JPS5839514B2 - グリコエンザイムの固定 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、グリコエンザイムを固定する方法および生成
物ならびにその用途に関する。

本発明においては、グリコエンザイムの炭水化物部分に
カルボニル基またはその前駆体たとえばアセタールを生
成するような条件下で酸化剤を用いてグリコエンザイム
を処理し、次にアミノ物質とグリコエンザイムとの配合
体を生成するような条件下でこの酸化生成物をアミノ含
有物質と接触させる。

本発明の好ましい実施例においては、グリコエンザイム
例えばグルコース・オキシダーゼをｐＨ２，５〜７，５
、温度約５℃〜４０℃で十分な時間過ヨウ素液または過
ヨウ素酸ナトリウムと接触させ、炭水化物の一部を酸化
生成物すなわちカルボニル基とアセタール基とを含む生
成物に変換する。

この酸化されたグリコエンザイムを、次に水不溶性ポリ
マー例えばｐ−アミノスチレンと接触させて、このグリ
コエンザイムとポリマーとの水不溶性配合体を生成させ
る。

最も好ましい酵素−ポリマー配合体、例えばグルコース
・オキシダーゼとｐ ＝アミノスチレンとの配合体は、
グルコース・オキシダーゼだけの溶液と比較するとその
活性度を完全に保持し、より高い熱安定性を有している
。

種々の化学的および物哩的方法を用いて酵素を固定する
ことができる。

今日まで用いられてきた化学的方法はいずれも、たとえ
この酵素が例えばグリコエンザイムの炭水化物残基のよ
うな使用可能な他の官能基を有していたとしても、この
酵素のアミノ酸残基を変換することがら戒るものであっ
た。

このように、グリコエンザイム例えばグルコース・オキ
シダーゼまたはグルコアミラーゼは、単にそれらのアミ
ノ酸残基を化学的に変換することによって固定してきた
。

グルコース・オキシダーゼの炭水化物残基の機能につい
て最近行なった研究により、これらの糖部分は接触作用
には関係しないことがわかった。

従って、アミノ酸基（これらの基のあるものは基質結合
および接触作用に加わる）よりも接触作用に不可欠では
ないこれらの炭水化物基を用いてグリコエンザイムと水
不溶性ポリマーとを共有結合させるのが、より望ましい
と考えられる。

本発明は従って、広く酵素の「非アミノ酸固定」に関す
る。

過ヨウ素酸塩を用いて糖蛋白質を変換することは当業界
では既に知られている。

例えば「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・
リサーチコミュニケーションズ（Ｂ ｉｏ−Ｃｈｅｍ
１ｃａｌ ａｎｄＢｉｏｐｌＴｙｓｉｃａｌ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ） Ｊ第３
１巻第１号（１９６８）には、メタ過ヨウ素ナトリウム
を用いて西洋ワサビ・パーオキシダーゼをその酸化生成
物に変換することが示されている。

その著者はこの酸化生成物をさらに反応させて、例えば
固定された酵素を製造することに関しては検討していな
い。

Ｂｏｓｓａｒｄ、 ”Ａｎｎｅｃ＜Ｂｉｏｌ、 ” ５
２．２０２（１９４８）によると、過ヨウ素酸はアーモ
ンドのグルコシダーゼをこわす。

同様に“Ｐｒｏｃ、 Ｊａｐａｎ 、Ａｃａｃ、”第２
９巻第７号、ｐｐ３５３〜３５６においてマエヵワ等は
、メタ過ヨウ素酸を用いてアルファ・アミラーゼを酸化
し、その最初の活性度をほんの少ししか持っていない酸
化生成物ヲ得ることについて記述している。

この文献もまた、酸化されたアルファ・アミラーゼをさ
らに固定されたアミラーゼ混合物の前駆体として反応さ
せることについては示唆していない。

“Ａ ｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ａｎｄＢｉｏｐｌｙｓｉｃｓ” １０３．５１
５〜５１８ （１９６３）においてＰａ ｚｕ ｒ 等
は過ヨウ素酸塩を用いてアルファ・アミラーゼおよびグ
ルコアミラーゼを酸化し、酵素活性度が損われない生成
物が得られることを記載している。

