JPH1172711A - 平面波照明を備えた顕微鏡検査装置及び検査方法 - Google Patents

平面波照明を備えた顕微鏡検査装置及び検査方法

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JPH1172711A
JPH1172711A JP10196304A JP19630498A JPH1172711A JP H1172711 A JPH1172711 A JP H1172711A JP 10196304 A JP10196304 A JP 10196304A JP 19630498 A JP19630498 A JP 19630498A JP H1172711 A JPH1172711 A JP H1172711A
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Donald J Dr Harter
ジェー ハーター ドナルド
Squier Jeffrey
スケアー ジェフェリー
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IMRA America Inc
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Abstract

(57)【要約】 【課題】試片の３次元像を作るための２光子蛍光顕微鏡
検査を実現する。 【解決手段】この２光子蛍光顕微鏡は、パルスが空間的
かつ時間的に重なるときに蛍光体の２光子放射を起こす
２本のパルスレーザビームを使用する。パルスがお互い
の中を通過すると、重なるライン状領域が移動し、蛍光
体を有する試片の１切片が重なる周期での２光子吸収で
励起される。２本のビーム中のパルスの相対的な遅延を
調節することで、部品を動かすことなく横方向の走査が
行われる。２本のビームが同じ軸方向に向かうとき、２
本のビームのパルスは反対方向に進む間に空間的かつ時
間的に重なり、２光子励起が起こるホットケーキ状領域
を作る。２次元検出器が使用され、２パルス間の時間遅
れを調節すると”ホットケーキ”領域の位置が変化する
ので、３次元像は時間遅れを調節することで作られる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、試片の３次元像を作る
ための２光子蛍光顕微鏡検査を実現する方法と装置に関
する。
【０００２】
【従来の技術】レーザ蛍光共焦点顕微鏡検査は３次元像
を作るための有効な技術である。これらの３次元像は、
共焦点顕微鏡が有する焦平面外の蛍光を区別して優れた
深度分解能を与える機能によって作られる。その区別
は、検出器の前にピンホールを設置することによって達
成される。代わりとして、深度分解能を与えるために２
光子吸収が使われる。
【０００３】２光子顕微鏡検査技術は、Ｄｅｎｋ等によ
って次の論文に紹介された。"Two-Photon Laser Scanni
ng Fluorescence Microscopy", Science,Vol.248,pp73-
76(April,1990).この方法を従来からのレーザ蛍光顕微
鏡検査に使用する動機は多様である。意図した利点に
は、生物系にダメージを与えないこと、より簡単に操作
できる長波長帯を使用すること、それに相対的に近くに
閉じ込められたいわゆる篭に入れられた化合物を解放す
る機能を有すること、が含まれる。
【０００４】従来からのレーザ蛍光顕微鏡検査が励起に
１個の光子λ1しか必要としないのに対し、２光子顕微
鏡検査は（全くその名称で暗示されるように）励起に２
光子λ2＋λ3の同時吸収を必要とするという事実から、
前記利点が生起される。エネルギで表すと、ｈｃ／λ1
〜ｈｃ（１／λ2＋１／λ3）である。このように、λ2
とλ3は共にλ1より長波長である。しかしながら、λ2
とλ3が等しい必要のないことに注意することが重要で
ある。事実、蛍光体の励起に必要な純エネルギ量が満足
される限り、任意の波長の組合せを使用することができ
る。また、この前提を３あるいはそれ以上の波長の同時
吸収を含むことに拡張できる点に注意すべきである。こ
れら全ての高次の多光子過程は、高次の強度依存吸収に
帰着する。
【０００５】１光子蛍光顕微鏡の例を図１に示す。波長
λ1の光が光源１０から出て、ダイクロイックミラー１
２と結像レンズ１４を通り、像面１８に沿う試片１６に
照射される。入射光は試片１６に含まれている蛍光体を
励起し、蛍光体が入射光の平均パワーに比例する異なる
波長の光を放射するようにする。試片１６中の蛍光体か
ら放射される後方散乱光は、ダイクロイックミラー１２
で検出器２０の方に反射される。これと同じ技術を透過
型配置にも同じように適用することができる。１光子の
場合、蛍光体から放射される光束は励起光強度に比例し
て強くなる。したがって、通常の共焦点配置では集光領
域全体を通してかなりの蛍光がある。一方、図１に示す
ように、焦平面外の蛍光を阻止するために、すなわち像
を作るために、ピンホール２２が共役像面に配置されて
いる。
【０００６】米国特許５，０３４，６１３にＤｅｎｋ等
が開示したように、２光子結像系は、レーザ走査顕微
鏡、固有の長波長（赤あるいは赤外）光を放射する試料
中の色素としての蛍光体、固有の波長のサブピコ秒レー
ザ光源、蛍光体からの放射光を検出する検出器、それ
に、コンピュータによる信号処理、からなる。２光子吸
収の場合、蛍光信号は励起光強度の２乗に比例して増大
する。この強度依存性の結果、焦点（集光領域全体に対
立するものとしての）でだけでかなりの蛍光が発生す
る。したがって、事実、像は１光子レーザ顕微鏡検査で
必要な阻止用ピンホールなしで得られる。
【０００７】２光子吸収を応用する場合、２乗強度依存
性は、レーザ光源が連続モードよりパルスモードで動作
することを要求する。基本的なことは、試料に総エネル
ギが低くピークパワの高いパルス光を与えることであ
る。レーザ強度（すなわち、Ｗ／ｃｍ２）は、２光子吸
収が許容速度で進行するのに十分な大きさでなければな
らない。短パルスを使用することによって、十分なＳＮ
比に必要な強度を達成することができる。しかしなが
ら、あるエネルギレベルを超えると、パルスはフォトブ
リーチング（光退色）を起こし、あるいは試片を損傷し
