JPS5910594A - 縮合方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な縮合方法に関する。更に詳しくｔよ、本
発明はリン酸ジエステルとアルコールからリン酸トリエ
ステルケ與造する方法に関する。

リン酸ジエステルとアルコールからリン酸トリエステル
ケ得る縮合反応は、ＤＮＡＣデオキシリボ核酸）オリゴ
マー、即ちオリゴデオキシリボヌクレオチドを得るため
の手段である核酸合成において、最も重要な素反応の一
つであシ、近年特に、遺伝子組み換えの手段と関連して
重璧視されている技術である。

従来、オリゴデオキシリボヌクレオチドもしくはオリゴ
リボヌクレオチド會得るための手段である核酸合成は、
その基本的要素である縮合反応、即ちヌクレオシドの５
′位と他のヌクレオシドの３′位會リン酸エステルの形
で結合させる反応の種類によってジエステル法、トリエ
ステル法およびホスファイト法（亜リン酸トリエステル
法）々とが知られている。

その中で反応収率、中間体の安定性、反応速度、中間体
の精製の容易さ等茫総合的に考慮すると、トリエステル
法が、比較的にすぐれた方法であると考えられ、最近主
としてこの方法が使われている。

トリエステル法は、Ｓ、Ａ、Ｎａｒ砿ｇらによって確立
された技術（Ｓ　、Ａ　、Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎ　油ｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５巻、６１０〜６
２０Ｍ（１９８０年、　Ａｃｒｕｉｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ
ｓ　）　）　テ、その縮合反応は、ヌクレオシド３′−
リン酸エステルとヌクレオシド５′−アルコール奮縮合
させてリン酸トリエステルとする反応であって次式（１
）で表わされる。

上記式中、Ｂ１．Ｊ３２は必要によりアミン基の保８０
された核酸塩基成分子表わし、Ｒ１は水酸基の保護基２
表わし、Ｒ２はリン酸基の保護基を表わし、Ｒ３は水素
原子もしくは保護された水酸基を表わし、Ｒ４は水酸基
の保にφ基荀表わすかもしくは−ＰＣ＝Ｏ）　ＣＯＲ２
）ＣＯＲ５）なるリン酸ジエステル残基全表わし、この
場合Ｒ５はリン酸の保護基２表わす。Ｒ３が水素原子會
表わす場合は、デオキシリボヌクレオシド系であシ、Ｒ
３が保誦された水酸基を表わす場合は、リボヌクレオシ
ド系である。通常、Ｒ１と８５はそれぞれ独立にそれだ
け２脱離させることの出来る保護基が選ばれる。ここで
Ｒ１およびＲ４は以下に述べる拡張した定義勿も同時に
含むものとする。

上記式（１）において得られる生成物である二量体（ダ
イマー）において・Ｒ５の保岐基荀脱すことによって新
たに二量体の３′−リン酸ジエステル成分が得られる。

一方、Ｒ”の保ｄ基を・脱すことによって新たに二量体
の５′−アルコール成分が得られる。これらの成分ケ式
（１）の左辺の化合物として用いれば・同様の反応で一
般に鎖長が２個以上のヌクレオチドオリゴマーが得られ
ることになる。即ちここで式（１）においてＲおよびＲ
４は場合により、５’−３’！Ｊン酸工ステル結合でつ
ながれたヌクレオシド、ヌクレオチドもしくはオリゴヌ
クレオチド成分で、すべての官能基が保護されているも
のと定義すると、式（１）は広義にヌクレオチドオリゴ
マーの合成法となる縮合反応會表わしでいる。

