JPH11506795A - 脂質及び例えばリポソーム中でのその使用 - Google Patents

脂質及び例えばリポソーム中でのその使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞中の生物活性物質また分子の輸送に適する脂質に関する。好ましい脂質は、L-リシン-bis-(O,O'-cis-9-オクタデカノイル-β-ヒドロキシエチル)アミド ジヒドロクロリドまたはその光学異性体の１つである。更に、本発明は、DNA及びRNA等のポリアニオンを有するこれらの脂質の複合体及びポリアニオン及びポルカチオンと共に説明される脂質の三元複合体を含む。最後に、本発明は、生物活性物質及び上記脂質から作られるリポソーム形成、同様に、ポリアニオン、ポリカチオンまたは生物活性物質の生物学的膜を通るこれらの脂質に関しする輸送方法を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 脂質及び例えばリポソーム中でのその使用 本発明は脂質化合物及び、例えば細胞における生物活性物質や分子の輸送のた めのその使用に関するものである。 リポソームは脂質二重層からなる球形の自己閉鎖構造で、それらが浮遊してい る溶媒の一部をその内部に封入している。リポソームは一以上の同心状の膜から なり得、そのサイズは数nmから数十μmの範囲に及ぶ。 リポソームは、多くは同一分子上に親水基（極性頭部と呼ばれることが多い） と疎水基（非極性尾部）とを有することを特徴とする両親媒性分子からなる。ま た殆どの場合、リポソームを形成する分子は水に不溶性である。しかし、ある状 況の下ではコロイド状分散物を形成する。 リポソームには大きなものから小さいものがあり、一から数百の同心の二重層 からなり得る。リポソームは、サイズ及び層（ラメラ）の性質に関して、マルチ ラメラベシクル（MLV）、スモールユニラメラベシクル（SUV）、及びラージユニ ラメラベシクル（LUV）に分類することができる。 SUVは、20〜600nmの直径を有し、内部の水性区画を取り囲む単一の脂質二重層 からなる。LUVは、600〜30000nmの直径を有する。MLVは、サイズが最大10000nm までの広い範囲にわたり、二以上の脂質二重層を含み、従ってその構造が多重区 画型である。 リポソームはさまざまな方法で生成することができる。いわゆる「薄膜水和」 法により主にMLVの不均一な分散物が形成される。荷電脂質組成物を用いること により、LUVの部分をある程度大きくすることができる。前記分散物をさらに処 理して（機械的、電気的、あるいは化学的）、SUVの溶液を生成することができ る。これらの方法においては多くの場合、異なる直径の細孔を有するフィルタを 通す押し出し、あるいは超音波処理を使用する。 あるいは凍結乾燥によりリポソームを製造することができ、この場合、脂質薄 膜を揮発性溶媒（例えばt-ブチルアルコール）に溶解し、次いで凍結して凍結乾 燥する。 リポソーム製造のための様々な方法が、例えばSzoka及びPapahadjopoulos、An n．Rev．Biophys．Bioeng．9，467-508(1980)や、米国特許第4,229,360号、第4, 241,046号、第4,235,871号等の定期刊行物や特許文書に記載されている。 リポソームの最も重要な特徴は、リポソームが親水性分子または疎水性分子を 溶解し、保護し、かつ運搬する能力を有することである。ある種のタンパク質を 含む、負に荷電した薬物には正に荷電したリポソームを用いることができる。正 に荷電したリポソームが有毒であり得るという公知の事実にもかかわらず、治療 を改善するものであった。 この二十年間に様々なDNAトランスフェクション法が開発されてきた。このよ うな方法としては、リン酸カルシウム沈降法、DEAEデキストラン法、エレクトロ ポレーション法、マイクロインジェクション、レセプター媒介エンドサイトーシ ス、リポソーム及びウイルスベクターを用いる方法がある。しかし、このような 方法の多くは重大な欠点を有する。