しかしこの著者も、生成物をさらに反応させて固定され
た酵素を製造することに関しては示唆していない。

ｐａＺｕｒ ｅｔ ａｌ〃Ａｒｃｈ、 Ｂ ｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂ １ｏｐｉｓｉｃｓ“、１１
１．３５１〜３５７（１９５６）＋東メタ過ヨウ素酸塩
を用いてグルコース・オキシダーゼの炭水化物残基を酸
化することを教示している。

この著者は酸化後こり酵素がその活性を失うことについ
ては報告しているが、この酸化された生成物をさらに反
応させて例えば固定されたグルコース・オキシダーゼを
製造することに関しては示唆していない。

グリコエンザイムの炭水化物残基が酸化されてカルボニ
ル基またはその前駆体を生じるような条件下でグリコエ
ンザイムを酸化剤と接触させ、この酸化された反応生成
物を次にアミノ含有物質と接触させて、前記のアミノ含
有物質と前記の酸化されたグリコエンザイムとの水不溶
性配合体を生成することによって固定されたグリコエン
ザイムを都合よく製造できることが、思いがけなくわか
った。

このアミノ含有物質は好ましくはポリマー例えばパラア
ミノポリスチレンである。

本発明のこれらの好ましい酵素−ポリマー配合体はその
最初の状態における酵素と実質的に等しい活性度を有し
、熱安定性はさらに向上する。

グリコエンザイムの特徴は分子の必須部分としての炭水
化物部分を有する。

このような酵素における炭水化物部分の櫛１はまだ完全
にはわかっていないが、これらが接触反応において不活
性である（すなわち活性を示すために不可欠なものでは
ない）ということが示唆され、ある程度実証されている
。

本発明ではこれらの炭水化物部分が接触反応に対して不
活性であることを利用し、グリコエンザイムとアミノ含
有物質とを結合させてこの酵素を変換させ、例えば水不
溶性配合体とするのにこれらの炭水化物部分を用いる。

このように本発明は、広く水不溶性グリコエンザイムの
製法およびその生成物ならびに用途に関する。

これまでに多くのグリコエンザイムが固定されている。

例えばここで参考文献として採用するＰａｚｕｒ等の”
Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＣ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
“第２７巻（１９７２）、にューヨーク、アカデミツク
・プレス社）、３０１頁以下を参照されたい。

本発明わ方法はまた、一般に糖蛋白質および糖ペプチド
を変性するのに用いられる。

しかし本発明の方法）まグリコエンザイムの変性に特に
適しており、酵素の接触反応に不活性な部分を用いて水
不溶性配置体を調製するものである。

このように接触反応には不要な基を用いて酵素と水不溶
性物質とを結斧させることにより、従来の多くの酵素［
技術（つきものの問題点、例えば活性炭の低下等をなく
すことかできる。

本発明は特にグルコース・オキシダーゼ、αアミラーゼ
、グルコアミラーゼ インベルダーゼ、ガラクトシダー
ゼ、ブロメリン、クロロパーオキシダーゼ、パーオキシ
ダーゼおよびいろいろなプロテアーゼの固定を行なうも
のである。

これらの酵素は次のようなプロセスで使用することがで
きる。

すなわち、溶液から０２の除去（グルコース・オキシダ
ーゼ）、テンフッの加水分解（α−アミラーゼ、グルコ
アミラーゼ）、ショ糖の加水分解（インベルターゼ）、
乳糖の加水分解（ガラクトシダーゼ）、ペプチド、アミ
ドおよびエステルの加水分解（フロメリン）、炭素−・
・ロゲン結合の合成（クロロパーオキシダーゼ）、）Ｌ
ｌ！０２の存在下におけるフェノール類、アミノフェノ
ール類、ジアミン類およびアミノ酸の酸化（パーオキシ
ダーゼ）、および蛋白質の加水分解（プロテアーゼ）グ
リコエンザイムの炭水化物基を酸化してカルボニル基ま
たはカルボニル前駆体となる基たとえばアセタール類に
変えるために＋３ いろいろな酸化剤を用いることがで
きる。

