JPS61240162A - 核酸の特異的ヨウ素化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、容易に放射線標識することのできる新規な核
酸プローブに関する。

合成オリゴヌクレオチドは分子生物学において異なる目
的に広く使用されてきている。それらは特定の免疫原を
導入しかつ検出するために、特定の遺伝子を単離するた
めに使用されてきている〔ギラム（Ｇｉ　ｌ　ｌａｍ）
、Ｓ−、ジャナケ（Ｊａｈｎａｋｅ）、Ｐ、アステル（
Ａａｔｅｌｌ）、Ｃ，、フィリー２ブス（Ｐｈｉｌｌｉ
ｐ３）、Ｓ、ハチｙソｙ（Ｈｕｔｃｈｉｎｓ。

ｎ）、Ｃ，Ａ、およびスミス（Ｓｍｉ　ｔ　ｈ）、Ｍ、
、“免疫原として合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
を使用するＤＮＡの特定の位置において定められたトラ
ンスバージョン突然変異（Ｄｅｆｉｎｅｄ　　Ｔｒａｎ
ｓｖｅｒｓｉｏｎ　　Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　　Ａｔ　　
Ａ　　５ｐｅｃｉｆｉｃ　　Ｐｏ５ｉｔｉｏｎ　　Ｉｎ
　　ＤＮＡ　　Ｕｓｉｎｇ　　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　　
Ｏｌｆｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
　　Ａｓ　　Ｍｕｔａｇｅｎｓ）、　　“ｇ　（Ｎ　ｕ
　ｃ　１　ｅ　ｉ　ｃ　　Ａ　ｃ　ｉｄｓ　　Ｒｅｓ、
）、６．２９７３−２９８５　（１９７９）；ギラム（
Ｇｉ　ｌ　ｊａｍ）、Ｓ、およびスミス（Ｓｍｉ　ｔ　
ｈ）、Ｍ、“合成オリゴデオキシヌクレオチドのプライ
マーを使用する部位特異的突然変異誘発（Ｓｉ　ｔｅ−
３ｐｅｃｉ　ｆ　ｉ　ｃＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　　Ｕ
ｓｉｎｇ　　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　　Ｏｌｉｇｏｄｅｏ
ｘｙｎｕｃｌｅ。

ｔｉｄｅ　　Ｐｒｉｍｅｒｓ）：１．最適条件および最
小オリゴデオキシヌクレオチド長さくＯｐｔｉｍｕｍ　
　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　　Ａｎｄ　　Ｍｉｎｉｍｕｍ
　　Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅ。

ｔｉｄｅ　　Ｌｅｎｇｔｈ）”、且匡ユ（Ｇ　ｅ　ｎ旦
）、旦、８１−９７　（１９７９）；ギラム（Ｇｉｌｌ
ａｍ）、Ｓ、およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｍ、“合成
オリゴデオキシヌクレオチドのブライマーを使用する部
位特異的突然変異誘発（Ｓｉｔｅ−５ｐｅｃｉｆｉｃ　
　Ｍｕｔａｎｇｅｎｅｓｉｓ　　Ｕｓｉｎｇ　　Ｓｙｎ
ｔｈｅｔｉｃｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ　　Ｐｒ　ｉｍｅ　ｒｓ）　　：　ＩＩ　、突然変異
体ＤＮＡ（７）生体外選択（Ｉｎ　　Ｖｉｔｒｏ　　５
ｅｌｅｃｔｉｏｎＯｆ　　Ｍｕｔａｎｔ　　ＤＮＡ）、
”蔗広ユ（９」−且至）、旦、９９−１０６　（１９７
９）；ハチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ）、Ｃ，Ａ、
、７４リツプス（Ｐｈｙｌｌｉｐｓ）、Ｓ、、ｘドゲル
（Ｅｄｇｅ　ｌ　ｌ）、Ｍ、Ｈ，ギラム（Ｇｉｌｌａｍ
）、Ｓ、ジャナヶ（Ｊａｎａｋｅ）、Ｐ、およびスミス
（Ｓｍｉ　ｔ　ｈ）、Ｍ、、”ＤＮＡ配列の特定の位置
における突然変異誘導（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　　Ａ
ｔ　　Ａ　　５ｐｅｃｉｆｉｃ　　Ｐ。

５ｉｔｉｏｎ　　Ｉｎ　　ＤＮＡ　　５ｅｑｕｅｎｃ旦
旦３．６５５１−６５６０　（１９７８）；サッグス（
Ｓｕｇｇｓ）、Ｓ、Ｖ、、　ワレス（Ｗａｌｌａｃｅ）
、Ｒ，Ｂ、、　　ヒロセ（Ｈｉ　ｒ　ｏ　ｓｅ）、Ｔ、
、カワシマ（Ｋａｗａｓｈｓｉｍａ）、Ｅ、Ｈ，および
イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）、に、、“交雑プローブと
して合成オリゴヌクレオチドの使用：ヒトβ１−ミクロ
グロブリンについてクローニングしたｃＤＮＡ配列の単
離（Ｕｓｅ　　Ｏｆ　　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　　Ｏｌｉ
ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　　Ａｓ　　Ｈｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎ　　Ｐｒｏｂｅｓ：ｌ５ｏｌａｔｉ。

ｎ　　Ｏｆ　　Ｃ１ｏｎｅｄ　　　ｃＤＮＡ　　５ｅｑ
ｕｅｎｃｅｓ　　　Ｆｏｒ　　Ｈｕｍａｎ　　β１−ｍ
ｉｃｒｏｇｌｌ−ｍ１ｃｒｏ”、プロシーディンゲスＯ
±よ）見互Ａ、１１．６６１３−６６１７　（１９８１
）；ラジン（Ｒａｚ　ｉ　ｎ）、Ａ、、ヒロセ（）ｌｉ
ｒｏｓｅ）、Ｔ、、イタクラ（Ｉ　ｔ　ａｋｕｒａ）、
に、およびリッグス（Ｒｉｇｇｓ）、Ａ、Ｄ、“化学的
に合成されたＤＮＡの使用による突然変異の効率よい補
正（ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＣｏｒｒ−ｅｃｔｉｏｎ　　Ｏ
ｆ　　Ａ　　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　　Ｂｙ　　Ｕｓｅ　　
Ｏｆ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　　５ｙｎｔｈｅｓｉｚ
ｅｄ　　ＤＮＡ）”、グ１　、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　、）
、ＵＳＡ、７５，４２６８−４２７０　（１９７８）；
　レイニス（Ｒｅ　ｙ　ｅｓ）、Ａ、Ａ、、ジョンソン
（Ｊｏｂｎｓ。

ｎ）、Ｍ、Ｊ、、ショルド（Ｓｃｈｏｌｄ’）、Ｍ９、
イト−（Ｉ　ｔ　ｏ）　、　Ｈ，、イタ（Ｉｋｅ）、Ｙ
、、モリ７（Ｍａｒｉｎ）、ｃ、％イタクラ（Ｉｔ、ａ
ｋｕｒａ）、に、およびワレス（Ｗａｌｌａｃｅ）、Ｒ
，Ｂ、、′分子クローニングによるＨ−２Ｋｂ−関連分
子の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　
ａｎ　　Ｈ−２Ｋｂ−Ｒｅｌａｔｅｄ　　Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌｅ　　　Ｂｙ　　Ｍ。