すなわちこれらの方法は、非効率的過ぎ、あ るいは毒性が強すぎ、あるいは複雑で時間がかかり過ぎ（tedious）、in vitro 及びin vivo両方での生物学的及び治療的プロトコルに有効に適合させられない 。例えば、最もよく用いられるin vitroリン酸カルシウム沈降法は効率が悪過ぎ る（平均トランスフェクション頻度は104個の細胞につき１回）。エレクトロポ レーションはリン酸カルシウム法よりずっと効率的である。しかしこの方法は攻 撃的過ぎ（約50%の細胞死で最大効率が得られる）、さらにこの方法には特殊な 装置が必要である。マイクロインジェクションは効率的であるが、時間がかかり 過ぎて実用的でない。またこのような方法はいずれもin vivoでは使用すること ができない。 レセプター媒介エンドサイトーシス法では、DNAの相互作用及びパッケージン グのための塩基性ポリマーとしてポリリシンを用いる。ポリリシンは、修飾タン パク質−DNA複合体を細胞表面のレセプターに向かわせるために、種々のリガン ド（トランスフェリン、インスリン、アシアロオロソムコイド、あるいはガラク トース）で修飾される(Wu，G.Y．ら、J.Biol．Chem．(1987)262:4429-4432、Cot ten，M．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)（1990）87:4033-4037、Huckett，B ．ら、Biochem．Pharmacol．(1990)40:253-263、及びPlank，C．ら、Bioconjuga te Chem． (1992)，533-539)。この方法は、不活性化アデノウイルスを用いてエンドソーム からのDNAの放出を促進することにより著しく改善された。Wagner，E．ら、Proc ．Natl．Acad．Sci.(USA)(1992)89:6099-6103、Christiano，R.J．ら、Proc．Na tl．Acad．Sci．(USA)（1993）90:2122-2126参照。上述の方法の主な欠点は、タ ンパク質抱合化学反応の調節、及びこのような抱合物を再生可能な形で製造する ことが本来的に不可能なことである。 現在、in vitro及びin vivoの両方での最良のトランスフェクション効率はレ トロウイルス、アデノウイルス等を用いることにより得られている。例えば、Ke rr，W.G．及びMule，J.J.、J．Leucocyte Biol．(1994)56:210-214、Hwu，P．及 びRosenberg，S．A.、Cancer Detect.Prevent．(1994)18:43-50、Rosenfeld，M. A．ら、Cell（1992）68:143-155を参照。しかし、ウイルスベクターを使用する ことは、過剰な細胞培養操作の必要性、ある種のウイルス系の低い力価、ウイル スの細胞指向性等のいくつかの考慮すべき事項を残している。さらに、ウイルス ベクターに対する免疫反応性も問題を起こすことがある。最も重要な点は、ウイ ルスベクターの使用に伴う安全性の問題が現在までのところ完全に解決されてい ないということである。 またin vitro及びin vivo両方において細胞にDNAを導入するためにリポソーム が用いられてきた。最も成功しているリポソーム系は、ジオレイルオキシプロピ ルトリメチルアンモニウム（DOTMA、ホスファチジルエタノールアミン（PE）と 組み合わせて試薬を形成する）、ジオレオイルオキシプロピルトリメチルアンモ ニウムメチルスルフェート（DOTAP）、ジメチルアミノエタンカルバモイルコレ ステロール、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、2,3-ジオレイルオキシ -N-(2-(スペルミンカルボキシアミド)エチル)-N,N-ジメチル-1-プロパンアミン （DOSPA）（PEを組み合わせて試薬を形成する）のような種々のカチオン性脂質 を用いるものである。Felgner，P.L、Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)（1987）84 :7413-7417、米国特許第5,208,036号、Leventis，R．