JPS58759A - 非煮沸変性によるアツセイ方法 - Google Patents
非煮沸変性によるアツセイ方法Info
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- JPS58759A JPS58759A JP57050242A JP5024282A JPS58759A JP S58759 A JPS58759 A JP S58759A JP 57050242 A JP57050242 A JP 57050242A JP 5024282 A JP5024282 A JP 5024282A JP S58759 A JPS58759 A JP S58759A
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- Japan
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- protein
- labeled
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/82—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/804—Radioisotope, e.g. radioimmunoassay
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は変性(内因性物質の検定可能な形態への転化)
を用いる臨床用アッセイ方法、更に具体的には、変性の
ための煮沸を要しない放射アッセイによる、ひと血清及
び細胞中のビタミンB1□及び/又は葉酸の含有量レベ
ルを決定するための方法に関する。血清又は細胞中の他
の目的成分(即ち、被分析物)−換言すれば、(他の内
因性成分)−や他の方式によるアッセイ方法にも本発明
は応用可能である。
を用いる臨床用アッセイ方法、更に具体的には、変性の
ための煮沸を要しない放射アッセイによる、ひと血清及
び細胞中のビタミンB1□及び/又は葉酸の含有量レベ
ルを決定するための方法に関する。血清又は細胞中の他
の目的成分(即ち、被分析物)−換言すれば、(他の内
因性成分)−や他の方式によるアッセイ方法にも本発明
は応用可能である。
血清中の葉酸及びビタミンB1□濃度並びに赤血球中の
葉酸濃度を測定することは臨床診断法の補助的手段とか
さまざまな種類の栄養複貧血の原因究明のための手段と
して有用である。これらのビタミン欠乏は主として不適
当な食事、吸収不良及びアルコール中毒のいずれかによ
り起る。
葉酸濃度を測定することは臨床診断法の補助的手段とか
さまざまな種類の栄養複貧血の原因究明のための手段と
して有用である。これらのビタミン欠乏は主として不適
当な食事、吸収不良及びアルコール中毒のいずれかによ
り起る。
ビタミンB1□が欠乏した場合、神経障害につながるこ
とがある。さらに、ビタミンB1□はN−メチルテトラ
ヒドロフオレートをひとの細胞壁を通して運ぶのに必要
とされるので、ビタミンB1□が欠乏すると、葉酸エス
テルの代謝を乱して巨赤芽球性貧血をひき起すおそれが
ある。
とがある。さらに、ビタミンB1□はN−メチルテトラ
ヒドロフオレートをひとの細胞壁を通して運ぶのに必要
とされるので、ビタミンB1□が欠乏すると、葉酸エス
テルの代謝を乱して巨赤芽球性貧血をひき起すおそれが
ある。
巨赤芽球異常は他の原因による葉酸エステルの欠乏によ
っても起り得るので、それが両ビタミンのうちどちらの
ビタミンが欠乏して起きたのか、それとも両方のビタミ
ンとも欠乏して起きたのか、あるいは全く別の原因によ
り発生したのかを調べる必要がある。
っても起り得るので、それが両ビタミンのうちどちらの
ビタミンが欠乏して起きたのか、それとも両方のビタミ
ンとも欠乏して起きたのか、あるいは全く別の原因によ
り発生したのかを調べる必要がある。
