JPS5816682A - セルラ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は担子菌によるセルラーゼの製造法に関する。

従来よシセルラーゼは、繊維質を分解する酵素として食
品工業、飼料、下水処理及び医薬等の分野に於いて広く
利用されている。

そこで本発明者等は、植物繊維質に対し強い酵素活性を
示すセルラーゼを生産する微生物を見い出すべく、広く
自然界よシセルラーゼ生産菌の検索を行なった結果、農
家の稲わら堆肥中よシ分離したコプリナス（Ｃｏｐｒｉ
ｎｕｓ）属−に属する担子菌が′極めて強い酵素活性を
示すセルラーゼを生産することを知シ、本発明を完成し
た。

即ち本発明は、コプリナス属に属し、セルラーゼ生産能
を有する菌株をセルロース含有培地に接種、培養し、培
養物よシセルラーゼを採取することを特徴とするセルラ
ーゼの製造法である。

以下本発明を詳述する。

先ず本発明に使用される菌としてはコブＩＪ　−７ス（
Ｃｏｐｒｉｎｕｓ　）属に属しセルラーゼ生産能を有す
る菌であれば如何なる菌でも良く、またこれらの菌の変
種もしくは変異株でも良い。そしてコプリナス属に属し
セルラーゼ生産能を有する菌の具体例としては、例えば
コプリナス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ＊　ｃｉｎ
ｅｒｅｕｓ　）　ＫＫ−Ｊ１７Ｍ等が挙げられる。

上記コプリナス・シネレウス３７Ｍの菌学的性質は以下
に示す通シである。なお菌学的性質は概ね「Ｔｈｅ　Ｆ
ｕｎｇｉ　■Ｂ　（Ｃｈａｐｔｅｒ　、１３　）　Ｊ　
ＡｌｅｘａｎｄｅｒＨｏＳｍｉｔｈ　（Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　ｐｒｅｓｓ、／　９７３　）および「標準原色図鑑
全集／４Ｌ１菌類」今関六也、本郷次雄、椿啓介共著（
保育社出版、／９７７）に記載の方法に準拠した。

コプリナス・シネレウスＫＫ−３７Ｍの菌学的性質（１
）各培地における生育状態（何れも、２ｊ’Ｃで培養）
■麦芽エキス寒天培地 ７日目で旺盛な生育を示し、集落−の直径は１！；Ｘｊ
ｊｍｍで、白く柔かいふわふわした綿毛状を呈する。／
≠日目ではシャーレ（ｃ５’　ｊ　ｘ　ｒ　３　ｔｍ　
）全面に生育し、中心部は直径！；０ｔｒａｎ程度の円
形で綿毛状の菌糸が盛り土シ、その周辺は極めて短い菌
糸が培地上を覆う。

■バレイショ・ブドウ糖寒天培地 ７日目で極めて旺盛な生育を示し、集落は（５’　３　
Ｘ　Ｊ’　３　ｍｍ　（直径）程度で、白く柔かい極め
て密に集合した綿毛状を呈する。／≠日目では直径（Ｓ
’　３　Ｘ　ｒ　ｊ　ｍｍで、厚さが２〜３霧、白色洋
毛状の菌糸が密生し、集落の周縁部に褐色の０．　／　
ｍｍ程度の菌核を形成する。

■ツアペック寒天培地 ７日目の生育は不良で、希薄な菌糸が？３×ｒ３ｔｕｎ
程度まで広がってはいるが、集落の形成は認められない
。１ｌｌ−日目でも菌糸の生育にはほとんど変化は見ら
れ々いが、シャーレの全面に褐色で０．　／　ｍｍ程度
の菌核をまばらに形成する。

■サブロー寒天培地 ７日目では小程度の生育を示し、集落は≠ｊ×≠！瓢程
度で、白く柔かい長毛の菌糸がやや粗く集合した集落を
形成する。１Ｉｌ−日目では中程度の生育（７！ｒ×７
３；ｔｐｍ）を示し、菌糸は白色でやや長く、中央部が
盛シ上シ、全体として花びらを重ねた状態となシ、裏面
は黄色を呈する。

■Ｙｐ８ｓ寒天培地 ７日目で極めて旺盛な生育を示し、集落はｒ３×ｒ３■
程度で白く柔かい綿毛状を呈し、培地中に褐色の０．　
／　ｍ程度の菌核を多数形成する。

／≠日目ではシャーレの全面（Ｊ’　Ｊ’　Ｘ　（５’
　ｊ　ｍｍ　）に生育し、菌糸は灰白色の綿毛状を呈し
、菌核は全面に形成し、裏面は褐色を呈し、集落の表面
に子実体形成の為の白色の原基をｌθ個程度形成する。