例えば四酢酸鉛、酢酸第二マンガン、酢酸第二コバルト
、酢酸第二タリウム、硫酸第二セリウム等を使用するこ
とができる。

しかし好ましい酸化剤は過ヨウ素酸塩たとえば過ヨウ素
酸、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、メタ過ヨウｌカリウム
等である。

過ヨウ素酸塩を用いて炭水化物や多糖類を酸化すること
は当業界では良く知られている。

例えばここで参考として採用する「アドバンシズ・イン
・カーボハイドレート・ケミストリー（Ａｄｖａｎｃｅ
ｓ １ｎＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ） ｊ １１． （１９５６）にューヨーク、アカ
デミツク・プレス発行）、第１頁からのＪｌＭ、ボビッ
ト（Ｂｏｂｂｉ ｔｔ ）の論文を参照されたい。

この論文において著者は、炭水化物部分の酸化に種々の
過ヨウ素酸化合物を用いることについて検討している。

ここに記載されてイル方法バ一般に酸化されたグリコエ
ンザイムの製造に用いることのできるものであり、これ
らの酸化されたグリコエンザイムは本発明の固定された
グリコエンザイムを生成する原料として用いる。

この酸化されたグリコエンザイムは、ｐＨ２，５〜７．
５、好ましくは４．５〜６．５の水溶液中でグリコエン
ザイムと過ヨウ素酸塩とを接触させて製造するのが好ま
しい。

この接触工程における温度は、約４〜４５℃とするのが
好ましく、また１０〜３０℃とすればさらによい。

グリコエンザイムの濃度は約０．１〜ｉｏ■／ｍｌ、例
えば約２■／ａとすることができる。

水溶液中の過ヨウ素酸塩の濃度は約０．１〜５■／ｒｎ
ｌ、例えば約０．５■／−とする。

当業者であれば、十分に酸化されてはいるが次の工程に
おいてアミノ含有物質と接触させるのに十分な程度の活
性度をまだ保有しているグリコエンザイムが得られるよ
うにこれらの条件を調節することができるであろう。

このグリコエンザイムの酸化によりカルボニル基または
その前駆体たとえばアセタールを得、これを次の工程で
アミノ化合物と反応させる。

種々のグリコエンザイムが炭化水素を含有しており、そ
の量はまちまちであるということが当業界では知られて
いる。

一般に過ヨウ素酸塩の濃度はクリコエンザイムの量およ
びこのグリコエンザイムの炭水化物部分の量を考慮して
調整する。

この反応は一般に完結するまで行なわれないので、炭水
化物残基に対して過剰量の過ヨウ素酸塩を使用するのが
一般的である。

炭水化物基のあるものはその立体構造において過ヨウ素
酸塩の作用を受げないように保護されているが、それで
もなお次の工程でアミノ含有物質と反応させるのに必要
なカルボニル基を生成するための炭水化物基は十分であ
る。

この酸化工程では光を完全にさえぎってグリコエンザイ
ムの酸化しすぎを防ぐのがよい。

接触時間は、次の工程でアミノ含有物質と反応させる少
くとも最低濃度のカルボニル基を得るのに十分な程度と
しなげればならない。

例えばグリコエンザイムと過ヨウ素酸塩との接触時間は
１５分ないし２４時間の範囲とすることができ、好まし
くは３０〜１８０分である。

こうして酸化されたグリコエンザイムは、残りの過ヨウ
素酸塩を含有する水溶液から分離するのが好ましい。

妨害化合物が存在しなければ、こうして酸化したグリコ
エンザイムを分離せずにアミノ含有物質と反応させても
よい。

例えばアミノ基または過剰のアミノ基と反応する化合物
が存在しない場合である。

この酸化されたグリコエンザイムは、緩衝した溶液によ
る透析を行なって分離するのが便利である。

例えばｐＨ５，５９の酢酸緩衝液を膜ごしにこの酸化さ
れたグリコエンザイムと接触させて、もうこれ以上透析
可能な物質が出ないというところまで透析を行なうこと
ができる。