放射アッセイ手法で出現するまでは、微生物学的アッセ
イ方法が血清中の葉酸エステル及びビタミンB1□の濃
度レベルを調べる主たる手段であった。かかる微生物学
的アッセイ方法は時間がかかり、しかも試料中にa様物
質や代謝拮抗物質が存在している場合のように、成長度
に影響を及ぼす可能性のある他の因子に基因する測定誤
差を伴うものである。
イ方法が血清中の葉酸エステル及びビタミンB1□の濃
度レベルを調べる主たる手段であった。かかる微生物学
的アッセイ方法は時間がかかり、しかも試料中にa様物
質や代謝拮抗物質が存在している場合のように、成長度
に影響を及ぼす可能性のある他の因子に基因する測定誤
差を伴うものである。
飽和分析法即ち拮抗的蛋白質結合法(CPB)による放
射アッセイ方法、特に葉酸エステル及びビタミンB1□
に対する放射アッセイ方法の概要が確立してから、従来
の微生物学的アッセイ方法はあらましそれによって置き
換えられてしまっている。放射アッセイ技術は微生物学
的手法によって得られた数値と良く相関した数値をもた
らしただけでなく、測定に対して妨害となる種々の原因
から影響の少い、より正確な結果をより少ない時間と経
費で提供した。これらの放射アッセイ方法に於いて用い
られる拮抗的結合法の原理は被分析物質及びその放射標
識物質をそれらに特有の結合位置を有する一定量の物質
(通常は蛋白質)に結合させることにある。ビタミンB
I2に対しては、精製内因子〔例えば、ぶたの内因子(
IF)、ひとの内因子(IF)、又はにわとりの若しく
はふぐの薄情〕が結合蛋白質として用いられ、葉酸エス
テルをアッセイする場合は、β−ラクトグロブリン中の
葉酸エステル結合能を有する蛋白質が用いられる。個々
の蛋白質の有する限られた数の結合位置に対する拮抗が
試料又は標準液中に存在する被分析物質と一定少量のト
レーサー(放射性同位元素により標識された、前記被分
析物質の対応物質)との間に起る。内因性の被分析物質
が存在しな(・場合、トレーサーは無競争で結合蛋白質
のありとあらゆる結合可能位置に結合する。結合したト
レーサーと結合しない(遊離状態)のトレーサーとを夫
々分離してそれらの量を測定することによって、放射能
の量を被分析物質の濃度の函数として標準線を引くこと
が出来る。任意の試料中に含まれる被分析物質の量は、
この試料の放射線強度の読み値を用いて、その標準線か
ら読み取ることが出来る。
射アッセイ方法、特に葉酸エステル及びビタミンB1□
に対する放射アッセイ方法の概要が確立してから、従来
の微生物学的アッセイ方法はあらましそれによって置き
換えられてしまっている。放射アッセイ技術は微生物学
的手法によって得られた数値と良く相関した数値をもた
らしただけでなく、測定に対して妨害となる種々の原因
から影響の少い、より正確な結果をより少ない時間と経
費で提供した。これらの放射アッセイ方法に於いて用い
られる拮抗的結合法の原理は被分析物質及びその放射標
識物質をそれらに特有の結合位置を有する一定量の物質
(通常は蛋白質)に結合させることにある。ビタミンB
I2に対しては、精製内因子〔例えば、ぶたの内因子(
IF)、ひとの内因子(IF)、又はにわとりの若しく
はふぐの薄情〕が結合蛋白質として用いられ、葉酸エス
テルをアッセイする場合は、β−ラクトグロブリン中の
葉酸エステル結合能を有する蛋白質が用いられる。個々
の蛋白質の有する限られた数の結合位置に対する拮抗が
試料又は標準液中に存在する被分析物質と一定少量のト
レーサー(放射性同位元素により標識された、前記被分
析物質の対応物質)との間に起る。内因性の被分析物質
が存在しな(・場合、トレーサーは無競争で結合蛋白質
のありとあらゆる結合可能位置に結合する。結合したト
レーサーと結合しない(遊離状態)のトレーサーとを夫
々分離してそれらの量を測定することによって、放射能
の量を被分析物質の濃度の函数として標準線を引くこと