（２）生理的性質 ■最適生育条件 ｐＨ；乙、ｏ−ｇ。

温度；２ｊ−≠θ℃ ■生育の範囲 ｐＨ；４４ｊ〜１０．ｊ 温度；２０−４’Ｊ”Ｃ 次に上記した菌学的性質を有するコプリナス・シネレウ
スＫＫ−３７Ｍの分類学上の位置について「Ｔｈｅ　Ｆ
ｕｎｇｉ　■Ｂ（Ｃｈａｐｔｅｒ２Ｊ）Ａｌｅｘａｎｄ
ｅｒＨ。

Ｓｍ１ｔｈ　（Ａｃａａｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ、　／　
９７３　）および「標準原色図鑑全集／≠、菌類」今関
六也、本郷次雄、椿啓介共著（保育社出版、／９７７）
の分類と対比検討した結果、本菌株は菌糸の隔膜部にカ
スガイ状突起を有し、ＹｐＳ　ｓ培地上に形成された子
実体は、幼時には長卵形で、極めて脱落し易い白色の毛
で被われ、ヒダは茎に離生じ刃状を呈すること、胞子は
成熟すると傘が一夜のうちに液化して線条に沿い裂片状
と々ること、更に胞子紋は黒紫褐色で傘には大形の側シ
スチジアを有することよシ、コプリナス属に属する菌株
であると判定される。

更に本菌株の子実体の茎は、絹糸状の細鱗片に被われ、
茎の根本はや＼ふくれ、上方に向ってやや細まっている
こと、更に−っの担子器に≠個の胞子を付け、該胞子は
楕円形（乙〜７×９〜／／μ）で発芽孔を有することか
らコプリナス・シネレウスと判定される。

そして上記傘は幼時に於いてクリーム色から除徐に濃い
紫色になり、成熟すると黒紫色になること、更に生育最
適温度は３７〜≠θ℃で、特に３７℃付近で子実体の形
成が旺盛となることよシ、本菌株はコプリナス・シネレ
ウスの新菌株であると同定し、本菌株をコプリナス・シ
ネレウスＫＫ−３７Ｍと命名した。

なお上記コプリナス・シネレウスＫＫ−３７Ｍは工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第乙θ７．２号
（ＦＫＲＭＰ−４０７２）として寄託されている。

次に、本発明に於けるセルラーゼ生産に使用される培地
としては、例えば濾紙、アビセル、脱脂綿、オガクズ、
おから、稲わら、醤油粕、コーヒー粕、落下生殻等のセ
ルロースを含有させることが必須で、これに必要により
殿粉等の多糖類、単糖類および少糖類、窒素源としてペ
プトン、肉エキス、コーンステイープリカー、酵母、ア
ンモニウム塩類、尿素等の有機もしくは無機の窒素化合
物、その他リン酸塩、マグネシウム塩、鉄塩等の無機塩
類、ビタミン類、生長促進物質等を適宜添加した培地が
用いられる。また培養培地としては、液体培地、固体培
地の何れでも良く、培養ｐＨは通常、３′、５以上、好
ましくは６〜９の範囲である。そして培養温度は、２！
〜４ｔ０℃、好ましくは３０〜３７℃付近であシ、また
培養期間としては通常λ〜ＩＯ日間程度である。

培養終了後、固体培養の場合は該培養物を常法により水
もしくは緩衝液等で抽出し、液体培養の場合は該培養液
を常法によシ濾過もしくは遠心分離し粗酵素液を得る。

上述の操作によシ得られる本酵素（粗酵素液）の理化学
的性質を示すと、以下の過多である。

（１）作用および基質特異性 濾紙、アビセル、ＣＭＣ−Ｎａ　、脱脂綿、オガクズ、
おから、稲わら、醤油粕、もみ殻、ピーナツ殻、コーヒ
ー粕等に作用し・、還元糖を生成させる。

（２）￥適ｐＨおよび安定ｐＨ 本酵素の至適ｐＨは第１図に示す如く、ｐＩ（Ａ、θ（
３０℃）でアわ、安定ｐＨの範囲は第２図の如くｐＨＱ
〜９（３０℃、２≠時間処理）である。

なおｐＨｊ〜？の範囲では、５０℃で≠時間加熱処理を
行っても３０％以上の活性が残存した。

（３）力価の測定法 セルラーゼ活性の測定は、濾紙を基質として生成する還
元糖の増加量を測定する方法を用いた（Ｍ。

Ｍａｎａｅｌｓ　＆　Ｄ、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ　、　Ｊ
、Ｆｅｒｍｅｎｔ、Ｔｅｃｈｎｏｌ、。

ｊ≠、２ｔ７．／９７６）。

即ち濾紙（ワットマンＪｆ６．／）！ｉ−０■を基質と
して、これに酵素液０．　ｊ　ｍ／とクエン酸緩衝液（
ｐＨｔ、θｙ　Ｏ−／　Ｍ）　／　ｍＡ’を加え！−０
℃で１０分間酵素反応を行なった後、ジニトロサリチル
酸試薬３ｍｌを加え、沸騰浴中で！分間加熱して発色さ
せる。