上記式（１）で表わされる縮合反応において縮合剤とし
ては、一般にはスルホニルクロライドとアゾールの反応
で得られるスルホニルアゾライドが用いられている。こ
の中で反応速度および反応収率の点で、メシチレンスル
ホニルテトラゾライトＣＭＳｉ’ｅ　）　、メシチレン
スルホニル−３−ニトロトリアシラ（）”　ＣＭＳＮＴ
）、２．４．６−）リインプロピルベンゼンスルホニル
テトラゾ２イドＣＴＰＳＴｅ）あるいｉ、１２．４．６
−ドリイソプロビルペンゼ／スルホニル−３−ニトロト
リアゾライト（ＴＰＳＭ“）等が最近主として好んで使
われている。

これらの縮合剤はいずれもかなり不安定な化合物であっ
て、通常は結晶の形でさえ、長期に保存する場合は、冷
凍庫中に保存する必要がある。・ｍ常、トリエステル法
の反応溶媒として用いられるのはビリジ／であるが、上
記縮合剤は、ピリジン溶液にすると数日中に七のかなシ
の部分が分解する。

トリエステル法核酸合成については、縮合削欠利用する
ものの他に、活性化されたリン酸トリアシライド葡使う
次式（２）に示すような変法も報告されている（板倉啓
壱らＭＬｃ　Ｌ　ｇ　ｉ　ｃ１〜かし、この場合、式（
２）左辺左側の化合物、即ちリン酸トリアシライドは、
かなり不安定な化合物で溶液状態では長期の保存に耐え
ない。

一方、核酸合成における最近の進歩としては、同相合成
法が特筆される。トリエステル法を用いた同相合成では
一般に前ハ１ジヌクレオシドの５′−アルコール化合物
がポリマー支持体に担持された形で反応が進行し、この
場合のポリマーは、架橋などによって不溶性となってい
るために、縮合生成物であるトリエステルは、ポリマー
に担持された形となるので、濾過等の手段によって簡単
に原料ジエステルや縮合剤等と分離することが出来る。

トリエステル法を用いた一般的な固相法顛前記式（１）
において、Ｒ４がポリマー支持体を表わすことで説明さ
れる。ヌクレオシドとポリマー支持体の結合は、通常エ
ステル結合のような形孕介して行われる。こうして得ら
れ°た式（１）右辺の化合物の保護基Ｒｋ脱し、新たな
ヌクレオとによってポリマー支持体上で、ヌクレオチド
のオリゴマーが得られる訳である。同相法による核酸合
成について更に詳しくは次に示す文献およびその中で引
用された文献に記載されている。〔板倉啓壱ら、Ｎｕ、
ｃｌｅｉｃルｉｄｓ　Ｉｈ５ｅａｒｃん、１０巻。

１７５５〜１７６９頁、　１９８２年〕。

前述したような、トリエステル法固相核酸合成先自動化
した装置で実施する試みもいくつかなされている。現在
一般に入手し得る装置とじては、例えば、ベガーバイオ
ケミカル社（アメリカ合衆国、アリシナ州、ツーソン）
のＤＮＡシンセサイザー列型と、ジエネテツク・デザイ
ン社（アメリカ合衆国、マサチューセッツ州、ウォータ
ータウン）の２５Ａ型がある。このような自動化された
核酸合成装置全利用するに描って最大の問題点は、反応
の基質となる各化合物や縮合剤の安定性である。即ち各
化合物や試薬類は、装置が自動的に運転される間Ｖよ、
安定に保たれる必要がある。

しかしながら、前述したように、式（１）の反応で用い
る縮合剤はかなり不安定な化合物であり、特に縮合能力
の大きい縮合剤の中ではかなり安定性が高く、現在数も
多く使われている縮合剤であるメシチレンスルホニル−
３−ニトロトリアゾジイド＜ＭＳＭｒ）でさえも、縮合
反応溶媒であるピリジン溶液として装置につけた状態で
は、２４時間後には１０％程度の分解が認められる。上
記分解生成物の一方は、スルホン酸もしくはその塩と推
定され、これは縮合反応に悪影響會及ぼす。

