O2に比べO2 -が極端に不足し、その結果H2O2は分解せず
系内に効率よく蓄積されるためと合いまって高レスポ
ンスの測定ができること、系内に電子伝達体が存在し
ないスーパーオキシドアニオン産生系を用いても前記
及びの効果のために高レスポンスの測定ができるこ
と、スーパーオキシドアニオン産生系を広範囲に選択
できること等を発見し本発明を完成した。
ころ、ベルオキシダーゼ（POD）を発色反応の際にで
はなく、予じめH2O2の生成反応系に最初から添加してお
けば、不均化反応による盲検値（ブランク）が著るしく
低下し、極めて微量のSODでも精度よく測定することが
できること、また前記ペルオキシダーゼは、H2O2を分
解する際には、2O2 -を必ず消費するが、SOD存在下には
（１）の反応が速みやかに進行するため、生成されるH2
O2に比べO2 -が極端に不足し、その結果H2O2は分解せず
系内に効率よく蓄積されるためと合いまって高レスポ
ンスの測定ができること、系内に電子伝達体が存在し
ないスーパーオキシドアニオン産生系を用いても前記
及びの効果のために高レスポンスの測定ができるこ
と、スーパーオキシドアニオン産生系を広範囲に選択
できること等を発見し本発明を完成した。
＜問題を解決するための手段＞ 本願は次の（１）〜（６）に記載する６個の請求項から
構成されている。
構成されている。
（１）スーパーオキシドジスムターゼを含有する検体
に、次の（イ）、（ロ）に記載する物質を含有する試薬
を添加して一定時間反応させ、生成する過酸化水素を常
法により定量することを特徴とするスーパーオキシドジ
スムターゼ活性の測定方法。
に、次の（イ）、（ロ）に記載する物質を含有する試薬
を添加して一定時間反応させ、生成する過酸化水素を常
法により定量することを特徴とするスーパーオキシドジ
スムターゼ活性の測定方法。
（イ）スーパーオキシドアニオン （ロ）ペルオキシダーゼ （２）スーパーオキシドジスムターゼを含有する検体
に、次の（イ）、（ロ）に記載する物質を含有する試薬
を添加して一定時間反応させ、生成する過酸化水素を常
法により定量することを特徴とするスーパーオキシドジ
スムターゼ活性の測定方法。
に、次の（イ）、（ロ）に記載する物質を含有する試薬
を添加して一定時間反応させ、生成する過酸化水素を常
法により定量することを特徴とするスーパーオキシドジ
スムターゼ活性の測定方法。
（イ）電子伝達体を介して産生されるスーパーオキシド
アニオン （ロ）ペルオキシダーゼ （３）酸化還元酵素反応系によりスーパーオキシドアニ
オンを産生する特許請求の範囲第２項記載のスーパーオ
キシドジスムターゼ活性の測定方法。
アニオン （ロ）ペルオキシダーゼ （３）酸化還元酵素反応系によりスーパーオキシドアニ
オンを産生する特許請求の範囲第２項記載のスーパーオ
キシドジスムターゼ活性の測定方法。
（４）還元型補酵素を用いてスーパーオキシドアニオン
を産生する特許請求の範囲第２項記載のスーパーオキシ
ドジスムターゼ活性の測定方法。
を産生する特許請求の範囲第２項記載のスーパーオキシ
ドジスムターゼ活性の測定方法。
（５）NADPHまたはNADHを用いてスーパーオキシドアニ
オンを産生する特許請求の範囲第（２）、第（４）項記
載のスーパーオキシドジスムターゼ活性の測定方法。
オンを産生する特許請求の範囲第（２）、第（４）項記
載のスーパーオキシドジスムターゼ活性の測定方法。
（６）アスコルビン酸を用いてスーパーオキシドアニオ
ンを産生する特許請求の範囲第（２）項記載のスーパー
オキシドジスムターゼ活性の測定方法。
ンを産生する特許請求の範囲第（２）項記載のスーパー
オキシドジスムターゼ活性の測定方法。
次に本願発明において、ペルオキシダーゼを発色反応の
際にではなく、予じめH2O2の生成反応系に最初から添加
しておく理由を詳細に説明する。
際にではなく、予じめH2O2の生成反応系に最初から添加
しておく理由を詳細に説明する。
本願発明に係る測定系において、H2O2の生成・蓄積は次
のようにして生ずると思われる。
のようにして生ずると思われる。