１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）”１Ｍ学（Ｌ匹見
見主土工！１１±ユ至Ｊ）、１４．３８３−３９２　（
１９８１）　　：Ｌ、イエス（Ｒｅ　ｙ　ｅｓ）、Ａ、
Ａ、、ショルド（Ｓｃｈｏｌｄ）。

Ｍ、、イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）、に、およびワレス
（Ｗａｌ　１ａｃｅ）、Ｒ，Ｂ、、“ネズミ移植抗原Ｈ
−２ＫｂについてのｃＤＮＡ核酸クローンの単ｆｉ（Ｉ
ｓｏｌａｔｉｏｎ　　Ｏｆ　　ＡｃＤＮＡ　　　Ｃ１ｏ
ｎｅ　　　Ｆｏｒ　　　Ｔｈｅ　　　Ｍｕｒｉｎｅ　　
Ｔｒａｎｓｐａｌｎａｔｉｏｎ　　Ａｎｔｉｇｅｎ　　
Ｈ−２Ｋｂ）”、プロシーディンゲス上ユ）見旦Ａ、Ｌ
旦、３２７０−３２７４　（１９８２）：ワレス（Ｗａ
　ｌ　１　ａｃｅ）、Ｒ，Ｂ　、、ジゴンソン（Ｊｏｈ
ｎｓｏｎ）、Ｐ、Ｆ、、タナ力（Ｔａｎａｋａ）、Ｓ、
、シゴルド（Ｓ　ｃ　ｈ　。

ｌｄ）、Ｍ、、　イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）、Ｋ、お
よびアベルソン（Ａｂｅｌｓｏｎ）、Ｊ、、”酵母菌転
移ＲＮＡ介在配列の有向欠失（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　　Ｄ
ｅｌｅｔｉｏｎ　　ＯｆＡ　　Ｙｅａｓｔ　　Ｔｒａｎ
ｓｆｅｒ　　ＲＮＡ　　Ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ　　５
ｅｑｕｅｎｃｅ）″。

サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０９．１３９６−１
４００　（１９８０）；ワレス（Ｗａｌｌａｃｅ）、Ｒ
，Ｂ、、ショルド（Ｓｃｈｏ　ｌ　ｄ）　。

Ｍ、、ジョンソン（Ｊｐｈｎｓｏｎ）、Ｍ。

Ｊ、、デンベク（Ｄｅｍｂｅｋ）、Ｐ、およびイタクラ
（Ｉｔａｋｕｒａ）、に、、′ヒトβ−グロビン遺伝子
のオリゴヌクレオチド有向突然変異誘発：クローニング
したＤＮＡにおける特異的点突然変異を生成する一般的
方法（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　　Ｄｉｒｅｃ
ｔｅｄ　　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　　Ｏｆ　　Ｔｈｅ
　　Ｈｕｍａｎ　　β−Ｇｌｏｂｉｎ　　Ｇｅｎｅ：Ａ
　　ＧｅｎｅｒａｌＭｅｔｈｏｄ　　Ｆｏｒ　　ｐｒｏ
ｃｉｕｃｔｎｇＳｐｅｃｉｆｉｃ　　Ｐｏ１ｎｔ　　Ｍ
ｕｔａｔｉ。

ｎ　　Ｉｎ　　Ｃ１ｏｎｅｄ　　ＤＮＡ）”、Ｕｇ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、）、９．３６
４７−３６５６　（１９８１）；ワシリク（Ｗａｓｙ　
ｌ　ｙｋ）、Ｂ、、デルビシャイヤー（Ｄｅｒｂｙｓｈ
ｉｒｅ）、Ｒ，、グイ　（Ｇｕｙ）、Ａ、、モルフ（Ｍ
ｏ　１　ｋｏ）　、　Ｄ　、、口ゲット（Ｒｏｇｅｔ）
、Ａ、、テオウレ（Ｔｅ。

ｕｌｅ）、Ｒ，およびチャンポン（Ｃｈａｍｂ。

ｎ）、Ｐ、、′コナルブミン遺伝子の特異的生体外転写
はコナルブミン遺伝子の特異的生体外転写Ｔ−Ａ−Ｔ−
Ａボックス相同配列における単一点突然変異により著し
く減少する（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　　Ｉｎ　　Ｖｉｔｒｏ
　　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　　Ｏｆ　　Ｃｏｎａ
ｌｂｕｍｉｎ　　ＧｅｎｅＩｓ　　Ｄｒａｓｔｉｃａｌ
ｌｙ　　Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　　Ｂｙ　　Ｓｉｎｇｌｅ
　　Ｐｏ１ｎｔ　　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　　Ｉｎ　　Ｔ−
Ａ−Ｔ−Ａ　　Ｂｏｘ　　Ｈｏｍｏ　Ｉｇｙ　　５ｅｑ
ｕｅｎｃｅ）″、プロシー８（１９８１）。

オリゴヌクレオチドを使用する特異的突然変異部位の検
出は５診断の目的で使用されてきている。コンナー（Ｃ
ｏｎｎｅｒ）、Ｂ、Ｊ、、ベイニス（Ｂｅｙｅｓ）、Ａ
、Ａ、、モリン（Ｍａｒｉｎ）、Ｃ，、イタクラ（Ｉ　
ｔ　ａｋｕ　ｒａ）、Ｋ、、テプリツ（ＴｅｐｌｉｔＺ
）、Ｒ，Ｌ、およびワレス（Ｗａ　１１　ａｃｅ）、Ｒ
，Ｂ　、、“合成オリゴヌクレオチドとの交雑による鎌
型β５−グロビンアＩ／Ｌ／の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏ
ｎ　　Ｏｆ　　５ｉｃｋｌｅ　　β　−Ｇｌｏｂｉｎ　
　Ａ１１ｅｌｅ　　Ｂｙ　　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ　　Ｗｉｔｈ　　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　　Ｏ１ｉｇｏ
ｎｕｃ見旦Ａ、且、２７８−２８２　（１９８３）は、
特異的１９−マーのオリゴヌクレオチドのプローブが鎌
型赤血球の患者と正常人とから抽出されたＤＮＡを区別
できることを示した。すべてのこれらの方法は、オリゴ
ヌクレオチドをある検出可能な放射性同位元素で標識す
ることを必要とする。

交雑のレベルおよび血液の数ｍｌの試料または組織の数
ｇの中に存在する遺伝子の量は非常に低いので、試験試
料に交雑したオリゴヌクレオチドの非放射性検出はまだ
実際的ではない、このような試料中の少量のＤＮＡを検
出するために十分な感度をもつ放射能を利用する方法は
、多数の潜在的危険を発生させる。それらの問題を軽減
するために、迅速な効率よい標識法を使用しなくてはな
らない、この方法は、標識された物質を容易に精製する
ことができ、そして標識された物質が十分に安定であっ
て結果の評価に必須である分析手順を通じて利用される
ようなものであるべきである。

