JP2001346579A - Ｓｎｐ検出用オリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】検出精度の高いＳＮＰ検出方法を提供する。 【解決手段】試験すべきオリゴヌクレオチドの配列と相
補的な配列または１〜数塩基を除いて相補的な配列を有
するオリゴヌクレオチドに特定波長の光の照射により構
造異性化する有機基を１または複数個結合させてなり、
試験すべきオリゴヌクレオチドとの二重鎖形成能を該光
の照射により変化させることが可能なＳＮＰ検出用オリ
ゴヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明はＳＮＰ検出用オリゴ
ヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを固定化したＤＮ
Ａチップ、該オリゴヌクレオチドを使用するＳＮＰの検
出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＳＮＰは、疾患感受性、薬剤感受性等の
情報となり、将来的に診断、治療および予防に応用して
いくことが期待されている。従って、ＳＮＰの迅速な解
析が望まれている。現在、ＳＮＰの検出は、ＤＮＡチッ
プ、ＤＮＡ解析ソフト等を用いて行われている。例え
ば、ＤＮＡチップ上にプローブとして標的シークエンス
のすべてのポジションについて中央の塩基がＡ，Ｇ，
Ｃ，Ｔをもつ４つの相補的オリゴＤＮＡを固定化し、ど
のプローブにハイブリダイズするかで、そのポジション
の塩基が同定され、これによりＳＮＰの検出が行われて
いる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、一定温
度において特定のプローブにハイブリダイズするか否か
のみによるＳＮＰの検出は、検出精度が低いという問題
がある。この問題は、特に調べる配列が長い場合に深刻
である。本発明の発明者は、ＳＮＰの検出精度を高める
方法について、鋭意研究を行った。その結果、試験すべ
きオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるオリゴヌ
クレオチドに特定波長の光の照射により構造異性化する
有機基（以下、場合により光応答性有機基と記す）を結
合し、該有機基の立体構造の変化による二重鎖形成能の
差を利用すると、ＳＮＰをより高い精度で検出できると
いう事実を見出した。以下、詳述する。

【０００４】予め光応答性有機基を結合させておいたオ
リゴヌクレオチドに、該有機基が平面性の高い立体構造
をとる状態で、これに完全に相補的なオリゴヌクレオチ
ド（以下、フルマッチオリゴヌクレオチドと記す）をハ
イブリダイズさせると、安定にハイブリダイズするが、
これに光を照射して、有機基を平面性の低い立体構造に
異性化すると、ハイブリダイズが解けやすくなる。即
ち、有機基の立体構造により二重鎖形成能が極端に異な
る。これに対し、予め光応答性有機基を結合させておい
たオリゴヌクレオチドに、上記フルマッチオリゴヌクレ
オチドと１塩基またはそれ以上の塩基が異なるオリゴヌ
クレオチド（以下、ミスマッチオリゴヌクレオチドと記
す）をハイブリダイズさせる場合、フルマッチオリゴヌ
クレオチドをハイブリダイズさせる場合に比べて、有機
基の立体構造による二重鎖形成能の差が小さい。この立
体構造による二重鎖形成能の差を利用することにより高
い精度でＳＮＰを検出し得ることを見出したのである。

【０００５】このような違いは、本発明の発明者により
導かれた下記の理論により説明され得る。ＡＧＣＴの塩
基はいずれも非常に平面性が高い。そして、Ａ−Ｔ，Ｇ
−ＣがＤＮＡ二重鎖中で塩基対を形成すると、塩基対が
板状の構造をなし、二重鎖間で板を縦に積んだような構
造を形成する。板（即ち、塩基対）と板の間には、同じ
ように“平面性の高い板”（即ち、平面性の高い分子）
を入れることができる。この“第３の板”が入ると、二
重鎖はより安定になる。しかしこの第３の板が折れ曲が
っていると、二重鎖は不安定化する（一本鎖に戻りやす
くなる）。例えば、アゾベンゼンは、可視光を照射する
と平面性の高いトランス体となるので、板と板の間に入
ることができ二重鎖を安定化する。しかし紫外光を照射
するとシス体となり、折れ曲がった板状の立体構造とな
るため、二重鎖が不安定化する。従って、相補鎖がフル
マッチシークエンスの場合、光応答性有機基が平面性の
高い立体構造をとる時と折れ曲がった立体構造をとる時
とで、二重鎖の安定性（二重鎖形成能）が著しく異な
る。ところが、相補鎖にミスマッチ（Ａ−Ｇ，Ａ−Ｃ，
Ｇ−Ｔ等）がある場合は、もともとその部分に歪みが生
じているため、光応答性有機基が平面性の高い立体構造
をとっていても、二重鎖の安定化が図れない。従って、
光応答性有機基が平面性の高い立体構造をとる時と折れ
曲がった立体構造をとる時とで、二重鎖の安定性の差が
小さい。