（イ）SODが存在しない場合（ブランク） （Ｉ）O2 -産生反応−→2O2 -＋2H+ −→O2＋H2O2 （II）の反応には、2O2 -が使用されるため、予じめPOD
をH2O2の生成反応系に最初から添加しておけば、最終的
に（Ｉ）の2O2 -を充分に消費することができ、従ってH2
O2はほとんど存在しなくなる。それ故、発色系試薬を添
加しても発色せず、盲検値は充分低くなる。
をH2O2の生成反応系に最初から添加しておけば、最終的
に（Ｉ）の2O2 -を充分に消費することができ、従ってH2
O2はほとんど存在しなくなる。それ故、発色系試薬を添
加しても発色せず、盲検値は充分低くなる。
これに対し、PODを予じめ添加しておかない従来法（特
開昭61−199799号公報）では不均化反応によるH2O2が残
存し、盲検値（ブランク）が高くなってしまう。
開昭61−199799号公報）では不均化反応によるH2O2が残
存し、盲検値（ブランク）が高くなってしまう。
（ロ）SODが存在する場合 （II）の反応には、2O2 -が使用されるが、SODが存在す
ると、反応（Ｉ）は加速的に進み、2O2 -が生産されても
次々に消費されるので2O2 -が不足し、結局（II）の反応
はほとんど進行せず、H2O2が蓄積されることになる。そ
して最終的には、H2O2として検出される本願発明に係る
SODの測定方法は、O2 -に対応するSODとペルオキシダー
ゼ両者の触媒としての競合関係から構成されるものであ
るということができる。従ってそのとき、発色試薬を添
加すれば、先のブランク場合と消費されたH2O2を含めて
H2O2に対応する多量の発色物が得られ低値の盲検値と相
まって高感度の測定が可能とななるのである。また、電
子伝達体を介して産生O2 -を利用するとき（II）の反応
はO2 -だけでなく反応中間体である還元型電子伝達体を
も利用される。すなわち、最終的にH2O2量として検出さ
れる本願発明に係るSODの測定方法は、O2 -に対するSOD
とペルオキシダーゼ両者の触媒としての競合関係から構
成されものであるということができる。
ると、反応（Ｉ）は加速的に進み、2O2 -が生産されても
次々に消費されるので2O2 -が不足し、結局（II）の反応
はほとんど進行せず、H2O2が蓄積されることになる。そ
して最終的には、H2O2として検出される本願発明に係る
SODの測定方法は、O2 -に対応するSODとペルオキシダー
ゼ両者の触媒としての競合関係から構成されるものであ
るということができる。従ってそのとき、発色試薬を添
加すれば、先のブランク場合と消費されたH2O2を含めて
H2O2に対応する多量の発色物が得られ低値の盲検値と相
まって高感度の測定が可能とななるのである。また、電
子伝達体を介して産生O2 -を利用するとき（II）の反応
はO2 -だけでなく反応中間体である還元型電子伝達体を
も利用される。すなわち、最終的にH2O2量として検出さ
れる本願発明に係るSODの測定方法は、O2 -に対するSOD
とペルオキシダーゼ両者の触媒としての競合関係から構
成されものであるということができる。
本願発明に使用するペルオキシダーゼには植物由来のも
のが適し、通常西洋ワサビ由来のものを使用する。また
使用濃度は、通常20μg/ml以下であるが、好ましくは４
〜0.04μg/mlである。
のが適し、通常西洋ワサビ由来のものを使用する。また
使用濃度は、通常20μg/ml以下であるが、好ましくは４
〜0.04μg/mlである。
本願発明において、電子伝達体を介して産生されるスー
パーオキシドアニオンを使用する場合には、電子伝達体
としてはPMS（Phenazine meth osulfate）,1−Methoxy
−PMS（１−Methoxy−５−Methylphenazinium methylsu
lfate）等のPMS誘導体、Meldla blue（９−dimethylami
nobenzo−α−phenazoxonium chlolide）が適してい
る。また使用濃度は、0.02μＭ〜40μＭであり、好まし