が出来る。任意の試料中に含まれる被分析物質の量は、
この試料の放射線強度の読み値を用いて、その標準線か
ら読み取ることが出来る。
前述のような種類の改良されたアッセイ方法を提供する
のが本発明の最も重要な目的である。
のが本発明の最も重要な目的である。
本発明はさまざまな被分析物質に対ずろいろいろな種類
のアッセイ方法に遍く適用可能であるが、説明のために
、まずビタミンB1□及び/又は葉酸エステルの放射ア
ッセイ方法に関してその要旨を説明する。
のアッセイ方法に遍く適用可能であるが、説明のために
、まずビタミンB1□及び/又は葉酸エステルの放射ア
ッセイ方法に関してその要旨を説明する。
水溶液と混合する。ビタミンB1□及びその複製に対し
て有用なシアン基結合を与える、例えば青酸カリのよう
な転化剤の存在下、得られた溶液をメルカプタン系−変
性剤に接触する。この過程に於いて、面清中の結合蛋白
質は不可逆的に変性処理されて、ビタミンB12と葉酸
エステルの両方が遊離される。この変性及び遊離手順は
pH12−14、好ましくは12−13 で行なわれる
。好適かつきわだって有益なメルカプタン系変性剤とし
てジチオチドリトールが挙げられる。
て有用なシアン基結合を与える、例えば青酸カリのよう
な転化剤の存在下、得られた溶液をメルカプタン系−変
性剤に接触する。この過程に於いて、面清中の結合蛋白
質は不可逆的に変性処理されて、ビタミンB12と葉酸
エステルの両方が遊離される。この変性及び遊離手順は
pH12−14、好ましくは12−13 で行なわれる
。好適かつきわだって有益なメルカプタン系変性剤とし
てジチオチドリトールが挙げられる。
このような試薬をかかるpHレベルで用いると、煮沸し
なくとも変性を起して、これらの(及び他のものを含め
て)被分析物質を内因性結合体から解離することが可能
で、被分析物質の放射標識対応物即ち複製をアッセイ作
業に有用な形に転化できるという実用的な利点があたら
される。
なくとも変性を起して、これらの(及び他のものを含め
て)被分析物質を内因性結合体から解離することが可能
で、被分析物質の放射標識対応物即ち複製をアッセイ作
業に有用な形に転化できるという実用的な利点があたら
される。
ビタミンB1□及び/又は葉酸エステルの他に、本発明
は例えば他の安定なビタミン類や変性の際に用いられる
高アルカリ条件に耐えることの出来る他の被分析物質の
放射アッセイ方法においても利用可能である。CPB以
外に、本発明は抗体分化アッセイにも有用である。その
場合、トレーサー法は放射能よりもむしろ、例えば、螢
光に依存することが出来る。さらに別の応用や変型は当
業者にとって当然思考しうるところである。
は例えば他の安定なビタミン類や変性の際に用いられる
高アルカリ条件に耐えることの出来る他の被分析物質の
放射アッセイ方法においても利用可能である。CPB以
外に、本発明は抗体分化アッセイにも有用である。その
場合、トレーサー法は放射能よりもむしろ、例えば、螢
光に依存することが出来る。さらに別の応用や変型は当
業者にとって当然思考しうるところである。
本発明の非煮沸法の利点を最も有効的に利用しうるよう
に、試薬、患者からの試料、標準液及び変性剤の量を適
宜法めなければならなし・。
に、試薬、患者からの試料、標準液及び変性剤の量を適
宜法めなければならなし・。
メルカプタン系変性(還元)剤としては、ジチオチドリ
オール型のものが好ましく、特にジチオトレイトール(
トリオ−1,4−ジメルカプト−2、3−ブタンジオー
ル)を用いると顕著な効果が得られる。
オール型のものが好ましく、特にジチオトレイトール(
トリオ−1,4−ジメルカプト−2、3−ブタンジオー
ル)を用いると顕著な効果が得られる。
結合蛋白質を添加すると、被分析物質とその対応する結
合蛋白質とから錯化合物が形成される。この結合手順は
pH8−10,好ましくはpH9,3にて実施される。
合蛋白質とから錯化合物が形成される。この結合手順は