【０００６】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、下記
のＳＮＰ検出用オリゴヌクレオチドに関する。 （１）試験すべきオリゴヌクレオチド（以下、場合によ
り被験オリゴヌクレオチドと記す）の配列と相補的な配
列または１〜数塩基を除いて相補的な配列を有するオリ
ゴヌクレオチドに特定波長の光の照射により構造異性化
する有機基を１または複数個結合させてなり、試験すべ
きオリゴヌクレオチドとの二重鎖形成能を該光の照射に
より変化させることが可能なＳＮＰ検出用オリゴヌクレ
オチド（以下、場合により光応答性オリゴヌクレオチド
と記す）。 （２）上記光応答性有機基の結合位置が、ＳＮＰが存在
するか存在する可能性のある位置またはその近傍である
ことを特徴とする（１）のＳＮＰ検出用オリゴヌクレオ
チド。 （３）上記光応答性有機基が、特定波長の光の照射によ
り可逆的に構造異性化する有機基であることを特徴とす
る（１）または（２）に記載のＳＮＰ検出用オリゴヌク
レオチド。 （４）上記光応答性有機基がアゾベンゼンまたはその誘
導体の残基であることを特徴とする（１）〜（３）のい
ずれかのＳＮＰ検出用オリゴヌクレオチド。 （５）上記光応答性有機基が、ポリメチレン鎖、好まし
くは炭素原子数２〜５のポリメチレン鎖中の炭素原子に
共有結合的に結合され、該ポリメチレン鎖の両端の炭素
原子の各々が隣り合うヌクレオチドのリン酸基の各々に
共有結合することにより、上記オリゴヌクレオチドに結
合していることを特徴とする（１）〜（４）のいずれか
に記載のＳＮＰ検出用オリゴヌクレオチド。 （６）該光応答性有機基がヌクレオチドのリボースの
２’位に共有結合することにより、上記オリゴヌクレオ
チドに結合していることを特徴とする（１）〜（４）の
いずれかのＳＮＰ検出用オリゴヌクレオチド。 （７）該光応答性有機基が５’末端の、３’末端のまた
はホスホジエステル結合を形成するリン酸基に直接また
は炭素原子数１〜１０のアルキレン基を介して共有結合
することにより、上記オリゴヌクレオチドに結合してい
ることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかのＳＮＰ
検出用オリゴヌクレオチド。

【０００７】また、本発明は、上記（１）〜（７）のい
ずれかのＳＮＰ検出用オリゴヌクレオチドを１種類当た
り１または複数個、１または複数種類固定化したＤＮＡ
チップまたは該ＤＮＡチップを製造するためのＤＮＡチ
ップ製造用キットに関する。

【０００８】さらに、本発明は、試験すべきオリゴヌク
レオチドを、上記（１）〜（７）のいずれかのＳＮＰ検
出用オリゴヌクレオチドと接触させ、該有機基の立体構
造の違いによる二重鎖形成能の差を調べ、両オリゴヌク
レオチドが完全に相補的である場合の差と比較すること
により、両配列が完全に相補的である（即ち、フルマッ
チである）か１〜数塩基を除いて相補的である（即ち、
１〜数塩基のミスマッチを有する）かを判断することか
らなるＳＮＰの検出方法に関する。さらに、本発明は、
上記（１）〜（７）のいずれかのＳＮＰ検出用オリゴヌ
クレオチドを含むＳＮＰ検出用キットに関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】（試験すべきオリゴヌクレオチ
ド）本発明において、「試験すべきオリゴヌクレオチ
ド」は、リボ核酸のオリゴマーまたはポリマー、デオキ
シリボ核酸のオリゴマーまたはポリマー、あるいはその
両者が混在するオリゴマーまたはポリマーのいずれでも
よく、ヒトまたは他の生物のゲノムＤＮＡの一部を構成
する配列であり得る。また、ＳＮＰが存在するか否かが
不明の配列に相当する配列に関するものであっても、Ｓ
ＮＰが存在することが知られている配列に関するもので
あってもよい。また、本発明において、オリゴヌクレオ
チドの長さは、例えば、５〜５００塩基、好ましくは１
０〜５０塩基である。一般にＳＮＰの検出には２０塩基
以下のオリゴヌクレオチドを使用するのが好ましいとさ
れるが、本発明の方法によれば、２０塩基以上、例えば
２０〜５０塩基のオリゴヌクレオチドであっても高い精
度で検出できる。また、配列中に複数のＳＮＰを含む場
合等に、好ましくはＳＮＰが存在するか存在する可能性
のある位置またはその近傍に複数の光応答性有機基を結
合すれば、さらに長いオリゴヌクレオチド、例えば１０
０塩基以上のオリゴヌクレオチドにおけるＳＮＰの検出
も可能である。

【００１０】（光応答性オリゴヌクレオチド）上記光応
答性オリゴヌクレオチドは、リボ核酸のオリゴマーまた
はポリマー、デオキシリボ核酸のオリゴマーまたはポリ
マー、あるいはその両者が混在するオリゴマーまたはポ
リマーのいずれでもよい。該オリゴヌクレオチドの長さ
は、上記試験すべきオリゴヌクレオチドに対応する長さ
であり得る。また、該オリゴヌクレオチドは、コンセン
サス配列を有するものであっても、ＳＮＰを有する配列
を有するものであってもよい。コンセンサス配列である
場合は、二重鎖形成能の差がフルマッチの場合より小さ
く、ミスマッチであると判断された場合にＳＮＰが存在
すると判定され、ＳＮＰを有する配列である場合は、二
重鎖形成能の差がフルマッチの場合と同等であり、フル
マッチであると判断された場合にそのＳＮＰが存在する
と判定される。本発明において、光応答性有機基が特定
波長の光の照射により可逆的に構造異性化する有機基で
ある場合は、温度を下げて、ハイブリダイズした試験オ
リゴヌクレオチドを完全に解き、その後、光照射により
光応答性有機基を逆方向、即ち二重鎖の結合を安定させ
得る立体構造へ、好ましくは実質的に平面的な構造へ、
例えばトランス型からシス型へ構造異性化させることに
より、本発明の光応答性オリゴヌクレオチドを再利用す
ることが可能である。