今日まで、オリゴヌクレオチドプローブの最も効率よい
標識法は、ポリヌクレオチドキナーゼを使用して放射性
リン同位元素を核酸の５′末端に導入することである。

この手順はある酵素の使用を含み、この酵素はある期間
にわたって再現性ある結果を与えるために十分には安定
ではない：また。それは半減期が非常に短いリンの同位
元素の使用に限定される。標識の目的で他の酵素を使用
することは同様な欠点を有する０例えば、末端デオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を使用し
てオリゴヌクレオチドを標識する場合、ジデオキシヌク
レオシドトリホスフェートを使用しないと標識の程度を
調節することができない、標識後、標識物質の精製はま
た、この系中に酵素が存在する場合、多少の問題を発生
させるであろう。

この問題に対する１つのアプローチは、オリゴヌクレオ
チドまたは核酸プローブの末端をヌクレオシドホスフェ
ートまたはヌクレオシドの酸化的結合により、およびま
たポルトン−ハンター（Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ）
試薬との反応［ポル）７（Ｂｏｌｔｏｎ）、Ａ、Ｅ、お
よびハンターユ、５２９．（１９７３）］により、化学
的に標識することを含む、ポルトン−ハンター試薬との
反応は、効率よくかつ迅速であるが、出発物質が不安定
であるために１日常の基準で実施することが多少困難で
ある。標識オリゴヌクレオチドは加水分解したポルトン
−ハンター生成物から精製しなくてはならず、これはゲ
ル電気泳動を展開することによって実施することができ
る。この手順は時間を消費し、そして大量の組込まれな
い同位元素を取扱うことを必要とする。

ヨウ素原子のいくつかの放射性同位元素を使用して特定
の目的に核酸を標識することができる［：ｌ７−７−７
＊−ルド（Ｃｏｍｍｅｒｆｏｒｄ）、Ｓ、Ｌ、、バイオ
ケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ　ｓｔ　ｒｙ）、１０
．１９９３　（１９７１）］、ヨウ素は半減期が異なる
同位元素を有するので、適当なヨウ素化試薬またはヨウ
素化可能な核酸は異なる目的に有用であろう、ヨウ素の
一塩化物を使用するヨウ素化は核酸が有機溶媒中に可溶
性であることを必要とし、そしてそれは有機溶媒中にお
いて核酸の大部分が分解しかつ溶解度が非常に低いので
困難である。Ｎ−ヨードスクシンイミドを使用するヨウ
素化は非常に低い収率で生成物を生成する。塩化タリウ
ム（ｍ）の使用は核酸を多少分解させる。すべてのヨウ
素化法は核酸塩基をヨウ素化し、核酸プローブの交雑性
質に多少影響を及ぼす０本発明の方法は、特定の部位に
おけるヨウ素化法であり、そして核酸の交雑性質を変更
しない。

したがって１本発明の目的は、前述の欠点を回避する方
法で放射線標識される核酸プローブを提供することであ
る。

これらのおよび他の目的および利点は本発明に従い実現
され、そして本発明によれば、核酸をコールド（非放射
性）ヨウ素化可能な残基で核酸を予備標識することによ
り核酸をヨウ素化する方法が提供される。ヨウ素化すべ
き核酸プローブをまず化学的に修飾して触媒的または酵
素的にヨウ素化・可能な残基を与え、核酸塩基を無傷で
残す。

その上１本発明は、また、出発物質および他の前駆物質
から、有利には高圧下にカラムクロマトグラフィー装置
を使用して、後にヨウ素化された物質を分離する迅速な
効率よい方法を提供する０本発明の核酸プローブは、そ
のヨウ素化された形態において、核酸の交雑に、とくに
核酸交雑アッセイにおいて使用することができる。

ラクトペルオキシダーゼまたはクロラミンＴを使用しで
ある種の芳香族残基（例えば、チロシン、ヒドロキシフ
ェニル残基）をヨウ素化することができる０本発明はこ
のような化学を使用する０本発明は２工程の反応である
。ヨウ素化すべき核酸プローブを、まず、触媒的にヨウ
素化して核酸を構造的にかつ機能的に無傷で残すことの
できる残基を与える試薬と反応させる。プローブは、ヨ
ウ素化を妨害しない基１例えば、ｌ＼口、ＯＨ，Ｎｌ２
．ＣＮ、アルキルなどで置換されていてもよい、ヨウ素
化可能な残基、例えば、アリール基、例えば、フェニル
、ナフチル、アントラシルなどへ共有結合した核酸１例
えば、オリゴヌクレオチド、断片からなる０本発明に好
ましいアリール基は、ヒドロキシフェニル基、インドー
ル基およびイミダゾール基を含む、核酸断片の７リール
基への結合は、−ＣＯＮ−基を介すことができる。

本発明によるプローブは、一般式 ％式％ 式中。

Ｒは１１個まで、好ましくは３〜６個の炭素原子の脂肪
族炭化水素基であり、そして Ｘは置換されていないアリール基、例えば、フェニル、
ナフチル、アントラシルであるか、あるいはヨウ素化を
妨害しない基１例えば、／＼口、ＯＨ，Ｎｌ２．ＣＮ、
アルキルなどで置換である。

Ｒは核酸の糖または複素環の部分の上に位置することが
できる。

その上、本発明の方法はヨウ素化された物質を出発物質
および他の前駆物質から分離する迅速な効率よい方法を
使用する０本発明は、また、このようなヨウ素化物質お
よびそれらの前駆物質を出発物質および他の反応成分か
ら分離する方法を包含する。この方法は、逆相分離のた
めの、疎水性結合相を有するクロマトグラフィー装置を
使用する。逆相カラム系で１分子をそれらの疎水性の性
質に主として基いて分離できることは知られている。核
酸プローブのその性質を利用するために。

標識物質を標識されない物質とそれらの疎水性の特性に
基づいて区別することができなくてはならない０本発明
は、誘導化オリゴヌクレオチドからおよびヨウ素標識さ
れた修飾オリゴヌクレオチドから、オリゴヌクレオチド
を分離する高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法
に関する０本発明は次の反応式により示される。

、　　　　　　　　　本発明は、第一アミン基および第
二アミン基をを有する核酸を。

式中、 Ｘは玉に定義した通りである、 と反応させることを含む。

この反応の一例を、アミン含有オリゴヌクレオチドを用
いて出発して下に記載する： ζ　　ζ （ロ、 −項　　　　　２ １　″　　　　　　、 ０＝二Ｊ　　− Ｈ−Ｈｃｙ アミン含有ヌクレオチド残基は、５−アリルアミノｄＵ
、または８−もしくは６−へキシルアミノｄＡ、または
５−７リルアミノＣまたはＣ１酸化的に結合したアミノ
含有Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ，Ｕであることができる。−ＮＨ２
とヨウ素化可能な残基との間の結合は、Ｎ−Ｃ，Ｃ−Ｃ
，Ｃ−５，Ｓ−Ｓ、−Ｃ−Ｏであることができる。−Ｎ
−Ｃ−以外の結合をつくるために、−ＮＨ２残基を既知
の試薬で適切に修飾しなくてはならない。例えば、ＲＮ
Ｈ２をｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルと反応させると、チオエーテル−Ｃ
−Ｓ−Ｃ結合を形成する第３反応性基を与えられるであ
ろう。

