JPS5832957B2 - 抗腫瘍能を有する溶血性連鎖球菌の培養方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は溶血性連鎖球菌（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓＰｙｏｇｅｎｅｓ＋以下溶連菌と略記）の培養方法に
係り、詳しくはストレプトリジンＳ（以下ＳＬＳと略記
）産生能および抗腫瘍能が高い菌体を高収率で得る溶連
菌の培養方法に関する。

溶連菌は、丹毒、敗血症、産褥熱、その他種々の疾病の
病源菌であるが、古くからある種の溶連菌が抗腫瘍能を
有していることが知られており、近年臨床的にも制癌剤
として用いられるようになった。

溶連菌の抗腫瘍能は、本菌の産生ずる溶血毒素の一つで
あるＳＬＳの産生能と密接な関係があり、自然界に存在
する溶連菌の中でも、ＳＬＳ産生能を有する菌株のみが
抗腫瘍能を有しており、また、たとえＳＬＳ産生能をも
つ溶連菌でも、ＳＬＳ産生能を失うような条件で培養す
ると、同時に抗腫瘍能も消失してしまうことが知られて
いる。

この例は、培地にグルコースを添加した場合によ〈調べ
られており、グルコースを０．３％以上添加すると菌の
発育は良くたるが、その菌のＳＬＳ産生能および抗腫瘍
能がほぼ完全に失われること、またグルコースのみなら
ずフラクトース、ラクトースマンノースあるいはグリセ
ルアルデヒドを培地中に添加してもＳＬＳ産生能が抑制
されることが知られており（Ｈ、Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ
ａｌ、 ＧＡＮＮ、 ５５ 。

２２５〜２３２ ｔ Ｊｕｎｅ、１９６４ ；Ｈ，Ｏｋ
ａｍｏｔ。

ｅｔ ａｌ−、Ｊａｐａｎ−Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、
３４ 、３ ＋ １０９〜１１８；犬月等、金沢大学が
ん研究所年報、第１巻、１４１〜１５３頁、１９６７年
参照）、本発明者等も、これらの添加によりＳＬＳ産生
能が消失することを確認した。

以上の理由から従来の培養法では、グルコース等の良好
な資化可能な炭素源が使用できず、菌の増殖上不利とい
う欠点があるにもかかわらず、抗腫瘍能を有する菌体を
得るＷ、それら資化可能な炭素源を含有もしくは添加し
ない培地を用いることが余儀なくされていた（特公昭４
３−６６９０）。

その後、資化可能な炭素源を含有しない培地として酵母
エキスを用いるとＳＬＳ産生能のより高い菌体が得られ
ることが開示されるに至った（特公昭４５−２１６２８
）が、その菌体収率は不良であり満足すべき方法とはい
い難い。

本発明者等は、ＳＬＳ産生能および抗腫瘍能の高い溶連
菌を高収率で得る培養方法について研究を進めた結果、
資化可能な炭素源（例えばグルコース）を含む培地を用
いた場合においても、培養経過中培地のｐＨを６〜７．
５に保持するならば、溶連菌のＳＬＳ産生能および抗腫
瘍能が失われず、かつ高収率で該菌体が得られることを
見出した。

本発明は上記の知見に基づくものであり、資化可能な炭
素源を０．３〜５幅含有もしくは添加した培地を用い、
培養経過中培地のｐＨを６〜７．５に保持することを特
徴とする抗腫瘍能を有する溶連菌の培養方法である。

以下本発明について詳細に説明する。

本発明を実施するに際して、培地としてブイヨン培地、
トッド・ヘーウイツド培地、トリプトソーヤ培地、カポ
チャエキス培地、酵母エキス培地あるいは大豆ポリペプ
トン培地等を基礎培地として用いる。

場合によってはこれら培地を組合せて用いることもでき
る。

資化可能な炭素源としてはグルコース、マンノース、フ
ラクトース、ラクトース、シュクロース、マルトース、
クリセルアルデヒド、トレハロースデキストリン、可溶
性澱粉、廃糖蜜等がある。