及びSilvius，J.R.、Bioch imica et Biophysica Acta(1990)，124-132、Gao，X．及びHuang，L.、Biochem ．Biophys．Res．Commun．(1991)179:280-285、Behr，J.-P．ら、Proc．Natl．A cad．Sci．(USA)（1989）86:6982-6986を参照。 上述の化合物を使用することの利点は、カチオン性リポソームが単純にDNAと 混合され、細胞に加えられるという点である。トランスフェクション効率は通常 、他の物理的DNA移入方法より高い。DNAのデリバリーの他、mRNA及びタンパク質 の培養細胞へのデリバリーのために特別な化合物が用いられている。Malone，R ．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)(1989)86:6077-6081及びDebs，R．ら、J． Biol．Chem．(1990)265，10189-10193を参照。上述の化合物の中には、リポータ ー遺伝子または治療的に使用される遺伝子をin vivoでトランスフェクトするた めに用いられるものもある。Nabel，G.J．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)(1 993)90:11307-11311、Zhu，N．ら、Science（1993）261:209-211を参照。さらに は、環状カチオン性ペプチドグラミシジンＳ及びPEを利用したDNAトランスフェ クションプロトコルが開発されている。Legendre，J.-Y．及びSzoka，F.C.、Pro c．Natl．Acad．Sci．(USA)(1993)，90:893-897を参照。上述の系はグラミシジ ンＳのDNA結合能及び膜不安定化特性を利用している。 カチオン性リポソームの主たる不利な点として、その細胞毒性が比較的高いこ とがある。さらに上述の化合物の多くは血清の存在下で不活性であるか、あるい は著しく低い活性を示す。これらの化合物の殆どはPEの使用を必要とするが、こ れは膜融合を促進する膜内脂質中間体をPEが形成し得るためであると考えられる 。カチオン性脂質を用いるトランスフェクションに係わるメカニズムについては 現在まで十分に研究されてこなかった。従って、生物学的分子の、生細胞の細胞 質及び核への、毒性が少なく非感染性でより効率的なデリバリーに対する必要性 が存在している。 本発明の目的は、現状の技術の上述した欠点及びその他の欠点を克服すること である。第一の形態として、膜を通しての生物活性物質や分子の輸送、従って細 胞または細胞オルガネラへの輸送を改善することを可能とするために提供される べき脂質化合物がある。 この目的は主として請求項１に記載の化合物により解決される。好ましい化合 物は従属請求項2〜11に記載する。本発明の新規な化合物の誘導生成物及び用途 については、請求項12〜24（複合体）、請求項25及び26（複合体の製造方法）、 請求項27（リポソーム）、請求項28〜32（リポソーム製剤）、及び請求項33〜 42（膜を通しての物質または薬剤の輸送方法）に記載する。これらの全ての請求 項の記載内容を引用により本明細書に含める。 本発明の化合物は下記の式Ｉによって示される。 式中、R1及びR2は同一であるかあるいは異なってもよく、6〜24個の炭素原子 を含むアルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、 R3、R4及びR5は同一であるかあるいは異なってもよく、水素、1〜8個の炭素原 子を含むアルキル基、もしくはアルキルアミン、またはアミノ酸、アミノ酸誘導 体、ペプチド、あるいはペプチド誘導体であり、 Wは水素、カルボキシル基、またはアミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチドもし くはペプチド誘導体の側鎖であり、 Yは少なくとも一個の水素以外の原子を有する連結基、特に-CO-、-(CH2)mCO- 、-(CH2-)m、-(CHOHCH2-)m(mは1〜20である）、-CH2-S-CH2-、-CH2-SO-CH2-、-C H2-SO2-CH2-、-CH2-SO2-または-SO2-であり、 Zは、エステル、エーテル、またはアミド結合であり、 nは、1〜8であり、 Xは、アニオン、特に医薬上許容されるアニオンである。 