【００１１】本発明の光応答性オリゴヌクレオチドにお
いて、上記光応答性有機基は、例えば１〜１０個結合さ
れ得る。ただし、必要な光応答性有機分子の数は、試験
すべきオリゴヌクレオチドの長さ、検出すべきＳＮＰの
数等に応じて、求められる検出精度を達成できる最低限
の数とするのが好ましい。従って、光応答性有機基の数
は通常は１〜５個で十分である。ただし、光応答性有機
基は、好ましくは４塩基から５０塩基に対して１分子、
より好ましくは５塩基から１６塩基に対して１分子の割
合でオリゴヌクレオチドに結合される。また、二重鎖形
成能の差は、光応答性有機基がＳＮＰの存在する位置ま
たはその近傍にある場合に、より小さくなるため、光応
答性有機基を、少なくともＳＮＰが存在するか存在する
可能性のある位置、またはその近傍に結合するのが好ま
しい。ここで「近傍」とは、例えば隣の塩基または１〜
５塩基隔てた塩基の位置、好ましくは隣の塩基または１
もしくは２塩基隔てた塩基の位置を意味する。なお、本
明細書において、「ＳＮＰ」とは、一塩基多型（single
nucleotidepolymorphism)を意味する。また、光応答性
有機基はオリゴヌクレオチドに側鎖として導入されてい
るのが好ましい。本明細書において、「側鎖として導
入」とは、オリゴヌクレオチドに、または、オリゴヌク
レオチドと光応答性有機基の間に介在するアルキレン基
等の介在基に、光応答性有機基が一つの共有結合によっ
て結合していることを意味する。従って、オリゴヌクレ
オチドの５’末端または３’末端に光応答性有機基が結
合している状態も、側鎖として導入されていることを意
味する。

【００１２】（光応答性有機基）本発明において、「光
応答性有機基」は、特定波長の光により二重鎖の結合を
安定させ得る立体構造から二重鎖の結合を不安定にする
立体構造へ、好ましくは実質的に平面的な構造から平面
的でない構造へ、例えばトランス型からシス型へ、メロ
シアニン型からスピロピラン型へ、またはその逆方向
に、好ましくは可逆的に構造異性化する有機基であり得
る。そのように、立体構造が特定波長の光の照射によっ
て可逆的に変化する有機基は、例えば、アゾベンゼン、
スピロピラン、スチルベン、およびこれらの誘導体の残
基であり得るが、好ましくはアゾベンゼンまたはその誘
導体の残基である。アゾベンゼンまたはその誘導体の残
基は、直接、または適当な介在基、例えば炭素原子数１
〜１０、好ましくは１〜６のアルキレン基、例えばトリ
メチレン基を介してオリゴヌクレオチドに結合すること
ができる。本発明の光応答性オリゴヌクレオチドは、例
えば下記式で表されるものであり得る。

【００１３】

【化１】

【００１４】上記式中、Ｘは光応答性有機基であり、Ａ
及びＢは各々水素、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ
チドを示す。Ｎは核酸塩基（アデニン、シトシン、グア
ニン、チミンまたはウラシル）を示す。ｎは１以上の整
数、好ましくは１以上１０以下、より好ましくは１以上
６以下の整数である。Ｐは、未置換またはハロゲン原
子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシ基等で置
換された炭素原子数１〜２０，好ましくは１〜１０，よ
り好ましくは１〜４のアルキル基もしくはアルコキシ
基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニ
トロ基、カルボキシ基等で置換された炭素原子数２〜２
０，好ましくは２〜１０，より好ましくは２〜４のアル
ケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原
子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシ基を表す。
Ｘは、例えば下記式I、II及びIIIで表される。

【００１５】

【化２】

【００１６】式I、II及びIII中、Ｒ^１、Ｒ^１１、Ｒ^２１
は各々直接の結合；未置換もしくはハロゲン原子、水酸
基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシ基等で置換された
炭素原子数１〜２０，好ましくは１〜１０，より好まし
くは１〜４のアルキレン基、または未置換もしくはハロ
ゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシ基
等で置換された炭素原子数２〜２０，好ましくは２〜１
０，より好ましくは２〜４のアルケニレン基であり、Ｑ
は直接の結合、酸素原子、−ＮＨ−ＣＯ−基または−Ｃ
Ｏ−ＮＨ−基であり、Ｒ^２〜Ｒ^１０、Ｒ^１２〜Ｒ^２０、
Ｒ^２２〜Ｒ^３０は各々独立に、未置換またはハロゲン原
子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシ基等で置
換された炭素原子数１〜２０，好ましくは１〜１０，よ
り好ましくは１〜４のアルキル基もしくはアルコキシ
基；未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニ
トロ基、カルボキシ基等で置換された炭素原子数２〜２
０，好ましくは２〜１０，より好ましくは２〜４のアル
ケニル基もしくはアルキニル基；水酸基；ハロゲン原
子；アミノ基；ニトロ基；またはカルボキシ基を表す。
なお、上記Ｒ^２〜Ｒ^１０、Ｒ^１２〜Ｒ^２０、Ｒ^２２〜Ｒ
^３０において、未置換または置換アルキル基、アルケニ
ル基、アルキニル基及びアルコキシ基は好ましくは直鎖
である。