中テモ、グルコースおよびシュクロースは菌体収量が多
く、得られた菌体のＳＬＳ産生能および抗腫瘍能も良好
であって特に好ましい。

これら炭素源の培地中濃度は、添加する炭素源の種類、
基礎培地中に含有されている炭素源の種類等によっても
若干量るが、一般的には、０．３〜５係の範囲であるの
がよく、例えばグルコースを基礎培地中に含有せしめる
場合のその濃度は好ましくは０．３〜２％、より好まし
くは０．３〜ｉ、ｏ係の範囲とするのがよい。

なお、ここで幅は〔資化可能な炭素源の培地中の重量／
培地の容量〕の百分率を意味し、以下特に断らない限り
全てこの意味で用いる。

本発明においては、上記の炭素源を含む培地に溶連菌を
培養するにあたり、培養経過中培地のｐＨを好ましくは
６〜７．５、より好ましくは６．０〜７．０に保持する
。

このようにすることによって、溶連菌は速やかに増殖し
、菌体収量が著しく向上するばかりでなく、得られた菌
体は優れたＳＬＳ産生能および抗腫瘍能を示す。

なお、トッド・ヘーウイツド培地、トリプトソーヤ培地
、カポチャエキス培地、大豆ポリペプトン培地等、もと
もと若干量の資化可能な炭素源を含む培地は、これをそ
のまま用い、ｐＨをコントロールするだけで、上記の如
き効果を得ることが可能であるが、それら培地に前記の
如き資化可能な炭素源を一般に５係以下、例えばグルコ
ースの場合は好ましくは２幅以下添加した培地を用いる
ことによって、より良好な培養結果を得ることができる
。

かくして、本発明においては、資化可能な炭素源を含有
しない基礎培地である酵母エキス培地にグルコースを添
加し、その培地中濃度を０，３〜２係とした培地、資化
可能な炭素源を含有する基礎培地である大豆ポリペプト
ンを３幅（重量／容量）含有する培地にグルコースを添
加し、その培地中濃度を０．３〜１．５係とした培地等
が好適な培地として使用できる。

本発明方法によって前記の如き優れた効果が発現される
理由、あるいは、資化可能な炭素源存在下に溶連菌のＳ
ＬＳ産生能および抗腫瘍能の消失もしくは低下が起る理
由は必ずしも明確ではない。

溶連菌を資化可能な炭素源を含む培地で培養すると、一
般に、ＳＬＳ産生能および抗腫瘍能の消失と共に培地の
ｐＨ低下が認められ、この事実からすれば、本発明方法
の効果は培地のｐＨ低下を防止したことによるものと考
えられるが、しかし一方、マルトースを含む培地で該菌
を培養すると、培地のｐＨ低下が起るにもかかわらず、
該菌のＳＬＳ産生能はある程度保持される（前掲の大月
等の報文参照）ことからすれば、該菌のＳＬＳ産生能の
低下は培地のｐＨ低下のみが要因であることは断定でき
ない。

即ち、本発明の効果は培地のｐＨ低下を防止したことそ
れ自体のみによるとは断定できない。

いずれにしても、単に培地のｐＨコントロールという簡
単な手段で優れた効果が得られることは全く予想できな
いことであった。

なお、上記の通りマルトースの場合は培地のｐＨが低下
しても菌のＳＬＳ産生能の低下は小さいがこの場合にお
いても、本発明のｐＨコントロールを症する該菌のＳＬ
Ｓ産生能、抗腫瘍能がより増大し、またその菌体収率も
著しく改善される。

本発明方法において、ｐＨをコントロールする方法とし
ては、緩衝液例えばリン酸緩衝液（ｐＨ７，０〜７．５
）を培地に対する最終濃度が５０〜３００ｍＭ、好まし
くは１００〜２００ｍＭになるように添加する方法、あ
るいは、低速例えば１００〜５００ ｒｐｍ で攪拌
下の培地中にアルカリ水溶液、例えば苛性ソーダ、苛性
カリ、アンモニア、塩基性アミノ酸等の水溶液（場合に
よっては塩酸、硫酸、燐酸、酸性アミノ酸等の水溶液）
を滴下する方法等が用いられる。

