JPS5889192A - ３α，１２α―ジヒドロキシ―７―ケト―５β―コラン酸及び／又はその塩の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発１１１ｔｊコール駿及び／又はそＯ塩を含む培地か
ら微生物によｐ３ｇ、１２ａ−ジヒドａｄ（シー７−ケ
ドー５β−コラン酸、３ｇ、、１２ｍ−ジヒドロキシ−
７−ケト−５β−ビスノルコラン酸及びこれらの塩から
なる群から選ばれる少なくと４１つのコール１ｌＩｌ導
体を製造する方法に関し、評しくはコール酸及び／又は
その塩を基質として３ｇ、１２ｇ−ジヒドロキシ−７−
ケト−５β−コラン酸、３α、１２ａ−ジヒドロキシ−
７−ケト−５β−ビスノルコラン酸及びこれらの塩から
なる評から遇はれる少なくとも１つのコール酸誘導体を
生産するコリネバクテリウム属に属する細菌を１コール
酸及び／又はその塩を含む培地に培養して上記の少なく
とも１つのコール酸誘導体を生成せしめ、これを採取す
ることを特徴とするコール酸誘導体の製造方法に関する
。

従来、コール酸を基質として３α、１２α−ジヒドロキ
シ−７−ケト−５β−コラン酸及び／又は、３ｇ、１２
ｇ−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−ビスノルコラン酸
を微生物の代謝産物として得る方法としては、へ−ンら
によるアルカリゲネス・フェカリスを用いて３α、１２
α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸を得る方
法〔ジャーナル・オプ・バイオロジカルケミストリー、
第１５２％、第５９頁（１９４４年）〕が知られている
にすぎない。

本発明者らは微生物を用いて３α、１２α−ジヒドロキ
シ−７−ケト−５β−：Ｉ２ン酸及び／又は３α、１２
α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−ビスノルコ２ン酸
を工業的に有利に得るためその基質としてコール酸及び
／又はその塩を要求する微生物のスクリーニングを長期
間行なってきた結果、コリネバクテリウム属に属する特
定の細菌がコール酸及び／又はその塩を基質として３α
。

１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸、３
α、１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−ビスノル
コラン酸及びこれらの塩からなる群から選ばれる少なく
とも１つのコール酸誘導体を高収率でしかも短期間の培
養で生産することを見出し、本発明を完成するに至った
。

本発明者らが得たコール酸及び／又はその塩を基質とし
て３α、１２ａ−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラ
ン酸、３α、１２α−ジヒドロ今シー７−ケドー５β−
ビスノルコラン酸及ヒこれらの塩からなる群から選ｄれ
る少なくとも１つのコール酸誘導体を生産する能力を有
するコリネバクテリウム属に属する細菌としては、コリ
ネバクテリウｈ　ＣＡ　−２ｇ　１　（Ｃｏｒｙｎ＠ｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ＣＡ−２８１）−株（黴工研曹寄第
５５３６号）があシ、その菌学的性質を列挙すると次表
のとおりでおる。

値学的性質 顕微鏡的所見 培地における培養所見 生理学的性質（注１） （注１）：生理学的性質において、＋および−はそれぞ
れ次のことを意味する。

＋・・・・・・・・・その性質又はその生成あり−・・
・・・・・・・その性質又はその生成なし（注２）：ヒ
ュー・アンド・ライフノン培地の炭素源をそれぞれ糖類
１〜１ｓと代えた培地での曹による糖類からの酸の生成
及びガスの発生を観察したものである。

＋・・・・・・・・・酸の生成又はガスの発生あり−・
・・・・・・・・酸の生成又はガスの発生なし上記の表
に示した菌学的性質に基づき、コリネバクテリウムＣＡ
−２８１菌株の同定を行なった。

コリネバクテリウムＣＡ−２８１菌株はその形態、グラ
ム染色などの顕微鏡的所見及び生理学的性質などからパ
ージエイズ・マニュアル・オツ・ｆｆ１−ミネイテイプ
・バクテリオロジ−ｊｌ［７１［及び第８版に基づきコ
リネバクテリウム属に属する細菌であると同定された。

