JPS5828300A - 細胞表面抗原の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、容器内底面に付着せしめた浮遊性細胞の表面
抗原の検出方法に関する。

近年、細胞表面抗原を識別する技術は急速に進歩した。

特に容易に検体を採取可能であることから、浮遊性細胞
である末梢ｍ　リンパ球の表面抗原には、多くの検討が
加えられている。

細胞の表面抗原とは、異種もしくは同種動物の免疫系に
よって認識しうる物質であシ、細胞表面に％出している
機能性および構造蛋白質、またはその蛋白質に結合して
いるれ々の糖鎖、　ＦＬ＜は脂質など多様な構造を有し
ている。

種々の表面抗原と、その細胞の機能とけ対応がつけられ
つつあり、ある細胞集団のうちである抗原が存在する細
胞の存在比を知ることは、細胞生物学、免疫学、および
臨床診断上意義が深い。

細胞表面抗原の種類としては多数存在するが。

それら個々の物質としての解析は未だ十分には進んでい
ない。これ←の抗原としては１例えばリンパ球表面抗原
であるＨＬＡ、Ｔ細胞特異抗原、Ｔ細胞の一部に存在す
る抗原、Ｂ細胞特異抗原、単球特異抗原などの存在が知
られている。これらはそれぞれ対応する抗体を用いて認
識できる。

ま友上記抗原ｔ−ｇ識する。抗体としては大まかに分類
すれば自己抗体、同種抗体、ｌｔ４種抗体等を挙げるこ
とができる。この中で異種抗体の一種であるモノクロナ
ール抗体は、特に選択性の高いものとして知られている
。

従来の浮遊性細胞の表面抗原の検出方法としては、螢光
抗体法により細胞をラベルし１表面抗原の有無を螢光顕
微鏡により、もしくはサイトフルオロメトリーと称する
細胞表置にラベルされた螢光量の自動解析法によシ分析
するととによシなされる。

しかし、螢光顕微ｆｉ！は１強い紫外線を放出する光源
をそなえた顕微値であり、このものを暗室中で長時間操
作することは、観測者に多大な疲労金しいることＫなる
。また細胞にあてられる強い光線の為、螢光色：／Ｒに
光分解され、螢光を失い長時間の観察は困難である。

またサイトフルオロメトリーは、細胞を流体に浮遊させ
て細管中を流しながら１個々の細胞の螢光強度を測定し
ヒストグラムとして表示する技術である。この方法は、
迅速正確な細胞表面抗原の測定が可能である、極めて有
用な分析方法であるが、装置が高価格でちゃ、十分に普
及していない。

そこで１本発明者は、安価かつ簡便に浮遊細胞の表面抗
原を検出する方法に鋭意検討を加えた結果、浮遊性細胞
を透明固体上に付着せしめ念後、酵素抗体法により、表
、面抗原に対応する部分で酵素反応を行なわしめること
によシ、浮遊細胞表面抗原に対応する反応生成物を透明
固体層＠よシ検出しうることを見出し１本発明を完成す
るに至った。

すなわち１本発明け、浮遊性細胞を透明かつ平担な底面
を有する容器の内底面に付着せしめ、酵素抗体法を用い
て表面抗原を検出する方法でおる。

浮遊性細胞を透明かつ平担な固体に付着せしめることは
、細胞を平面状にならべることとなり。

固体の裏面から顕微鏡で細胞上の抗原の存在状態を観察
が可能となる。このことは、従来の酵素抗体法によシ測
定しえなかった浮遊性細胞を極めて簡便かつ迅速に測定
することを可能にし、浮遊性細胞の表面抗原の分析法を
一段と進歩せしめた。

本発明を実施する際に用いる透明かつ平担な底面を有す
る容器とは、水溶性固体からなり、浮遊性細胞を付着し
うるものであればいずれでもよい。

容器底の厚みは特に制限はないが、付着せしめた細胞を
顕微鏡にて観察する必要上、１１ｗ以下の厚みが好まし
い。

また少数の浮遊性細胞を効率よくせまい容器底面に付着
させる為には、テラサキグレートと称されるすりばち状
の壁面と直径ｌ■程度の円型かつ平担な底面を有する透
明プラスチック製用具を用いることが好ましい。

ここでいう浮遊性細胞とは、浮遊性のものであればいず
れでも良く、例えば動物を構成する細胞としては、赤勘
球、顆粒球、リンノく球、単球などの血中に存在する細
胞、および、骨髄、胸腺、膵臓などの諸臓器に存在する
〆胞、そして浮遊培養可能な細胞を含む。