pH8−10,好ましくはpH9,3にて実施される。
それ以降の手順は通常のCPB放射アッセイと同じ条件
により実施される。
により実施される。
低温放置したのち、前記蛋白質と結合した被分析物及び
トレーサーを結合しないものから吸収により分離し、標
準線が引ける。結合したビタミンB1゜及び/又は葉酸
エステル及び/又は結合していないビタミンB1□及び
/又は葉酸エステルの放射線強度を計数し、標準線上に
プロットする。
トレーサーを結合しないものから吸収により分離し、標
準線が引ける。結合したビタミンB1゜及び/又は葉酸
エステル及び/又は結合していないビタミンB1□及び
/又は葉酸エステルの放射線強度を計数し、標準線上に
プロットする。
本発明の他の目的、特徴及び利点は添付の図面を参照し
、次の好ましい実施の態様に関する記載から明らかにな
る。
、次の好ましい実施の態様に関する記載から明らかにな
る。
本発明の放射アッセイ方法の実施に際して用いられる代
表的試薬は次の通りである。
表的試薬は次の通りである。
ゼロ標準液:緩衝液及びす) IJウムアジドを含有す
るポリマーペース。
るポリマーペース。
標準ビタミン液:緩衝液及びナトリウムアジドを含有す
るポリマーベース中 にビタミンBI2 (シアノコバラ ミ/)及び葉酸エステル(N− メチルテトラヒドロフオレート) を下記濃度で含有する再調製用 標準液。
るポリマーベース中 にビタミンBI2 (シアノコバラ ミ/)及び葉酸エステル(N− メチルテトラヒドロフオレート) を下記濃度で含有する再調製用 標準液。
50 1.5
150 3.0
400 6.01000
10.02000
20.0還元剤ニジチオトレイトール水溶液(0,2
6ウム水溶液。
10.02000
20.0還元剤ニジチオトレイトール水溶液(0,2
6ウム水溶液。
トレーサー:塩化ナトリウム、指示染料及びナトリウム
アジドを含むホウ酸塩 緩衝液中に1.5μCi未満のCO57標識ジアノコバ
ラミン及び30μCi 未満の■125標識葉酸エステルを含 ムモの。コバラミンの比放射能は 2 Ci / μmole である。
アジドを含むホウ酸塩 緩衝液中に1.5μCi未満のCO57標識ジアノコバ
ラミン及び30μCi 未満の■125標識葉酸エステルを含 ムモの。コバラミンの比放射能は 2 Ci / μmole である。
〔各アッセイ毎に、アッセイ開始
直前に前記抽出剤及びトレーサー
を少量ずつ、具体的には例えば
100μl ずつ混合して、トレーサ
ーのマスター試薬をつくる。」
無添加試薬:蛋白質及びナトリウムアジドを含有するホ
ウ酸塩及びリン酸塩の 緩衝液。
ウ酸塩及びリン酸塩の 緩衝液。
結合剤:蛋白質及びす) IJウムアジドを含有するホ
ウ酸塩及びリン酸塩緩衝液の 精製内因子及びβ−ラクトグロブリ ン液。
ウ酸塩及びリン酸塩緩衝液の 精製内因子及びβ−ラクトグロブリ ン液。
吸着剤:カーボン、ポリマー、結合剤及び崩壊剤との錠
剤、又はポリマー被覆カ ーボン及びナトリウムアジドとの水 性スラリー。
剤、又はポリマー被覆カ ーボン及びナトリウムアジドとの水 性スラリー。
試料の作成は移動及び保存(凍結状態で)可能なモノグ
ルタミン酸塩(維持 必須栄養素)類を単離するために
従来から用いられている放射アッセイ法に従って行う。
ルタミン酸塩(維持 必須栄養素)類を単離するために
従来から用いられている放射アッセイ法に従って行う。
保存状態から使用状態に試薬を調整するには、蒸留水を
添加することを要する(試薬自体が10〜100 tn
l容量の試薬ピンに入っている場合、各試薬毎に蒸留水
2 mlを加える)。血清、トレーサー及び抽出剤の最
適容量比率は次の通りである。
添加することを要する(試薬自体が10〜100 tn
l容量の試薬ピンに入っている場合、各試薬毎に蒸留水
2 mlを加える)。血清、トレーサー及び抽出剤の最
適容量比率は次の通りである。
s:t:e=2:2:1
