JPH11509736A - オリゴマーハイブリダイゼーションによる配列決定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、オリゴマーハイブリダイゼーションによるＤＮＡの配列決定方法に関する。担体上に置いたＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドオリゴマーおよび（任意に）ＤＮＡオリゴマーまたはＲＮＡオリゴマーをハイブリダイゼーションマトリックスとして使用する。

Description

【発明の詳細な説明】 オリゴマーハイブリダイゼーションによる配列決定方法 本発明は、オリゴマーハイブリダイゼーションによる配列決定の新規方法に関 する。 長い間知られたゲルへの適用によりもたらされるＤＮＡ配列決定に加え、数年 前にさらなる方法、即ち、オリゴマーハイブリダイゼーションによる配列決定が 開発された（Drmanac ら、Genomics 4，(1989),114-128頁またはBains ら、J．T heor．Biol．135，(1988),303-307 頁等を参照）。この配列決定法のためには、 それぞれ短いオリゴヌクレオチドおよびオリゴマーの完全なセット（例えば、す べての考えられる６５，５３６個のオクタマー）が、個々のオリゴヌクレオチド それぞれの位置がわかるように、支持体材料上に整列した格子内に結合している 。配列が決定対象であるＤＮＡ断片を、特異的二重らせん形成のみを可能にする 条件下で、かかるハイブリダイゼーションマトリックスおよび「オリゴマーチッ プ」それぞれにハイブリダイズさせる。結果として、該ＤＮＡ断片は、相補的配 列がそれ自体の配列の一部（例えば、「オクタマーチップ」を用いるときはオク タマー）に正確に対応するオリゴマーのみに結合する。従って、ハイブリダイズ したＤＮＡ断片の結合位置の検出により、該断片に存在するすべてのオリゴマー 配列が決定される。隣接するオリゴマー配列の重複によって、適当な数学的なア ルゴリズムによりＤＮＡ断片の連続した配列を決定することができる。この原理 は、その配列がオクタマーハイブリダイゼーション配列決定により決定される１ ３塩基の長さを有するＤＮＡ断片に対する図１の実施例により示される。 本発明の方法を実施するときに生ずる主要な問題点は、オリゴマーがそれらの 配列の関数として異なる結合力（解離温度）を有するが、実験上のハイブリダイ ゼーション温度の単一セット下で決定対象のＤＮＡ断片に特異的にそして全長で 結合しなければならないことにある。しかしながら、高いストリンジェンシーを 用いたとき、弱く結合するオリゴマーは、それらの相補的配列が中に含まれてい ても該ＤＮＡ断片に結合しない（偽陰性）。しかしながら、低いストリンジェン シーの場合、高い結合力を有するオリゴマーの一部の領域（例えば、オクタマー のわずか６個または７個のヌクレオチドのみ）も結合し、偽陽性となる。安定性 の相違の広さにより、両アーチファクトはほとんどの条件下で起こる。従って、 この配列決定技術を用いるためには、すべてのオリゴマーの結合力を配列に関係 なくある一定レベルにまでもっていくことが必要である。現在まで、このことは 、オリゴマーの濃度を変えることにより行なわれている（Khrapko ら、（1991） DNA Sequence 1，375-388頁）。しかしながら、このことは、特異的な濃度をオ リゴマー毎に付加的に調整しなければならないので、ハイブリダイゼーションマ トリックスを製造するときに大きな技術的困難が起こるという欠点を伴う。すべ てのオリゴマーの結合力をある一定レベルにまでもっていくために供する第２の アプローチは、特定の塩基対形成の安定性の変化を生ずる塩基誘導体の導入によ り示される。それと関連して、多くの異なる誘導体を使用しなければならず、塩 基対形成の特異性は誘導体の導入により変化することが不利である。オリゴマー の結合力を調節するための第３の解決方法は、Ｇ：Ｃ塩基対とＡ：Ｔ塩基対間に 存在する安定性の相違を低下させるテトラアルキルアンモニウム塩中のハイブリ ダイゼーションを提供する（Woodら、(1985)，Proc．Natl．Acad．Sci．82，158 5-1588）。しかしながら、この効果は、短いオリゴマーには不十分である。さら に、高モルの塩溶液の使用は、ハイブリダイゼーションを妨害する。 従って、本発明の目的は、オリゴマーハイブリダイゼーションによる配列決定 方法において、すべてのオリゴマーの結合力をある一定レベルまでもってくると 同時に、前記欠点を避けることにある。 この問題は、クレーム１記載の方法により解決される。サブクレームから有利 な態様が生ずる。 本発明者らは、ハイブリダイゼーションマトリックス上で、任意にＤＮＡおよ び／またはＲＮＡオリゴマーと組み合わせてＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドオリゴ マーを用いることにより、塩基対形成の特異性に影響することなく糖のフォール ディングまたはパッカーリングに対して影響を及ぼすことにより、未知のＤＮＡ 断片の配列を決定するときに結合力（二重らせんの安定性）を変え得ることを発 見した。