たりすることがある。したがって、高ピークパワで低エ
ネルギの超短パルスを供給する必要がある。このよう
に、レーザの繰り返し周波数は、連続光励起条件と比べ
十分に低く抑えられる。励起用の低く抑えられたレーザ
照射は、試片に対して有益である。ピコ秒とフェムト秒
レーザが２光子蛍光信号を発生させるために使用され
る。その信号は強度の２乗に比例して増大するので、ほ
とんどのシステムが非常に短いフェムト秒パルスから恩
恵を受けており、現在、これらの光源は必須になりつつ
ある。Ｔｉ：Ａｌ2Ｏ3やファイバレーザのような信頼性
の高い固体フェムト秒システムの出現は、この点でも役
立つ。
【０００８】超短パルスを２光子顕微鏡に供給するため
に、幾つかの異なる光源が使われてきた。たとえば、高
ピークパワーパルスが、Ｔｉ：サファイアとＣｒ：Ｌｉ
ＳＡＦとファイバ源を使って”自由空間”に供給されて
いる。Ｓｔｏｃｋ、等の米国出願Ｎｏ．０８／７６３，
３８１に開示されているように、顕微鏡内の光部品の分
散を補償することができる光ファイバ供給システムを、
高ピークパワーパルスの供給に使用することができる。
【０００９】Ｄｅｎｋ、等の上述の特許とＢｒａｋｅｎ
ｈｏｆｆ、等の次の論文"Real-time two-photon confoc
al microscopy using a femtosecond, amplifiedTi:sap
phire system", Journal of Microscopy, Vol.181, pp2
53-259(1996)に報告されているように、ポイント励起条
件とスリット励起条件の両方を使って２光子像を得るの
に、フェムト秒パルスがうまく使われている。２次元視
野を作るのに、ポイント走査ではビームをｘとｙの両方
に移動する必要があるのに対し、スリット走査ではｘ方
向に移動するだけでよい。したがって、より高速の走査
はスリット励起条件で可能になる。どちらの励起（ポイ
ントあるいはスリット）モードでも、試片の深さの関数
としてのたくさんの２次元データセットを測定すること
によって、３次元像が作られる。完全な３次元像を得る
ために、これらのデータセットは後でコンピュータ中で
再構築される。
【００１０】レーザビームと試片の走査あるいは偏向に
は幾つかの異なる方法がある。音響光学偏向は、励起パ
ルス幅を増大させ、分散のために２光子強度をかなり低
下させるので、２光子像システムには使われない。検流
計の走査器に取り付けられたミラーは、図２に示すよう
に、分散が無視でき、パルス幅を保存するので、好まし
いビーム走査法である。２次元視野を実測するために
は、十分な次数の自由度が得られるように、幾つかの走
査器を使用する必要がある。
【００１１】図２に示す例で、回転ミラー２４と２６
は、入射レーザビームを焦平面内でｘとｙ方向に走査す
るために回転する。試料２８を光軸に沿って顕微鏡対物
レンズ３０に対して動かすことによって、焦平面が変化
し、３次元像が作られる。試料２８を透過してくる蛍光
体からの放射を検出するために、光電子増倍管が使用さ
れる。蛍光検出に２次元電荷結合素子（ＣＣＤ）アレイ
を使用する（光電子増倍管に対立するものとして）なら
ば、像を作るために試料からの蛍光が走査されないよう
にする必要がある（すなわち、蛍光が走査光学系を素通
りして入射ビームと反対方向に進むようにしなければな
らない）。このことは、システムの光学設計をより一層
複雑にする。多数の走査系を使う別の問題は、走査速度
の不均一である。これは結果として横方向の像質の違い
を起こす。この問題は、多分、走査速度の増大と共に増
大する。
【００１２】多数の生物学的疑問は、実時間で３次元像
を作る機能を使って解明される。最近のデータ取得と再
生の方法は、３次元領域全体を検査する速度を制限して
いる。速度を制限する因子には次のものが含まれる。す
なわち、被検試片体の中をポイントあるいはライン励起
源で走査するのに必要な時間、与えられた軸方向深さで
の各２次元視野のデータ取得、このデータのある種の蓄
積媒体への転送、最後に、試片の３次元プロファイルを
構築するための２次元視野の操作、が含まれる。次に考
慮すべき問題は、これまでの２光子走査システムにおけ
る保存しなければならない情報の総数である。作られる
全ての３次元像の場合、巨大な数のデータセットが発生
する。
【００１３】
【本発明が解決しようとする課題】本発明の一つの目的
は、レーザビームの入射角の偏向なしで試片の２次元断
面像を作るための２光子蛍光顕微鏡検査を提供すること
である。本発明の別の目的は、２光子蛍光顕微鏡におけ
る、レーザビームの横方向走査に必要な部品移動を取り
除くことである。本発明の別の目的は、２光子蛍光顕微
鏡におけるレーザビームの横方向走査を正確に調節する
ことである。
【００１４】本発明のさらに別の目的は、レーザビーム
の横方向走査なしで２次元像を作ることである。本発明
のさらに別の目的は、部品移動なしの２光子蛍光顕微鏡
で、３次元像を作ることである。本発明のさらに別の目
的は、実時間で３次元像を作ることと、３次元像を作る
ために必要なデータ蓄積量を減らすことである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】上の目的を達成するため
に、本発明の２光子蛍光顕微鏡は、波長がλ2、λ3の２
つのパルスレーザビームを備えており、この２つのパル
スが空間的かつ時間的に重なったとき蛍光体の２光子放
射を引き起こす。一つの実施例によれば、２つのビーム
のパルスが同じ軸に沿って、時間的には分離して試片に
照射される。λ2の光を反射する反射体は、反射された
波長λ2のパルスが試片内で波長λ3のパルスと空間的か
つ時間的に重なるように配置される。ビームは互いに平
面波であるので、それらはホットケーキ状領域を形成
し、その領域内で２光子励起が起こる。横方向の走査な
しで一度に試片の２次元部分を検出するために、２次元
電荷結合素子（ＣＣＤ）アレイのような２次元検出器が
使われる。３次元像は、２つのパルスの交差で作られ
る”ホットケーキ”領域の位置を変化させることによっ
て作られる。”ホットケーキ”の位置は、試片をビーム
の軸方向に動かすか、２つのパルス間の相対的な時間遅
れを調節することによって、変化させられる。後者のや
り方は、部品移動なしで３次元像を作ることを可能にす
る。