本発明の方法によるコール酸誘導体の生産は、前記の本
発明に係るコリネバクテリウム属に属する細菌をコール
酸及び／又はその塩を含む培地に培養することによシー
行なわれる。コール酸の環上しては異体的にはコール酸
のナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属の塩及びカ
ルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属の塩が
挙げられる。コール酸及び／又はその塩の濃度は通常的
１〜５００　ｆ／ｌの範囲でよいが、生産される目的と
するコール酸誘導体の収量、培養条件及び操作性などの
経済的一点から約５〜２００　ｆ／Ｉの範囲が好ましい
。本発明に用いる培養方法は原則的には微生物の培養で
一般に採用される方法と同じであり、通常は液体培地に
よる振盪培養法又は通気攪拌培養法が用いられる。培地
としては上記の本発明に係るコリネバクテリウム属に属
する細菌が資化利用できる栄養源を含有するものであれ
ばよい。

炭素源としてはコール酸及び／又はその塩を単一炭素源
として４よく、或いはコール酸及び／又はその塩にアラ
ビノースなどのペントース類；グルコース、マンノース
、）９り）−ス、カラクトースなどのヘキソース類；マ
ルトースなどの二糖類；デンプン分解物、糖アルコール
類、グリセリンなどの多価アルコール類；又はポリペプ
トン、ペプトン、肉エキス、麦芽エキス、コーンステイ
ープリカー、酵母エキス、各種ア建ノ酸などを併用して
もよい。また窒素源としては例えば硫酸アン啼ニクム、
塩化アンモニウム、燐酸アンモニウム。

硝酸アンモニウム・・・・・・・・・・・・・・・など
が用いられる。また、この他に燐酸水素２カリウム、燐
酸２水素カリウム、硫酸マグネシウムなどの無機塩が添
加される。培養条件に特徴はないが、通常２５〜３５℃
で６時間〜５日間振盪培養又は通気攪拌培養を行なう。

このようにして培養液中に蓄積された３ａ、１２α−ジ
ヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸、３α、１２α
−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−ビスノルコラン酸及
び／又はその塩は、例えば、培養液中の菌体その他の不
溶成分を濾過又は遠心分離などによシ分離除去して得ら
れた培養濾液又は上清に、塩酸、硫酸な−どの酸を加え
て酸性としたのち、上記カルボン酸類を溶解しかつ水と
相分離する有機溶媒、例えば酢酸エチル、クロロホルム
、りｏａホルムとメタノールの混合液などを用いて抽出
する。得られた抽出液を集め、これよプ溶媒を溜去する
ことによって目的とする３α、１２ａ−ジヒドｃＩ＋？
シー７−ケドー５β−プラン酸及び／又は３α、１２α
−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−ビスノルコラン酸を
回収することができる。この有機溶媒による抽出操作は
培養濾液又祉上清についてのみでなく、培養液そのもの
について行なうことができ、またこれらの培養液、培養
濾液又は上清に予め酸を加えることなしに行なう仁とも
できる。上記において培養濾液又は上清を酸性とじ九場
合Ｋｔｉ３ｇ、１２ｇ−ジヒドロキシ−７−ケト−５β
−コラン駿及び／又は３ａ、１２ａ−ジヒドロ中シー７
−クトー５β−ビスノルコラン酸か沈澱物として得られ
るため、これをその１１濾過又は遠心分離などにより回
収することもできるが、これに続く精製勢の魁理の操作
性を考慮すれば上記の抽出操作を行なうことが好ましい
。

上記の方法で得られ九抽出物又は沈澱物中には３α、１
２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラ／酸及び／
又は３α、１２α−ジζドａキシー７−ケドー５β−ビ
スノルコラン酸の他に残存基質のコール酸及び／又はそ
の塩並びに副生物が含すれてお勤、その抽出物又は沈澱
物を例えばシリカゲルカラムに吸着させ、りｇロホルム
とエタノールの混合液で溶出させることによｊ）３ｇ、
１！α−ジヒドロ中シー７−ケドー５β−コラｙ酸及び
／又は３α、１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−
ビスノルブーラン酸を取得することがで自る０ 本発明の方法により得られる３ｇ、１２α−ジヒドロキ
シ−７−ケト−５β−コランｌｌ及ヒ３ｇ。

