JPS59104383A - プリン系核酸塩基の析出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプリン系核酸塩基およびヌクレオチド全含有す
る液から、プリン系核ｒ駿塩基を析出する方法に関する
。

ヌクレオチドは調味料あるいは医薬原料等としれ全分離
する必要がある。この分離方法としては、プリン系核酸
塩基が中性付近で水に対する溶解度が低いことを利用し
て、ｐＨ調整、冷却、塩析、蒸発、水浴性有機溶媒添加
等によシ該塩基全優先的に析出させ、次いでか過、遠心
沈降等により分取する方法が従来よシ行なわれている。

ところが、プリン系核酸塩基の析出物は微細な結晶また
は無定形の微粒子であって、ａ：：Ｆ５過性、難沈降性
を示し、従来の方法によるとその分離（は容易ではない
ばかシか、析出物が多量の母液を含むためにこれに伴っ
て失なわれるヌクレオチＦの爪も多いという欠点がある
。

こうした状況に鑑み、本発明者らは鋭意研究の結果、以
下に述べるように、活性炭を用い工業的に有利なプリン
系核酸塩基を析出する方法を完成した。

全共存せしめること全特徴とするプリン系核酸塩基の析
出方法である。

本発明において用いられるプリン系核ｅ塩基およびヌク
レオチドを含有する液とは、例えば、酵母核酸等の加水
分解液、動物組織等の抽出液、核酸関連物質醗酵液、ヌ
クレオシドを化学的にあるいは酵素を用いてリン酸化し
た反応液およびそこから目的とするヌクレオチド全分離
取得する中間工程の液等であって、ヌクレオチドと共に
相当量のプリン系核酸塩基を含有する液をいう。

ここに、プリン系核酸塩基としては、例えば、アテニン
、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、メチ／レキ
サンチン等であシ、これらは２種類以上が共存していて
もよい。またシトシン、ウランｌし等のピリミジン系核
酸塩基およびイノシン、グアノシン、アデノシン等のヌ
クレオシドが混在していても本発明方法の実施を何んら
妨げるものではない。

また、ヌクレオチドとしては、イノシン、グアノシン、
アデノシン、キサントシン、シチジン、ウリジン等のプ
リン系、ピリミジン系ヌクレオシドのモノ、ジ、トリー
リン酸エヌテルまたはそれらに対応するデオキシリボー
ス同族体を指す。例エバ、イノシン−５′−リン酸、グ
アノシン−５′−リン酸、アデノシン−５′−リン酸、
キサンチン−５′−リン酸、シチジン−５′−リン酸、
ウリジン−５′−リン酸、デオキシアデノシン−５′−
リン酸、デオキシアデノシン−５′−リン酸、デオキシ
シチジン−５７−リン酸、デオキシウリジン−５′−リ
ン酸、イノシン−２’（３’）　、　５’−シリン酸、
イノシン−５２−シリン酸、グアノシン−２’（３’）
　、　５’−シリン酸、グアノシン−５７−シリン酸、
アデノシン−２’（３’）　、　５’−シリン酸、アデ
ノシン−５′−シリン酸、シチジン−５′−シリン酸、
ウリジン−５′−シリン酸、デオキシアデノシン−５′
−シリン酸、デオキシアデノシン−５′−シリン酸、デ
オキシシチジン−５′−シリン酸、デオキシウリジン−
５′−シリン酸、アデノシン−５′−トリリン酸、グア
ノシン−５′−トリリン酸、デオキシアデノシン−５’
−）シリン酸、デオキシグアノシン−５′−トリリン酸
、デオキシシチジン−５７−トリリン酸、デオキシウリ
ジン−５′−トリリン酸、イノシン−２′−リン酸、グ
アノシン−３７−リン酸、アデノシン−３’、　５’−
環状リン酸、キサンチン−２’、　３’−環状リン酸等
があげられる。これらのヌクレオチドは２種類以上が液
中に含まれていてもよい。

本願発明方法で対象とするヌクレオチドおよびプリン系
核酸塩基？含有する液におけるそれぞれの濃度は、プリ
ン系核酸塩基を析出させるときの条件や用いる活性炭等
によって適宜に調整される。