触媒的にヨウ素化可能な分子を有する試薬、例えば、ス
ルホスクシンイミジルヒドロキシフェニルプロピオネー
トと反応性である第一アミン残基を有するような方法で
、核酸プローブを、まず。

修飾または調製する。ヒドロキシフェニル残基をオリゴ
ヌクレオチドへ共有結合させた後、ヒドロキシフェニル
残基を穏和な条件下にクロラミンＴ、またはラクトペル
オキシダーゼ、または同様な試薬の存在下にヨウ素化す
ることができる。

ヨウ素化可能な残基は、分子の残部（核酸部分）が性質
を変化させないような、特定の条件下に共有的にヨウ素
で修飾することができる基である。適当なヨウ素化可能
な基は、ヒドロキシアリール、好ましくはヒドロキシフ
ェニル。

のような基、トリプトフェン、ヒスチジン、メチオニン
、システィンおよびインドール、例えば。

シスチンからなる。すべてのこれらのヨウ素化可能な基
は、既知の反応により、核酸−アミンへ共有結合させる
ことができる。

特定的には、第一アミン残基をもつ核酸（例えば、アリ
ルアミノＵまたはへキシルアミノＡ）は保護のアミノ酸
のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応するで
あろう、このようなトリシンエステルとの反応は、 を与え、トリプトファン（ｔｒｐ）との反応は。

をダーえ、ヒドロキシｔｒｐとの反応は。

を与え、ヒスチジンとの反応は。

を午え、そして他の７ミ／ｆｊ＃との反応は、他のヨウ
素化可能な残基を導入することができるであろう。

このようなヨウ素化試薬をオリゴヌクレオチドと反応さ
せた後、出発物質から生成物を精製して引続く反応のた
めに純粋な誘導化オリゴヌクレオチドを得なくてはなら
ない０次いで、ヒドロキシフェニル残基で標識された核
酸プローブを逆相系で精製し、次いでクロラミンＴまた
は他の触媒の存在下にヨウ素化する。クロラミンＴまた
は他の触媒の存在下でヨウ素化した後、主要な放射性不
純物はヨウ素である。ヨウ素化された核酸およびヨウ素
化されない核酸からヨウ素を除去するために、小型の逆
相カラムを使用することができる。

日常的には、このカラムはＣ−１８相で被覆された幅広
いシリカ（３０００オングストローム）［米国カリフォ
ルニア州すンタ・クララ所在のブラウンリー・ラボラト
リーズ・インコーホレーテッド（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　　
Ｌａｂｓ、Ｉｎｃ。

からアクアボアー（Ａｑｕａｐｏｒｅ）ＲＰ−３ＯＯと
して入手可能Ｊから成る。カラムの大きさは内径３ｃｍ
Ｘ０．４６ｃｍであり、そして水溶液中で最小５ＩＬｇ
のオリゴヌクレオチドを結合する吸収容量を有する。

主容量の１２５ヨウ化ナトリウムを除去した後、単一の
分析用カラムでアセトニトリル勾配を使用して、ヨウ素
化されたオリゴヌクレオチドをヨウ素化されないオリゴ
ヌクレオチドから分離することができる。ヨウ素化され
た物質がヨウ素化されない物質からいったん分離される
と、ヨウ素化物質を含有する分画中の実質的にすべての
オリゴヌクレオチドは少なくとも１種の同位元素で標識
されるであろう、ヨウ素化物質を物質の残部から分離し
た後、試料を未知の試料および既知の試料との交雑によ
り試験し、およびまた、ゲル電気泳動の展開により試験
する。全体の手順は通常ヨウ素化可能な残基との反応１
分離、ヨウ素化、および分離を含むが、全体の手順は数
時間以内で実施することができる。その上、すべての中
間生成物は安定であり、誘導化オリゴヌクレオチドの大
規模の生産および貯蔵を可能とし、それらのオリゴヌク
レオチドは必要な時はいつでも１２５Ｉで標識すること
ができる。この方法は全部または一部を自動化して時間
および材料を節約し、かつ適切な濃度条件および適切な
溶媒および緩衝液を選択することにより、生成物の純度
およびこの方法の有効性を改良することができる。こう
して、商業的に入手可能なりロラミンＴを触媒として使
用し、これによりヨウ素化反応後に、唯一の不純物を簡
単なガード（ｇ　ｕ　ａ　ｒ　ｄ）カラムで非常に容易
に除去可能なヨウ化ナトリウムとすることができる。

本発明は、また、次の実施例より説明する。これらの実
施例において、特記しないかぎり、すべての部は重量部
である。実施例は特定のオリゴヌクレオチドを使用して
記載するが、同様な手順をリボオリゴヌクレオチド、デ
オキシリボオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、またはＲＮＡ
のプローブについて適合させることができる。この反応
は二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、前記ＲＮＡ、−末鎖Ｒ
ＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡ雑種または混合核酸プロー
ブを使用して、あるいは異なる酵素のための基質として
使用することができる。単一のジまたはモノヌルレオチ
ドまたはヌクレオシドホスフェートを使用して実施する
ことができる。すべての核酸試料、リボ、デオキシリボ
または混合オリゴまたはポリ−ヌクレオチドは第一アミ
ン含有するヌクレオチドトリホスフェート、酵素、例え
ば、ＴＤＴで修飾することができ、これは核酸含有第−
ＮＨ２残基を生成するであろう、順次に、これを芳香族
酸の活性化エステルと反応して、核酸りに７リール残基
を与えるであろう、アミン含有ヌクレオシドホスフェー
トは、また、同様に反応して核酸の修飾のためのヨウ素
化可能な残基含有酵素基質を生成するであろう、触媒と
して、固定化されたまたは可溶性クロラミンＴ、ラクト
ペルオキシダーゼなどを使用することができる。

実施例１ 反応性アミン含有オリゴヌクレオチドの合成： ビリソン 反応式　５°末端において１９Ａ’へ付加すべき１の合
成。

ｌの合成は上の反応式で概略的に示されている。

５−クロロ水銀−２゛−デオキシウリジン（５）［Ｄ、
Ｅ、ベルゲストｏム（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ）およびＪ、
Ｌ、ルス（Ｒｕｔｈ）。