【００１６】本発明の別の実施例によれば、波長λ2と
λ3の２つのビームが試片の中である交差角θで結合す
る。そうすると、試片のライン状領域内で２つのビーム
が重なる瞬間２光子吸収が起きる。ライン状領域の厚さ
は、交差角θとパルスの長さで決められる。パルスは互
いに透過するので、重なるライン状領域は移動し、蛍光
体を含む試片のスライスが、重なる周期の間の２光子吸
収で励起される。横方向の走査が、２つのビームのパル
スの相対的な遅れを調節することで、部品の移動なしに
達成される。
【００１７】各々の重なるビーム対は、試片の一つの領
域が２次元視野として検出される光を放射するようにす
る。したがって、３次元領域が高速に走査、検出され、
３次元像を実時間で見たり、表示したりすることができ
るようになる。さらに、本発明のビーム重ね原理を使っ
て３次元表示素子を作ることができる。特に、反対方向
に進む波長λ2とλ3のパルスが表示材料中のホットケー
キ状領域の中で空間的かつ時間的に重なるとき、適当に
添加された表示材料の”ホットケーキ”状領域が励起さ
れる。空間光変調器を一方のビームあるいは両方のビー
ムの通路に挿入することによって、個々のボクセル（３
次元等価ピクセル）がアドレス可能になる。このよう
に、２つのパルス間の相対的な時間遅れを調節して、次
々とやってくるパルスが材料中の異なる点で重なるよう
にすることで、３次元領域が励起される。同じ原理は、
材料の３次元領域中に情報を読み込んだり書き込んだり
するのに応用される。
【００１８】
【実施例】ここに記載した本発明は、超短パルスと２光
子像形成を有する実時間３次元像形成に関する問題を解
決する。本発明の原理を理解するために、最初に直径１
００μｍ〜１０ｍｍの平行ビーム化されたフェムト秒レ
ーザを考える。次に、パルス幅が１００フェムト秒（１
００×１０-15ｓｅｃ）で、光速ｃが３×１０8ｍ／ｓｅ
ｃ．が与えれた場合、パルスは物理的な範囲３×１０8
×１００×１０-15＝３０マイクロメータ（μｍ）に限
定されるという事実を考える。そうすると、パルスは空
気中を伝搬する”ホットケーキ”のように見えるように
なる。パルスは直径が１００μｍ〜１０ｍｍで、厚さは
非常に薄く僅か３０μｍである。パルス幅が短くなれば
なるほど、”ホットケーキ”は薄くなる。この超短パル
スの”ホットケーキ”を使う本発明によって、実時間３
次元顕微鏡検査が可能になる。
【００１９】
【実施例１】図３は本発明の第１実施例に関する２光子
顕微鏡を示している。光源３７で作られた平行ビーム３
６が被験試片３８に垂直入射する。その平行ビームには
所定の遅延時間δｔ離れた波長がλ2、λ3の２つのパル
ス（４０、４２）が含まれている。これらのパルスを含
むこの平行ビーム３６は、照明光源の働きをする。試片
はλ2とλ3の２光子の同時吸収でのみ励起される適当な
蛍光体でラベリングされている。したがって、２つのパ
ルスが同時に起きない、すなわちδｔがゼロに等しくな
い限り蛍光体は励起されないで残り、放射がなく、像が
見えない。
【００２０】図３に示すように、試料３８の入射ビーム
３６と反対側には窓４４が配設され、その窓４４には波
長λ2の光を反射し、それ以外の全ての波長の光を透過
するように膜が付けてある。波長λ2のパルス４０が試
料に最初に入射するので、このパルスは窓４４で反射さ
れ、試料３８の中を逆方向に進み、波長λ3のパルスと
交差する。この交差時、”ホットケーキ”領域は蛍光体
の励起条件を満たすようになる。試片のどの部分も蛍光
体でラベリングされており、このホットケーキ領域に存
在する蛍光体が２光子蛍光を放射し、反射と透過のどち
らでも可視化できる像面４６を作る。このシステムの深
さ分解能は、パルスが制限される空間的な範囲、すなわ
ち”ホットケーキ”の”厚さ”で決まる。さらに重要な
ことには、一つの走査構成要素もなしに、あるいは蛍光
の走査なしに完全な２次元視野が作られる。したがっ
て、本発明では不均一な走査速度が横方向の像質に影響
するという心配がない。２次元視野を作るためにポイン
ト走査もライン走査も不要なので、この像が作られる時
間は本質的に短い。視野は結像レンズ４８を透過し、顕
微鏡を通りＣＣＤアレイあるいはそれと等価な２次元検
出器５０で記録される。
【００２１】像の３番目の次元は、試片３８を顕微鏡の
軸に沿って前後に走査するか、４０と４２のパルス間の
遅延時間δｔを変えることによって作られる。試片３８
をビデオレートの２〜３倍の早さで動かすことで、完全
な３次元２光子像を実時間で直接見ることができるよう
になるし、あるいはビデオシステムで間接的に見ること
ができるようになる。パルス間の遅延時間を高速に変化
させることができると、同じことが正しく行われるよう
になる。この２番目の方法は、顕微鏡が動く部品をもた
ないので、特に魅力的である。試片は静止したままで、
レーザビームを空間的に走査したり、あるいは蛍光を走
査する走査器が不要である。
【００２２】本発明の別の特徴は、３次元像が２次元視
野として記録されるということである。すなわち、蛍光
を検出器の前のスリットを使って共焦点で検出する必要
がないので、検出される蛍光は狭い焦平面に限定されな
い。むしろ、励起領域内のｚ軸（すなわち、検出器の光
軸）に沿う異なる点からの蛍光を含む励起された”ホッ
トケーキ”領域全体の蛍光が検出される。したがって、
適当な開口数の結像レンズを使うことで、たとえばＣＣ
Ｄアレイによる（ｚ軸に垂直なｘ，ｙ方向の）２次元視
野内の蛍光検出からｚ方向の深さを知ることができる。
このように、３次元像が２次元視野として記録されるの
で、３次元領域を表すのに必要な検出数が減少する。こ
の自動的な像圧縮は、蓄積データ量を劇的に減らし、し
たがって、生物試片が観察される所定の像蓄積スペース
の範囲を増やす。Ｃｈｅｎ、等によって、ここに参考文
献として上げられた"The Collection, Processing, and
Display of Digital Three-Dimensional Images of Bi
ological Specimens", Handbook of Biological Confor
cal Microscopy, Chapter13, Second Edition, Plenum
Press(1995)に開示されているように、この場合の深さ