本発明の化合物は、脂質（洗剤、界面活性剤）を含み、その主要な性質は周知 のものである。式Ｉの構造を有する化合物は、その光学異性体（R-またはS-配置 ）、またはその混合物の形態で存在し得る。 式Ｉによれば、前記脂質化合物はイオン性塩の形態で製造される。これは、そ れ自体中性の化合物は（水）溶液中でイオンとして存在するということによる。 本発明が対応する中性の化合物もその範囲に包含することはいうまでもない。式 Ｉの化合物は、置換基を適当に選択することによりさらに荷電し得る。例えばア ミノ酸の側鎖を適当に選択することにより置換基Wにおいてさらに荷電し得る。 請求の範囲及び明細書の理解を助けるために、以下、用語の定義について記 す。 アルキルは、分岐または直鎖の完全飽和炭素鎖ラジカルをいう。 アルケニルは、分岐または直鎖の１以上の二重結合を有する不飽和炭素鎖ラジ カルをいう。 アルキニルは、分岐または直鎖の１以上の三重結合を有する不飽和炭素鎖ラジ カルをいう。 アミノ酸は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のモノマー単位をいう 。20種のタンパク質アミノ酸（L異性体）は、アラニン（A）、アルギニン（R） 、アスパラギン（N）、アスパラギン酸（D）、システイン（C）、グルタミン（Q ）、グルタミン酸（E）、グリシン（G）、ヒスチジン（H）、イソロイシン（I） 、ロイシン（L）、リシン（K）、メチオニン（M）、フェニルアラニン（F）、プ ロリン（P）、セリン（S）、スレオニン（T）、トリプトファン（W）、チロシン （Y）、及びバリン（V）である。本明細書で使用する「アミノ酸」の用語は、タ ンパク質アミノ酸の類似体、タンパク質アミノ酸のＤ異性体、β-、γ-、及び他 のアミノ酸、非天然のアミノ酸、及びそれらの類似体も包含する。 生物活性物質とは、in vitro及び／またはin vivoで生物学的効果を発揮する 任意の分子、分子の混合物または複合体をいい、医薬品、薬剤、タンパク質、ス テロイド、ビタミン、ポリアニオン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレ オチド等を含む。 本明細書でいうバッファーには、Hepes、PBS、トランスフェクションバッファ ー、トリスが含まれ、HepesはN-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンス ルホン酸であって、pHが約７のバッファーとして使用され、PBSはリン酸緩衝食 塩水であって、10mMリン酸塩及び0.9重量%NaClであり、pH7.4の等張の生理的バ ッファーとして使用され、トランスフェクションバッファーは、10mM Hepes及び 0.9重量% NaClであり、pHが約7.4のバッファーとして使用され、トリスはトリス （ヒドロキシメチル）アミノメタンであって、これもpHが約７のバッファーとし て使用される。 細胞に適用される細胞を指向する（cell-targeted）複合体またはリポソーム は、例えばその表面上に、前記指向細胞の表面上の成分を認識できる分子をさら に含む。細胞認識成分としては、細胞表面レセプターに対するリガンド、細胞表 面抗原に対する抗体等がある。 電荷遮蔽された（charge-masked）複合体またはリポソームは、正に荷電した 、例えばリポソーム表面をカバーする結合ポリマー及び式Iの化合物を含むもの として理解されるべきものである。ポリマーはリポソームを形成する任意の脂質 に共有結合し得、あるいはその表面に吸着され得る。 複合体は、二以上の成分の混合により生成される生成物として定義される。