同時に、結合力の変動は、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの使用により、 オリゴマーの塩基配列とは無関係である。 ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドオリゴマーを、純粋なＤＮＡオリゴヌクレオチド の合成のために開発された公知の常法により合成し、ヌクレオチドの必要数は、 二倍になるだけである（各Ａ、Ｇ、ＣおよびＴのＤＮＡヌクレオチドならびにＲ ＮＡヌクレオチド）。合成は、市場で公知の商業上利用可能な装置または多少改 造した装置で行なうことが好ましい。ハイブリダイゼーションマトリックスの調 製のための個々のオリゴマーの適用は、市販のロボットを用いることによる支持 体の一定の位置に一定量を別々に移すことを介してなされることが好ましい。当 業者であれば、支持体の材料に精通しており、ガラス、ポリプロピレンまたはシ リコンが好ましく用いられる。当業者に公知で、同様に任意に化学的に修飾され た市販の利用可能なリンカーを介して、オリゴマーを支持体の表面に結合するこ とが好ましい。 しかしながら、支持体上で同時にすべてのオリゴマーを合成する可能性も存在 する。この目的のために、合成ビルディングブロックを、支持体を介して４つの 並行チャンネル（デオキシリボース糖部分またはリボース糖部分いずれかを有す るビルディングブロックＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔの各場合において１つ）に通過させる。 第２の合成工程において、これらのチャンネルは、第１の工程における向きに関 して垂直である。第３および第４の工程において、まず一次元で、次いで二次元 で合計１６個のチャンネルを用いるように、合成工程１および２の各独立したチ ャンネルに対して、４つのチャンネルをビルディングブロックＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔに 使用する。合成工程のさらなる対それぞれに対して、チャンネル数をそれぞれ４ 倍にする。一般に、この方法は、サザン(Southern)ら、(1992)，Genomics 13，1 008-1017頁に記載されており、本明細書において参照される。 すべてのオリゴマーを支持体上で同時に合成するさらなる方法は、ピーズ(Pea se)ら、(1994)，Proc．Natl．Acad．Sci．91，5022-5026頁に記載されており、 本明細書において参照される。それは、光活性化され得るビルディングブロック と写真石版技術を使用することにより、支持体上でオリゴヌクレオチドを合成す る。該支持体は、マスクで被覆され、光を照射される。該表面は、マスクが孔を 有する位置でのみ光の投射により活性化される。ＤＮＡヌクレオチドまたはＲＮ Ａヌクレオチドは、その後の合成工程でこの活性化された位置のみに取り込まれ 得る。以下の合成工程のために、別の位置に孔を有する新しいマスクを適用し、 この新しい位置の表面は、光によって活性化され、新しいＤＮＡまたはＲＮＡヌ クレオチドが取り込まれる。 実際問題として、２００塩基までのＤＮＡ断片の配列決定のために、オクタマ ーが適用された（「オクタマーチップ」）ハイブリダイゼーションマトリックス を使用する価値があることがわかったが、２００塩基から１０００塩基までの長 さのＤＮＡは、「デカマーチップ」を使用することによりより良い配列決定がな される。好適なオリゴマーサイズの選択は、当業者に委ねられ、テトラマーから ドデカマーのハイブリダイゼーションマトリックスを含むことが好ましい。 ２つの異なるドデカマー配列で行なった以下の実験は、本発明の基礎を形成し 、大文字はＤＮＡヌクレオチドを表し、小文字はＲＮＡヌクレオチドを表す。以 下のオリゴマーを調製した。 ＸＳ−０ ＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣ ＸＳ−１７ ＴＣＴａＧＡＧＴｃＧＡＣ ＸＳ−４２ ＴｃＴａＧＡｇＴｃＧａＣ ＸＳ−６７ ＴｃＴａｇａｇＴｃｇａｃ ＸＳ−１００ ｔｃｔａｇａｇｔｃｇａｃ ＳＸ−０ ＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡ ＳＸ−１７ ＧＴｃＧＡＣＴＣＴａＧＡ ＳＸ−４２ ｇＴｃＧａＣＴｃＴａＧＡ ＳＸ−５８ ｇＴｃｇａｃＴｃＴａｇＡ ＳＸ−８３ ｇＴｃｇａｃｔｃｔａｇＡ ＳＸ−１００ ｇｔｃｇａｃｔｃｔａｇａ 等量の放射線標識オリゴマーをそれぞれ、相補的配列を含む一本鎖ＤＮＡとと もに混合した。非特異的結合は起こらなかった。該一本鎖ＤＮＡオリゴマー混合 物を、薄フィルムプレートに適用した。温度勾配を流れの方向に対して横切るよ うに適用したハイブリダイゼーション条件下で、薄フィルムクロマトグラフィー を行なった。