浮遊性細胞の容器底面への付着方法は、静置法、遠心法
などいずれの方法を用いても良い。カチオン性ポリマー
をわらかじめ容器底面に付着せしめることは、浮遊性細
胞の接着性カニ為まり好ましい、。

カチオン性ポリマーとしては、中性水溶液中で、カチオ
ンとしてふるまうものであればいずれでも良く、平均分
子量１０，０００以上のもの力玉好ましい。

カチオン性ポリマーの例としては、ボＩＪＬリジン、ポ
リＬヒスチジン、ポリ孔アルギニン、ボ１Ｊアミン、ポ
リエチレンイミン、ポリＮ−アルキルアミノエチルスチ
レン、ポリアミノ糖など力；含マれるが、ポリトリジン
は細胞に強い傷害を与えることなく、付着性を高める効
果を有し１％に好ましい。

Ｓ− 酵素抗体法とけ、抗原に結合する能力を有する抗体と、
光学的に検知可能表反応生成物を生ぜしめる機能を有す
る酵素とを結合せしめることにより抗原周辺で酵素反応
をさせる方法であり、抗原の存在を光学的に検出するこ
とが可能である。

抗体と酵素との結合様式は、共有結合たよるものおよび
分子間の選択的親和性によるものがある。

酵素抗体法を実施するＫあたっては、以下のような方法
のいずれを用いても良い。

ｔ　抗体と酵素を直接共有結合したものを、抗原認識物
として用いる方法 ２　抗原を認識する抗体を抗原認識物として用い。

続いて該抗体を抗原としてｇ＊する抗体と酵素を共有結
合したものを用い順次細胞に反応せしめる方法 λ　抗原を認識する抗体と化合知人を共有結合せしめた
ものを抗原Ｍ織物として用い、かつ化合知人に対して選
択的親和性を有する化合物Ｂと酵素を共有結合したもの
を用い順次細胞に反応せしめる方法 ６− 第１の方法Ｕ具体的には、抗体と酵素とをグルタルアル
デヒドなどの２官能性試薬を用いて結合する方法、カル
ボジイミドなどの縮合性試薬を用いて結合する方法など
がある。

第２の方法としては１例えば第一抗体としてウサギを用
いて作られた抗体、第二の抗体としてウナギの抗体を抗
原として作られたヤギの抗体を用い、このヤギの抗体［
Ｗｌｌを結合せしめることとなる。

いずれの方法も珈々工夫して用いうるが、第２の方法は
検出感＆を高める方法でわシ、第３の方法は、一般に化
合物Ａ−Ｂの組合せとして、ビオチン−アビジン、アル
サエル酸−抗アルクニル酸抗体などの組合せが用いられ
、高感度かつ選択性を高める方法で好ましい。

抗体と＃素との組合せＫは特に制限がない。抗体と酵素
とけいずれも分子量が大きく、またそれぞれで別々の機
能を営むものであ９１組合せ方には影響されにくい。

用いる＃累は、パーオキシダーゼ、アルカリフォメファ
ターゼ、βガ２クトシダーゼ、アスパラギナーゼ等、い
ずれでも良く、光学的に検知可能な反応生成瞼を生ずる
ような基質を選択すれば良い。

本発明に開示される方法は以下の効果を有している。

Ｌ　浮遊性細胞を固体表面に付着せしめることＫより従
来実施しえなかった酵素抗体法による浮遊性細胞の表面
抗原の分析が実施可能となった。

２　浮遊性細胞の表面抗原の分析が、明所で実施可能と
なシ、実験者の疲労を大巾に改善できた。

ユ　酵素抗体法を用いた友めに、螢光抗体法とくらべ１
０倍程度の高ｇ度の分析が可能となった。

笑施例１ 〔ヒト末梢崩す７７球中のＴ細胞比率の測定〕（１）　
　ポリＬリジン付着プレートの調製リンパ球を付着せし
める容儀としてポリスチレン樹脂ｔａ型してなる０穴テ
ラサキプレートを用いた。

テラサキグレートの各穴に４μｆ／ｍの濃度にポリＬリ
ジンを溶解した水溶液をｌμｔずつ分注し風乾せしめた
。

（２）　ヒトリンパ球浮遊液の調製 倫常者末梢血に抗凝固剤としてヘパリンを添加し、リン
酸緩衝化生曹的食塩水（以下ＰＢ８と略す）にて３倍に
希釈した０ 試験管にフィコール・コンレイＩＩ（比重１．０７７）
を３−加え上記の希釈血液ｔｓＩｔｈｇ重層し、４００
ＧＩＯ分の遠心分離を施した０ 遠心終了後中間の白濁層をぬｉｋｍｌＩＮ７ＰＢｓにて
３回洗浄し、ＰＢ８ｒ−浮遊せしめ、１・−個／−０１
１１１１１１度に調整した。