こ のような複合体は、二以上の成分間の非共有結合性の相互作用（イオン性、親水 性、疎水性等）を特徴とする。 DNAは、非天然のヌクレオチドを含み得るデオキシリボ核酸を表す。DNAは、一 本鎖または二本鎖のものであり得る。 薬剤は、ヒトや動物の疾病の予防、診断、緩和、処置、または治療において使 用される任意の予防的あるいは治療的な化合物をいう。 リポソーム製剤は、診断的用途、生物学的用途、治療的用途、あるいはその他 の用途のための物質を内包したリポソームを含む物質の組成物である。 任意の共存脂質（optional co-lipid）とは、それのみかあるいは他の脂質成 分と組み合わせて安定なリポソームを生成することができる化合物と理解される べきものである。任意の共存脂質の例としては、レシチン、ホスファチジルコリ ン、ジオレイルホスファチジルコリン（DOPC）、ホスファチジルエタノールアミ ン（PE）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジ ルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファ チジン酸（phosphatic acid）、セレブロシド、ジセチルホスフェート等のリン 脂質関連物質や、ステロイド及びテルペンのような非リン含有脂質が挙げられる 。別の非リン含有脂質としては、例えばステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘ キサデシルアミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレエート、ヘキ サデシルステアレート、イソプロピルミリステート、ジオクタデシルアンモニウ ムブロミド、両性ポリマー、トリエタノールアミンラウリルスルフェート、及び 前述のカチオン性脂質等が挙げられる。 医薬上許容されるイオンは、それ自体無毒性のイオンである。 ポリアニオンは、ポリマーの二単位以上が負の電荷を有し、ポリマーの正味の 電荷が負であるようなポリマー構造である。 ポリカチオンは、ポリマーの二単位以上が正の電荷を有し、ポリマーの正味の 電荷が正であるようなポリマー構造である。 ポリヌクレオチドとは、二以上のヌクレオチドを含むDNAまたはRNAである。ポ リヌクレオチドは、環状ヌクレオチド及び非天然ヌクレオチドを含むことを意図 するものであり、化学的方法、組換え技術、あるいはその両方により製造できる 。 ポリペプチドは、共有結合で結合された二以上のアミノ酸の配列と理解される べきものである。 RNAは、非天然のヌクレオチドを含み得るリボ核酸を表す。RNAは一本鎖あるい は二本鎖であってよい。 上記の式Ｉの化合物は、Yとしてカルボニル基、すなわち-CO-を含んでいるの が好ましい。これにより、ペプチド結合型、すなわち-CO-N＜の結合が生じる。 式Ｉの脂質化合物において、Z基は、エステル結合、すなわち-O-CO-基を含む のが好ましい。 さらに好ましい態様においては、R1及びR2は、10〜20個の炭素原子、好ましく は12〜18個の炭素原子のアルキルまたはアルケニル基を含む。基R1及びR2は同じ ものであることが好ましい。前述の好ましい基のなかではアルケニル基が好まし い。従って、基R1及びR2は、パルミチル基あるいはステアリル基の他、好ましく はオレイル基あるいはリノール酸の部分を含む。 式Ｉにおいて、nは２であるのが好ましい。さらに基Wは塩基性アミノ酸の側鎖 、特にリシンまたはオルニチンの側鎖であることが好ましい。 基R3、R4、及びR5は、1〜8個の炭素原子を有するアルキル基、特にメチル基で あり得る。このR3、R4、及びR5の３つの基は同じものであることが好ましい。特 に好ましい態様では、R3、R4、及びR5が水素である。 一般に、考えられるアニオンはいずれも対イオンXとして用いることができ、 本発明の殆どの用途については医薬上許容されるアニオンが好ましい。好ましく は、Xはハライドアニオン、特にクロリドイオンとすることができる。 