これらの条件下では、遊離のオリゴマーは、緩衝液の移動前面とと もに流れるが、結合オリゴマーは、開始点に留まる。開始点での放射活性の測定 は、結合オリゴマー量の定量を可能にする。この測定方法は、ホーヘイセル(Hoh eisel)ら、J．Biol．Chem．165，16656-16660 頁（1990）により詳細に記載され 、本明細書において参照される。 とりわけ、オリゴマーの解離温度、即ち、初めから結合していたオリゴマーの ５０％がいまだ結合している温度も前記実験により決定された。ＤＮＡヌクレオ チドからＲＮＡヌクレオチドおよびＲＮＡヌクレオチドからＤＮＡヌクレオチド へのサイクル数をそれぞれ増加させるにつれて、二重らせんの安定性が直線的に 減少することが図２および図３から明らかである。サイクルとは、１つの分子に おけるＤＮＡとＲＮＡ間の変化数を意味するものと解する。従って、７サイクル は、断片「ＡｇＣｔＴｇＡｇ」で起こり、１サイクルのみが断片「ＡＧＣＴＴｇ ａｇ」で起こる。 ハイブリダイゼーションマトリックス上のオリゴマー（「オリゴマーチップ」 ）の結合力を一定のレベルまでもっていくために、「テストチップ」上の純粋な ＤＮＡオリゴマーの解離温度を、公知の配列のＤＮＡ試験断片とのハイブリダイ ゼーションにより決定しなければならない。それは、試験断片が結合するおよび 結合しない（偽陽性）「テストチップ」のオリゴマーに対する真の発端から公知 であるので、断片が結合可能なおよび結合したオリゴマーの解離温度が決定され る。この手法は、チップのすべてのオリゴマーの解離温度が決定されるまで、さ らなるＤＮＡ試験断片で繰り返される。次いで、決定された最低の解離温度を、 すべてのオリゴマーがすべてのオリゴマーを一定のレベルの結合力までもってい くように調整された温度であると仮定する。このことは、新しいチップを合成す るときに、対応するオリゴマーへのＲＮＡヌクレオチドの導入、即ち、対応する ＤＮＡ／ＲＮＡサイクルが導入されてオリゴマーの解離温度が低下することによ りなされる。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドオリゴマーが、ＤＮＡからＲＮＡおよ びＲＮＡからＤＮＡへのそれぞれ少なくとも２サイクルを有することが好ましく 、少なくとも４サイクルが特に好ましい。この基準において、すべてのオリゴマ ーの一定の結合力により顕著となり、未知のＤＮＡ断片の配列決定に適するチッ プが得られる。ＲＮＡオリゴマーを「試験チップ」に適用した後、ＤＮＡ／ＲＮ Ａハイブリッドオリゴマーの調製のためにＤＮＡヌクレオチドを導入するために 試験することも本発明の範疇にある。 結合力を予測する別の、しかしあまり正確でない可能性は、塩基配列に基づく 計算方法である。この方法は、ブレスロウエル(Breslauer)ら、(1986)，Proc．N atl．Acad．Sci．USA，83，3746-3750 頁に記載され、コンピューターを使用し た場合に迅速な測量を供することができる。 本発明を、図を参照して述べる。 図１は、オリゴマーハイブリダイゼーション配列決定の原理を示し、 図２は、ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子との間のサイクル数の関数として、ＸＳシリー ズのオリゴマーの解離温度のプロットを示し、 図３は、ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子との間のサイクル数の関数として、ＳＸシリー ズのオリゴマーの解離温度のプロットを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 支持体上に適用したＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドオリゴマー、ならびに任 意にＤＮＡオリゴマーおよび／またはＲＮＡオリゴマーをハイブリダイゼーショ ンマトリックスとして使用することを特徴とする、オリゴマーハイブリダイゼー ションによるＤＮＡの配列決定方法。 ２． 支持体がガラス、ポリプロピレンまたはシリコンからなることを特徴とす る請求項１記載の方法。 ３． ハイブリダイゼーションマトリックスが、テトラマーマトリックスからド デカマーマトリックスであることを特徴とする請求項１または２記載の方法。 ４． オリゴマーが、光活性化され得るビルディングブロックと写真石版技術を 使用することにより、支持体上で合成されたことを特徴とする請求項１〜３いず か記載の方法。 ５． オリゴマーが別々に合成され、次いで、リンカーにより支持体表面上に適 用されたことを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の方法。 ６． ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドオリゴマーが、ＤＮＡからＲＮＡおよびＲＮ ＡからＤＮＡへの少なくとも４サイクルをそれぞれ有することを特徴とする請求 項１〜５いずれか記載の方法。