【００１７】Ｘのさらに具体的な例を下記式に示す。

【化３】

【００１８】

【化４】

【００１９】式中、Ｚ_１、Ｚ_２及びＺ_３は各々独立に、
未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ
基、カルボキシ基等で置換された炭素原子数１〜２０，
好ましくは１〜１０，より好ましくは１〜４のアルキル
基もしくはアルコキシ基；未置換またはハロゲン原子、
水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシ基等で置換さ
れた炭素原子数２〜２０，好ましくは２〜１０，より好
ましくは２〜４のアルケニル基もしくはアルキニル基；
水酸基；ハロゲン原子；アミノ基；ニトロ基；またはカ
ルボキシ基を表す。なお、上記未置換または置換アルキ
ル基、アルケニル基、アルキニル基及びアルコキシ基は
好ましくは直鎖である。

【００２０】（光応答性オリゴヌクレオチドの製造）光
応答性有機基のオリゴヌクレオチドへの導入方法として
は、ポリメチレン鎖（例えば炭素原子数２〜１０のも
の、好ましくは炭素原子数２〜５のもの）の側鎖に共有
結合的に導入した後、これをホスホアミダイトモノマー
にして、既存のＤＮＡ合成機を使用してオリゴヌクレオ
チドに導入する方法を用いることができる。ホスホアミ
ダイトモノマーの合成は、ザ・ジャーナル・オブ・オー
ガニック・ケミストリー（The Journal of Organic Che
mistry）誌１９９７年第６２巻８４６ページ以降に記載
の方法を用いればよい。ポリメチレン鎖は様々な長さの
ものを用いることができるが、エチレンまたはトリメチ
レン鎖が好ましい。この場合、有機基は、エチレン鎖の
場合はいずれかの炭素原子に、トリメチレン鎖の場合は
中央の炭素原子に共有結合的に導入するのが好ましい。
有機基は、リボースの２’位に導入しても、リン酸部位
に導入してもよい。

【００２１】（二重鎖形成能）本明細書を通じて、「二
重鎖形成能」は、相補的または一部相補的なオリゴヌク
レオチド同士がハイブリダイズして二重鎖を形成する性
質の強さを意味し、慣用の方法により、例えばＴｍ（融
解温度）を測定することにより、一定の温度においてハ
イブリダイズするオリゴヌクレオチドの量を測定するこ
とにより、または一定の温度においてハイブリダイズす
るかしないかを検出することにより調べることができ
る。従って、本発明において、「立体構造による二重鎖
形成能の差」は、有機基の光照射により異なる各立体構
造における上記のような二重鎖形成能を表す値の差で表
され得る。Ｔｍの測定は、バイオコンジュゲート・ケミ
ストリー（Baioconjugate Chemistry）誌１９９７年第
８巻３頁以降およびジャーナル・オブ・ザ・アメリカン
・ケミカル・ソサエティー（Journal of the Americ
an Chemical Society）誌１９９７年第１１９巻２６
３頁以降に記載の方法を参考にすることができる。融解
温度は様々な方法で決定することができるが、融解温度
曲線の一次微分の極大を与える温度として決定するのが
好ましい。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの量
の測定は、慣用の方法により、例えば溶液中での光吸収
量を測定することにより調べることができる。ハイブリ
ダイズしているか否かの検出、ハイブリダイズしたオリ
ゴヌクレオチドの量は、上記ＤＮＡチップを用い、これ
に標識した被験オリゴヌクレオチドを接触させ、ハイブ
リダイズした被験オリゴヌクレオチドを該標識に基づい
て検出することにより行ってもよい。立体構造による二
重鎖形成能の差は、まず、有機基が一の立体構造（例え
ばトランス体）をとる状態で上記Ｔｍ、ハイブリダイズ
量等により二重鎖形成能を測定し、その後、特定波長の
光、例えば紫外線を照射して、有機基を他の立体配置
（例えばシス体）とし、同様に二重鎖形成能を測定し、
この差を計算することにより、求めることができる。

【００２２】（ＳＮＰ検出用ＤＮＡチップ）本発明のＳ
ＮＰ検出用ＤＮＡチップは、上記で説明した本発明のオ
リゴヌクレオチドを１種類につき１または複数本、１ま
たは複数種類、公知または慣用のＤＮＡチップ基盤に公
知または慣用のスポッティング法により固定化したもの
であり得る。また、本発明のＳＮＰ検出用ＤＮＡチップ
は、該オリゴヌクレオチドを、公知または慣用のＤＮＡ
チップ基盤上で、公知または慣用の方法により化学合成
したものであってもよい。本発明において、光応答性有
機基が特定波長の光の照射により可逆的に構造異性化す
る有機基である場合は、温度を下げて、ハイブリダイズ
した試験オリゴヌクレオチドを完全に解き、その後、光
照射により光応答性有機基を逆方向、即ち二重鎖の結合
を安定させ得る立体構造へ、例えばシス型からトランス
型へ構造異性化させることにより、本発明のＳＮＰ検出
用ＤＮＡチップを再利用することが可能である。