分解能は、像捕捉後の処理を通して高められる。深さ分
解能は、システムの開口数を減らすことでも高められ
る。
【００２３】さらに、波長λ2とλ3が同じでない場合、
バックグランドの影響を受けない結像が可能である。こ
の方法の可能性に関する重要な疑問は、２つの異なる波
長の光子の相対的な断面積が１つの波長（に縮退した場
合）の断面積と同じであるかどうかである。これは実験
的に検証された。周波数を２倍にしたファイバーレーザ
が混合色素（ＡＰＳＳ）に集光され、２光子蛍光が測定
された。この色素に必要な縮退したあるいは１色の２光
子励起波長は、７７７ｎｍである。周波数を２倍にした
ファイバーシステムの出力は、７７７ｎｍに合致するよ
うに調節される。さらに、光パラメトリック発振を使っ
て、同じレーザシステムから１１６５ｎｍの発振とこの
周波数を２倍にすることによる５８３ｎｍの発振を得
た。これらの波長は １／５８３＋１／１１６５＝１／７７７＋１／７７７ のように決められた。この方法では、２色（λ2＝５８
３ｎｍ、λ3＝１１６５ｎｍ）の場合と縮退した場合
（２λ1＝７７７ｎｍ）で、同じ断面積が励起された。
蛍光速度Ｗは、１色の２光子過程の場合、 Ｗ〜σ（Ｉ1）２ であり、２色過程の場合は Ｗ〜σ（Ｉ2Ｉ3） である。ここで、Ｉは強度である。これらの過程は実験
の誤差範囲内で等しいと考えられた。なぜなら、Ｉ1２
＝Ｉ2Ｉ3の場合、蛍光速度は同じであり、事実、１色と
２色の２光子断面積が同じであることが検証されている
からである。
【００２４】図３に示す第１実施例では、波長λ2とλ3
の２つのパルスが一方向から一本のビームとなって試片
に入射するのに対して、図６に示すように、パルスを互
いに反対側から入射するようにしてもよい。こうするこ
とで、反射窓４４を省略することができる。
【００２５】
【実施例２】図４に示す本発明の第２実施例にしたがっ
て、それぞれ波長がλ2とλ3の２本の平行パルスレーザ
ビーム５２と５４が交差角θで結合する。図４に示すよ
うに、各ビームのパルスを表す２つの”ホットケーキ”
５６と５８が２本のビームの交差部で衝突する。これら
２つのパルスの交差は、ラインに見えるようになる。こ
の交差部に適当にラベリングされた試片６０があれば、
各ビームからのパルスが空間的かつ時間的に一致し、２
光子信号を発生する。２光子信号は２つの”ホットケー
キ”５６と５８が交差する領域内でのみ発生する。した
がって、結像レンズ６４を通してθを２分する方向から
システムを見下ろす２次元検出器６２は、ラインを見る
ことになる。このラインの幅はパルス幅と交差角θで決
まる。
【００２６】交差角の両極端は簡単に示される。θ＝０
の場合、完全な２次元視野が広がり、平面波すなわち、
第１実施例に示された幾何学配置になる。したがって、
第１実施例の平面波を作るシステムは、第２実施例でθ
＝０とした特別のケースである。９０度あるいはそれ以
下の交差角の場合、平面よりむしろラインができる。ラ
インの幅は角度が減少すると増加し、θ＝０で平面波に
なる。
【００２７】次のことを理解することが重要である。す
なわち、ビーム５２と５４に沿って発生する信号が互い
に無関係であるのに対し、交差領域からの２光子信号強
度は、同時に存在する両ビームのパルス５６と５８の存
在に依存し、２色あるいは１色が２光子信号発生に使わ
れる、ということを理解することが重要である。はじめ
に、２色が使われる（すなわち、波長λ2とλ3が異な
る）場合を考える。この場合は、一方のビームが遮られ
ると、２光子信号が発生しない。同様に、一方のビーム
が遅れて２本のビームが交差領域に同時に到達しない
と、２光子信号は最早発生しない。これが背景光の影響
を受けない動作モードである。
【００２８】１色（波長λ2とλ3が同じ）で、２光子過
程の場合、パルス５６と５８が試片６０の中で交差する
かどうかにかかわらず、２光子蛍光の背景光が発生す
る。ビーム５２と５４のどちらかが遮られても、残りの
ビームが２光子蛍光の背景光を発生する。同様に、遅れ
を調節してパルスが交差領域内で出会わないようにして
も、まだ、各ビームは２光子蛍光の背景光を発生する。
適当なタイミングで交差信号が発生し、背景光に重畳す
る。ピーク対背景光であるＳＮ比は、おおよそ４：１で
ある。一方のビームをチョッピングし、像減算技術を使
うことが、ＳＮ比を大幅に改善し、２色、２光子の場合
に似た背景光の影響を受けない動作を作り出す。
【００２９】Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆ、等によって上述の
文献中に開示されているように、従来の２光子共焦点シ
ステムでは、ライン状の滑子で試片を走査することで実
時間像が作られていた。このライン状の滑子は、単一の
レーザビーム（とパルス）を空間的に操作するものであ
る。本発明の第２実施例によれば、２つのパルスを使
い、２本のレーザビームが交差することで、ライン状滑
子が作られる。ラインは各ビームのそれぞれの短いパル
ス幅で決まる。したがって、”時間的”滑子が作られ
る。従来法に比べ、滑子を作るためのビームの空間的調
整が不要である。従来の空間的滑子と比べた本発明の時
間的滑子のすばらしい別の特徴は、時間的滑子が走査さ
れるということである。時間的滑子は、一方のレーザパ
ルスを他方のビームより遅延させることによって走査さ
れる。対照的に、どんなタイプの時間的遅延をしても従
来の走査される空間的滑子にはならず、ビームは時間的
遅延以外の方法で物理的に偏向されなければならない。
【００３０】完全な３次元２光子像を作ることができる
この方法は、これまでに確立された方法と比べても独特
である。θ＝０の場合、第１実施例で説明したように、
試片を顕微鏡の軸方向において前後に走査するか、パル
ス間の遅延を変えることで、３次元像を作ることができ
る。θ＞０の場合は、同じ効果を出すために、一方のビ
ームのパルスが他方のビームに関して連続的に遅延され
る。図４に示すように、相対的な遅延時間δｔが２つの
パルスの間で変えられるので、ラインが試片を横方向に
掃引する。各遅延毎に、試片の軸方向の切片が可視化さ
れる。この切片はθ＝０の場合の”ホットケーキ”と９
０度の角度をなし、図４の点線で示す光軸とは平行であ
る。連続する一連の遅延の場合、完全な３次元領域が掃
引される。