酸化されたグリコエンザイムを次のカップリング工程で
使用する前に貯蔵しておく場合には、２５℃より低い温
度に保たなければならない。

この酸化されたグリコエンザイムの水溶液、例えば０．
１〜３％グリコエンザイム水溶液を、次にアミノ含有物
質と接触させる。

このアミノ含有物質は水不溶性物質飼えばポリマーであ
るのが好ましいが、低分子量のアミノ含有化合物も使用
できる。

この接触工程におけるｐＨはわずかに酸性、またはわず
かにアルカリ性になるように、好ましくは５．５〜６．
５または７．５〜９．５に調整する。

このｐＨ調整にはＨＣｌまたはＮａＯＨを使用するのが
便利である。

この混合物は５〜３５℃の温度でグリコエンザイムーア
ミノ配合体を生成するのに十分な時間かきませる。

この配合体は次に１過により混合物から分離することが
でき、次に好ましくは水、続いて塩溶液たとえば緩衝し
た塩化ナトリウムで洗って、縮合していない酵素を全て
除去する。

本発明の方法で用いるアミノ含有物質は分子量たり少く
とも１個のアミノ基を有する。

このアミノ含有物質が少くとも１個の第一アミノ基を有
するのが好ましい。

この酸化されたグリコエンザイムとの反応に対して第ニ
アミノ基は第一アミノ基よりも劣り、第三アミノ基は最
も劣る。

このアミノ基は、反応後に得られる酵素−アミン配合体
が水不溶性となるように選ぶ。

この配合体は水不溶性の固体物質であるのが好ましく、
不均一系方式で酵素接触反応に使用できる。

アミノ基、特に第一アミノ基を含有するアミンが好まし
い。

本発明の方法において使用するアミン化合物は次の一般
式を有する化合物群から選ばれる：（式中Ｒ，Ｒ１およ
びＲ２は水素、炭化水素基および置換された炭化水素基
から成る群から選ばれ、Ｘは窒素または炭素原子である
）。

炭化水素基の置換基はハロゲン、酸素、イオウ、リン、
ケイ素および窒素を含有することがよい。

Ｒは好ましくは本質的に直鎖状で５００〜１ｏｏｏｏｏ
ｏの分子量を有するポリマ一部分であり、Ｒ１およびＲ
２は好ましくは水素である。

Ｘが窒素である場合にはこれに共有結合しているもう一
つの基があるわけであるが、この基は上の一般式では示
されていない。

Ｘが炭素である場合には上の式では示していないがもち
ろんこれと共有結合している基がさらに二つあるわけで
ある。

一般にこれらＱ基は水素または炭化水素基たとえば炭素
原子２０個までの炭化水素基である。

これらの基は好ましくは水素またはＣ１〜Ｃ３のアルキ
ル基であるが、最も好ましいのは水素である。

好ましいＲ基すなわちポリマ一部分中に存在する上述の
置換基のあるものは、このポリマー鎖から側鎖法に出て
いてもよく、またはへテロ原子としてこのポリマー鎖中
に含まれていてもよい。

例えば酸素置換基はへテロ・エーテル状で存在していて
もよい。

すなわちＲがポリエチレンオキシド基でもよい。

またはこの酸素置換基は側鎖状カルボニル基、例えばポ
リビニルアセテート基でもよい。

アミノ含有物質は水不溶性アミノ含有ポリマーであるの
が好ましく、その例としてはポリ−ルアミノスチレン、
アミノエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース
・ヒドラジド、ビオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ ）Ｐ−２ヒ
ドラジド〔カリフォルニア州、リッチモンドのバイオ−
ラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃｏｒ、ｐ、）のポリアク
リルアミド誘導体〕、アミツー−（＝７７１１−ス（５
ｅｐｈａｒｏｓｅ ） ＣＪ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４５．３０５９−３０６５（
１９７０）のＣｕａｔｒｅｃａｓ ａｓの記載に従って
製造できる〕、アミノアルキル化ガラス〔イリノイ州ロ
ックフォードのピアス・ケミカル（Ｐ ｉｅｒｃｅＣｈ
ｅｍｉｃａｌ）の商品〕があげられる。