但し、S:血清の容積
tニドレーサーの容積
e:抽出剤の容積
アッセイを実施するに際し、表−■に示す通り、まず試
、I管を18本(2本ずつ1組で合計9組)1人目の患
者に用意し、さらに2人目の患者に2本(試験管419
及び扁20)、3人目の患者に2本(試験管/%2]及
び腐22、・・・と云った具合に用意し、試験管扁3及
び應4を特に結合剤を用いない対照として用いる。
、I管を18本(2本ずつ1組で合計9組)1人目の患
者に用意し、さらに2人目の患者に2本(試験管419
及び扁20)、3人目の患者に2本(試験管/%2]及
び腐22、・・・と云った具合に用意し、試験管扁3及
び應4を特に結合剤を用いない対照として用いる。
表−■は試験管の各組に対して行なわれる試験手順をも
示す。即ち、試験管/I63〜/1618・・・に標準
液200μlをピペットで取り、試験管扁1〜A]8・
・・にトレーサーマスター試薬を200μlピペツトで
加え、(1〜2秒間)攪拌混合したのち低温放置する。
示す。即ち、試験管/I63〜/1618・・・に標準
液200μlをピペットで取り、試験管扁1〜A]8・
・・にトレーサーマスター試薬を200μlピペツトで
加え、(1〜2秒間)攪拌混合したのち低温放置する。
次いで全部の詳験管に抽出剤を100μlずつピペット
で加え、同様に攪拌混合及び低温放置を行い、試験管扁
1〜屑4にのみ無添加試薬1 mlを加え、また試験管
/163〜/16.I 8−に結合剤1 mlを添加し
たのち、やはり攪拌混合及び低温放置し、次いで、試験
管層3〜AI8・・−・に錠剤又はスラリーを加え、攪
拌混合及び低温放置を繰り返し、全部の試験管を遠心分
離に付したのち上澄(即ち、液体)のみ試験管A3〜A
]8・・・から傾斜法により分離し、試験管中に固形物
(錠剤又は粉末)が残る。得られた上澄液を新しい試験
管、即ち、試験管屑3A、4A、5A、6A、・・・・
・・に移す。これらの上澄液はガンマ−線計数試験に用
いることが出来る。CO57及び1125の読値の間の
クロスオーバーが必ず3%未満であるようにガンマ計数
器を調節する。
で加え、同様に攪拌混合及び低温放置を行い、試験管扁
1〜屑4にのみ無添加試薬1 mlを加え、また試験管
/163〜/16.I 8−に結合剤1 mlを添加し
たのち、やはり攪拌混合及び低温放置し、次いで、試験
管層3〜AI8・・−・に錠剤又はスラリーを加え、攪
拌混合及び低温放置を繰り返し、全部の試験管を遠心分
離に付したのち上澄(即ち、液体)のみ試験管A3〜A
]8・・・から傾斜法により分離し、試験管中に固形物
(錠剤又は粉末)が残る。得られた上澄液を新しい試験
管、即ち、試験管屑3A、4A、5A、6A、・・・・
・・に移す。これらの上澄液はガンマ−線計数試験に用
いることが出来る。CO57及び1125の読値の間の
クロスオーバーが必ず3%未満であるようにガンマ計数
器を調節する。
第1図は上記方法を用いて得られた代表的結果を示し、
下側の標準線は葉酸エステルに対するもの(左側の縦座
標及び下側の横座標に対応スル)で、上側の標準線はビ
タミン81□K 対するもの(右側の縦座標及び上側の
横座標に対応する)である。標準液の横座標値とそれに
対応する葉酸エステル及びビタミンB2のCPM (1
分間当りの計数)読み値の縦座標変化を用(・て点をプ
ロットする。これらの点から標準線を得る。しかる後、
患者のCPM値に対応する縦座標値から線をのばし、対
応する横座標」二の単位容積当りの重量(ml当りのr
J又はp! )として読み取ることが出来る。以上の例
は血清に適用できる。第2図は上記と同様の葉酸エステ
ル濃度測定試験用標準線を示すが、トレーサー及びマス
ター試薬は第1図の条件と違っている。
下側の標準線は葉酸エステルに対するもの(左側の縦座
標及び下側の横座標に対応スル)で、上側の標準線はビ
タミン81□K 対するもの(右側の縦座標及び上側の
横座標に対応する)である。標準液の横座標値とそれに