くは0.1μＭ〜20μＭである。
パーオキシドアニオンを使用する場合には、電子伝達体
としてはPMS（Phenazine meth osulfate）,1−Methoxy
−PMS（１−Methoxy−５−Methylphenazinium methylsu
lfate）等のPMS誘導体、Meldla blue（９−dimethylami
nobenzo−α−phenazoxonium chlolide）が適してい
る。また使用濃度は、0.02μＭ〜40μＭであり、好まし
くは0.1μＭ〜20μＭである。
酵素反応時のpHは中性からアルカリ性がよく、通常SOD
活性の至適pH領域であるpH8〜10が好ましい。
活性の至適pH領域であるpH8〜10が好ましい。
本発明の測定方法は、SOD活性により生成蓄積されるH2O
2量を定量して酵素活性を求める方法であり、一定時間
反応後、既存のH2O2測定試薬を加えることによって測定
するものである。基本的には反応の第１段階としてペル
オキシダーゼ存在下、適当な反応物質あるいは反応系を
利用することによって、最終的にO2 -を産出させると同
時にSOD反応を一定時間行なう。次いで第２段階では、
蓄積したH2O2をペルオキシダーゼ、被酸化性発色試薬を
添加することにより測定を行なう。
2量を定量して酵素活性を求める方法であり、一定時間
反応後、既存のH2O2測定試薬を加えることによって測定
するものである。基本的には反応の第１段階としてペル
オキシダーゼ存在下、適当な反応物質あるいは反応系を
利用することによって、最終的にO2 -を産出させると同
時にSOD反応を一定時間行なう。次いで第２段階では、
蓄積したH2O2をペルオキシダーゼ、被酸化性発色試薬を
添加することにより測定を行なう。
第１段階でのO2 -生成に必要な反応物質としては、NAD
（Ｐ）Ｈ等の還元型補酵素、アスコルビン酸が適してお
り、反応系としてはXOD反応遊離の補酵素を必要とする
脱水素酵素系、例えばNAD、リンゴ酸、リンゴ酸脱水素
酵素のように補酵素、基質、酵素の組合せを用いる。ま
た、遊離の補酵素を必要としない酸化還元酵素系の場合
には、例えばザルコシン、ザルコシン脱水素酵素のよう
に酵素とその基質を用いる。
（Ｐ）Ｈ等の還元型補酵素、アスコルビン酸が適してお
り、反応系としてはXOD反応遊離の補酵素を必要とする
脱水素酵素系、例えばNAD、リンゴ酸、リンゴ酸脱水素
酵素のように補酵素、基質、酵素の組合せを用いる。ま
た、遊離の補酵素を必要としない酸化還元酵素系の場合
には、例えばザルコシン、ザルコシン脱水素酵素のよう
に酵素とその基質を用いる。
他方第２段階のH2O2定量系では、第１段階に用いるペル
オキシダーゼとは別に、ペルオキシダーゼと種々の被酸
化性発色試薬を使う比色法、蛍光法あるいは発光法等既
存の方法が利用できる。例えば比色法では４−アミノア
ンチピリンとハイドロキシトリイオドベンゾイックアシ
ッド、蛍光法ではホモバニリン酸、発光法ではルミノー
ル等が代表的なものである。
オキシダーゼとは別に、ペルオキシダーゼと種々の被酸
化性発色試薬を使う比色法、蛍光法あるいは発光法等既
存の方法が利用できる。例えば比色法では４−アミノア
ンチピリンとハイドロキシトリイオドベンゾイックアシ
ッド、蛍光法ではホモバニリン酸、発光法ではルミノー
ル等が代表的なものである。
本発明の実施にあたり主な操作手順は、例えば0.3mM N
ADH、0.8μg/ml ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由来）
を含むpH ９の緩衝液（試薬 Ａ）の一定量に、試料を
一定量加えて37℃に予じめ加温する。これに50μM1−Me
thoxy−PMS水溶液（試薬 Ｂ）を一定量加えて反応を始
める。37℃で一定時間反応後、ペルオキシダーゼと被酸
化性発色試薬を含む緩衝液（試薬 Ｃ）を一定量加え、
一定時間後に比色定量するものである。
ADH、0.8μg/ml ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由来）