９７７）の方法に従って調製した１をメタノール中で３
−トリフルオロアセトアミド−１−プロパｙ（７）［Ｍ
−パイラー（Ｐａｉｌｅｒ）およびＷ、Ｊ、ツブシ、（
Ｈｕｂｓｃｈ）、％ナトシュ６６）］およびに、ＰｄＣ
１４で処理して、２回のクロマトグラフィーおよびメタ
ノールからの結晶化後２２％の収率で、５−トリフルオ
ロアセトアミドアリル−２°−デオキシウリジン（８）
を得た。８を塩化４゜４°−ジメトキシトリチルをピリ
ジン中で反応させると、フラッシュクロマトグラフィー
後８５％の収率で９が生成し［Ｗ。

Ｃ，スチル（Ｓｔ　ｉ　ｌ　ｌ）　、　Ｍ、カーｙ（Ｋ
ａｈｎ）、Ａ、ミトラ（Ｍｉｔｒａ）、ジャーナ／ｌｚ
−オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ、　　Ｏｒｇ
、　　Ｃｈｅｍ、）、４３．２９２３　（１９７８）］
、これを引続いてＮ、Ｎ−ジイソプロピルアミノメトキ
シクロロホスフィン［Ｌ、Ｊ、マクブライド（ＭｃＢｒ
ｉｄｅ）およびＭ、Ｈ，カルサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒ
ｓ）、テトラヘドロン−Ｌ／ターズ（Ｔｅｔ、　　Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ）、２４．２４５　（１９８３）］　　（１
０）で処理すると、ｌがペンタンから沈殿後白色固体と
して得られた。

１９単位のオリゴヌクレオチドＨ１９Ａ’：３′−ＧＡ
−ＧＧＡ−ＣＴＣ−ＣＴＣ−ＴＴＣ−ＡＧＡ−ＣＧ−５
’ をＤＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を
使用して調製した；各オリゴヌクレオチドの１つの別々
のＩＩＬモルのバッチをつくり、各々を固体の支持体に
結合し、そしてジメトキシトリチル基で完全に保護した
。ジメトキシトリチル保護基を５゛−末端から除去し、
モしてｌをＤＮＡシンセサイザーを使用しないが、この
機械を典型的には使用するときと同一の試薬および条件
を用いて、前記１９−ｉ位の釦へ結合した。

この方法の生成物は、支持体から除去後、Ｃ−５“末端
に５°−（３−７ミノアリル）−５°−（４，４°−ジ
メトキシトリチル）−２°−デオキシ−ウリジン単位を
もつオリゴヌクレオチド、すなわち１次のものである： この生成物のポリヌクレオチドを最後に３％のトリクロ
ロ酢酸に短時間暴露して脱トリチル化し。

次いでポリアクリルアミドのゲル電気泳動により精製し
た。

ポルトンおよびハンター［Ａ、Ｅ、ポルトン（Ｂｏｌｔ
ｏｎ）およびＷ、）ｌ　、ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）、
バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｊ
、）、よ３３．５２９　（１９７３）］試薬の類似体を
結合する方法は１次の通りである： 式中、Ｘは上に定義した通りである。

上の反応の特定の例は次の通りである：（Ｊ１２ クロミラン１°の存在下のヨウ素化 式中、ｎは１〜４、好ましくは１〜２である、すなわち
、アミン官能化ポリヌクレオチド１１を３−（４°−ヒ
ドロキシフェニル）プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル（１２）と反応させると、クロラミ
ンＴの存在下にヨウ素化して化合物１４を生成すること
のできるヒドロキシフェニル残基を含有するプローブの
ポリヌクレオチドを生成する。

ポリヌクレオチドＨＢ１９Ａ’は１９単位のポリヌクレ
オチドであり、このポリヌクレオチドはポリペプチドβ
ヘモグロビンの遺伝情報を指定するヒ）ＤＮＡの部分、
ことに鎌型赤血球のヘモグロビンの形成および鎌型赤血
球貧血として知られている遺伝疾患において出現する突
然変異が存在するＤＮＡの区域に相当する。

赤外ｃＩＲ）スペルトルは、特記しないかざ１　　　　
　　　　　リ、ＣＨＣｌ３中の溶液として得た：ポリス
チレンフィルムの１６０２ｃｍ−帯を外部の目盛定め標
準として使用した。

プロトン磁気共鳴（ｌ　ＨＮＭＲ）スペクトルは、特記
しないかぎり、ＣＤＣ１３溶液中で得た。化学シフトは
、特記しないかぎり、内部標準のテトラメチルシランか
らダウンフィールド（ｄｏｗｎｆｉｅｌｄ）においてｐ
ｐｍで報告する。

炭素−１３の磁気共鳴（’　３　ＣＮＭＲ）スペクトル
は、特記しないかぎり、ＣＤＣｌ３溶液中で得た。炭素
のシフトは、特記しないかぎり、内部標準のテトラメチ
ルシランからダウンフィールドにおいてｐｐｍで報告す
る。

リン−１３の磁気共鳴（３１ＰＮＭＲ）スペクトルは、
特記しないかぎり、ＣＤＣｌ３溶液中で得た。リンのシ
フトは、特記しないかぎり、内部の水性１５％のＨ３ｐ
ｏａ標準からダウンフィールドにおいてｐｐｍで報告す
る。

薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、Ｅ、メルク（Ｍ
ｅｒｃｋ）からのシリカゲル６０Ｆ−２５４板を使用し
て実施した。カラムクロマトグラフィーはＥ、メルク（
Ｍｅｒｃｋ）のシリカゲル６０（７０〜２３０メツシユ
）を使用して実施した。

ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）等級のメタ
ノール（１２０ｍり中の５−クロロ水銀−２′−デオキ
シウリジン（５）［ベルゲストロム（Ｂｅｒｇｓｔｒｏ
ｍ）およびルス（Ｒｕｔｈ）、５ｕｐｒａ］　　（５，
５６ｇ；１２ミリモル）の懸濁液を、不活性ガス雰囲気
中で周囲温度に維持し、３−トリフルオロアセトアミド
−１−プロパ７（７）（パイラー（Ｐａｉｌｅｒ）およ
びツブシ、（Ｈｕｂｓｃｈ）、５ｕｐｒａｌ（７，３３
ｇ；４８ミリモル；４当量）およびに２　ＰｄＣＩａ　
　（４，２８ｇ；１．１当量）で処理した。この反応混
合物は徐々に黒色となり、そして２２時間攪拌した。こ
の混合物をＨ２Ｓガスで数分間処理し１次いでセライト
（Ｃｅｌｉｔｅ）で濾過し、メタノールで洗浄し、そし
て８０℃の浴から減圧蒸発乾固すると、粗製の半固体の
残留物（７、０ｇ）が得られた。この残留物をシリカゲ
ルのカラムのクロマトグラフィーにかけ。