【００３１】図５は、第２実施例の代替配置を示してお
り、ここでは波長がλ2とλ3の２本の平行レーザパルス
ビーム６６、６８が交差角θで結合される。交差角θ
は、検出器６２の光軸と直交する軸と関係がある。この
場合、交差するパルス７０と７２の各対で作られる”切
片”は、検出器６２の光軸と直角をなし、ビームが角θ
で向かい合って並ぶ軸と平行である。２つのパルス７０
と７２の間の相対的な遅延δｔが変化すると、ライン状
の滑子が検出器の光軸に沿って試片を掃引する。
【００３２】ある応用の場合、光切断モードで動作する
ことが要求される。これは各遅延毎の２次元視野を分け
て記録することを意味する。３次元像は、伝統的な共焦
点顕微鏡検査のように、２次元データセットを使ってた
だちに作られる。しかしながら、本発明は次のような顕
著な特徴を有している。すなわち、本発明では各遅延毎
に、所定軸方向深さでの完全な２次元視野が、以前の技
術体系で最近作られたように、レーザビームあるいは蛍
光を走査することなしに瞬時に作られる。たとえば、図
４に示す構成で、一対の交差するパルスで励起される”
切片”は、検出器の光軸方向に揃えられる。共焦点配置
が使われない（すなわち、検出器の位置にスリットある
いはピンホールがない）とき、この切片からの蛍光が集
められて１セット（ライン）の検出量となり、これら検
出量が結果として生じる像の深さ分解能を与える。
【００３３】
【実施例３】幾何学的に限定された大きさのフェムト秒
パルスは、前述の像を作る応用に加えて、他の応用にも
使われる。たとえば、Ｍａｒｕｏ、等によって"Three-d
imensional microfabrication with two-phton-absorbe
d photopolymerization", Optics Letters, Vol.22, pp
132-134(1997)に最近報告されているように、２光子吸
収が紫外線に感度を有する液体高分子を硬化するのに有
効に使われた。これは、液体高分子の入った容器内に”
書く”ことを可能にし、微視的な構造を形成するために
特定の領域を選択的に硬化することを可能にする。ここ
に記載された方法もこのような関係において使われる。
さらに、有利な点は、ここに記載された技術は３次元構
造を、現在行われているポイントからポイントへ走査し
なければならない技術より早く形成できるということで
ある。
【００３４】本発明の第３実施例によれば、前述の２光
子放射を選択的に制御する原理が、３次元表示素子を作
るために添加された材料に応用される。２光子吸収のた
めに適度に添加された材料内の（異なる波長の）２本の
交差ビームは、蛍光を放射するために特定のボクセル
（３次元的に等価なピクセル）を材料内に作ることがで
きる。これらのビームは像を作るために領域中を高速に
走査される。本発明の第３実施例の表示素子は、２光子
吸収と次に起こる放射のラインあるいは面を走査なしで
作る機能に依存している。個々のボクセルは、一方のビ
ームあるいは両方のビーム中に空間光変調器（たとえ
ば、２次元液晶アレイのような）を使用することで、ま
すますアドレスされやすくなる。
【００３５】たとえば、図６に示すように、波長λ1の
最初のパルスレーザビーム７４が光軸に沿って一方から
表示媒質８２を透過する。波長λ2の２番目のパルスレ
ーザビーム７６が光軸に沿って反対側から表示媒質を透
過する。ボクセルの特定の水平面（図６に示された方向
を向いた）が同時に励起されるように、ビーム７４と７
６のパルス７８と８０の相対的なタイミングが制御され
る。その平面内の個々のボクセルに到達する波長λ1の
光量が、ビーム７４の通路に配置された２次元空間光変
調器８４で制御される。したがって、空間光変調器が各
ボクセル内の励起と放射の量を制御するために使われ、
表示物質８２内での１セットのパルス７８と８０の交差
で平面像が形成される。３次元像は、パルス７８と８０
の相対的な遅延を変えることで作られる。遅延を変える
と、パルスは各連続するパルスのセット毎に表示物質内
の異なる平面で交差する。ボクセルサイズ（図６の光軸
方向の長さ）がパルス幅で決まることに注意する必要が
ある。図６に示した例は第１実施例のホットケーキ状の
重なり領域を使っているが、第２実施例のビーム方位を
使うことで３次元表示が行われるようになることはすぐ
に理解できる。
【００３６】
【実施例４】図３〜６に示した構成は、３次元領域が高
速に書き込まれて読み出される光メモリデバイスを作る
のに応用される。デジタル情報を蓄積できる典型的な方
法は、あるタイプの蓄積媒体をその状態を１か０として
区別することができるような種類に変えることである。
この変化が持続して書き込みメモリ（ＲＯＭ）あるいは
消去可能メモリ、すなわち、情報が蓄積され後で回復す
るか元々そこに蓄積されていた情報を消去して新しい情
報が書き込まれるメモリとなる。
【００３７】本発明により、媒質を変化させるために多
光子吸収を使用することで、デジタルデータビットが作
られる。この変化は、たとえば、媒質中の個々の場所に
損傷スポットを作ることで持続する。その変化は、損傷
スポットを作る代わりに媒質の局所的な吸収あるいは放
射の特性を変えることで、一時的になる。このように、
本発明でＲＯＭと読みとり／書き込みメモリの両タイプ
のメモリが達成可能になる。
【００３８】記憶、蓄積を達成する基本的な構成は、顕
微鏡検査と３次元表示を実現するために記述されたもの
と同じである。書き込みは波長が同じかあるいは異なる
２本のパルスビームで行われる。２本のビームが空間と
時間の両方で重なると、多光子吸収が起きる。２本の時
空で重なるビームは、記録媒質内の重なり領域での吸収
／放射が時間的に変化できるようにするか、あるいは、
瞬間の多光子誘起誘電破壊によって媒質が永久的に変化
できるようにする、強度である。
【００３９】特に、２本のビームが上述の技術の一つで
媒質内で交差する。媒質としては、特に書き込みビーム
に使われる波長の多光子吸収に感度の高いものが選ばれ
る。たとえば、媒質が４００ｎｍで強く吸収するとする
と、８００ｎｍあるいは１／λ1＋１／λ2＝１／４００
のような組み合わせ波長の２本の書き込みビームが使わ
れる。ここで、λ1とλ2は書き込みビームの波長であ
る。２本のビームが媒質内で交差し、その交差領域はビ