これに水／１ｍｌを加えｓｓｏｎｍに於ける吸光度を測
定し、グルコース量として表わしだ。

酵素単位は、ｊθ℃／時間の反応で／μＶのグルコース
に相当する還元力を生成する酵素活性を／単位とした。

（４）作用適温の範囲 本酵素の作用適温の範囲は、第３図の如く４Ｌ！〜ｊｊ
℃（ｐＨＡ、Ｑ）である。

＋５）ｐＨ，温度などによる失活の条件はぼ！Ｏ 第≠図の如く、ｐＨＡ、θの条件下で＃＃Ｉｓ＃匁℃ま
で安定である。

（６）阻害および活性化 本酵素は水銀、銀等の重金属により阻害を受け、マンガ
ン、コバルト、バリウム等により活性化される。

（７）精製方法 本酵素の精製方法は、本菌の培養液を遠心分離して得ら
れた濾液（粗酵素液）を、Ｑ、Ｏｊ；　Ｍ　ＮａｘＨＰ
Ｏダ（クエン酸でｐＨ１，０に調整）溶液で充分に平衡
化したＤＥＡＥ−セファデックス（スエーデン、ファル
マシア社製）に吸着させる。次いで前記緩衝液で充分に
洗った後、０．．３−Ｍ食塩を含む前記緩衝液で溶出す
る。溶出液を限外濾過膜ＵＭ−ＩＯＣ米国、アミコン社
製）を用いて脱塩、濃縮し、この濃縮液を前記緩衝液で
平衡化したセファデックスＧ＝／３０（スエーデン、フ
ァルマシア？１ＩＪ）でゲル濾過を行い精製する。

（８）分子量 本酵素はＣ７−酵素、Ｃｘ−酵素、β−グルコシダーゼ
等の酵素群よシなシ、分子量は平均／ψθθ〜１０ｏＪ
０００である。

本発明により得られるセルラーゼは、その安定ｐＨ範囲
がｔｌ−〜９と極めて広く、殊にｐＨＪ’付近に於いて
も強い酵素活性を有する為、例えば消化薬等の医薬品工
業、その他食品工業等に広く使用され、本発明は工業的
に極めて有意義である。

以下実施例によυ本発明を具体的に示す。

実施例 アビセル；・１％−（Ｗ／Ｖ　）、（ＮＨＩ’　）Ｊ　
５Ｏ４ｔＨＱ、／’ｌ−％（Ｗ／Ｖ　’）、ＫＨＪＰＯ
Ｉ　；０．２θ％（Ｗ／Ｖ）、尿素；　０．０３　％　
（、Ｗ／Ｖ　）、ＣａＣ１ｚ　＋　０．０３％　（Ｗ／
Ｖ）、Ｍｇ５Ｏ４ｔ・７ＨコＯ：０．０３％（Ｗ／Ｖ　
）、ペプトン；％　（Ｗ／Ｖ　）、Ｍｎ８０ｐ　響ＨＪ
Ｏ；０．００θ＃％（Ｗ／Ｖ）、ＺｎＳ０ｇ　−７Ｈ：
ｌＯ；　Ｑ、（７θθ／１％　ＣＷ／Ｖ　）及びＣｏＣ
１ｘ；　ｏ、ｏｏｏ、２チ（Ｗ／■）を含有する液体培
地ｊＯｍｌを３００ｍ１容ヒダ付きフラスコに投入し、
常法によシ加熱殺菌後、これにｊ　％　ＮａａＣＯ３溶
液２．θ−を加え培地のｐＨをｒ！に調整したものに、
コプリナス・シネレウスＫＫ−３７Ｍ（微工研菌寄第乙
θ７２号、ＦＩＲＭ　Ｐ−乙０７２）の菌糸を接種し、
３０℃で３日間ロータリシェーカーで種培養して得られ
る培養液の全量（４ＡＯｒｒｔｌ）を、上記組成の液体
培地／ｌと共に２１容三角フラスコに投入し、次いで該
培地のｐＨを！％Ｎａ、２ＣＯ３溶液でｐＨ１３に調整
した後、３０℃で７日間ロータリシェーカーで培養を行
なった。

培養終了液を常法によシ遠心分離して得られた濾液♂０
０ｍ１に冷アルコールを２’１００ｍ１を加えて／昼夜
放置後、沈澱する区分を補集し、次いで常法により減圧
下で乾燥し本粗酵素粉末ｊｔを得た。

該粗酵素の酵素活性は／、　ＩＩ　ｘ　／θ′Ｕ、／グ
であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素の至適ｐＨ，第２図は安定、ｐＨ範囲、
第３図は作用適温の範囲、第≠図は温度による失活の条
件（ｐＨ，θ）を夫々示す。 特許出願人　　キッコーマン株式会社 オ　Ｉｌ！ｌ ｉ λ　２１！１ オ　３　口 オ今回

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. コプリナス属に属し、セルラーゼ生産能を有する菌株を
   セルロース含有培地に接種、培養し、培養物よシセルラ
   ーゼを採取することを特徴とするセルラーゼの製造法。