本発明のグリコエンザイムーポリーｐ−アミノスチレン
配合体は、驚くべきことにはグリコンザイムの元の状態
すなわち水溶液とほとんど等しい活性度を有することが
わかった。

もつと驚くべきことには、多くのグリコエンザイム・ア
ミノ・ポリマー配合体はその元の状態の酵素と比較して
、より高い熱安定性を有することもわかった。

本発明の水不溶性配合体は、現在グリコエンザイムをそ
のまΣ使用している全ての方法に使用することかできる
。

さらにこれらの酵素の熱安定性がより高いため、それら
の方法を従来より高温でしかも酵素を変質させることな
〈実施することができる。

次に特定の実施例をあげで本発明を説明する。

例１ ｐＨ６，０，２５℃のり４緩衝液１００ｍＭにおいてＤ
−グルコースを使用し、カップリングしたパーオキシダ
ーゼ−〇−ジアニシジン系により４６０ ｎｍにおいて
、アスペルギルス・ニカー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ ） （＝ニージャジー州フリーホールドの
ワーシングトン・バイオケミカル社（Ｗｏｒｔｈｉｎｇ
ｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ、 ）
）から得たグルコース・オキシダーゼの活性度を分光光
度法により測定した。

これについてはＨｏＨｌＷｅｅｔａｌ ｌおよびり、Ｓ
Ｈｅｒｓｈの”ＢｉｏｃｈｉｍＢ １ｏｐｈｙｓ、
Ａ ｃ ｔｅ“ ２０６．５４−６０（１９７０を参照
されたい。

固定した酵素誘導体の活性度を００Ｚａｂｏｒｓｋｙお
よびＪ、 ０ｇ１ｅｔｒｅｅの“Ｂｉｏｃｈｅｍ、−Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ〃２８９．６８７６（１９７２
）の記載に従って測定した。

吸光係数１．４１ Ｘ １０’Ｍ ’ｃｔｒｔ ’
を用い、４５０ｎｍ（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５，
６）で分光光度法によりり゛ルーコース・オキシダーゼ
の濃度を測定した。

４５０ｎ ｍにおける微分分子吸光係数１．３１Ｘ １
０’Ｍ ’ｃｆｒＬ’ を用いて分光光度法により、
接触的活性を有する酵素の濃度を測定した。

これに関してはＭ、に、ＷｅｉｂｅｌおよびＨｏＪ。

Ｂｒｉｇｈｔによる“Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ”
２４ ６．２７３４〜２７４４（１９７１）を参照さ
れたい。

４５０ｎｍにおける微分分子吸光係数１．３１Ｘ１０４
Ｍ ’ｃｍ ’ を用いてグルコースによるこの酵
素の嫌気的滴定を行ない、分光光度法によりこの接触的
活性を有する酵素の濃度を測定した。

これに関してはＭ、 Ｋ、ＷｅｉｂｅｌおよびＨｌＪ。

Ｂｒｉｇｈｔによる〃Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、〃１２４．
８０１〜８０７（１９７１）を参照されたい。

酵素−ポリマー配合体の蛋白質含量は、上述の方法によ
るアミノ酸分析を行なって測定した。

これに関しては０ 、ＲｏＺａｂｏｒｓｋｙおよびＪ、
０ｇ１ｅｔｒｅｅの“Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、 Ａｃｔａ“ ２８９．６８７６（１９７２）を参
照されたい。

蛋白質の量はアラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）お
よびグルタミン酸（Ｇｌｕ）の測定量から、この酵素の
分子量が１５００００でありまた１分子当りＡｌａ残基
ｌＯ８、Ｖａｌ残基７９およびＧｌｕ残基９９として決
定した。

これに関してはＪ、 Ｈ，Ｐａｚｕｓ Ｋ。Ｋｌｅｐ
ｐｅおよびＡ、 Ｃｅｐｕｒｅの“Ａ ｒｃｈ、 Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ 。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ” １１１．３５１〜３５７（１９
６５）を参照されたい。