【００２３】（ＳＮＰ検出方法）さらに、本発明は、上
記ＳＮＰ検出用オリゴヌクレオチド及びＳＮＰ検出用Ｄ
ＮＡチップを用いて、試験すべきオリゴヌクレオチド
を、上記ＳＮＰ検出用オリゴヌクレオチド、または上記
ＤＮＡチップと接触させ、該有機基の立体構造の違いに
よる二重鎖形成能の差を調べ、両オリゴヌクレオチドが
完全に相補的である場合の差と比較することにより、両
配列がフルマッチであるかミスマッチであるかを調べる
ことからなるＳＮＰの検出方法に関する。二重鎖形成能
の差、フルマッチであるかミスマッチであるかの比較等
は、コンピューター解析により行い得る。有機基の構造
異性化のために照射する光は、該有機基の異性化が可能
ならば紫外領域から赤外領域までのすべての波長の光を
用いることができるが、ＤＮＡを損傷させない３００ｎ
ｍ以上が好ましい。

【００２４】（ＳＮＰ検出方法の具体例）以下、本発明
のＳＮＰの検出方法の具体例について説明するが、これ
らは本発明を限定するものではない。なお、本発明にお
いて、ＳＮＰの検出とは、ＳＮＰが存在することが知ら
れている配列について、被験オリゴヌクレオチド中に既
知のＳＮＰが存在するか否かを判定することのほか、Ｓ
ＮＰが存在することが知られていない配列においてＳＮ
Ｐを検出することをも含む。 （i）上記コンセンサス配列に相補的な配列を有するオ
リゴヌクレオチドに予め光応答性有機基を結合してなる
オリゴヌクレオチドを一定濃度で含む溶液中（ここで、
有機基は安定なハイブリダイズを可能にする一の立体配
置、例えばトランスのような平面性の高い構造をとる）
に、試験すべきオリゴヌクレオチドの一定量を添加し、
一定の温度において、ハイブリダイズしたオリゴヌクレ
オチドの量を例えば光吸収量により測定し、その後、こ
の溶液に特定波長の光、例えば紫外光を照射し、有機基
がハイブリダイズを不安定化する他の立体配置（例えば
シスのような屈曲した構造）をとるようにして、同様に
ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの量を測定し、
両値の差を計算し、この差が予め測定しておいたフルマ
ッチの場合の値より小さい場合にミスマッチがある、即
ちＳＮＰが存在すると判定し、フルマッチの場合の値と
同等の場合にはＳＮＰは存在しないと判定する。上記と
は、逆に、ＳＮＰを有する配列に相補的な配列を有する
オリゴヌクレオチドに光応答性有機基を結合してなるオ
リゴヌクレオチドを一定濃度で含む溶液を用いて、立体
構造による二重鎖形成能の差を計算し、フルマッチの場
合にＳＮＰが存在すると判定してもよい。

【００２５】（ii）上記コンセンサス配列に相補的な配
列を有するオリゴヌクレオチドに予め光応答性有機基を
結合してなるオリゴヌクレオチドを一種類につき複数本
を１または複数種類有するＤＮＡチップ（ここで、有機
基は安定なハイブリダイズを可能にする一の立体配置、
例えばトランスのような平面性の高い構造をとる）に、
標識（例えば、蛍光色素、放射性同位体元素等による標
識）した試験すべきオリゴヌクレオチド複数本を接触さ
せ、一定の温度において、ハイブリダイズしたオリゴヌ
クレオチドの量を該標識を検出することにより測定し、
その後、このＤＮＡチップに特定波長の光、例えば紫外
光をあて、有機基がハイブリダイズを不安定化する他の
立体構造（例えばシスのような屈曲した立体構造）をと
るようにして、同様にハイブリダイズしたオリゴヌクレ
オチドの量を測定し、両値の差を計算し、この差がフル
マッチの場合の値より小さい場合にミスマッチがある、
即ちＳＮＰが存在すると判定し、フルマッチの場合の値
と同等の場合にはＳＮＰは存在しないと判定する。この
場合も、逆に、ＳＮＰを有する配列に相補的な配列を有
するオリゴヌクレオチドに光応答性有機基を結合してな
るオリゴヌクレオチドをＤＮＡチップに固定化し、フル
マッチの場合にＳＮＰが存在すると判定してもよい。

【００２６】なお、ＳＮＰの存在が知られていない配列
について、ＳＮＰの存在を検出したい場合は、既知の配
列のコンセンサス配列に相補的な配列に光応答性有機基
を結合したものと試験すべきオリゴヌクレオチドとの立
体配置による二重鎖形成能の差をＳＮＰを検出するのに
十分な数の試料について例えば上記（i）、（ii）の方
法により調べ、予め調べておいたコンセンサス配列と上
記光応答性の有機基を結合した相補的な配列との立体配
置による二重鎖形成能の差と比較し、この差が小さくな
るものがあればその配列にＳＮＰが存在することを知る
ことができる。二重鎖形成能の差は、光応答性の有機基
がＳＮＰの存在する位置またはその近傍にある場合に、
より小さくなるため、光応答性の有機基の結合位置が異
なるオリゴヌクレオチドを複数種類用い、各々の立体構
造による二重鎖形成能の差を調べることにより、ＳＮＰ
のおおよその存在箇所を知ることができる。さらに、Ｓ
ＮＰが存在すると考えられる位置の塩基（例えばＡ）が
コンセンサス配列と異なる（例えばＧ，Ｃ，Ｔ）配列に
相補的な配列を有し、光応答性の有機基が該位置または
その近傍に結合されたオリゴヌクレオチドを、ＳＮＰを
有する配列を有するオリゴヌクレオチドと接触させ、ど
の配列とフルマッチであるかを調べることにより、ＳＮ
Ｐの正確な位置及び塩基を特定することができる。得ら
れた結果をコンピューター解析することにより効率よく
ＳＮＰを解析することができる。