偉）ｍ胞の付着操作 （１）の操作を経たテｙｔキプレートの各穴Ｋ（２）の
操作で得られたリンパ球浮遊液をＳ　ｅｔずつ分注し遠
心操作を施した。

続いて牛胎児血清１μｔを各穴に分注し、１０分開放置
９、ＰＢＳを満たしたビーカーにテラサキプレートをゆ
るやかに沈め、付着しない細胞を落下させ洗浄した。

（４）酵素抗体法による反応操作 ヒトのＴ細胞を認識しうる抗体として、オーツ　ダイア
グノスティック　システムズ社より市販されているヒト
の末梢血Ｔ細胞を認識するマウスの抗体商品名ＯＫ’ｆ
’　−３を用いた。

細胞を付着せしめたテラサキプレートに該抗体溶液を１
μｔずつ分注した。この際空試験として該抗体の代りに
ＰＢＳ　１μｔを入れたものも調整した。

１時間放置後、１０Ｇ−のＰＢＳ入りのビーカー為伽含
用い、該テラサキプレートを１回洗浄し、次いで抗マウ
スＩｒＧ抗体（ウサギにより作られたもの）とパーオキ
シダーゼ結合物のＰＢ８溶液を蛋白量として１μｔずつ
各穴に分注した。

１時間放置後、ＰＢＳにてテラサキグレートを３回洗浄
し、次いで基質液として０．０６！１　％過酸化水素を
含鳴した３、３′−ジアミノベンチジン浴１１（リン酸
緩ｗ１により等法化し、ｐｌｘ　７．９に水素イオン濃
度を調整したもの）を１０１４ｔずつ各穴に分注した。

る）測定結果 ２０分放置後に４００倍の拡大倍率の倒立顕微鏡にて、
着色した陽性細胞比率および空試験による陽性細胞の比
率を算出し、さし引き真の０ＫＴ−３に反応する陽性細
胞の比率を算出したところ、５８−であった。

実施例２ 〔末梢血リンパ球中の細胞表面にイムノグロブリンを有
するＢ細胞比率の測定〕 ポリしリジン付着プレートの調製、およびヒトリンパ球
浮遊液の調製、および細胞の付着操作は実施例１と同一
に行った。

抗ヒトイムノグロブリン抗体（ウサギにより作られたも
の）と大腸菌のアスパラギナーゼ結合物ＯＰＢＳ　１！
液を蛋白量としてｌμｆずつ各穴に分注した。空試験用
として該酵素抗体結合物の代りにＰＢＳを添加したもの
を作成した。

１時間放［１，ＰＢＳにてテラサキプレートを１回洗浄
し、次いで基質液としてＨｍＭ　　のアスパラギンｐｒ
Ａｙニトロアニリドを含むＰＢＳ１０μｔを各穴に添加
した。

２０分放置後、４００倍の拡大倍率の倒立顕微鏡にて、
着色した陽性細胞比率および空試験による・陽性細胞の
比率を満員し、さし引きして、？＃ｆＵ胞表面にイムノ
グロブリンを有する細胞比率を満員したところ、６．２
チであった。

実施例３ 〔ヒト末梢血リンパ球中のＴ細胞比率の測定〕実施例１
と同一の操作を施して作成したポリＬリジン付着プレー
トおよびヒトリンパ球浮遊液を用いリンパ球付着プレー
トを作成した。

酵素抗体法の操作としては、抗ヒトリンパ球抗体０ＫＴ
−３のかわりに０ＫＴ−３にビオチンを共有結合したも
の、および抗マウスＩｆＧ抗体ドパーオキシダーゼの結
合物のかわりにアビジンにパーオキ７ダーゼを結合した
ものを用いた以外は、実施例１と同様の操作を施した。

基質液注入２０分後に４００倍の拡大倍率の倒立順４に
鏡にて、着色した陽性細胞比率および空試験（０ＫＴ−
３にビオチンを結合させたものを龜加しない系）に於け
る陽性細胞の比率をさし引き真の０ＫＴ−３抗体に反応
する陽性細胞の比率を算出したところ、５Ｏｑｋであっ
た。

特許出願人　旭化成工業株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. Ｌ　透明かつ平担な底面を有する容器の内底面に浮遊性
   細胞を付着せしめ、細胞の表面抗原を酵素抗体法を用い
   て検出、する方法