好ましい式Ｉの化合物は請求項10に記載されており、特にこれを引用する。特 に好ましい化合物は、L-リシン-ビス-(O,O'-シス-9-オクタデセノイル-β-ヒド ロキシエチル)アミド-ジヒドロクロリドあるいはその光学異性体である。 式Ｉの定義に包含され、本発明の好ましい化合物は、以下に記載のカップリン グ： アミノ酸または ---- ジアルカノールアミン ---- 脂肪酸または ペプチド 脂肪アルコール を用いて対応する化合物を調製することにより製造できる。 このように製造できる化合物は以下に記載する用途に特に適している。前記化 合物は特に、同様な用途に使用されるこれまでに知られた脂質化合物よりもその 毒性がかなり低いことを特徴としている。 上記の脂質化合物の他、本発明は、前記した新規な化合物により製造される複 合体を包含する。「複合体」という表現は上記の定義の意味で理解されるべきも のである。これは必ずしも完全に形成されたリポソームである必要はない。しか し、複合体形成の正確なメカニズムは判明していないので、最初に脂質からリポ ソームが形成され、これがポリアニオン、ポリカチオン、及びその複合体と複合 体を形成する場合は本発明から排除されるものではない。 本発明の複合体の特徴は請求の範囲に記載されており、請求項12〜17、及び請 求項18〜24にそれぞれ記載されている。これらの請求項を明示的に引用する。複 合体の形成は、本発明の化合物が正に荷電しているという事実に本質的に基づく ものである。 脂質化合物と複合体の他の成分との比率、すなわち（二成分の）ポリアニオン −脂質複合体中のポリアニオンと脂質化合物との比率は、所望の用途に応じて広 範囲に変化させることができる。脂質化合物からみてこの比率は１：１より大き くし（荷電を考慮して）、複合体が正の総荷電あるいは正味の荷電を有して負に 荷電した生物学的膜の表面と単純な形態で相互作用できるようにするのが好まし い。必要ならば特に有利な比率を実験的に求める。すなわち、例えばDNAのトラ ンスフェクションにおいては、トランスフェクトDNAの最適な発現が得られるよ うなDNAと脂質化合物との比率を実験により求める。 一般に、本発明の複合体は全ての分子を負に荷電させたものとして実現するこ とができる。好ましいのは、ポリアニオンとしてポリヌクレオチドを用いた複合 体である。 請求項18〜24に記載した三元複合体では、ポリカチオンがポリペプチドである のが好ましい。一般に、同様に本発明の範囲に含まれるポリヌクレオチド−ポリ ペプチド−脂質三元複合体の形成のために中性ポリペプチドを用いることが可能 である。 驚くべきことに、三元複合体形成の際に例えばポリペプチドを用いることによ り、ポリヌクレオチドのトランスフェクションがポリヌクレオチド−脂質複合体 を使用した場合と比較して著しく増加することが見出された。好ましくは請求項 23に記載のペプチド配列を用いることができる。この請求項の記載を明示的に引 用する。第一の配列は、Ｂ型肝炎ウイルス（NBV）の核タンパク質のＣ末端部分 を示す。現時点では最終的な科学的説明がなされていないが、三元複合体におけ るこれらのペプチド配列の有用な効果と、該配列における塩基性アミノ酸の比較 的高い割合とは相関性を有し得るようである。 特定の用途のための上記の複合体は、所望に応じて電荷遮蔽し、あるいは特定 の細胞または細胞オルガネラとの相互作用のために細胞を指向するものとし得る 。 さらに本発明は、請求項25及び26に記載の、本発明の複合体の製造方法を含む 。製造及びそれにおける接触は当業者に周知の通常の方法により行う。すなわち 、例えば二成分の複合体の製造においては、ポリアニオンと脂質化合物とをそれ ぞれ含むバッファー溶液を合せる。これに相当する方法で三元複合体の製造も行 い、この場合、最初にバッファー溶液中にポリアニオン−ポリカチオン複合体を 得、その後このバッファー溶液を脂質化合物を含むバッファー溶液と合せる。 さらに本発明は、本発明の脂質化合物の少なくとも一種から製造できる、ある いは製造されたリポソームを包含する。リポソームの製造は現在の技術において 周知の慣用的な方法で行う。 