一方、式（２）の反応會利用する場合は、リン酸トリア
シライドが同様に不安定でるるという欠点があジ、更に
リン酸トリアシライドは縮合装置にかける直前に合成せ
ねばならず、しかも合成法がかなダ難かしいという欠点
がある。

一般に、トリエステル法による固相核酸合成音自動化さ
れた装ｆｋ用いて行ない、ヌクレオシドモノマーを順次
縮合させてゆく方法をとった場合、１５ないしは２０ｆ
体を得るには２日間程度の時間が必要である。従って、
縮合反応に開力する化合物は、装置にかけられた状態で
２日間程度は１００％安定であるのが望ましい。

トリエステル法核酸合成を固相法で行なう場合にはもう
一つ重要な点がある。それは縮合反応における反応液量
の問題である。一般にトリエステル法の縮合反応は前記
の縮合剤音用いて３０分〜２時間程度で完結するが、反
応速度は反応液量に依存する。即ち、反応試剤のモル濃
度が高い方が反応速度は大きく、一般にトリエステル法
では、３’ｌン酸ジエステルの濃度が０．１〜０．２Ｍ
程度以上が望ましいとされている。

ところで、核酸合成の手法を使って、ＤＮＡのオリゴマ
ー（オリゴデオキシリボヌクレオチド）全得る場合、遺
伝子操作の技術に用いられる量は、一般に数マイクログ
ラムもあれば充分である。また、一般に、トリエステル
法で用いる原料、試薬勇１は高価である。従って、前述
の縮合反応は、かなり、Ｊさい反応スケールで行うのが
経済的である。そのためには、前記のように、できるだ
け少ない反応液量で、従って反応試剤の濃度に大きなス
ケールのときと同じようにして縮合反応ケ行なう必要が
ある。

しかし例えば前述の自動合成装置を使用する場合は、送
液システムおよび検知システムの関係上、反応液量を１
〜１．５ｍｌ以下にすることは非常に困難である。

本発明者らは、上記の点會改良すべく、トリエステル法
核酸合成において縮合剤を安定な形で反応系内に導入し
、かつ少ない液量で縮合反応全行なうことができる方法
について鋭意検討した結果、効果の顕著な本発明に到達
した。即ち、反応容器内に、反応液音道り込むまでは従
来の方法２用いながらしかる後に、反応容器力・ら、溶
剤の一部葡留去することによって結果として反応液ｔｉ
大幅に減少せしむることを利用して反応試剤の少量使用
にもかかわらず、縮合反応の収率が低下しないことを見
出して本発明欠完成したのである。

本発明は、リン酸ジエステルとアルコールケ縮合剤の存
在下ピリジン中で縮合反応させて、リン酸トリエステル
會得る反応において、縮合剤を溶媒に溶かして反応系内
に導入し、しかる後に溶媒の一部を留去してから縮合反
応速度うことケ特徴とする縮合方法欠提供するものであ
る。

この場合、反応溶媒としては、従来用いられて来たピリ
ジンが使用されるが、前述の縮合剤を安定化するための
溶媒としてピリジン以外の溶媒を用いこれら會組み合わ
せて使用することによってよｐ大きな効果が得られる。

即ち、縮合剤全安定に溶解しておく溶媒としてピリジン
よりもかなシ低沸点の溶剤を選べば、溶媒の留去はより
容易になる。具体的に自動合成装置上操作する場合には
、ヌクレオシドの３′−リン酸ジエステルｔピリジンに
溶かし、一方、縮合剤全、適当な溶媒に漕力）して装置
に装着し、縮合反応の際に、両者を独立にあるいは混合
して反応容器内に送り込めばよい。ベガ・バイオケミカ
ル社の装置の場合には、液量測定用の容器が、反応容器
の前にあるのでこの中で両者上混合し、しかる後に反応
容器内に送液することにすれば、送液量が多くなって送
液はスムーズに問題なく行われる。反応容器内に混合物
老込り込んだ後、適当な手段で反応液の一部を留去し低
沸点溶剤の殆んどが留去され、ピリジンの一部が残存す
るような条件で留去音圧める。縮合剤會溶かした溶媒が
、縮合反応を阻害することはなくても、実際上その共存
が縮合反応速度を低下させる場合においても、上記条件
で留去すれば、縮合反応は進行する。この場合、縮合剤
全港かした溶媒の一部が残存してもあまり問題にならな
い。また、ピリジンの一部が留去されても反応液量が少
なくなる結果となシ、かえって望ましい。