を含むpH ９の緩衝液（試薬 Ａ）の一定量に、試料を
一定量加えて37℃に予じめ加温する。これに50μM1−Me
thoxy−PMS水溶液（試薬 Ｂ）を一定量加えて反応を始
める。37℃で一定時間反応後、ペルオキシダーゼと被酸
化性発色試薬を含む緩衝液（試薬 Ｃ）を一定量加え、
一定時間後に比色定量するものである。
＜実施例１＞NADPHを使用した場合 （イ）試薬 試薬A:0.3mM NADPH、0.72μg/ml ペルオキシダーゼ
（西洋ワサビ由来）を含む50mM トリス−塩酸緩衝液
（pH9.0） 試薬B:50μＭ １−メトキシPMS水溶液 試薬C:8mM ハイドロキシトリイオドベンゾイックアシ
ッド（Hydroxy triiodebenzoic acid）、 4mM ４−アミノアンチピリン、40μg/ml ペルオキシ
ダーゼ（西洋ワサビ由来）を含む10mMトリス−塩酸緩衝
液（pH8.0） （ロ）操作法 試薬Ａ 1mlに試料20μを加えて37℃に予加温する。
試薬Ｂ 20μを加えて反応を始め、37℃10分後に試薬
Ｃ 250μを添加した。３分後に波長 510nmの吸光度
を測定した。また同様に試料を蒸留水に代えて、試薬盲
検値を同時に測定した。
（西洋ワサビ由来）を含む50mM トリス−塩酸緩衝液
（pH9.0） 試薬B:50μＭ １−メトキシPMS水溶液 試薬C:8mM ハイドロキシトリイオドベンゾイックアシ
ッド（Hydroxy triiodebenzoic acid）、 4mM ４−アミノアンチピリン、40μg/ml ペルオキシ
ダーゼ（西洋ワサビ由来）を含む10mMトリス−塩酸緩衝
液（pH8.0） （ロ）操作法 試薬Ａ 1mlに試料20μを加えて37℃に予加温する。
試薬Ｂ 20μを加えて反応を始め、37℃10分後に試薬
Ｃ 250μを添加した。３分後に波長 510nmの吸光度
を測定した。また同様に試料を蒸留水に代えて、試薬盲
検値を同時に測定した。
その結果は第１図の通りであり、0.014U/mlから検出可
能であった。
能であった。
＜実施例２＞リンゴ酸脱水素酵素を使用した場合 （イ）試薬 試薬A:54μＭ リンゴ酸ナトリウム、2.2mM NAD、0.09
μg/mlペルオキシダーゼ、22μＭ PMSを含む35mM ト
リス−塩酸緩衝液（pH9.0） 試薬B:383U/ml リンゴ酸脱水素酵素を含む硫安懸濁液 試薬C:7.7mM ハイドロキシトリイオドベンゾイックア
シッド 4mM ４−アミノアンチピリン、40μg/ml ペルオキシ
ダーゼ（西洋ワサビ由来）を含む10mMトリス−塩酸緩衝
液（pH8.0） （ロ）操作法 試薬Ａ 1mlに試料20μを加えて37℃に予加温する。
これに試薬Ｂ 10μを加えて反応を始め、37℃10分後
に試薬Ｃ 250μを添加した。３分後に波長 510nmの
吸光度を測定した。また同様に試料を蒸留水に代えて、
試薬盲検値を同時に測定した。
μg/mlペルオキシダーゼ、22μＭ PMSを含む35mM ト
リス−塩酸緩衝液（pH9.0） 試薬B:383U/ml リンゴ酸脱水素酵素を含む硫安懸濁液 試薬C:7.7mM ハイドロキシトリイオドベンゾイックア
シッド 4mM ４−アミノアンチピリン、40μg/ml ペルオキシ
ダーゼ（西洋ワサビ由来）を含む10mMトリス−塩酸緩衝
液（pH8.0） （ロ）操作法 試薬Ａ 1mlに試料20μを加えて37℃に予加温する。
これに試薬Ｂ 10μを加えて反応を始め、37℃10分後
に試薬Ｃ 250μを添加した。３分後に波長 510nmの
吸光度を測定した。また同様に試料を蒸留水に代えて、
試薬盲検値を同時に測定した。
その結果は第１図の通りであり、1.7U/ml以上の高濃度
のSOD活性に適することがわかる。
のSOD活性に適することがわかる。
＜実施例３＞ザルコシン脱水素酵素反応を使用た場合 （イ）試薬 試薬A:54μＭ ザルコシン、0.34μg/ml ペルオキシダーゼ、1.0μＭ １−メトキシPMSを含む40mMトリス−塩酸緩衝液（pH9.