過ヨウ素酸によるグルコース・オキシダーゼの酸化 遮光した２５℃の恒温容器に入れてかきまぜたグルコー
ス・オキシダーゼ溶液（４０，２■、２．６８Ｘ １０
”−Ｅ−／１／、５ｏｍＭ酢酸緩衝液２０ｍ１中、
ｐＨ５，６０）に、過ヨウ素酸溶液（９，１２■、４０
０Ｘ １０−５モ／Ｉ／） ０．４ｍｌを加えた。

得られた黄色の溶液を４時間攪拌し、これにエチレング
リコール０．０２５１１１１．４．４８Ｘ１０−４モル
を加えて過剰の過ヨウ素酸塩と反応させ、さらにＱ、５
時間攪拌する。

この溶液を５０ ｐｓｉ Ｎ２圧力下、ＸＭ−５０フイ
ルターを備えたアミコン・モデル（Ａｍ１ｃｏｎ Ｍｏ
ｄｅｌ ） ２０２限外沢過セルに移し、もうこれ以
上透析できないという点まで、ｐＨ５，５９でｓｏｍＭ
酢酸緩衝液を用いて透析を行なった。

グルコース・オキシダーゼと４時間反応させた後の過ヨ
ウ素酸の転化率は、Ｊ、 Ｊ。

Ｄｉｘｏｎおよびり、Ｌｉｐｋｉｎの“Ａｎａｌ、 Ｃ
ｈｅｍ、 ’ｚ１、１０９２〜１０９３ （１９５４）
の、２２３ｎｍにおける吸光度変化に基いて６１．６％
であった。

こうして酸化された酵素を５℃で貯蔵した。

酸化グルコース・オキシダーゼとｐ−アミノスチレンと
のカップリング 酸化グルコース・オキシダーゼ溶液５１ｎｌ（１０７Ｖ
）に、ｐ−アミノスチレンの微細な粉末〔ペンシルバニ
ア州ワリングトンのポリサイエンジス社（Ｐｏｌｙｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ、）の商品、１２５０７Ｖを加え
た。

０． ｌＮＮａＯＨを用いてこの懸濁液をｐＨ９に調節
し、約２５℃で１時間攪拌し、次にミリポア（Ｍｉｌｌ
ｉｐｏｒｅ ） ０．４５ μのフィルターを用いて１
過した。

こうして得られた固体をｐＨ６，４の５０ ｍＭリン酸
緩衝液中Ｈ２０１１およびＩＭＮａＣｌＩＪで洗った。

Ｈ２Ｏの数ｒｎｌを用いて洗った後はこの洗液からは活
性度が検出されなかった。

最初の１液は高活性度を示したが、ＮａＣ１洗液から活
性度が検出されなかった。

酸化グルコース・オキシダーゼとｐ−アミノスチレンと
のカップリングにより活性な酵素−ポリマー配合体が得
られた。

理論にしばられたくはないが、この酵素はイミン結合に
よってポリマーと結合しているようである。

しかしこのアミノ含有物質がヒドラジドである場合には
この結合はヒドラゾンとなる。

ｐ−アミノスチレンによる蛋白質ローディング（酵素−
ポリマー配合体Ｖ当たりの酵素の■数）は５〜８■であ
る。

この固定された酵素の活性度は元のま工の酵素および酸
化された酵素と等しい。

下の第１表参照。酵素中のアミノ酸残基は酸化されてい
ないので、これは接触反応に不可欠ではない炭水化物残
基を経由した酵素の固定によるものと思われる。

この配合体をｐＨ６，３１のリン酸緩衝液１１００７Ｆ
Ｌ中で６週間貯蔵した。

この貯蔵期間後も配合体の活性度は変らず、また緩衝液
は不活性のま工であったので脱着が起らなかったことに
なる。

グルコース・オキシダーゼの熱安定性は第■表に示す。

元の酵素と酸化された酵素とは安定性が等しい（酸化さ
れた酵素は厳密にはわずかに安定性が高い）が、他方水
不溶性配合体の安定性は明らかに高い。

他のアミノ含有ポリマー（アミノエチルセルロースカル
ボキシメチルセルロース・ヒドラジド、バイオゲルＰ−
２ヒドラジドおよびアミノ−セファロース）を用いて同
様に酸化グルコース・オキシダーゼの固定を行なった。