ームが同一線上にあるかないかでラインあるいは面にな
る。パルス間の相対的な時間を変えると、領域内のライ
ンあるいは面の位置が変化する。多光子吸収がそのライ
ンあるいは面で起こり、それによって情報を記録する。
このラインや面が記録媒質内を空間的に動くようにパル
ス間の相対的な時間が変えられるという事実から、蓄積
は実際３次元的に起きる。それに比べ、フロッピーディ
スクのような標準的な磁気記録媒体では、蓄積がディス
クやテープの表面に起こり、２次元的である。本発明で
は、蓄積が媒質の立体全域にわたって起こり、３次元全
てを使用できるようにする。このように、本発明は横方
向と同様に深さ方向も使用するので蓄積密度の増大に対
応することができる。
【００４０】ビット情報をラインあるいは面として蓄積
することは不経済あるいは不必要であるので、書き込み
ビームの一方あるいは両方の通路に空間光変調器が使用
される。空間光変調器は交差ラインあるいは面内の個々
のボクセルに到達する光量を制御する。この方法で、ラ
インあるいは面内のボクセルは個々にアドレス可能にな
り、この技術の有用性が大きく拡張される。他の技術と
比べてのこの方法の特に強い利点は、多数のボクセルを
同時にアドレスできるということである。書き込みビー
ムの一方の通路に”チェッカーボード”マスクを置くこ
とを想像すると、基本的概念を理解しやすい。事実、そ
のようなマスクはプログラム可能な２次元液晶アレイで
作られる。チェッカーボードマスクの黒い領域で光は遮
断され、透明領域は光を透過する。したがって、マスク
を通過するビームの中では、”ホットケーキ”のように
見える入射光ビームがアレイ状の小さな”チェッカーボ
ード”の矩形に分割される。２番目の光の中では、光は
今まで通りに乱されることなく、”ホットケーキ”のよ
うに蓄積媒質に到達する。２本のビームが交差しても、
ラインあるいは面がもはや媒質中に書き込まれることは
ない。なぜなら、一方のアームが多数の遮蔽されたエリ
アをもっており、多光子書き込み処理は、光が両方のビ
ームから供給される領域でのみ起こるからである。した
がって、２本の同一直線上にあるビームの場合、チェッ
カーボードパターン状のボクセルが媒質中に書き込まれ
る。しかしながら、この場合は、ボクセルを含む平面の
垂線が入射光ビームの進行方向を示すｋベクトルの２等
分線と直交する。同一直線上にあるビームの場合は、ボ
クセルを含む平面の垂線は、入射光ビームの進行方向を
示すｋベクトルと同一直線上にある。この技術の特徴
は、ボクセルが、使用される短パルスの有限な幅で空い
た場所に制限されることである。対照的に、全ての既知
の方法は、書き込みを小さい領域に制限するため空間的
に区別するある型を必要とする。この技術は既知の方法
と異なり、パルス幅を頼りにして書き込まれる領域を制
限する。
【図面の簡単な説明】
【図１】１光子蛍光共焦点顕微鏡の概観図。
【図２】ミラーでレーザビームを走査することによって
試料の３次元像を作るようにした２光子顕微鏡の概観
図。
【図３】本発明の第１実施例に関する平面波照明を使う
２光子顕微鏡システムの概観図。
【図４】本発明の第２実施例に関する２つの交差するビ
ームを用いる２光子顕微鏡システムの概観図である。
【図５】本発明の第２実施例に関する２光子顕微鏡の代
替配置の概観図である。
【図６】本発明の第３実施例に関する２光子蛍光を用い
た３次元表示素子の概観図。
【符号の説明】 １０、３７・・光源、１２・・ダイクロイックミラー、
１６、３８、６０・・試片、１８、４６・・像面、２
０、６２・・検出器、２２・・ピンホール、２４、２６
・・回転ミラー、３０・・顕微鏡対物レンズ、３２・・
光電子増倍管、４０・・波長λ2のパルス、４２・・波
長λ3のパルス、４４・・λ2を反射する膜が付けられた
窓、４８、６４・・結像レンズ／対物レンズ、５０・・
２次元検出器、５２、６６、６８・・ビーム１、λ2、
５４・・ビーム２、λ3、７４：入力パルス、波長λ1、
７６：入力パルス、波長λ2、８２：表示媒体、８４：
空間光変調器。

Claims (47)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】第１波長の第１パルス（ａ）と第２波長の
    第２パルス（ｂ）を発生し、該第２パルスが該第１パル
    スと物質内で交差し、該第１パルスと該第２パルスの空
    間的かつ時間的重なりが２光子吸収によって該物質の交
    差領域内の蛍光体の励起を引き起こし、該交差領域が平
    面に沿って延びる光源と、 該第１パルスと該第２パルスの時間的かつ空間的重なり
    部分からの放射の２次元視野を検出する、該交差領域内
    の励起された該蛍光体からの放射光を検出するために配
    置された検出器と、 を具備することを特徴とする物質中の蛍光体の２光子励
    起を引き起こすための装置。
  2. 【請求項２】前記第１パルスと前記第２パルスが同一方
    向から前記物質に入射し、該第２パルスは該第１パルス
    に対して相対的に遅延しており、さらに、該第１と該第
    ２パルスの入射方向と反対側の該物質に配置された反射
    体を含み、該反射体は該第１パルスを反射し、その反射
    した該第１パルスと入射する該第２パルスが該物質内の
    ホットケーキ領域中で時間的かつ空間的に重なるように
    した請求項１に記載の装置。
  3. 【請求項３】前記光源は前記第１パルスを発生する第１
    レーザと前記第２パルスを発生する第２レーザとからな
    り、該第１パルスは前記物質に一方の側から光軸に沿っ
    て入射し、該第２パルスは該物質に反対側から光軸に沿
    って入射し、該第１パルスと該第２パルスが該物質内の
    ホットケーキ状領域中で時間的かつ空間的に重なるよう
    にした請求項１に記載の装置。
  4. 【請求項４】前記光源は連続する前記第１と前記第２パ
    ルスの対を発生し、連続する対にとっての該第１と該第
    ２パルスの相対的なタイミングを調節することで前記物
    質の３次元領域が走査される請求項１に記載の装置。
  5. 【請求項５】前記光源は連続する前記第１と前記第２パ
    ルスの対を発生し、前記物質を前記検出器の光軸に沿っ
    て動かすことで該物質の３次元領域が走査される請求項