ＣＨ２Ｃ１２：ＭｅＯＨ（５：　１）　で展開した。

変性ｐ−アニスアルデヒド試薬で青色に着色し〔エゴン
拳スタールＣＥｇｏｎ　　５ｔａｈｌ）。

プリンガーーフェルロク、ニューヨーク、８５７（１９
６９）］かつＲｆ＝０．５１　（ＣＨ３ＣＮ：ＭｅＯＨ
３：１）を有する集め、そして真空蒸発乾固すると、無
色の泡が得られた。この生成物を最小量のメタノールか
ら結晶化し、濾過し、冷ＣＨＣ１３：ＭｅＯＨ（３：　
１）　で洗浄し、そして真空乾燥した。母液を第２収穫
について処理すると、合計の収量は１．０１ｇ（２２％
）であった＊　Ｍ　ｅ　ＯＨから再結晶化すると１表題
化合物（８）が分析的に純粋な小さい白色針状結晶とし
て得られた。６４℃で一夜真空（＜１．０）ル）乾燥後
、融点＝１８３−１８４℃、ＩＲ（ＫＢｒ）ａｍ−’　
　３４２０．３２６０、１７１８゜１６８３（ｂｒ）　
　、　１５６０、１４７８．　１２８３、１１９０、１
１０２．　１０６１．　９８０．　７８８．７６３．ｌ
ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）（参照ＤＭＳＯ−ｄ６）８
２．１３　（ｄｄ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、３．５９　　
（ｂｒ　　　ｓ、２Ｈ）、３．７０−３．９７（ｍ、３
Ｈ）、４−２５（ｂｒ　　　ｓ、ＩＨ）、５．０６（ｂ
ｒ　　ｍ、　　ｌＨ）、５．２０　　（ｂｒ　　ｍ、Ｉ
Ｈ）、６．０５−６．６５　　（ｍｓ、４Ｈ）、８．０
１　　Ｃｓ、ＩＨ）、９゜６０　　（ｂｒ　　ｓ、ＩＨ
）；”　ＣＮＭＲ（ＤＭＳｏ−ｄ６）（参照ＤＭＳＯ−
ｄ）ｐｐｍ１６２．０５．　１５５．２９、１４９．５
０．　１３８．０５、１２４．３３．　１２４．１４、
１０９．９６、８７．５３．　８４．４７．　７０．２
３．６１．１２，３９．９３；　　［α］　Ｄ＝十ａ　
。

０１”　　（ｃｍ０．８７、ＭｅＯＨ）。

分析：　ＣＩａ　Ｈ＋　ｓ　Ｎ３０ｓ　Ｆ３計算値：　
　Ｃ，４４，３３；Ｈ，４，２５；Ｎ。

１１．０８ 実測値：　Ｃ１４４，１９；Ｈ１４，１０，Ｎ。

１０．９３ 無水ピリジン（８ｍｌ）中の８（０，６０ｇ。

１．５８ミリモル）の溶液を不活性ガス雰囲気中のもと
に維持し、そして周囲温度において塩化４．４′−ジメ
チキシトリチル（０，６７ｇ。

１．２５当量）で処理した。１８時間攪拌した後１反応
混合物を氷水（７０ｍｌ）中に激しく振盪しながら注ぎ
入れる。１７３時間０℃で放置した後、ゴム状固体が分
離し、はぼ透明の溶液が得られ、これをデカンテーショ
ンした。固体をＨ２Ｏ（５ｍｌ）で１回洗浄し、次いで
ＣＨ２ＣＨ２Ｃ１２（１０中に取り、ブライン（５ｍｌ
）で−回洗浄し１次いでＣＨ２Ｃｌ２溶液をに２ＣＯ３
で乾燥し、濾過し、そして真空蒸発乾固すると、褐色の
泡が得られた。この粗生成物をシリカゲル［メルク（Ｍ
ｅ　ｒ　ｃ　ｋ）　、等級６０，２３０−４００メツシ
ユ、６０Ａ］　　（７５ｇ）のカラムのフラッシュクロ
マトグラフィー［スチル（Ｓｔｉｌｌ）ら、５ｕｐｒａ
ｌにかけ、ＣＨＣｌ３中の４．０％ｃ７）ＭｅＯＨ（１
、ＯＬ）　で展開した。ピリジン（１０，１）を含有す
る管の中に各々約２０　ｍ　ｌの分画を集めて５′−ヒ
ドロキシルの脱プロトン化を抑制した。主要生成物の帯
（Ｒｆ＝０．２９；ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３　７．９３）
を含有する分画を合わせ、！過し、そして真空蒸発乾固
すると、９（０，９１ｇ；８５％）がわずかに黄色がか
った泡として得られた。溶離帯の中心からの分画から溶
媒を除去し、Ｅｔ　ｏＡｃ中に取り、ノリト（Ｎｏ　ｒ
ｉ　ｔ）２１１で処理し、セライトで濾過し、６４℃で
高真空（く１．Ｏトル）のもとに−夜蒸発乾固すると１
分析用試料が無色の泡として得られた。融点＝１０５−
１１０（分解）、ＩＲ（ＣＨＣｌ３）ｃｍ−’　３３７
０．２９２０、１７１５、１６９５．　１６１８、１５
１５、１４７０．　１２６０、１１８２、１０４５．８
４２　；　Ｈ’　　ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）　　δ２．３
８（ｂｒ　　ｍ、２Ｈ）、２．２５−３．７５　　（ｍ
、５Ｈ）、３．７５　　（ｓ、６Ｈ）、４．１０　　（
ｂｒｍ、ＩＨ）、４．６０　　（ｂｒ　　　ｓ、　　Ｌ
Ｈ）。

５．３９　　（ｄ、Ｊ＝１６　　Ｈｚ、ＩＨ）、６．１
０−６．５５（ｍ、２Ｈ）、６．７０−６．９５（ｍ、
５Ｂ）、７．１５−７．４５　　（ｍ、　　１０Ｈ）、
７．８４（ｓ、　　ＩＨ）；”ＣＮＭＲ（ＣＤＣ１３）
（参照ＣＤＣ１３）　ｐ　ｐｍｌ　６２．３１．１５８
　．７４、１５７．７０．　１５６．０１、１４９．７
０、１４４．０４．　１３７．８８、１３５．６５、１
３５．５２、１３０．１２、１２８．１１．　１２７．
２６、１２５．０５、１１３．４８、１１１．３３、８
６゜９４．９６．６８．８５．２５．７２．１８．６３
．６０．　５５．３４、４２．６６、４１．４匁逝：　
Ｃ３ｓ　Ｈ３ａ　Ｎ３０Ｂ　Ｆ３計算値：　　Ｃ，６１
，６７、Ｈ２Ｓ、０３：Ｎ、６．１６ 実測値：　Ｃ１６１，４７，Ｈ２Ｓ、１９．Ｎ。