これらの結果を第■表に示す。

酵素−ポリマー配合体を水性懸濁液またはｐＨ５，６の
酢酸ナトリウム緩衝液（元のま”Ｓの酵素の場合）とし
、６０℃でその熱安定性を調べた。

酸化処理しない元のまＳの酵素と酸化酵素との濃度を０
．４■／ｍｌに調整した。

配合体の濃度は約０、７５ ｗｔ６１／ｍｌであった。

例２ 酸化グルコース・オキシダーゼのアミノエチル（ＡＥ）
−セルロースに対するカップリングおよびクロマトグラ
フィー ｐＨ４，９３の５ ＭＮａＣｌ−５０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム緩衝液１００ｍｌ、およびｐＨ４，９４の５０？７１
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液１００ｍ１で前もって洗ってお
いた（精度測定ポンプを用い、４０ｍ１／ｈｒ、で）Ａ
Ｅ−セルロースのカラム〔バイオランド・セレツクスー
ＡＥ （Ｂｉｏ−ＲａｄＣｅｌｌｅｘ −Ａ Ｅ ）
０．２５ ｍＷ／ ｆｆ交換能〕に処理していない元の
まＳのグルコース・オキシダーゼまたは酸化グルコース
・オキシダーゼ１，０ｍ７を入れた。

１ｍｌを集めて２８０ｎｍにおける吸光度をモニターし
た。

３０ｍ１を通した後この緩衝液を５０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ４，９３）からＩＭＮａＣｌ−５０ｍＭアセテ
ート（ｐＨ４，９４）、さらに２．５Ｍ−ＮａＣ１−５
０ｍＭアセテート（ＰＨ４，９４）、さらに５Ｍ Ｎ
ａＣ１−５０ｍＭ７セテー） （ｐＨ４，９４）へ変え
た。

５Ｍ−ＮａＣ１緩衝液を用いて溶離を行なってからこの
カラムをｐＨ４，９３の５ｏｒｒＬＭ酢酸緩衝液を用い
て洗った。

元のま工のグルコース・オキシダーゼと酸化グルコース
・オキシダーゼとに分離した同じカラムを用いた。

溶離の最後に両方のＡＥ−セルロースカラム内の活性度
を観察した（活性度は充填床の頂部ならびに底部で測定
した）。

これらの結果を下の第■表に示す。

溶離時により少量の酸化された酵素が回収可能であり、
水不溶性０尊素−アミノ、ポリマー配合体が形成される
ことを示していることに留意されたい。

この酸化された酵素−アミノ・ポリマー配合体の活性度
について試験を行なった結果、その酵素の活性度は元の
状態の時よりも増加していることがわかった。

例３ 酸化グルコース・オキシダーゼとカルボキシメチルセル
ロース（ＣＭＣ）−ヒドラジドとのカップリング ポリアミノスチレンの場合と同様にし−Ｃ１化されたグ
ルコース・オキシダーゼをカルボキシメチルセルロース
のヒドラジド〔エンザイト（Ｅｎｚｉｔｅ ）、ＣＭＣ
−ヒドラジド〕〔インディアナ州エルクバーズのマイル
ス・ラボラトリーズ（Ｍｉ ｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓの商品）〕とカップリングさせた。

カップリング条件は次のとおりであつた。

すなわち、ｐＨ５，０６の水性酢酸緩衝液１０ＴｒＬｌ
中でエンザイト２５０■および酸化されたグルコース・
オキシダーゼ１０．２■を、５℃で１８時間接触反応さ
せた。

この酵素−ポリマー配合体を洗う場合クランピング（ｅ
ｌｕｍｐｉｎｇ ）による問題カ生じた。

この問題はコントロール（グルコース・オキシダーゼお
よびＣＭＣ−ヒドラジド）では生じないものである。

この配合体をＰ液（約１５０ｍのに活性が見られなくな
るまで、まずｐＨ４，９４の５０ｍＭ酢酸ナトリウム１
３０ＴｆＬｌで洗い、次にｐＨ４，８の５０７ＡＭ酢酸
ナトリウム緩衝液中のＩ Ｍ−ＮａＣｌ ６００ ｍｌ
で洗った。