【００２７】また、ＳＮＰの位置及び塩基が知られてい
る配列について、特定の試料がそのＳＮＰを有するか否
かを調べる場合は、該ＳＮＰを有する配列に相補的な配
列を有し、好ましくは該ＳＮＰの位置またはその近傍に
光応答性の有機基を結合したオリゴヌクレオチドを用い
て、例えば上記（i）または（ii）の方法により、フル
マッチであるかミスマッチであるか調べ、フルマッチで
あれば、試験すべき配列にそのＳＮＰが存在すると判定
することができる。また、逆にコンセンサス配列に相補
的な配列を有し、光応答性の有機基を結合したオリゴヌ
クレオチドを用い、ミスマッチであれば、そのＳＮＰが
存在すると判定することもできる。なお、この場合、Ｓ
ＮＰは特定の疾病、特定の体質に関するものであること
ができ、これにより、特定の疾病の罹患、特定の疾病に
対する感受性、特定の薬物に対する感受性、特定の体質
等を調べることができ、これにより得られた情報を用い
て診断、治療等を行うことが可能である。

【００２８】

【実施例】実施例１：ホスホアミダイトモノマーの合成 まず、テトラヘドロン（Tetrahedron）誌１９９２年第
４８巻２２２３頁、ニュークレイック・アッシズ・リサ
ーチ（Nucleic Acids Research）誌１９８７年第１５
巻６１３１頁、およびザ・ジャーナル・オブ・オーガニ
ック・ケミストリー（The Journal of Organic Che
mistry）誌１９８９年第５４巻２３２１頁に記載の手法
に従い、ウリジンの５’と３’の水酸基を１，３−ジク
ロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサ
ンで保護し、続いてＮ３位をベンジルクロリドで保護し
た。次にマクロモレキュールズ（Macromolecules）誌１
９８４年第１７巻７８２頁以降に記載の方法に従って合
成した４−ブロモメチルアゾベンゼンを、上記保護ウリ
ジンに加え、ジメチルホルムアミドに溶解させた。これ
を−２０℃に冷却し、ジメチルホルムアミドに分散させ
た水素化ナトリウムをゆっくり加えることによって、
２’位にアゾベンゼンを導入した。この後定法に従って
保護基を外し、２’−Ｏ−（ｐ−フェニルアゾベンジ
ル）ウリジンを合成した（Uazo）。その後、ザ・ジャー
ナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（The Journ
al of Organic Chemistry）誌１９９７年第６２巻８
４６頁に記載の方法にしたがって、下記式に示すよう
に、５’位にジメチルトリチル基を、３’位にホスホロ
アミジドを付加して、ホスホアミダイトモノマー（Amid
ite−Uazo）を合成した。

【００２９】

【化５】

【００３０】実施例２：ホスホアミダイトモノマーの合
成 オリゴヌクレオチドの５’末端に導入することを目的と
して、以下のようなホスホアミダイトモノマーを合成し
た。４−ブロモアゾベンゼンとエチレングリコールをジ
メチルホルムアミドに溶解させ、−２０℃で水素化ナト
リウムを滴下して、２−（ｐ−フェニルアゾ）ベンジル
オキシエタノール（下記式中、Ｘ１）を合成した。同様
にして３−（ｐ−フェニルアゾ）ベンジルオキシ−１−
プロパノール（下記式中、Ｘ２）を合成した。これに上
記と同様にしてホスホロアミジドを付加したホスホアミ
ダイトモノマー（下記式中、Amidite-X1およびAmidite-
X2）を合成した。

【００３１】

【化６】

【００３２】実施例３：光応答性オリゴヌクレオチドの
合成 次にＤＮＡを合成機を用いて、上記のホスホアミダイト
モノマーを使用して様々な配列を持つ本発明の光応答性
オリゴヌクレオチドを合成した。また比較のため、上記
アゾベンゼン導入ウリジンの代わりにチミジンを導入す
る以外は全く同じ配列の、天然型のオリゴヌクレオチド
も同様にＤＮＡ合成機を使用して合成した。表１に合成
したオリゴヌクレオチドを示す。

【００３３】

【表１】

【００３４】次に、これに対応する相補鎖を加えて二重
鎖の安定性を、融解温度で評価した。融解温度測定の条
件を以下に示す。 ｐＨ（１０ｍｍｏｌ／リットルＮａ_２ＨＰＯ_４バッファ
ー）：７．０ オリゴヌクレオチド：５０μｍｏｌ／リットル 塩化ナトリウム：１ｍｏｌ／リットル 測定波長：２６０ｎｍ 温度掃引速度：−１．０℃／ｍｉｎ 測定温度範囲：６０℃〜−５℃

【００３５】以上の条件下で測定した融解温度を表２に
示す。ＵＶ光照射前のアゾベンゼン残基は８０％以上が
トランス体であった。ＵＶ照射は、オリゴヌクレオチド
を入れた試料に、キセノンランプをＵＶＤ−３６Ｃフィ
ルターを通して３００ｎｍ以上４００ｎｍ以下の光を１
０分間照射することにより行った。その結果、８０％以
上がシス体に変化した。融解温度は、融解温度曲線の一
次微分の極大値を与える温度として求めた。