    １に記載の装置。
  6. 【請求項６】前記第１と前記第２のパルスが超短パルス
    である請求項１に記載の装置。
  7. 【請求項７】前記２次元検出器が電荷結合素子（ＣＣ
    Ｄ）アレイである請求項１に記載の装置。
  8. 【請求項８】前記第１波長が前記第２波長と異なる請求
    項１に記載の装置。
  9. 【請求項９】前記物質が試片である請求項１に記載の装
    置。
  10. 【請求項１０】前記物質が３次元表示素子を形成する請
    求項１に記載の装置。
  11. 【請求項１１】前記物質がデジタルビット情報を蓄積す
    るメモリを含む請求項１に記載の装置。
  12. 【請求項１２】最初の時刻に、蛍光体を有する試片に入
    射する第１波長の第１パルス（ａ）と２番目の時刻に試
    片に入射する第２波長の第２パルス（ｂ）を発生し、該
    第１パルスと該第２パルスが２光子吸収によって該蛍光
    体の２次元視野を瞬間的に励起するために該試片内のホ
    ットケーキ領域中で時間的かつ空間的に重なる、光源
    と、 ホットケーキ領域内の励起された該蛍光体からの放射光
    の２次元視野を検出するために配置された検出器と、 を具備することを特徴とする２光子蛍光顕微鏡。
  13. 【請求項１３】前記第１パルスと前記第２パルスが同一
    方向から前記試片に入射し、前記２番目の時刻が前記最
    初の時刻と異なり、さらに、該第１と該第２パルスの入
    射方向と反対側の該試片に配置された反射体を含み、該
    反射体は該第１パルスを反射し、その反射した該第１パ
    ルスと入射する該第２パルスが該試片内のホットケーキ
    領域中で時間的かつ空間的に重なるようにした請求項１
    ２に記載の顕微鏡。
  14. 【請求項１４】前記光源は前記第１パルスを発生する第
    １レーザと、前記第２パルスを発生する第２レーザを含
    み、該第１パルスは前記試片の一方の側から光軸に沿っ
    て入射し、該第２パルスは該試片の反対側から光軸に沿
    って入射し、該第１パルスと該第２パルスが該試片内の
    ホットケーキ領域中で時間的かつ空間的に重なるように
    した請求項１２に記載の顕微鏡。
  15. 【請求項１５】前記光源は、連続する前記第１と前記第
    ２パルスの対を発生し、連続する対にとっての該第１と
    該第２パルスのタイミングを調節することで前記試片の
    ３次元領域が走査される請求項１２に記載の顕微鏡。
  16. 【請求項１６】前記光源は、連続する前記第１と前記第
    ２パルスの対を発生し、前記試片を前記光源の光軸に沿
    って動かすことで該試片の３次元領域が走査される請求
    項１２に記載の顕微鏡。
  17. 【請求項１７】前記第１と前記第２パルスが超短パルス
    である請求項１２に記載の顕微鏡。
  18. 【請求項１８】前記２次元検出器が電荷結合素子（ＣＣ
    Ｄ）アレイである請求項１２に記載の顕微鏡。
  19. 【請求項１９】前記第１波長が前記第２波長と異なる請
    求項１２に記載の顕微鏡。
  20. 【請求項２０】蛍光体を有する試片に入射する第１波長
    の第１パルスを発生する第１光源と、 該第１パルスの入射角に関して交差する角度で該試片に
    入射する第２波長の第２パルスを発生し、所定の瞬間該
    第１パルスの一つと該第２パルスの一つが該試片内のラ
    イン状領域で交差し、領域内の２光子吸収によって該ラ
    イン状領域中の該蛍光体を励起する第２光源と、 領域内の励起された該蛍光体からの放射光を検出するた
    めに配置され、該第１パルスの一つと該第２パルスの一
    つの交差からの放射の２次元視野を検出する検出器と、 を具備することを特徴とする２光子蛍光顕微鏡。
  21. 【請求項２１】前記第１と前記第２パルスの交差が前記
    試片中を進行するにつれて、前記ライン状領域が該試片
    内を平面に沿って進行する請求項２０に記載の顕微鏡。
  22. 【請求項２２】連続する交差パルス対にとっての前記第
    １パルスと前記第２パルスの相対的なタイミングを調節
    することで、前記ライン状領域が沿って進行する平面が
    横方向に移動するように、前記試片の３次元領域を走査
    するようにした請求項２１に記載の顕微鏡。
  23. 【請求項２３】前記ライン状領域の幅が前記第１と前記
    第２パルスのパルス幅と交差角で決まる請求項２０に記
    載の顕微鏡。
  24. 【請求項２４】前記第１波長が前記第２波長と異なる請
    求項２０に記載の顕微鏡。
  25. 【請求項２５】次のステップからなる物質中の蛍光体を
    選択的に励起する方法、 第１波長の第１パルスを該物質に向かわせるステップ、 第２波長の第２パルスを該物質に向かわせるステップ、 該第１光パルスと該第２光パルスを該物質内で空間的か
    つ時間的に重ね合わせ、該第１と該第２パルスが２光子
    吸収によって該物質の交差領域内の該蛍光体の励起を引
    き起こし、該交差領域が平面に沿って延びるステップ、 該交差領域内の励起された該蛍光体からの放射光を検出
    し、該第１パルスと該第２パルスの時間的かつ空間的重
    なり部分からの放射の２次元視野を検出するステップ。
  26. 【請求項２６】前記第１パルスと前記第２パルスが前記
    物質に同一方向から入射し、該第２パルスは該第１パル
    スに対して相対的に遅延しており、さらに、該第１パル
    スを反射するステップを含み、反射した該第１パルスと
    入射する該第２パルスが該物質内のホットケーキ領域中
    で時間的かつ空間的に重なるようにする請求項２５に記
    載の方法。
  27. 【請求項２７】前記第１パルスは前記物質に一方の側か
    ら光軸に沿って入射し、前記第２パルスは該物質に反対
    側から光軸に沿って入射し、該第１パルスと該第２パル
    スが該物質内のホットケーキ領域中で時間的かつ空間的
    に重なるようにする請求項２５に記載の方法。
  28. 【請求項２８】さらに次のステップを含む請求項２５に
    記載の方法；連続する前記第１と前記第２パルスを発生