この固体は活性であり、これを５℃の該緩衝液中に貯蔵
した。

コントロール固体はＰＡＳと同様で、活性をほんのわず
か示すだけであった。

例４ グルコース・オキシダーゼとバイオ−ゲルＰ−２のヒド
ラジドとのカップリング ｐＨ５，５１の５０ｍＭ酢酸ナトリウム中、５℃で１９
時間酸化グルコース・オキシダーゼとヒドラジド・バイ
オーゲ７Ｌ／ｐ −２（１００〜２００メツシユ）との
カップリングを行なった。

未処理のまＳのグルコース・オキシダーゼを用いた相当
するコントロールも同様に行なった。

５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，６）、１Ｍ−
ＮａＣ１−５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，８）およ
び２．０Ｍ−ＮａＣ１−５０ｍＭアセテート（ｐＨ５，
１）を用いてこれらの配合体を洗った。

酸化されたグルコース・オキシダーゼの場合とは反対に
、２Ｍ−ＮａＣ１で洗うことにより（吸着された酵素）
ヒドラジド−未処理グルコース・オキシダーゼ配合体か
ら活性度を完全にとり除くことができた。

本発明の実施の態様および関連事項を以下に記載する。

（１）クリコエンザイムの固定法であって、グリコエン
ザイムの炭水化物部分を、少くとも１個のカルボニル基
またはその前駆体が生成する条件下で酸化し、この酸化
されたグリコエンザイムをアミノ含有物質と反応させ、
水不溶性のグリコエンザイムーアミノ配合体を生成せし
めることを特徴とする該固定法。

（２） グリコエンザイムの炭水化物が酸化されて少
くとも１個のカルボニル基またはその前駆体が生成する
ような条件下で、グリコエンザイムを過ヨウ素酸塩含有
物質と接触させ、この酸化されたグリコエンザイムを上
記過ヨウ素酸塩含有物質から分離し、次に水不溶性の酵
素−ポリマー配合体を生成するような条件下でこの酸化
されたグリコエンザイムを水不溶性のアミノ含有ポリマ
ーと接触させることがら戒る前記第（１）項記載の方法
。

（３） グリコエンザイムがグルコース・オキシダー
ゼである前記第（２題記載の方法。

（４）水不溶性ポリマーがパラ−アミノスチレンである
前記第（２）項記載の方法・ （５） 過ヨウ素酸塩を、ｐＨ２，５〜７．５の水溶
液中で、グリコエンザイムと接触せしめる、前記第（３
）項記載の方法。

（６）過ヨウ素酸塩を、過ヨウ素酸および過ヨウ素酸ナ
トリウムからなる群から選ぶ、前記第（５題記載の方法
。

（７）接触温度が約５〜約４５℃の範囲にある、前記第
（６）項記載の方法。

（８）水不溶性の酵素−ポリマー配合体であって、ヒド
ラゾン結合により水不溶性ポリマーに共有結合したグリ
コエンザイムを含むことからなる該配合体。

（９）酵素がグルコース・オキシダーゼである、前記第
（８項記載の配合体。

（ＩＱ） ポリマーがポリアクリルアミド誘導体であ
る、前記数８）項記載の配合体。

（１１）ポリマーがカルボキシメチルセルロース誘導体
である、前記第（８頓記載の配合体。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ グリコエンザイムの炭水化物部分を、少なくとも１
   個のカルボニル基またはその前駆体が生成する条件下で
   酸化し、この酸化されたグリコエンザイムと次の一般式
   ： 〔上式中、Ｒ，Ｒ１およびＲ２は水素、炭化水素基およ
   び置換炭化水素基からなる群から選ばれ、Ｘは窒素また
   は炭素原子（ただし、Ｘには、水素および炭化水素基か
   らなる群から選ばれる１つまたは２つが結合している）
   である〕 を有する化合物から選ばれるアミノ含有物質とを、水不
   溶性の、固定されたグリコエンザイムーアミノ配合体を
   生成せしめるように反応させることを特徴とする該配合
   体の製造方法。