本発明の縮合剤としては、例えば、メンチレンスルホニ
ルテトラゾライドＣＭＳＴｅ　）　、メシチレンスルホ
ニル−３−ニトロトリアシライドＣＭｓＮＴ）　、２．
４．６−　トリイソプロピルベンゼンスルホニルテトラ
ゾライドＣＴＰＳＴｅ）あるいは２，４．６−ドリイソ
プロビルベンゼンスルホニルー３−ニトロトリアシライ
ド（ＴＰＳＮＩ’）等が好ましいが、もちろんこれらに
限定されるものではない。

縮合剤の量は特に限定されないが、通常好ましいモル比
は、アルコール成分１に対して０．５〜５０、同相法の
場合は３〜２５の範囲で選ばれる。

縮合剤を溶解する溶媒としては、ピリジンおよび縮合剤
が溶液中でピリジン中でよシも安定であシ、シかも縮合
反応２本質的に阻害するものでないものであればすべて
本発明に含まれる。実際上は、更にピリジンよシも低沸
点、望ましくは８００程度以下の郷点を有する溶剤でろ
って、縮合剤と、ヌクレオシド−３′−リン酸ジエステ
ルの溶解度が大きいものの中から選ばれるのが望ましい
。

そのような溶媒としては、例えば、エーテル類、塩素化
炭化水素類あるいはニトリル類がある。これらの溶媒に
溶かした状態では前述の縮合剤は著しく安定であって、
室温で数日間保存しても何ら分解會受けない。沸点およ
び縮合剤の溶解度の両者を考え合わせると、例えばエー
テル類の中ではテトラヒドロフランＣＴＨＦ）、塩素化
炭化水素類の中では塩化メチレン、ニトリル類の中では
アセトニトリル等が望ましいが、もちろんこれらに限定
されるものではない。縮合剤のうちで９’ｌＪ工ｉ、ｆ
’、ＭＳＮＴ　（メシチレ／スルホニル−３−ニトロト
リアシライド）は、脱水蒸留したＴＨＦ中では、３週間
室温で保存しても事実上分解生成物は全く認められない
。縮合剤全溶解する溶媒の使用量は特に限定されないが
、通常好ましくは、反応溶媒のピリジンの量に対して０
．３〜５倍の範囲で選ばれる。

溶媒の留去の方法としては、減圧留去もしくは不活性ガ
スの通気による留去が考えられ、どちらでもよいが、例
えば、既存のベガ・バイオケミカル社の自動合成装置で
は、減圧装置は付属しておらず、その代りに不活性ガス
通気装置が付属しているのでこれを利用すればよい。こ
の場合、反応混合物は、上下がグラスフィルターである
反応容器に入っているので、不活性ガスを下から上の方
向に流し、反応液の液状での流出全防止する必要がある
。縮合剤全溶解する溶媒としてピリジン以外の溶媒音用
いる場合には、一部ビリジンが反応系に残存する限シ、
その全量を留去してもよい。

リン酸ジエステルとアルコールの量は、特に限定されな
いが本反応の性質上、アルコール成分のスルホン化を避
けるためには、アルコール成分に対してリン酸ジエステ
ル成分の量會同尚量もしくはそれ以上使用するのが望ま
しい。通常特に好ましいモル比は、アルコール成分１に
対してリン酸ジエステル成分が０．５〜１０、固相法の
場合は２〜１０の範囲で選はれる。