    するステップ、 一連の連続する対にとっての該第１パルスと該第２パル
    スの相対的なタイミングを調節して前記物質の３次元領
    域を走査するステップ。
  29. 【請求項２９】さらに次のステップを含む請求項２５に
    記載の方法；連続する前記第１と前記第２パルスを発生
    するステップ、 励起された前記蛍光体からの放射光を検出する検出器の
    光軸に沿って前記物質を動かすことで該物質の３次元領
    域を走査するステップ。
  30. 【請求項３０】前記第１波長が前記第２波長と異なる請
    求項２５に記載の方法。
  31. 【請求項３１】第１波長の第１パルス（ａ）と第２波長
    の第２パルス（ｂ）を発生する光源を具備し、該第２パ
    ルスが該第１パルスと物質内で交差し、該第１パルスと
    該第２パルスの空間的かつ時間的重なりが該物質の交差
    領域内で２光子吸収を起こし、該交差領域が平面に沿っ
    て延び、前記２光子吸収が該交差領域内で化学反応を誘
    起することを特徴とする物質中に２光子励起を起こすた
    めの装置。
  32. 【請求項３２】前記物質は、ＵＶに感度を有する液体ポ
    リマであり、前記２光子吸収が前記交差領域内の該ＵＶ
    に感度を有する液体ポリマを硬化させる請求項３１に記
    載の装置。
  33. 【請求項３３】前記第１パルスと前記第２パルスは同一
    方向から前記物質に入射し、該第２パルスは該第１パル
    スに対して相対的に遅延しており、さらに、該第１と該
    第２パルスの入射方向と反対側の該物質に配置された反
    射体を含み、該反射体は該第１パルスを反射し、その反
    射した該第１パルスと入射する該第２パルスが該物質内
    のホットケーキ状領域中で時間的かつ空間的に重なる、
    請求項３１に記載の装置。
  34. 【請求項３４】前記光源は、前記第１パルスを発生する
    第１レーザと前記第２パルスを発生する第２レーザとか
    らなり、該第１パルスは前記物質に一方の側から光軸に
    沿って入射し、該第２パルスは該物質に反対側から光軸
    に沿って入射し、該第１パルスと該第２パルスが該物質
    内のホットケーキ状領域中で時間的かつ空間的に重な
    る、請求項３１に記載の装置。
  35. 【請求項３５】前記光源は、一連の前記第１と前記第２
    パルスの対を発生し、連続する対にとっての該第１パル
    スと該第２パルスの相対的なタイミングを調節すること
    で前記物質の３次元領域が走査される請求項３１に記載
    の装置。
  36. 【請求項３６】前記光源は、一連の前記第１と前記第２
    パルスの対を発生し、前記物質を一方の走査方向と直交
    する方向に動かすことで該物質の３次元領域が走査され
    る請求項３１に記載の装置。
  37. 【請求項３７】２光子吸収によって特性が変化し、前記
    特性変化の有無がディジタル情報を表す物質と、 第１波長の第１パルス（ａ）と第２波長の第２パルス
    （ｂ）を発生し、該物質の交差領域内で２光子吸収を起
    こし、それによって交差領域内の該物質の特性を変化さ
    せ、その中にディジタル情報を書き込む光源と、 それによってディジタル情報の価値が決まるべく該物質
    の前記交差領域内の特性変化の有無を検出するために配
    置された検出器と、を具備することを特徴とするメモリ
    デバイス。
  38. 【請求項３８】前記交差領域が平面に沿って延びる請求
    項３７に記載のメモリデバイス。
  39. 【請求項３９】前記第１パルスと前記第２パルスは前記
    物質に同一方向から入射し、該第２パルスは該第１パル
    スに対して相対的に遅延しており、さらに、該第１と該
    第２パルスの入射方向と反対側の該物質に配置された反
    射体を含み、該反射体は該第１パルスを反射し、その反
    射したパルスと入射する該第２パルスが該物質内のホッ
    トケーキ状領域中で時間的かつ空間的に重なる請求項３
    ７に記載のメモリデバイス。
  40. 【請求項４０】前記光源は、前記第１パルスを発生する
    第１レーザと前記第２パルスを発生する第２レーザとか
    らなり、該第１パルスは前記物質に一方の側から光軸に
    沿って入射し、該第２パルスは該物質に反対側から光軸
    に沿って入射し、該第１パルスと該第２パルスが該物質
    内のホットケーキ状領域中で時間的かつ空間的に重な
    る、請求項３７に記載のメモリデバイス。
  41. 【請求項４１】前記光源は、一連の前記第１と前記第２
    パルスを発生し、連続する対にとっての該第１パルスと
    該第２パルスの相対的なタイミングを調節することで前
    記物質の３次元領域が書き込まれる請求項３７に記載の
    メモリデバイス。
  42. 【請求項４２】前記光源は、一連の前記第１と前記第２
    パルスを発生し、前記物質を一方の走査方向と直交する
    方向に動かすことで該物質の３次元領域が書き込まれる
    請求項３７に記載のメモリデバイス。
  43. 【請求項４３】前記第１と前記第２パルスが超短パルス
    である請求項３７に記載のメモリデバイス。
  44. 【請求項４４】前記検出器が電荷結合素子（ＣＣＤ）ア
    レイである請求項３７に記載のメモリデバイス。
  45. 【請求項４５】前記第１波長が前記第２波長と異なる請
    求項３７に記載のメモリデバイス。
  46. 【請求項４６】さらに、前記第１と前記第２パルスの一
    方の通路に配置された空間フィルタを有し、該空間フィ
    ルタは前記交差領域の個々の部分に到達する光量を選択
    的に減少させ、前記個々の部分に２光子吸収を選択的に
    起こし、前記交差領域中にディジタルビットの２次元視
    野を一度に書き込む請求項３７に記載のメモリデバイ
    ス。
  47. 【請求項４７】前記物質は、ディジタル情報を３次元マ
    トリックス中に蓄積し、ディジタル情報の２次元アレイ
    が一度に検出される請求項３７に記載のメモリデバイ
    ス。
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