【００３６】

【表２】

【００３７】このように、アゾベンゼン誘導体残基を結
合したオリゴヌクレオチドを、これとフルマッチの相補
鎖とハイブリダイズさせる場合、ＵＶ光照射により、即
ち、アゾベンゼンをトランス体からシス体にすることに
より、５℃以上も融解温度が変化することが明らかとな
った。更に驚くべきことに実験番号１に示した本発明の
オリゴヌクレオチドは、トランス体では、対応する従来
のオリゴヌクレオチド（実験番号５）より５℃以上融解
温度が高く、アゾベンゼンの導入により二重鎖形成能が
高くなっていることがわかる。一方比較例に示すように
従来の未修飾のオリゴヌクレオチドでは、ＵＶ照射前後
でほとんど融解温度の変化はなかった。この後、キセノ
ンランプをＬ−４２フィルターを通すことにより４２０
ｎｍ以上の可視光を１０分間照射したところ、８０％以
上がトランス体に戻った。上記と同じ条件で融解温度を
求めたところ、ＵＶ照射前の値と誤差範囲内で一致し
た。このように可逆的に融解温度が変化することが明ら
かとなった。上記の操作を５回繰り返したが、特に劣化
することなく可逆的にアゾベンゼン残基は異性化した。
それに伴い融解温度も可逆的に変化した。

【００３８】実施例４：ホスホアミダイトモノマーの合
成

【００３９】

【化７】

【００４０】テトラヘドロン(Tetrahedron)誌１９９８
年第３９巻９０１５〜９０１８頁に記載の方法に従い、
以下の手法でアゾベンゼンをオリゴヌクレオチドの側鎖
として導入した。まずジメチルスルホキシド（ＤＭＦ）
中で、ジシクロヘキシルカルボジイミドと１−ヒドロキ
シベンゾトリアゾールの存在下で反応させることによ
り、４−アミノアゾベンゼンを２，２−ビス（ヒドロキ
シメチル）プロピオン酸に、アミド結合によって導入し
た（上記式の１）。得られた化合物（上記式の１）はヘ
キサン−クロロホルム混合溶媒から再結晶することによ
り精製した。次にピリジン・塩化メチレン混合溶媒中で
４−ジメチルアミノピリジンの存在下で４，４−ジメト
キシトリチル（ＤＭＴ）クロリドと反応させることによ
り、化合物（上記式の１）の一方の水酸基をジメトキシ
トリチル基（ＤＭＴ）で保護した（上記式の２）。得ら
れた化合物（上記式の２）は、展開溶媒として塩化メチ
レン：トリエチルアミン：メタノール＝９０：５：１０
の混合溶媒を使用して、シリカゲル・クロマトグラフ法
により分離精製した。この後ザ・ジャーナル・オブ・オ
ーガニック・ケミストリー（The Journal of Organic C
hemistry)誌１９９７年第６２巻８４６頁に記載の方法
に従って、もう一方の水酸基にホスホロアミジドを付加
して、ホスホアミダイトモノマー（上記式の３）を合成
した。

【００４１】実施例５：光応答性オリゴヌクレオチドの
合成 ＤＮＡ合成機を用いて、実施例４で合成したホスホアミ
ダイトモノマーを使用して様々な配列を持つ本発明の光
応答性オリゴヌクレオチドを合成した。得られた光応答
性オリゴヌクレオチドには全て、ホスホアミダイトモノ
マー（上記式の３）の不斉炭素に基づく二つのジアステ
レオマーが存在し、これらは液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）で以下の条件で完全に分離することができ
た。 カラム：Merck LiChrospher 100 RP-18(e) 通液速度：1.0ml/min 展開溶媒：50mMの蟻酸アンモニウムを含むアセトニトリ
ル／水混合溶媒 その際、アセトニトリルの濃度が２５分で５％から２５
％に直線的に増加するような溶離条件で行った。以上の
条件で、保持時間の短い（先に溶出してくる）方のジア
ステレオマーを、以下の実験に使用した。合成した光応
答性オリゴヌクレオチドの一つ（光応答性オリゴヌクレ
オチド（６））を下記式に示す。

【００４２】

【化８】

【００４３】試験例：ＤＮＡ合成機を用いて、表３に示
す４種類の被験オリゴヌクレオチドａ，ｂ，ｃ，ｄを合
成し、上記実施例５で合成した光応答性オリゴヌクレオ
チド（６）との二重鎖形成能を測定した。オリゴヌクレ
オチドａは上記光応答性オリゴヌクレオチド（６）とフ
ルマッチの配列を有するオリゴヌクレオチドであり、ｂ
は上記光応答性オリゴヌクレオチドで光応答性有機基を
結合させた塩基に相当する塩基がＴではなくＧである配
列を有するオリゴヌクレオチドであり、ｃは上記光応答
性オリゴヌクレオチドで光応答性有機基を結合させた塩
基に相当する塩基がＴではなくＡである配列を有するオ
リゴヌクレオチドであり、ｄは上記光応答性オリゴヌク
レオチドで光応答性有機基を結合させた塩基に相当する
塩基がＴではなくＣである配列を有するオリゴヌクレオ
チドである。