対応する葉酸エステル及びビタミンB2のCPM (1
分間当りの計数)読み値の縦座標変化を用(・て点をプ
ロットする。これらの点から標準線を得る。しかる後、
患者のCPM値に対応する縦座標値から線をのばし、対
応する横座標」二の単位容積当りの重量(ml当りのr
J又はp! )として読み取ることが出来る。以上の例
は血清に適用できる。第2図は上記と同様の葉酸エステ
ル濃度測定試験用標準線を示すが、トレーサー及びマス
ター試薬は第1図の条件と違っている。
赤血球読み値を次の葉酸エステル補正式により補正する
。
。
100% XDXC
H
〔但し、RCFは赤血球中の葉酸エステル濃度(ng/
rnl)、Cは分析したhomolgsate ali
quot (溶血反応生成物数) (ng/mt )、
Hはへマドクリット率(4)、及びDは適用可能な希釈
係数(通常の実施において41)を示す。〕 第3図及び第4図は本発明に係る上記方法(非煮沸変性
)を用いて得たビタミンB12及び葉酸エステルの濃度
を従来技術による煮沸変性法により求めた結果に相関づ
けて示すものである。
rnl)、Cは分析したhomolgsate ali
quot (溶血反応生成物数) (ng/mt )、
Hはへマドクリット率(4)、及びDは適用可能な希釈
係数(通常の実施において41)を示す。〕 第3図及び第4図は本発明に係る上記方法(非煮沸変性
)を用いて得たビタミンB12及び葉酸エステルの濃度
を従来技術による煮沸変性法により求めた結果に相関づ
けて示すものである。
プロットした点の間に中心線を引くと、両者間に本発明
の方法の信頼性−を十分に示す相関性があるのがよくわ
かる。
の方法の信頼性−を十分に示す相関性があるのがよくわ
かる。
ひとたび上記の開示内容を知れば、当業者にとって、本
発明の概念から離間することなく本明細書中に記載した
特定の実施態様から無数の他の応用、変更及び改良が可
能なこ°とは明らかである。従って、本発明は本明細書
に記載した技術のあらゆる新規な特徴および特徴の組み
合わせのすべてを包括するものとして解釈され、前記特
許請求の範囲及びその精神によってのツメ限定されると
理解されるべきである。
発明の概念から離間することなく本明細書中に記載した
特定の実施態様から無数の他の応用、変更及び改良が可
能なこ°とは明らかである。従って、本発明は本明細書
に記載した技術のあらゆる新規な特徴および特徴の組み
合わせのすべてを包括するものとして解釈され、前記特
許請求の範囲及びその精神によってのツメ限定されると
理解されるべきである。
第1図及び第2図は本発明の方法を実施して得られた「
標準」線の例を示すグラフ、第3図及び第4図は本発明
により求めたビタミンB1゜及び葉酸エステル濃度と従
来の放射アッセイ法により得た結果とのそれぞれの相関
性を示すグラフである。 特許出願人 アールアイエイ プロダクン インコーポレイテソト代
理人 煮ノ;へ°°“FIo、 4 手 続 補 正 書 (自発) 昭和57年5 月26日 特許庁長官 殿 1、事件の表示 昭和57年 特許願 第50242
号2、発明の名称 非煮沸変性によるアッセイ方法 3、補正をする者 事件との関係 出願人 アールアイエイ プロダクツ インコーホレイテッド4
、代理人 住所 東京都港区赤坂1丁目9番20号5、補正の対
象 代理権を証明する書面、願書の出願人の欄及び図面。 ゛6.補正の内容
標準」線の例を示すグラフ、第3図及び第4図は本発明
により求めたビタミンB1゜及び葉酸エステル濃度と従
来の放射アッセイ法により得た結果とのそれぞれの相関
性を示すグラフである。 特許出願人 アールアイエイ プロダクン インコーポレイテソト代
理人 煮ノ;へ°°“FIo、 4 手 続 補 正 書 (自発) 昭和57年5 月26日 特許庁長官 殿 1、事件の表示 昭和57年 特許願 第50242