ヌクレオチドはプリン系核酸塩基を析出するときに溶解
可能な量であればよいが、通常、約０．１〜１０％であ
ろう一方、プリン系核酸塩基の濃度は特に制限はないが
、たとえば上記ヌクレオチド量に対して約１〜１０％程
度含まれるような高含量の液にも本発明方法を適用でき
る。

本発明の方法で用いられる活性炭としては、特に限定さ
れないが、たとえば直径１５μ以下の細孔の全細孔容積
０．７　ＣＣ／　９以上、直径３００Ａ以下の軸孔の全
細孔容積０．４ＣＣ／ｆ以上、直径３００＾以下の細孔
の平均細孔直径１７Ｘ以上の細孔特性を有する活性炭が
挙げられる。

上記細孔特性のうち、直径１５μ以下の細孔の全細孔容
積は、たとえば水銀圧入法、窒素ガス吸着法〔慶伊富長
：吸着、第９５〜１１３頁（１９６７）。

共立出版〕などの方法によって測定される。直径３００
Ａ以下の細孔の全細孔容積については、たとえば窒素ガ
ス吸着法（前記文献に記載された方法）などの方法によ
って測定される。また、直径３００＾以下の軸孔の平均
細孔直径とは、直径３００八以下の細孔を円筒形と仮定
し、この細孔容積と窒素ガス吸着等製線からＢＥＴ式（
前記文献に記載された方法）によシ計算される比表面積
とから次式によって計算される値である。

（注）この場合の細孔容積とは、直径３００Ａ以下の細
孔の全細孔容積をいう。

上記のような特定の細孔特性を有する活性炭は、たとえ
ば、１）木材片、ノコクズ、果実殻（ヤシガラ）などの
木質原料を塩化亜鉛、燐酸、塩化力μシウムなどの薬品
に浸漬し、約６００〜７００℃で焼成した後、たとえば
塩酸などの酸によって添加薬品類全脱離、洗浄すること
にょシ、２）石炭、石油残渣、石油コークス、石油ピッ
チなどの鉱物系原料を酸またはア／レカリで処理してか
ら、水蒸気、炭酸ガスなどにより約７５０〜９００°Ｃ
て賊活すること等によりｉられる。

活性炭の形状は、粉末状、粒状あるいは顆粒状等のいず
れでもよいが、粒度については、たとえば８〜２５０メ
ツシユの粒度のものが全体の９０％以上含有するものが
好ましい。なお、上記のメツシュは日本工業規格（ＪＩ
Ｓ）の規準による。

上記活性炭の具体例としては、たとえばクロマト用特製
白鷺、粒状白鷺ＫＬ、粒状白鷺Ｗ、球状活ｉ炭ｘ−Ｙ＋
ｏｏ、カルボラフイン、精製白鷺、白鷺Ｐ（いずれも武
田薬品工業株式会社）、ＣＡＬ（Ｃａｌｇｏｎ　　Ｃｏ
ｒｐ、　米国）、粒状活性度ダイアホープ００８、ダイ
アホープ５６０（いずれも三菱化成工業株式会社〕等が
挙げられる。

本発明方法は、前記のようなヌクレオチドおよびプリン
系核酸塩基全含有する液（被処理液）に、活性炭を共存
せしめることによって行なわれる。

活性炭全共存せしめる手段は特に限定されないが、通常
、被処理液中に必要量の活性次金添加し、全体を均一化
させればよい。

この活性炭の添加に際し、プリン系核酸塩基の過半量が
既に原液中に析出していたのでは、本発明にかかわる活
性炭添加の効果がない。このような場合には、例えば、
被処理液の液性を酸性または強塩基性たとえばｐＨｉ約
１０以上にするか、もしくは６０°Ｃ以上に加熱するか
によシ溶解度を高めるか、あるいは水で希釈する等によ
シブリン系核酸塩基の大部分を溶解せしめ、しかる後に
活性炭を添加すればよい。

活性炭の使用量は、活性炭の種類や以下に述べる析出条
件等によって異なるが、通常はプリン系核酸塩基の含有
量の約４〜２０倍（重量）で十分である。

プリン系核酸塩基の析出法自体は、特に制限はなく、公
知の方法が採用できる。例えば、ｐＨ調整、冷却、塩析
、濃縮、蒸発等の方法が、それぞれ単独であるいは２種
以上を組合せて適宜に実施できる。とシわけ、活性炭を
添加後に、ｐＨを約７〜１０に調整し、必要に応じてそ
の他の析出方法を併用するのが有利である。