0） 試薬B:5.2U/ml ザルコシン脱水素酵素を含む20mM ト
リス−塩酸緩衝液（pH7.8） 試薬C:7.7mM ハイドロキシトリイオドベンゾイックア
シッド 4mM ４−アミノアンチピリン、40μg/ml ペルオキシ
ダーゼ（西洋ワサビ由来）を含む10mMトリス−塩酸緩衝
液（pH8.0） （ロ）操作法 試薬Ａ 1mlに試料20μを加えて37℃に予加温する。
これに試薬Ｂ 10μを加えて反応を始め、37℃10分後
に試薬Ｃ 250μを添加した。３分後に波長 510nmの
吸光度を測定した。また同様に試料を蒸留水に代えて、
試薬盲検値を同時に測定した。
0） 試薬B:5.2U/ml ザルコシン脱水素酵素を含む20mM ト
リス−塩酸緩衝液（pH7.8） 試薬C:7.7mM ハイドロキシトリイオドベンゾイックア
シッド 4mM ４−アミノアンチピリン、40μg/ml ペルオキシ
ダーゼ（西洋ワサビ由来）を含む10mMトリス−塩酸緩衝
液（pH8.0） （ロ）操作法 試薬Ａ 1mlに試料20μを加えて37℃に予加温する。
これに試薬Ｂ 10μを加えて反応を始め、37℃10分後
に試薬Ｃ 250μを添加した。３分後に波長 510nmの
吸光度を測定した。また同様に試料を蒸留水に代えて、
試薬盲検値を同時に測定した。
その結果は第１図の通りであり、実施例１と実施例２の
中間の検出範囲を測定することが可能であった。
中間の検出範囲を測定することが可能であった。
＜実施例４＞NADHを使用した場合 実施例１中のNADPHをNADHに代えて、他は全て実施例１
に準じて同様に行なった。得られた結果は第１図のよう
に、NADPHの場合に次ぐ測定感度が得られた。
に準じて同様に行なった。得られた結果は第１図のよう
に、NADPHの場合に次ぐ測定感度が得られた。
＜実施例５＞XOD反応を利用した場合 （イ）試薬 試薬A:50μＭ キサンチン、50μg/ml ペルオキシダー
ゼ（西洋ワサビ由来）を含む50mM トリス−塩酸緩衝液
（pH9.0） 試薬B:0.4U/ml キサンチンオキシダーゼを含む20mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.5） 試薬C:8mM ハイドロキシトリイオドベンゾイックアシ
ッド 4mM ４−アミノアンチピリン、50μg/ml ペルオキシ
ダーゼ（西洋ワサビ由来）を含む2mMトリス−塩酸緩衝
液（pH8.0） （ロ）操作法 試薬Ａ 1mlに試料５μを加えて37℃に予加温する。
これに試薬Ｂ 20μを加えて反応を始め、37℃、５分
後に試薬Ｃ 250μを添加した。３分後に波長 510nm
の吸光度を測定した。また同様に試料を蒸留水に代え
て、試薬盲検値を同時に測定した。
ゼ（西洋ワサビ由来）を含む50mM トリス−塩酸緩衝液
（pH9.0） 試薬B:0.4U/ml キサンチンオキシダーゼを含む20mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.5） 試薬C:8mM ハイドロキシトリイオドベンゾイックアシ
ッド 4mM ４−アミノアンチピリン、50μg/ml ペルオキシ
ダーゼ（西洋ワサビ由来）を含む2mMトリス−塩酸緩衝
液（pH8.0） （ロ）操作法 試薬Ａ 1mlに試料５μを加えて37℃に予加温する。
これに試薬Ｂ 20μを加えて反応を始め、37℃、５分
後に試薬Ｃ 250μを添加した。３分後に波長 510nm
の吸光度を測定した。また同様に試料を蒸留水に代え
て、試薬盲検値を同時に測定した。
その結果は第２図の通りであり、0.059〜18U/mlの広い
範囲に対応した発色応答がみられた。
範囲に対応した発色応答がみられた。
なお、以上の実施例に用いたSOD標品は牛赤血球由来の
酵素標品を、トリス−塩酸緩衝液（pH7.4）で調製し
た。
酵素標品を、トリス−塩酸緩衝液（pH7.4）で調製し
た。
＜実施例６＞血清中のSOD活性の測定 試料としてヒト血清20μを用い、実施例３に準じて反
応を行ない、SOD活性を測定した。
応を行ない、SOD活性を測定した。
また、以下に示すNTB還元法によって同時にSOD活性を求
めた。
めた。
（イ）試薬 試薬A:30μＭ NTB、0.1mM EDTA・2Na、0.1％トリトン
Ｘ−100を含む50mM 炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（pH9.0） 試薬B:1mM キサンチンを含む50mMトリス−塩酸緩衝液
（pH10.0） 試薬C:1.2×10-5M キサンチンオキシダーゼを含む20mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.4） （ロ）操作法 試薬Ａ 1.8ml、試薬Ｂ 0.2mlと試料10μを混合し、
37℃に予加温する。これに試薬Ｃ 25μを加えて反応
を始め、３分後４分後に、560nmでの吸光度を読みその
変化量を測定した。同様に試料を蒸留水に代えて試薬盲
検値を同時に測定した。検量線用には試料を既知SOD溶
液に代えて測定した。
Ｘ−100を含む50mM 炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（pH9.0） 試薬B:1mM キサンチンを含む50mMトリス−塩酸緩衝液