後者の操作は、ｐＨコントローラーを用いて自動的に行
うこともできる。

培養温度は通常用いられる範囲でよいが特に３７℃附近
が好ましい。

培養時間は、培地の種類および菌の接種量によって異る
が、８〜３０時間程度であり、一般には１２〜１６時間
で活性収量とも十分な結果が得られる。

本発明方法によれば、資化可能な炭素源を含有しない培
地を用いる方法に比べて、２〜５倍の収量で溶連菌菌体
が取得でき、しかもそのＳＬＳ産生能および抗腫瘍能は
優れている。

以下実施例を挙げて本発明の詳細な説明する。

なお、各実施例において、菌体収量は培養液の吸光度（
ＯＤ６６ｏ）をもって示し、また、該０Ｄ６６０および
単位培養液中に含まれている菌体のＳＬＳ産生能（ＨＵ
／ｍｌ）の測定は、培養１６時間目以降毎２時間置きに
採取した試料について行い、ＨＵ／ｍｌはそれら測定値
中の最高値を、またｏＩ）６ａｏは当該時点の値を示し
た。

また菌体当り該時点の０Ｄ６６０ で除した値をもって示した。

抗腫瘍能は培養終了時の培養液から分離した菌体をもっ
て調製した試料について測定した。

各測定は以下の通り行った。

〔菌体収量（ＯＤ６６ｏ）〕 培養液の一定量を採取し、これより遠心分離して得られ
た菌体を生理食塩水で２回洗浄ｔまた後、６６０ｎｍに
おける吸光度（ＯＤ６６ｏ）が０．１〜０．２になるよ
うに該菌体を生理食塩水で希釈し、その希釈液の０Ｄ６
６０ を測定し、この値に希釈倍率（希釈液量／採取
培養液量）を乗じて培養液の０Ｄ６６０ とした。

〔単位培養液当りのＳＬＳ産生能（Ｈ′Ｕ／ｍｌ）〕培
養液５ ｍｉｌを小試験管に採取し、氷冷し、これを冷
時遠心分離して得た菌体をバーンノ・イマー基礎培地（
マルトース６７５ ＴＩＬｇ、２０幅リン酸２水素カリ
ウム水溶液を水酸化ナトリウムでｐＨ７，０に調節した
溶液６ ｍｉｌ、２幅硫酸マグネシウム７水和物水溶液
１２ｍ１および蒸留水６６ｍ１からなる培地、以下ＢＢ
Ｍと略記）で洗浄後、２ｍｌの新鮮なりＢＭに懸濁し、
ＳＬＳを産生させるため、これに０．０６％となるよう
ＲＮａｓｅ −００ｒｅ（酵母ＲＮＡをＲＮａｓｅ で
処理したもの）を添加し、３７°Ｃで６０分間保温した
。

該菌懸濁液は、次いで、氷冷して３５００ ｒｐｍで１
０分分間時遠心分離し、その上澄液（ＳＬＳ含有原ＢＢ
Ｍ液）を１ｍｌとって冷緩衝液（塩化ナトリウム７．４
ｇ、リン酸２水素カリウム３．１７９、リン酸水素２ナ
トリウム１２水３．５９ｇを水ｌｌ中に含み、そのｐＨ
は６．５である）で倍々に希釈した。

この希釈液のそれぞれ１ｍｌに対し、ウサギ赤血球懸濁
液〔ウサギ脱繊維素血液より遠心分離した血球を上記緩
衝液で数回洗浄し、該緩衝液で濃度が３係（容量／容量
）となるように希釈したもの〕１ ｍ１１を添加して３
７°Ｃで６０分間保温し、５０係溶血が生じた希釈液に
ついての原ＢＢＭに対する希釈倍率をＳＬＳの溶血単位
（ＨＵ）とし、これより単位培養液当りのＳＬＳ産生能
（ＨＵ／ｍ１ｌ）を求めた。

（ｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍能〕 各実施例および比較例の培養液より、その２５０ｍ１を
取って冷時遠心分離を行い、得られた菌体を冷生理食塩
水で２回洗浄後、冷ＢＢＭに懸濁し、６６０ ｎｍにお
ける吸光度（０Ｄ６６ｏ）６；１０．０となるように調
整した。

これにパニシリンＧカリウム２０万単位の１．２５ ｍ
ｌｌ生理食塩水溶液をＢＢＭの５分の１量加えて３７℃
に２０分間、次いで４５℃に３０分間保温後その１ｍｌ
ずつを無菌試験管に分注し凍結乾燥して〔乾燥菌体５ｒ
ｒｇ／試験管〕の溶連菌凍結乾燥製剤を得た。

１０ 個のエールリッヒ腹水癌細胞をマウス（１群５匹
、約５週令のｄｄＹ雌性マウスを使用）腹腔内に移植し
、翌日以降、毎日１回４日間、上記の如くして得た溶連
菌凍結乾燥製剤の５ｍｌ生理食塩水懸濁液の０．２ ｍ
ｌずつを腹腔内に投与した。

生理食塩水０．２ ｍｌｌを同様に投与した群を対照と
した。

抗腫瘍能はエールリッヒ腹水癌移植後２０日日および３
０日日のマウスの生存四散なもって示した。

たお、本試験における対照群のマウスの２０日日目よび
３０日日の生存四散はいずれも零匹であった。

実施例１（比較例Ａ、Ｂ） ５幅酵母エキス培地〔工業用酵母エキス（オリエンタル
酵母工業製）５０ｇを５００？７Ｚ７の蒸留水に溶解し
、ｐＨ７，２〜７．４に調整後１００℃で１時間煮沸し
、次いで水冷し沈澱物を済去し、溶液をｐＨ７，２〜７
．４に再調整し再び１００℃で３０分間煮沸、水冷、沈
澱物済去を行い、ろ液に蒸留傘本水を加えて１０１００
Ｑとし１２１℃で１０分間滅菌したもの〕を基礎培地と
して用いた。

１５００？？Ｚ７のジャーファーメンタ−中に上記の基
礎培地５００７？Ｚｌを加え、予め肉エキスブイヨン培
地（極東製）で培養した溶連菌（Ｓ ｔ 、 Ｐｙｏｇ
−ｅｎｅｓ ＡＴＣＯＩｌａ ２１０６０ ）の培養液
２．５ｍ１ｌを加えて植菌し、これにグルコース濃度が
０．４％となるように無菌グルコース溶液を加え、ｐＨ
コントローラーＦＣ−ＩＣ東京理化機械（株）〕により
培養経過中の培地のｐＨが６．５となるよう５Ｎ苛性ソ
ーダ水溶液を１７０ｒｐｍ で攪拌下の培地中に滴下
しつつ３７°Ｃで２０時間培養を行った。

比較例Ａは次のとおり実施した。

上記と同様に基礎培地に溶連菌を植菌し、グルコース溶
液は添加するが培地のｐＨ調節は行わず、３７℃で２０
時間培養を行った。

比較例Ｂは次のとおり実施した。

前記と同様に基礎培地に溶連菌を植菌し、グルコース添
加およびｐＨ調節は行わず、３７℃で２０時間静置培養
を行った。

各培養法によって得られた菌体収量、菌のＳＬＳ産生能
および１ｎｖｉｖｏ抗腫瘍能の測定結果を第１表に示す
。

第１表に示した通り、本発明方法によって得られる溶連
菌の菌体当りのＳＬＳ産生能および抗腫瘍能はグルコー
ス無添加静置培養（従来法；比較例Ｂ）によって得られ
た該菌のそれらと比べ何んら遜色なく、しかもその菌体
収量は後者の２．６倍にも及び培養効率が飛躍的に向上
する。

一方、グルコースを添加するがｐＨ制御は行わないもの
（比較例Ａ）では、若干の菌体収量増加は認められるも
のの、該菌体のＳＬＳ産生能が著しく低下し、またその
抗腫瘍能ははｇ完全に失われる。