なかでも、プリン系核酸塩基の濃度がほぼ飽和溶解度付
近にある被処理液に活性炭を添加し、しかる後に、ｐＨ
を上記の範囲に調整し冷却するのが、実用的に好ましい
析出方法である。

かくして、プリン系核酸塩基を主として活性炭に結合せ
しめた状態で彼処ｉＭ液から析出せしめることができる
。この析出物の分離は公知の固液分離方法で行うことが
でき、たとえば濾過、沈降分離などが好ましく採用され
る。このように、プリン系核酸塩基を結合した活性炭は
、酸、アルカリ、熱水等で処理することにより、包含す
る核酸塩基等が容易に溶出し再生されるから繰返し便用
が可能である。

本発明方法によると、ヌクレオチドおよびプリン系核酸
塩基を含む液から、プリン系核酸塩基を容易に析出分離
することができ、以後のヌクレオチドの精製を有利に実
施できる。すなわち、従来の方法によると、プリン系核
酸塩基が＠濾過性、難沈降性の性状を呈し、この分離に
は大量の珪藻土、粉末炭等を濾過助剤とする濾過による
か、もしくは、ケーキの繰返し洗滌が必要な遠心沈降（
Ｃよらねばならないため、操作方法は複雑で、かつ付着
母液へのヌクレオチドのロスが多いのに対し、本発明方
法によればこれらの欠点がなく工業的に極めて有利であ
る。

さらに、本発明方法によシ除き得るプリン系核ｅ塩基の
量は、活性炭の種類によって異るが、活性炭本来の吸着
能による吸着量の通常は約１．５〜５倍に及ぶので、活
性炭の使用量はわずかである。

また、本発明方法で必要とされる活性炭の量は、従来の
ように単に水溶液より析出させたプリン系核酸塩基を炉
別する際に濾過助剤として添加する活性炭の必要量と比
奴しても、その数分の一程度であシ、この点でも有利で
ある。

以下に、参考例および実施例をあげて本発明をさらに具
体的に説明する。

参考例１ ５’−イ／シン酸、５′−グアニル酸、ヒポキサンチン
、グアニンの濃度がそれぞれ４．５％、４．９％、０、
２３　％、０．　Ｉ　５　％　テｈルｐＨＩ　２　）ｙ
ｋｍＨ３，１ｅに液温を２５℃に保ちながら攪拌下、３
５％塩酸を６０分間を要して加え、ｐＨを９，０に調整
した。

そのまま６時間攪拌を続はヒポキサンチン寂よびグアニ
ンを析出させた。この懸濁液１ｅを東洋ｐ紙社ｄｌ＆５
ｃｐ紙を敷いた内径３０ηｍのヌツツエで減圧濾過しよ
うとしたが約５分の１量を濾過したところで目詰りのた
め濾過は不能となった。

また同じ懸鉤液１ｅに粒状活性炭白鷺Ｋ］ＬＩＱｙを濾
過助剤として添加し、しばらく撹拌してから、同様に濾
過する場合の濾過所要時間は６９分で、濾過助剤への付
層ロスは５′−イノシン酸２．５％、５′−ダアニル酸
２．６％であった。

実施例１ 市販リボ核１駿を酵素（５′−ホヌホジエヌテラーゼお
よび５′−アデニル酸デアミナーゼ）で処理しテ得うれ
た５′−ヌクレオチド含有液をハイフロス−パーセルの
存在下に濾過し、次に陽イオン交換樹脂アンバーライト
エＲ−１２０で処理し、水酸化ナトリウムでｐＨを９．
５に調整した後、減圧下８０°Ｃで濃縮した。この液に
は５−イノシン酸７、９％、５′−グアニ／し酸８．１
％、５−ウリジ／ｌ／酸７．２％、５′−シチジル酸５
，６％、イノシン０．０９０％、グアノシン０．０９６
％、ヒポキサンチン０、１６５％、グアニン０．１２２
％を含んでいた。