反応温度は、特に限定されないが通常好ましくは、室温
付近、ＯＬないし５０℃の間で選ばれる。反応溶媒のピ
リジンの量は特に限定されず、通常好ましくは、リン酸
ジエステルの濃度で０．０１〜０．５Ｍ、特に好ましく
は０．０５〜０．２５　Ｍの間で選ばれる。

本発明方法は、縮合剤上溶媒に溶かして行なうという方
法ばか９でなく、前記式（２）の反応の場合の様に、リ
ン酸トリアシライド等の活性化されたリン酸エステル（
式（２）の左辺左側の化合物）を用いる方法にも、もち
ろん利用できる。

次に具体的な実施例によって本発明の内容上例示するが
もちろん本発明はこれによって限定されるものではない
。

反応溶媒として用いたピリジンは市販の特級試薬を水素
化カルシウムから蒸留したもの愛用いた。含水率は、カ
ールフィッシャー法で１０ｐｐｍ以下であった。

Ｔｌ１Ｆは市販の特級試薬をモレキュラーシープ４Ａで
乾燥した後、水素化アルミニウムリチウムから蒸留した
もの愛用いた。含水率はカールフィッシャー法で４０ｐ
ｐｍ以下であった。

クロロホルムは、試薬特級品の液体クロマトグラフ川音
使用した。トリクロロ酢酸、過塩素酸（６０％）、エタ
ノール、４−ジメチルアミノピリジンは試薬特級品を使
用した。無水酢酸は、試薬特級品會五酸化リンで蒸留し
たもの音便用した。

メシチレンスルホニル−３−ニトロトリアゾリドは、既
知の方法で合成したもの全使用した（　Ｃ，Ｂ、Ｒｓｅ
ｓｇら、Ｔｔｔｔｒａｈｔｔｄｒｃｍムｔｔｇｒｓ、　
５０５９頁（１９７９年））。

原料として用いる保護基のついたヌクレオシドモノマー
およびダイマーは既知の方法で合成したもの勿使用した
（Ｓ、Ａ。

Ｎａｒａｎｇら、　Ｊｄａｔｈｏｄｇ　ｉｎｈｈｚｙｒ
ｎｏｌｏｇｙ、　６５巻、６１ｏ頁（１９（資）年））
。

オリゴマーの３′−末端となるヌクレオシドとレジン、
即ちポリマー支持体との結合は、アミドもｔ、　＜　ｔ
まエステル結合、もしくは、アミドとエステル結合の両
者金倉して行われる。

３′−末端となるヌクレオシドがレジンに結合したヌク
レオシド　レジンの合成は既知の方法によった。即ち、
ポリスチレン支持体を用いる場合は、Ｊ（、Ｍｉｙｏｓ
屓らＮｕｔ：１ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ１？５ｓｅａｒｃ、
ん、８巻、　５５０７頁（１９８０年）、あるいはその
中に引用された文献に従って合成した。トリエステル法
では主として、このポリスチレン支持体のヌクレオシド
レジン７用いた。

シリカゲル支持体は主としてホスファイト法の固相法に
用いられるが、これはＭ、ＩＬ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ。

７１９頁（１９８０年）の文献に従って合成したものを
用いた。

実施例　ｌ。

ベガ社、２８０型、同相合成機の反応容器（リアクショ
ンベセ々）に、ポリスチレン（Ｉｑｂ架橋）担持　５′
−ジメトキシトリチル−ベンゾイルデオキシシチジン６
］、、５＋ｎ？（ヌクレオシド置換量１０μｍｏ　ｌ　
）　′に入れた。次に示すプログラムで機械１動かした
。