実施例２，３．４（比較例Ｃ，Ｄ、Ｅ） 実施例１で用いた菌（Ｓｔ−Ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＡＴ
ＣＣ＊”＆２１０６０）の代りにＳｔ 、Ｐｙｏｇｅｎ
ｅｓ ＡＴＣＣ＆２１０５９（実施例２、比較例Ｃ）
、同ｌＩＤＳ−４３（実施例３、比較例Ｄ）、同ＩＩＤ
Ｔ−３（実施例４、比較例Ｅ）を用いた他は実施例１お
よび比較例Ｂに記したと同様の培養法により第２表に示
す結果を得た。

実施例５．６．７（比較例Ｆ） 培養経過中の培地のｐＨをそれぞれ５．０（比較例Ｆ）
、６．０（実施例５）、７．０（実施例６）、７．５（
実施例７）に保持する他は実施例１と同様に培養を行い
第３表に示す結果を得た。

なお、比較のため比較例Ｂの結果を再掲した。

第３表の結果から、培地のｐＨは６．０〜７．０が最も
好ましい範囲であることが判る。

実施例 ８，９，１０．１１ 添加グルコース濃度を０．３ ％ （実施例８）、０．
８係（実施例９）とする他は実施例１と同様に培養を行
った結果、および添加グルコース濃度、培養時間をそれ
ぞれ２係、３０時間（実施例１０）、５係、４０時間（
実施例１１）とする他は実施例１と同様に培養を行った
結果を第４表に示す。

なお、比較のため比較例Ｂの結果も併せて示す。

実施例８〜１１のいずれの場合においても、本発明方法
によって菌体収量は従来法に比べて２〜５倍に増大し、
しかも一方、菌体当りのＳＬＳ産生能は十分なレベルに
保持され、培養取得されるＳＬＳ総産生産生能いて著し
い改善が認められる。

なお、第４表の結果から、グルコースの添加量が増える
につれて菌体収量が増大するが、逆に菌体当りのＳＬＳ
産生能は若干低下する傾向があり、グルコース添加量に
は好ましい範囲があることがわかる。

実施例１２，１３，１４，１５（比較例Ｇ、Ｈ。

Ｉ 、Ｊ） 資化可能な炭素源としてグルコースの代りにマルトース
（実施例１２、比較例Ｇ）、マンソース（実施例１３、
比較例Ｈ）、シェフロース（実施例１４、比較例■）、
ラクトース（実施例１５、比較例Ｊ）を用いる他は実施
例１および比較例Ａと同様にして培養を行い第５表の結
果を得た。

資化可能な炭素源を添加するがｐＨの調節を行わない上
記Ｇ−Ｊの比較例の他、比較のため炭素源を添加しない
前記の比較例Ｂの結果を再掲した。

実施例１２〜１５０本発明方法によればいずれの場合も
、菌体収量は著しく増大し、しかもＳＬＳ産生能および
抗腫瘍能の優れた菌体を得ることができる。

一方、該炭素源を添加するがｐＨ制御を行わないもので
は、菌体収量は若干量増加するものの、ＳＬＳ産生能お
よび抗腫瘍能は著しく減少するか、あるいは消失する。

実施例１６．１７（比較例に、Ｌ） 基礎培地として、実施例１の酵母エキスの代りに、ポリ
ペプトンを主成分とする培地〔ポリペプトン（ＢＢＬ社
製）１．５％、大豆ポリペプトン（ＢＢＩＪ：製）０．
５％、酵母エキス（オリエンタル酵母工業製） ０．５
％、塩化ナトリウム０．５％の水溶液をｐＨ７，２〜
７．４に調節し、１２１℃で２０分間滅菌したもの〕（
実施例１６）、あるいは大豆ポリペプトン（ＢＢＬ社製
）より成る培地〔大豆ポリペプトン３係の水溶液をｐＨ
７，２〜７．４に調節し１２１℃で２０分間滅菌したも
の〕（実施例１７）を用いる他は実施例１と同様に培養
を行い、また比較例として、それら培地を用いて比較例
Ｂと同様に培養を行い（比較例に、Ｌ）第６表に示す結
果を得た。