号2、発明の名称 非煮沸変性によるアッセイ方法 3、補正をする者 事件との関係 出願人 アールアイエイ プロダクツ インコーホレイテッド4
、代理人 住所 東京都港区赤坂1丁目9番20号5、補正の対
象 代理権を証明する書面、願書の出願人の欄及び図面。 ゛6.補正の内容
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)拮抗蛋白質結合法を用いる血清中の目的成分を分析
するための放射アッセイ方法であって、 (a) 一種もしくはそれ以上の内因性目的成分を有
する一定量の血清試料を還元剤及び前記目的成分の放射
標識複製とを含有する溶液に接触せしめたのち、はぼ室
温にて低温放置して前記目的成分の変性、即ち、前記血
清中における前記目的成分の内因性結合蛋白質からの不
可逆的分離を開始し; (b) 得られた混合物のpHを実質的に12〜14
にする物質を含有する別の溶液を添加し、次いで室温に
て充分低温放置して前記目的成分の変性、即ち、前記血
清中における前記目的成分の内因性蛋白質からの不可逆
的解離を完了し; (C) 生成した溶液のpHを前記目的成分を結合す
るのに適当な範囲に下げ; (d) 前記目的成分の解離を同時にまたはその後で
、前記目的成分に対する新しい結合蛋白質を添加し; (e) 得られた混合物を低温放置して前記目的成分
及びその放射標識複製と前記新しい結合蛋白質とを完全
に結合せしめ; (f) 蛋白質に結合しなかった標識複製と蛋白質に
結合した認識複製とをそれぞれ別個のグループとして分
離したのち、前記グループの一方又は両方からの放射線
強度を測定して、拮抗的な前記蛋白質と前記目的成分及
びその標識複製との結合結果並びに前記血清中の前記目
的成分の含有量とに相関性を有する計数値を得ることを
特徴とする放射アッセイ方法。 2)前記還元剤がジチオチドリトール(DTT)である
特許請求の範囲第1項記載の放射アッセイ方法。 3)前記目的成分が葉酸である特許請求の範囲第1項ま
たは第2項記載の放射アッセイ方法。 4)前記標識複製が■125で標識した葉酸エステル誘
導体で、前記新しい結合蛋白質が精製β−ラクトグロブ
リンである特許請求の範囲第3項記載の放射アッセイ方
法。 5)前記目的成分がビタミンB1□である特許請求の範
囲第1項または第2項記載の放射アッセイ方法。 6)前記標識複製がCo57で標識したジアノコバラミ
ンで、前記新しい結合蛋白質が精製内因子及びpH8−
10とするのに添加された緩衝液と−から成る特許請求
の範囲第5項記載の放射アッセイ方法。 7)前記pH12−14における目的成分の変性がDT
T、シアン酸類及び/又はそれらの塩の水溶液、並びに
強アルカリ成分を前記溶液中に用いることにより一部実
施される特許請求の範囲第2項記載の放射アッセイ方法
。 8)前記目的成分が同時アッセイに付される葉酸及びビ
タミンB1□とから成り、前記標識複製が■125で標
識した葉酸エステル誘導体及びC057で標識したジア
ノコバラミンとから成り、新しい結合蛋白質がβ−ラク
トグロブリン、精製内因子及びpH5−1oeするのに
添加された緩衝液とから成り、前記両標識複製からの放
射線をそれらのエネルギーレベルの違(・に基づいて分
離する特許請求の範囲第2項または第7項記載の放射ア
ッセイ方法。 9)初期変性手順を含む臨床用アッセイ方法であって、
前記変性手順がpH12−14にてプルカプタン系還元
剤を用いて被分析物質及びその結合体とを含む内因性試
料を処理することを一特徴とする臨床用アッセイ方法。 10)変性後pHを8−10の範囲に下げ、アッセイを
拮抗的蛋白質結合法を用いて実施する特許請求の範囲第
9項記載の臨床用アッセイ方法。 11)蛋白質との拮抗的結合の程度を測定し−C内因性
被分析物質の含有量を決定する特許請求の範囲第10項
記載の臨床用アッセイ方法。
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