１、クロロホルム洗浄　　　　　２ｍｌ　　　５秒　　
４回３、クロロホルム洗浄　　　　　２ｄ　　　１５秒
　　□ｊＪ４、ピリジン洗浄　　　　　　　２ｒｎ！、
３０秒　　４回５、窒素通気（上から下）　　　　　　
　　１０分６、　ヌクレオシドモノマージエステル　　
１００μｍｏｌ／ピリジン０．５コア、　　ＭＳＮＴ　
　　　　　１００＊’ＴＨＦ　　　１ｍ（６，７は計量
容器（メータリングベセル）内で混合シてから反応容器
に移送した。） ８、反応容器ケ上下逆にしてから窒素通気　　１０分（
下から上、　窒素圧約２ｐｓｉ）　　残存液量は０．３
〜０．５ｍｌになった。

９、攪拌　８０分 １０、　　ピリジン　２ｄ？ｒ−反応容器に加えてから
反応液をすてる。

１１、ピリジン洗浄　　　　　　　２ｍｌ　　　３０秒
　　５回１２、無水酢酸　１０％、　４−ジメチルアミ
ン６９９フ１１３、ピリジン洗浄　　　　　　２ｍｌ　
　　３０秒　　５回１４、クロロホルム洗浄　　　　　
２−　　３０秒　　３回上記処法において、８のステッ
プのみは、手動で操作する。

他のステップはすべて自動的に操作される。以上の操作
音、１サイクル目は、６のステップのモノマーとして、
Ｎ−ベンゾイル−５′−〇ージメトキシトリチルー２′
ーデオキシアデニン−３’−０−クロロフェニルフォス
フニー）盆、２サイクル目は６のステップのモノマーと
して、Ｎ−イソブチリル−５′−〇ージメトキシトリチ
ルー２′ーデオキシグアニン−３′−〇ークロロフェニ
ルフォスフェート會用いて２サイクルｋｌｌＪかし、３
サイクル目はステップ３で止めた。

ステップ２およびステップ３の沖液を集めたのち、クロ
ロホルムでメスアップして５０−とし、このうち１ｍｊ
？（のうしゆく乾固してから１０チドリクロル酢酸／ク
ロロホルムにとかして２５−とじた。この溶液の吸光度
ｉ５０７ｔＬｍで測定すると、２サイクル目と１サイク
ル目の比が、１００％であった。

３サイクル目と２サイクル目の比が、８２％であった。

これらはそれぞれ１サイクル目と２サイクル目の縮合反
応の収率全表わしている。

実施例　２。

再結晶で精製した縮合剤、ＭＳＮＩ’　（メシテレンス
λホニルー３ーニトロトリアシライド）各１００■塗，
脱水ピリジン、脱水ＴＪＩＦ、脱水ジオキサン、脱水ア
セトニトリル、脱水塩化メチレン、各１．　ｍ／に溶１
−　Ｌ、アルゴン雰囲気下、密封して室温で保存した。

シリカゲル薄層クロマトグラフ、展開溶剤トシて、クロ
ロホルム：メタノール（１０：１）ｋ用いて分析し、分
解の様子を定性的に観察した。その結果、ピリジン中で
は２４時間後に数％〜１０％程度の分解物が原点付近に
認められた。１週間後では数ｌＯ％の分解物が認められ
た。

ＴＨＦ、ジオキサン、アセトニトリルおよび塩化メチレ
ン中ではいずれも１週間後にも分解物は殆んど認められ
ず、初期値と殆んど同じであった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リン酸ジエステルとアルコールと會縮合剤の存在下
   にピリジン中で縮合反応させてリン酸トリエステル老製
   造するに際し、縮合剤を溶媒に溶かして反応系内に導入
   し、しかる後溶媒の一部を留去してから縮合反応を行う
   ことン特徴とする縮合方法。 ２、アルコールがヌクレオシド、ヌクレオチドもしくは
   オリゴヌクレオチドの５′位アルコールである特許請求
   の範囲第１項記載の縮合方法。 ３、アルコールがポリマー支持体上に担持されている特
   許請求の範囲第１項または第２項記載の方法。