１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−ビスノルコラ
ン酸はこれらをファン・叱ンロン還元反応に供すること
によシそれぞれデオキシコール鐵及び３α、１２α−ジ
ヒドロキシ−５β−ビスノルコラ、ン酸に容易に変換さ
れる。デオキシコール酸及び３α、１２α−ジヒドロキ
シ−５β−ビスノルコラン酸は履々のステロイドホルモ
ンの合成原料として有用である。

以下実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ コリネパクテリクムＣＡ−２８１菌株（黴工研曹寄第５
５３６号）を次に示す方法で培養した。コール酸１００
　ｆ、硝酸アンモニウム２．０Ｆ％燐［１２水素カリウ
ム２．Ｏｆ、燐酸水素２カリウム＆Ｏｆ１硫酸マグネシ
ウム・７水和物０．２Ｆ、酵母エキス１、Ｏｆ及び水酸
化ナトリウム１０Ｆに蒸留水を加えて容量をＩＪに調整
した培地を５００ｇＪＩＦ坂ロフラスコに１００ｔＩＩ
Ｉ宛１０本に分注し、１２０℃で１５分間、蒸気殺菌を
行なった。予め上記の培地と同じ培地で試験管振盪機に
て２日間増殖させた種菌を上記の５００ｍ容坂ロフラス
コあたり１０ｄ宛添加し、２日間振盪培養した。培養Ｉ
ｌ、これらの培養液を集め、達心分離機で１体を除去後
、得られた培養上清に塩酸を添加して腋上清を塩酸酸性
にするとコール酸の酸化生成物及び未変換コール酸が沈
澱した。この沈澱物を採取し、残りの溶液を酢酸エチル
ＩＪで抽出し、ロータリー・エバポレーターで酢酸エチ
ルを置去後、得られた残存物を先の沈澱物と合わせるこ
とにより、ｓｓｔのコール酸の酸化生成物及び未変換コ
ール酸の混合物を得た。この混合物の極く一部を＊Ｃ％
これにメタノールを加えて１−溶液とし、この溶液１０
μｍを建クロポンダパックＣ−１８力２ムを備え九高速
液体クロマトグラフィー（米国クオーターズ社製、ＨＬ
Ｃ−ＧＰＣ−２４４１１）に注入した。移動相としてｌ
’８２．５に調整し走水／メタノールの３０／７０容量
比の混合液を流速ＩＷＬｌ／分で流し、検出を屈折率方
式で行なったところ第１図のクーマトダラムが得られた
。このクロマドグ２ムにおけゐピークム及びビークＢは
標準品のピークと照合することによシ各々３α、１２ａ
−ジヒドＣ！中シー７−ケドー５β−コラン酸及び３ｍ
、１２ａ−ジ＊　ドａキシ−７−ケドー５β−ビスノル
コラン酸のものと一致した。

上記の混合物３ｔを少量のりｃ１０ホルム／エタノール
の９８７２容量比の混合液に溶解させ、５０Ｖのシリカ
ゲルカラムに吸着させた。このカラムをクロロホルム／
エタノールの９８／２容量比の混合液４００ｄで洗滌後
、カラムにりａロホルム／エタノールの９５１５容量比
の混合液８００１１１を流した。その溶出液を２０ｄ宛
フ２クシヨンチユーブに分取し、薄層クロマトグラフィ
ーで調べたところ、溶出液の前半の約２００ｄ分は単一
スポットを与える両分として得られた。これらを合わせ
、ロータリー・エバポレーターで溶媒を溜去することに
よシ、３α、１２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−
コラン酸を１．６ｆ得た。また溶出液の後半の約６００
ｄ分は薄層上で２つのスポットを与える画分として得ら
れた。これらを合わせ、ロータリー・エバポレーターで
溶媒を溜去することにより、その残漬１．１Ｆを得た。