水液３βにクロマト用活性伏特製白鷺１０ｇを添加し、
面押下毎時１０℃の速度で２０℃まで冷却し、そのまま
６時間攪拌を続は念。次いで得られた懸濁液のうち１．
３ｅを東洋沖紙社製１に５ｅ濾紙を敷いた内径４５廖の
ヌツツエで濾過しだ。このときの濾過所要時間は４分１
０秒で、目づ捷りを起こすことなく容易に澄明なろ液を
得ることができた。５′−イノシン酸、５′−グアニル
酸、５′−ウリジ／し酸、５′−シチジＡ／酸の付着ロ
スはそれぞれ０．７％、０．８％、０．８％、０．９％
で、ヒポキサンチン、グアニンの除去率は７５％、８１
％であった。

実施例２ リン酸トリメチルにオキシ塩化リンを溶解し、これに少
量の水を添加してから市販のイノシンおよびグアノシン
を加え、室温で３時間攪拌反応後、氷水中に加えて加水
分解しく特公昭４２−１１０７１参照）、１，２−ジク
ロフレエタンでリン酸トリメチルを抽出分離、抽残液を
活性炭を充填したカラムに通して核酸関連物質を吸着さ
せ、次に水酸化ナトリウム水溶液で溶出した。この溶出
液は≠１２で、５′−イノシン酸４．５％、５′−グア
ニ／し酸４．９％、ヒポキサンチン０．２３％、グアニ
ン０．１５％を含んでいた。この液３，１１に粒状活性
法白鷺ＫＬ　　３１ｇを添加し、液温を２５℃に保ちな
から流拌下３５％塩酸を６０分間を要して加えｐＨを９
．０に調整し、そのまま６時間放置したつ次いで得られ
た懸濁液のうち１１を東洋沖紙社製Ｎｘ５ｃ：Ｐｍを敷
いた内径３０關のヌツツエで濾過したつこのときの濾過
所要時間は４分２０秒で、目づまシを起こすことなく容
易に実施することができた。５′−イノシン酸および５
′−グアニ／し酸の付着ロスはそれぞれ０．８％、０．
９％でグアニンの除去率は８１％であった。

一方、上記で得たｆｉ過前の懸濁液１４を、予めクロマ
ト用活性炭を充填した内径２６ｒｒｔｍ、充填高さ１０
０間のカラムの上部に２，５時間を要して導き、懸濁物
の層を充填活性炭の上に形成しつつ通液した。続いて純
水６０ｙｇｔ通液し、通過液を高速液体クロマトで分析
した。５′−イノシン酸および５′−グアニアし酸の付
着ロスはそれぞれ０．５％、０．６％で、ヒポキサンチ
ンおよびグアニンの除去率はそれぞれ７９％、９６％で
あったわ実施例３ グアノシンをアセトン溶媒中、少量の水の存在下にオキ
シ塩化リンと５℃で６時間反応させた後、反応液を一７
０℃で凍結ｍ縮し過剰のオキシ塩化リンおよびアセトン
を留去した。得られた残渣に氷水を加えて溶解し、水酸
化ナトリウムを加えてｐＨを１．５に調整してから７０
°Ｃ１３０分間加熱、続いて５℃まで急冷した。ここに
得られた水溶液は、５′−グアニル酸５，７５％、グア
ノシン０．４１％、グアニン０．２１％を含んでいた（
特公昭４０＝＋ａａ＋９８照）。

この液３ｅに粒状活性炭ダイアホープ８６０を３Ｏｆ添
加し、液温を２０℃に保ちながら攪拌下、２５％水酸化
すＦリウム水溶液を２時間を要して除々に加えｐＨを８
に調整し、そのｔ−ま６時間攪拌を続けた。ここに得ら
れた液のうち１．３ｅを東洋沖紙社鯛ｆｆ１ＳｃＰ紙を
敷いた内径４５πｍのヌツツエで戸〕面した。このとき
の濾過所要時間は２分５０秒で、目づ１シを起こすこと
なく容易に澄明な：Ｆ５液が得られた。５′−グアニ／
し酸の付層ロヌは０．９％で、グアニンの除去率は８５
％であった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ヌクレオチドおよびプリン系核酸塩基全含有する液から
   プリン系核酸塩基を析出せしめる方法において、活性炭
   全共存せしめることを特徴とするプリン系核酸塩基の析
   出方法。