【００４４】

【表３】

【００４５】１ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．１）に実施例５で合成した光応答性オ
リゴヌクレオチドを５０μＭの濃度となるように添加し
た水溶液を調製した。また、１ＭのＮａＣｌを含有する
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）に表３の４種の被
験オリゴヌクレオチドａ，ｂ，ｃ，ｄを各々５０μＭの
濃度となるように添加して、水溶液を調製した。上記で
調製した光応答性オリゴヌクレオチドの水溶液と、被験
オリゴヌクレオチドの水溶液の各々とを混合し、２６０
nmの吸光度を測定することにより、アゾベンゼン基がト
ランス体である場合のＴｍを求めた。また、各々の混合
液につき、３０℃で混合した時の２６０ｎｍの吸光度か
らアゾベンゼン基がトランス体である場合の二重鎖形成
量を測定した。次に、各々の混合溶液に 紫外線（波長
３００〜４００ｎｍ）を照射することにより、アゾベン
ゼンの構造をシス体とした。その後、上記と同様の方法
により、Ｔｍ、３０℃における二重鎖形成量を求めた。
各混合液の、アゾベンゼン基がトランス体である場合及
びシス体である場合のＴｍ、その差、及び３０℃におけ
る二重鎖形成量の差を表４に示す。

【００４６】

【表４】

【００４７】表４に示されるように、フルマッチの場合
の立体構造による二重鎖形成量の差と、１塩基のミスマ
ッチがある場合の立体構造による二重鎖形成量の差は著
しく異なる。従って、この値に基づき、フルマッチであ
るかミスマッチがあるかを検出することができる。

【００４８】

【発明の効果】本発明の光応答性オリゴヌクレオチドを
用いることにより、ＳＮＰの検出精度を著しく高めるこ
とができ、また長いオリゴヌクレオチドについても高い
検出精度でＳＮＰを検出できるため、ＳＮＰ解析の効率
を高めることができる。また、特定の体質や疾病を診断
する場合に、本発明の光応答性オリゴヌクレオチドを用
いて、該体質や疾病に関連するＳＮＰがあるか否かを検
出することにより、信頼性の高い結果を得ることができ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ Ｆターム(参考） 2G054 CA22 CB10 GA02 GA03 4B024 AA01 AA11 AA20 CA09 HA12 4B063 QA01 QA19 QQ42 QR32 QR55 QR66 QR84 QS03 QS32 QS36 QX02

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試験すべきオリゴヌクレオチドの配列と
   相補的な配列または１〜数塩基を除いて相補的な配列を
   有するオリゴヌクレオチドに特定波長の光の照射により
   構造異性化する有機基を１または複数個結合させてな
   り、試験すべきオリゴヌクレオチドとの二重鎖形成能を
   該光の照射により変化させることが可能なＳＮＰ検出用
   オリゴヌクレオチド。
2. 【請求項２】 上記光応答性有機基の結合位置が、ＳＮ
   Ｐが存在するか存在する可能性のある位置またはその近
   傍であることを特徴とする請求項１記載のＳＮＰ検出用
   オリゴヌクレオチド。
3. 【請求項３】 上記光応答性有機基が、特定波長の光の
   照射によりで可逆的に構造異性化する有機基であること
   を特徴とする請求項１または２に記載のＳＮＰ検出用オ
   リゴヌクレオチド。
4. 【請求項４】 上記光応答性有機基がアゾベンゼンまた
   はその誘導体の残基であることを特徴とする請求項１〜
   ３のいずれか１項に記載のＳＮＰ検出用オリゴヌクレオ
   チド。
5. 【請求項５】 上記光応答性有機基が、ポリメチレン鎖
   中の炭素原子に共有結合的に結合され、該ポリメチレン
   鎖の両端の炭素原子の各々が隣り合うヌクレオチドのリ
   ン酸基の各々に共有結合することにより、上記オリゴヌ
   クレオチドに結合していることを特徴とする請求項１〜
   ４のいずれか１項に記載のＳＮＰ検出用オリゴヌクレオ
   チド。
6. 【請求項６】 該光応答性有機基がヌクレオチドのリボ
   ースの２’位に共有結合することにより、上記オリゴヌ
   クレオチドに結合していることを特徴とする請求項１〜
   ４のいずれか１項に記載のＳＮＰ検出用オリゴヌクレオ
   チド。
7. 【請求項７】 該光応答性有機基が５’末端の、３’末
   端のまたはホスホジエステル結合を形成するリン酸基に
   直接または炭素原子数１〜１０のアルキレン基を介して
   共有結合することにより、上記オリゴヌクレオチドに結
   合していることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１
   項に記載のＳＮＰ検出用オリゴヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか１項に記載のＳ
   ＮＰ検出用オリゴヌクレオチドを１種類当たり１または
   複数個、１または複数種類固定化したＤＮＡチップ。
9. 【請求項９】 試験すべきオリゴヌクレオチドを、請求
   項１〜７のいずれか１項に記載のＳＮＰ検出用オリゴヌ
   クレオチドと接触させ、該有機基の立体構造の違いによ
   る二重鎖形成能の差を調べ、両オリゴヌクレオチドが完
   全に相補的である場合の差と比較することにより、両配
   列が完全に相補的であるか１〜数塩基を除いて相補的で
   あるかを判断することからなるＳＮＰの検出方法。
10. 【請求項１０】 請求項１〜７のいずれか１項に記載の
    ＳＮＰ検出用オリゴヌクレオチドを含むＳＮＰ検出用キ
    ット。