これをア七トンで晶出することにより３α、１２α−ジ
ヒドロキシ−７−ケト−５β−ビスノルコラン酸を０．
４２ｆ得た。得られた各々の化合物を下記の方法で同定
した。

３α、１２ｍ−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン
酸 マススペクトルｍ　／　ｓ　：　４０６　（Ｍ）”３８
８（Ｍ−Ｈ＊Ｏ）” ３７０（Ｍ−ＩＨｓｏ）”。

３５２（Ｍ−３シ０〕１゜ ’Ｊ　タｍ／　ｌ　＝　６０　ヨｂ　−ＣＭ５−Ｃｏｏ
ｌ　Ｏ存在が確認された。

ＮＭＲｘべ／）＃（９０ＭＨｚ）ｌ　ＤＭ”−”１Ｍ８
　　　’ ０．５Ｊｌ（３Ｈ，ｓ）　１８−ＣＨｓｏ、８４（３Ｈ
，ｄ）２１−ＣＭ５ １．０５（３Ｈ，１１）　１９−ＣＨｓ２．８０（ＩＨ
，ｄｄ、Ｊ＝１２Ｈｚ）８β−Ｈ３，３５（ＩＨ、ｂｒ
ｏａｄ　）　３β−Ｈ３，７３（ＩＨ，ｔ、Ｊ＝３Ｈｓ
）１！β−Ｈ４，２３（ＩＨ，ｂｒｏａｄ）１２α−０
Ｈ４，４１（Ｉ　Ｈ、ｂｒｏａｄ　）　３　ａ−ＯＲマ
ススペクトルｍ／　ｚ　：　３７８　ＣＭ）”、’　　
　　　３６０　（Ｍ−Ｈ禦０〕“。

３４２（Ｍ−２出０〕十〇 ３２７（Ｍ−３Ｈ雪０−ＣＨｊ）” ３０９（Ｍ−３Ｈ！Ｏ−Ｃ出〕“。

またｎａ／　ｚ　＝　７４より一〇Ｈ−ＣＯＯＨの存在
が確認Ｈａ された。

ＮＭＲｘ　ベク）ｙ（９０ｋ１ｍｓ）Ｊ　ＤＭ８０　”
ＨＭＳ　　　’ ０Ｊ４（３Ｈ，ａ）１８−ＣＭ５ １．０７（６Ｈ，ｍ）　１９−ＣＨｓ及び２１−ＣＨｊ
２．８０（１１１，ｄｄ　、Ｊ−Ｊ２Ｈ篤）８β−Ｈ３
，３３（ＩＨ、ｂｒｏａｄ　）　３β−Ｈ３，６９（Ｉ
Ｈ，ｔ、Ｊ：＝８Ｈｉ）１２β−Ｈ４，４０（２Ｈ、ｍ
　）　３　ａ−ＯＨ及び１２ａ−ＯＨ＃１１図のりｃ２
マドグラムにおける各ピークの面積比を積分針（高滓製
作所製、高滓りロマトパックＣ−ＲＩム）で求め、この
面積比から得られたコール酸の酸化生成物の収量及び未
変換のコール酸の残存量を算出すると次表のとおりであ
る。

【図面の簡単な説明】

１１１１図は実施例１で得られたコール酸の酸化生成物
及び未変換のコール酸の液体りａｇ）ダラムを表わす◇ 特許出願人　株式金社　り　ラ　し 代理人弁履士本多　塵 −Ｆｌ（１７− 第１図 ０２４６　ｇｌｏｊ２１４１ｆｓ 孫＃鉾１ｖＩ紛）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 コール酸及び／又はその塩を基質として３ａ。 １２ｍ−ジヒドロ中シー７−ケドー５β−コラン酸、３
   α、１２ａ−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−ビスノル
   コラン酸及びこれらＯ塩からなる群から選ばれる少なく
   とも１つのコール酸誘導体を生産するコリネバクテリウ
   ム属に属する細菌を、コール酸及び／又はその塩を含む
   培地に培養して上記の少なくとも１つのコール酸誘導体
   を生成せしめ、これを採取することを特徴とするコール
   酸誘導体の製造方法。