（pH10.0） 試薬C:1.2×10-5M キサンチンオキシダーゼを含む20mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.4） （ロ）操作法 試薬Ａ 1.8ml、試薬Ｂ 0.2mlと試料10μを混合し、
37℃に予加温する。これに試薬Ｃ 25μを加えて反応
を始め、３分後４分後に、560nmでの吸光度を読みその
変化量を測定した。同様に試料を蒸留水に代えて試薬盲
検値を同時に測定した。検量線用には試料を既知SOD溶
液に代えて測定した。
その結果は、第１表（巻末）の通りであり、良好な結果
を示した。
を示した。
＜発明の効果＞ 以上のように本発明によれば、体液中の微量のスーパー
オキシドジスムターゼを、生体成分の測定用試薬に通常
用いられている既知成分だけで、簡便に増大方式により
高感度に測定できるため、従来にない汎用性のある測定
法を提供することができるという効果を有する。
オキシドジスムターゼを、生体成分の測定用試薬に通常
用いられている既知成分だけで、簡便に増大方式により
高感度に測定できるため、従来にない汎用性のある測定
法を提供することができるという効果を有する。
第１図は、スーパーオキシドアニオン産生系にNADP
H、リンゴ酸脱水素酵素（MDH）反応、ザルコシン脱
水素酵素反応、NADHを使用した場合のSODの測定感度
を示すグラフ、第２図は、スーパーオキシドアニオン産
生系にXOD反応を利用した場合のSODの測定感度を示すグ
ラフである
H、リンゴ酸脱水素酵素（MDH）反応、ザルコシン脱
水素酵素反応、NADHを使用した場合のSODの測定感度
を示すグラフ、第２図は、スーパーオキシドアニオン産
生系にXOD反応を利用した場合のSODの測定感度を示すグ
ラフである
Claims (6)
- 【請求項１】スーパーオキシドジスムターゼを含有する
検体に、次の（イ）、（ロ）に記載する物質を含有する
試薬を添加して一定時間反応させ、生成する過酸化水素
を常法により定量することを特徴とするスーパーオキシ
ドジスムターゼ活性の測定方法。 （イ）スーパーオキシドアニオン （ロ）ペルオキシダーゼ - 【請求項２】スーパーオキシドジスムターゼを含有する
検体に、次の（イ）、（ロ）に記載する物質を含有する
試薬を添加して一定時間反応させ、生成する過酸化水素
を常法により定量することを特徴とするスーパーオキシ
ドジスムターゼ活性の測定方法。 （イ）電子伝達体を介して産生されるスーパーオキシド
アニオン （ロ）ペルオキシダーゼ - 【請求項３】酸化還元酵素反応系によりスーパーオキシ
ドアニオンを産生する特許請求の範囲第２項記載のスー
パーオキシドジスムターゼ活性の測定方法。 - 【請求項４】還元型補酵素を用いてスーパーオキシドア
ニオンを産生する特許請求の範囲第２項記載のスーパー
オキシドジスムターゼ活性の測定方法。 - 【請求項５】NADPHまたはNADHを用いてスーパーオキシ
ドアニオンを産生する特許請求の範囲第（２）、第
（４）項記載のスーパーオキシドジスムターゼ活性の測
定方法。 - 【請求項６】アスコルビン酸を用いてスーパーオキシド
アニオンを産生する特許請求の範囲第（２）項記載のス
ーパーオキシドジスムターゼ活性の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28877188A JPH0775555B2 (ja) | 1988-11-17 | 1988-11-17 | スーパーオキシドジスムターゼ活性の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28877188A JPH0775555B2 (ja) | 1988-11-17 | 1988-11-17 | スーパーオキシドジスムターゼ活性の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02135099A JPH02135099A (ja) | 1990-05-23 |
| JPH0775555B2 true JPH0775555B2 (ja) | 1995-08-16 |
Family
ID=17734503
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28877188A Expired - Lifetime JPH0775555B2 (ja) | 1988-11-17 | 1988-11-17 | スーパーオキシドジスムターゼ活性の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0775555B2 (ja) |
-
1988
- 1988-11-17 JP JP28877188A patent/JPH0775555B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02135099A (ja) | 1990-05-23 |
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