５．９５ 」１Σ 無水ＣＨ２Ｃ１２（１，５ｍ１）中の９（０゜３４ｇ：
０．５ミリモル）の溶液を、アルゴン雰囲気のもとに周
囲温度に維持し、まず、無水ジイソプロピルエチルアミ
ン（０，３５ｍ１：０．２５９ｇ：２ミリモル；４当量
）で処理し、次いでイ　　　　　　　　　Ｎ、Ｎ−ジイ
ソプロピルアミノメトキシ−クロロホスフィン［マクブ
ライド（ＭｃＢ　ｒ　ｉ　ｄ　ｅ）ら、王且エエ１参照
］　　（１０）（０，１９ｍ１；約０．２ｇ；１２当ｉ
）で１分かけて滴々処理した。を澄みの無色溶液を２０
分間纜押し１次いでＥｔＯＡｃ　（２０ｍｌ）（ＥｔＯ
Ａｃは前もって飽和水性ＮａＨＣＯ３で洗浄し１次いで
ブラインで洗浄しである）で分液漏斗に移し、次いでブ
ライン（各回３５ｍ１）で４回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で
乾燥し、濾過し、そして真空蒸発乾固すると、無色のガ
ラズ状材料（ｏ　、　５１　ｇ）が得られた。この粗生
成物を無水ベンゼン（２ｍｌ）中に取り、そして急速に
攪拌したペンタン（６０ｍｌ）中に一７８℃においてア
ルゴン雰囲気のもとで沈殿させた。得られる懸濁液を濾
過し、−７８℃のペンタンで洗浄し、そして＜１）ルに
おいてＫＯ）Ｉで一夜真空乾燥すると、表題化合物（１
）（０，３８ｇ：９３％）が白色粉末として得られた。

ＩＲ（ＣＨＣＩｓ）ｃｍ−’　２９６５．１７２２．１
６９８．１６１８％　１５１８．１４７０．１２８２．
１１８５．１０４５．９８ｇ、８４２　；　’　ＨＮＭ
Ｒ）　　（ＣＤ２　Ｃｌ　２　）δ０．９５−１．３０
（ｍ、　１２Ｈ）、２．２０−２．６０（ｍ、２Ｈ）、
３．２４および３．３７（ｄｄ、Ｊ　＝１３Ｈｚ、３Ｈ
）　　（Ｐ−０−ＣＨｓ）、３．２０−３．８０（ｍ、
６Ｈ）、４．１７（ｂｒ　　ｍ、　　ＩＨ）、４．６８
（ｖ　　　ｂｒ　　ｍ、　　ＩＨ）、５．４２　　（ｄ
、Ｊ＝１６Ｈｚ、ＩＨ）、６．１５−６．５５（ｍ、３
Ｈ）、６．７５−６．９５（ｍ、　４Ｈ）、　　７．２
０−７．５０（ｍ、ｌ０Ｈ１７，７９（ｓ、ＬＨ）；”
　ＣＮＭＲ（ＣＤ２　Ｃ１２）（参照ＣＤ、Ｃ１２）Ｃ
１２）ｐｐ、４０．　１５９．２１．　１５７．７８、
１４９．７８．　１４９．７８．　１４４．７１、１３
８．３４、１３６．００．　１３０．５３、　１２８．
７１．　１２８．４５．　１２７．５４％　１２５．６
６、１２５．２７、１１３．８２、１１１．４８．８７
．２３．８６．３１．８５．６０．５５．７５．　４３
．７８．４３．２０．４２．９４．２４．９９．２４．
６０：”Ｐ　　ＮＭＲ（ＣＤ２　　Ｃ１２）Ｐ　Ｐｍｌ
　４９．３０．１４８．８７．１４．１１　（約１２％
の純度）、８．１８（約４％の純度）。

１のオリゴヌクレオチドへの結合 対照の穴ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌ　　ｐｏｒｅｇｌａｓ
ｓ）の固体の支持体上で７プライド・バイオーシステム
ス（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｌｏ−５ｙｓｔ　ｅｍｓ）３
８０ＡＪＪＤＮＡシンセサイザーを使用して、１９一単
位のオリゴヌクレオチドを合成した。ｌをオリゴマーの
５°末端へ結合する直前に、５’−０−（４，４°−ジ
メトキシトリチル）保護基を前記機械によりＣＨ２Ｃｌ
２中の３％のＣＣ１３ＣＯｚＨで９０秒間切離した。支
持体に結合した５°−脱保護したオリゴマーをＣＨ２Ｃ
ｌで洗浄し、そしてアルゴンの流れで乾燥した。引続く
工程は１機械を使用しないが、同一の化学を用いて実施
した； ｌ、　支持体に結合したオリゴマーを自動化合成に使用
した容器（カラム）から取り出し、そしてアルゴン雰囲
気のもとで乾燥した隔膜のキャップのバイアルに移し た。

２、　結合したオリゴマーを２０〜３０倍過剰の無水Ｃ
Ｈ３ＣＮ中の０．５モルのＩＨ−テトラゾールで処理し
、次いで直ちに同様な過剰量のＣＨ３ＣＮで処理した。

それをおだやかに攪拌しながら３０分間インキュベーシ
ョンした。

３、　試薬をピペットで取り、そして結合したオリゴマ
ーを３つの部分のＣＨ３ＣＮで洗浄した。

４、　結合したオリゴマーを含有する固体支持体を過剰
のＩ２−Ｈ２Ｏ−ルチジン−ＴＨＦ　（０、１モル：ｌ
：ｌＯ：４０）で処理し、そして１５分間攪拌した。

５、　　試薬をピペットで取り、そして結合したマ　　
　　　　　　　　　　　オリゴマーを４つの部分のＣＨ
３ＣＮで洗浄した。

６、　結合したオリ３マーを含有する固体支持体を過剰
のトリフエノール−トリエチルアミン−ジオキサンで６
０分間洗浄し た。

７、　試薬をピペットで取り、そして結合したオリゴマ
ーを４つの部分のＭ　ｅ　ＯＨで洗浄した。

８、　結合したオリゴマーを含有する固体支持体を製水
性ＮＨ４０Ｈで２時間周囲温度で処理した（これは保護
されたオリゴヌクレオチドを支持体から取り出す）。

９、　すべての保護基を除去するために、オリゴヌクレ
オチドを製水性ＮＨ４０Ｈで処理し、そして５０℃で一
夜加熱した（これはジメトキシトリチル以外のすべての
保護基を除去する）。

１０、　　支持体を濾過し、モして濾液を蒸発乾固して
粗製のオリゴヌクレオチドを得た。

上の１０工程を支持体結合したオリゴヌクレオチドのす
べてのバッチについて反復した。シリカゲルのＴＬＣ板
上の各々の一部をＣＨ２Ｃｌ、中の３％のＣＣ１３Ｇｏ
ｔ　Ｈで処理すると、ジメトキシトリチルの陽イオンの
オレンジ−赤色が生成し、これにより１のオリゴヌクレ
オチド中への組込みが成功したことを示された。

修飾されたＨＢ　１９Ａ　’オリゴヌクレオチドの１つ
のバッチをＣＨ２Ｃ１２中の３％のＣＣ１３ｃｏ２Ｈで
脱トリチル化し、次いでポリアクリルアミドの電気泳動
により精製した。