基礎培地がポリペプトン培地、あるいは大豆ポリベグト
ン培地である場合においても、本発明方法によって、菌
体収量がそれぞれグルコース無添加静置培養（比較例に
、Ｌ）の４．８倍および２．５倍に増大し、ＳＬＳ産生
能、抗腫瘍性も良好である。

なお比較例しでは、グルコースを添加していないにもか
！わらずＳＬＳ産生能が低下しているが、これは本来大
豆ポリペプトン中に資化可能な還元糖が約０．４％（グ
ルコース換算値）含まれているホ傘ためであろうと考え
られる。

この場合、更にグルコースを添加しても、ｐＨ制御する
と実施例１７の如く、ＳＬＳ産生能の低下は起らないこ
とが分る。

実施例 １８ 基礎培地として実施例１７で用いた大豆ポリペプトン培
地（約０．４％の還元糖を含む）を用い、グルコース添
加は行うことなく実施例１７と同様に培養を行い得た結
果を前記の比較例りの結果と共に第７表に示す。

実施例 １９ １０係酵母エキス培地（工業用酵母エキス１００ｇを５
００ｍ１の蒸留水に溶解しｐＨを７２〜７．４に調整し
、１００℃で１時間煮沸後水冷し、沈澱物を済去し、ｐ
Ｈを７．２〜７．４に再調整後再度ｉｏｏ℃の煮沸（３
０分間）、水冷、沈澱物炉去を行い、これに蒸留水を加
え１０１００Ｏとしたもの）５００ｍｌと、３００ ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，３）５００ｍｌと混合して、
１２１℃で１０分間滅菌した。

これに予め肉エキス培地で培養した溶連菌（Ｓｔ −Ｐ
ｙｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣＡ：２１０６０）培養液を５
ｏｍｌｌ加えて植菌し、培養液のグルコース濃度が０．
４％となるように滅菌グルコース溶液を添加し、３７℃
で２０時間静置培養を行った。

この培養においてはｏＩ）ａａｏは２．２に達し、緩衝
液およびグルコース無添加の静置培養（比較例Ｂ、０Ｄ
６６０＝０．８９ ”）に比べて約２．５倍の菌体増殖
が見られた。

また、単位培養液当りのＳＬＳ産生能（ＨＵ／ＨＵ／ｍ
１ ｍ１ｌ ）および菌体当りのＳＬＳ産生能（□）Ｄ６６
０ は、それぞれ４６６および２１２と高い値を示し、凍結
乾燥製剤についてｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍抗腫瘍全試験た
結果では、被験マウス（１群５匹）は、エールリッヒ腹
水癌移植後３０日日においても全四散が生存していた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 抗腫瘍能を有する溶血性連鎖球菌（Ｓ ｔｒｅｐｔ
   ｏ−ｃｏｃｃｕｓ Ｐｙｏｇｅｎｅｓ ）を培地中に増
   殖させる方法にお〜）で （Ａ） 資化可能な炭素源を０．３〜５％含む培地を
   用い、且つ （Ｂ） 培養経過中、該培地のｐＨを６〜７．５の範
   囲に維持する ことを特徴とする該菌の培養方法。 ２ 資化可能な炭素源を０．３〜２幅含む培地を用いる
   特許請求の範囲第１項に記載の培養方法。 ３ 培養経過中、培地のｐＨを６．０〜７．０の範囲に
   維持する特許請求の範囲第１項に記載の培養方法。 ４ 資化可能な炭素源が資化可能な単糖類もしくは三糖
   類である特許請求の範囲第１項に記載の培養方法。 ５ 資化可能な単糖類がグルコースである特許請求の範
   囲第４項に記載の培養方法。 ６ 資化可能な三糖類がシュクローズである特許請求の
   範囲第４項に記載の培養方法。