実施例２ 応 実施例１の１９Ａ゛アミンの２ｊＬｇを、２０ルｌのＩ
Ｏミリモルのホウ酸塩緩衝液、ｐＨ８、１６の中に溶解
した。これに、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）から購入した
スルホスクシニミル３−（４−ヒドロキシフェニル）−
プロピオネート（ＳＨＰＰ）の新しく調製した溶液の５
．１を添加した。５ＨＰＰの濃度は水中５ｍｇ／ｍｌで
あった０反応を室温で３０分間進行させ、次いでそれを
フリーザー内に保持し１次いでＰＨＬＣの分離を実施し
た。この反応後１反応の程度を慣用法により２０％のポ
リアクリルアミドゲルの展開により監視した。

Ｘ電値１ シンクロパック（Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｃｋ）ＲＰＰ４．
ＬＸｌｏｃｍ　［ジンクロム（Ｓ　ｙ　ｎ　ｃ　ｈｒｏ
ｍ）；リンデン、インジアナ］カラムへ結合したブラウ
ンリー（Ｂｒｏｗｎ　ｌ　ｅｅ）ＲＰ３００ガードカラ
ムを使用して、周囲温度において、１モルの酢酸トリエ
チルアンモニウムｐＨ７から０．１モルの酢酸トリエチ
ルアンモニウムｐＨ７の勾配を用いてＨＰＬＣ分離を実
施し、５０％のア七ト二トリルで試料に依存して１０〜
１２０分かけて展開した。検出器を２５４ｎｍに設定し
、そして全目盛は０．１５の吸収単位であった０Ｍ導化
オリゴヌクレオチド生成物の位置を決定するため、ブラ
ンクの展開をオリゴヌクレオチドを含有しない反応混合
物で実施した。新しいピークはオリゴヌクレオチドの添
加後に現われ、そして反応生成物に相当した。生成物を
分離し、分画コレルター中に集めた後、生成物をゲル電
気泳動により分析し、そして次の展開から、適切なピー
クの分析決定は不必要に思われた。カラムからの生成物
の収率および回収率は８０〜９０％であった。

５ＨＰＰ標識オリゴヌクレオチドを含有するＨＰＣＬ分
画を減圧蒸発させ１次いで５ｕ、１の水中に再溶解した
。２ｊＬｇの５ＨＰＰ標識オリゴヌク１　　　　　　　
　　レオチドを含有する５ＩＬ１の水溶液をリン酸基緩
衝液ｐＨ’ｌｌで５０μｌに希釈した。この緩衝液は１
００ミリモルのリン酸水素二ナトリウムおよび５０ミリ
モルのリン酸二水素ナトリウムを含有した０次いで、１
μＩの０．１規定の１１！酸をこのｓｓｇｔの溶液に添
加し１次いでＩＩＬ＋の１２５１にュー・イングランド
争ニュークリアー（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｎ　
ｕ　ｃ　ｌ　ｅ　ａｒ）１．４マイクロキユーリーおよ
びｌヨードビード（Ｉｏｄｏｂｅａｄ）（固定化クロラ
ミンＴ）［ビアー７、（Ｐｉ　ｅ　ｒｃｅ）］を添加し
た。

この反応氷水中で１５分間続けた０反応をヨードビード
の除去により停止し、そしてこの溶液を逆相クロマトグ
ラフィーシステムの上に注入した。

オリゴヌクレオチドおよびヨウ素化試薬を含有する混合
物を酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液で希釈し、次い
でそれらをガードカラム（実施例３）上に装入した。ま
ず、カラムを０．１モルの酢酸トリエチルアンモニウム
で洗浄してヨウ化ナトリウムおよび逆相カラム上に吸収
されない他の成分を除去した。最初の大きい放射性ピー
ク（これはオリゴヌクレオチドを含有しない）が溶離さ
れた後、ガードカラムを分析用カラム（シンクロパック
ＲＰ−Ｐ）と直列に配置し、そして０．１モルの酢酸ト
リエチルアンモニウム中の０〜５０％のアセトニトリル
の勾配をこの系を通して流した。典型的な展開において
、ヨウ素化されない材料はヨウ素化Ｓ　ＨＰ　ｐｒｉｍ
オリゴヌクレオチドの前に溶離された。ピークを集め、
それらを再びゲル電気泳動で分析した。クロマトグラフ
ィーの性質が確立された後、この分析は不必要であった
。

この実施例のために選択した特異的オリゴヌクレオチド
断片は、鎌型赤血球貧血の検出に有用であった。このオ
リゴヌクレオチドの特定の配列５°−０本−ＧＣＡ　　
ＧＡＣＴＴＣＴＣＣＴＣＡ　　ＧＧＡ　　Ｇ−３°（Ｕ
本＝５７リルアミノＵ）は正常の血液から抽出されるＤ
ＮＡと交雑し、これに対して厳格な条件下では、それは
鎌型赤血球貧血の病気をもつ人の血液から抽出されるＤ
ＮＡと交雑しないであろう、血液試料からのＤＮＡの抽
出および制限酵素を使用する消化および交雑法の他の処
理は、コンナー（Ｃｏ　ｎ　ｎ　ｅｒ）、Ｂ、Ｊ、ら、
５ｕｐｒａの論文に０本をもたなない同様なオリゴヌク
レオチドに関連して詳述されている。

本発明によりヨウ素化された物質は、鎌型赤血球貧血の
検出に使用できる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヨウ素化可能な残基へ共有結合した核酸断片からな
   るプローブ。 ２、前記ヨウ素化可能な残基はヒドロキシフェニル基、
   インドール基またはイミダゾール基である特許請求の範
   囲第１項記載のプローブ。 ３、前記結合は−ＣＯＮ−基を含む特許請求の範囲第１
   または２項記載のプローブ。 ４、式 核酸−Ｒ−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ 式中、Ｒは１１個までの炭素原子の脂肪族炭化水素基で
   あり、そしてＸはヨウ素化可能な残基である、 をもつ特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のプ
   ローブ。 ５、Ｘは ▲数式、化学式、表等があります▼ である特許請求の範囲第４項記載のプローブ。 ６、Ｒは３〜６個の炭素原子を有する特許請求の範囲第
   ４項記載のプローブ。 ７、Ｒは核酸の糖または核酸の複素環の部分へ結合して
   いる特許請求の範囲第４項記載のプローブ。 ８、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｘはヨウ素化可能な残基であり、Ｒは１１個まで
   の炭素原子の脂肪族炭化水素基であり、そしてｎ＝１〜
   ４である、 のヨウ素化プローブを製造するにあたり、式 核酸−Ｒ−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ をヨウ素化剤と反応させることを特徴とする方法。 ９、反応の塊をクロマトグラフィーのカラムに通過させ
   、そしてヨウ素化プローブからなる実質的に純粋な分画
   を分離することを特徴とする特許請求の範囲第８項記載
   の方法により製造されたヨウ素化プローブを分離する方
   法。 １０、核酸の交雑における、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｘはヨウ素化可能な残基であり、Ｒは１１個まで
   の炭素原子の脂肪族炭化水素基であり、そしてｎ＝１〜
   ４である、 のヨウ素化プローブの使用。