さらに本発明は、少なくとも一種の生物活性物質（物質または分子等）及び一 種の脂質成分を含む水溶液中のリポソーム製剤を包含する。この場合、脂質化合 物は少なくとも一種の本発明の脂質化合物を含む。生物活性物資及び脂質成分の 他に、リポソーム製剤は水溶液の通常の溶液成分を含み、該水溶液は、純水、あ るいは好ましくは慣用のバッファー溶液であり得る。 請求項28に記載したように、単一の式Ｉの化合物あるいはそのような化合物の 混合物を脂質成分として用いることができる。さらに、本発明の化合物の一種以 上を、前に定義した別の共存脂質、例えば混合物としたPE、POPEとともに用いる ことが可能である。 リポソームの製造が可能である限り生物活性物質の量は一般的に重要ではない 。通常、生物活性物質はリポソーム製剤中に10重量%まで存在させる。下限とし ては、例えば0.01重量%という数値が挙げられる。1〜5重量%の生物活性物質の濃 度範囲が好ましい。 本発明の化合物は、好ましくは前記脂質成分の1%〜100%の量とし得る。リポソ ーム製剤の好ましい態様においては、一種以上の共存脂質が存在し、そのような 共存脂質が脂質成分の30〜70%の量を占めるものである。 生物活性物質が薬剤である場合、その量は所望の治療に従い、慣用的なものと して選択し得る。好ましくはリポソーム製剤中に1〜5重量%の薬剤が存在するも のとする。生物活性物質として適用される薬剤の場合には、リポソーム製剤中に 医薬上許容される賦形剤を含めることができる。 上記したように、本発明の複合体とともに、本発明のリポソームあるいはリポ ソーム製剤は、任意に電荷遮蔽し、あるいは特定の細胞と相互作用するように細 胞を指向するものとし得る。 さらに本発明は、ポリアニオンあるいはポリカチオンを移入する方法、あるい は一般的に生物膜を通して生物活性物質を移入する方法、特に細胞または細胞オ ルガネラに移入する方法を包含する。この点については特にそれぞれ請求項33〜 38、及び39〜42を引用する。本発明の方法には、本発明の化合物自体、あるいは そのような化合物を含む組成物を使用し得る。 in vivoでのインキュベーションにより前記方法を実施する間に、例えばポリ エチレングリコールのような追加的な安定剤を含めてもよい。 本発明の方法をさらに詳細に以下に記載する。 本発明の化合物及びその他の部分は種々の利点を有する。本明細書に記載し た化合物の一つの利点は、便利なプロトコールによりポリアニオン性物質を100% まで封入させ得るということである。一方、正の荷電を有する複合体を負の荷電 を有する細胞表面とインキュベートすると、特にポリアニオン性物質及びその他 の一般的な生物活性物質の迅速で良好な取り込みが起こる。後者によれば、複合 化あるいは包含された例えばＤＮＡのようなポリアニオン性の物質をそのような 細胞についてこれまで知られていなかったような量で導入することが可能となる 。 本明細書に記載した化合物の特別な利点は以下の通りである。第一に、これら の化合物は新規なリポソーム形成脂質である。式Ｉの化合物における両方の脂質 鎖の形状によりそれらが安定な二重層構造に構成されることが可能となる。極性 頭部(例えばアミノ酸)は用途により変更することができる。これにより、例えば アミノ基、側鎖あるいは結合に対する種々の修飾を容易に導入することが可能と なる。本明細書に記載したカチオン性化合物の殆どのものの細胞毒性は、その他 のカチオン性両親媒性化合物について報告されたものより有利なものである。式 Ｉに示された全ての結合は細胞中で容易に加水分解され、非毒性の化合物が形成 される。 さらに、式Ｉの正に帯電した脂質は、現状の技術によるその他のカチオン性脂 質に比較して、血清の存在下で改良されたトランスフェクション効率を有する。 定常的に血清が存在する中で細胞をトランスフェクトする能力は多くの理由から 有利であり、すなわちより容易により時間をかけずにトランスフェクションが生 じ、媒体あるいは血清についての要件が減じられ、細胞の機能や生存性を害し得 る細胞における血清の枯渇を起こすことがない。 開示されている現状の技術に対する第二のユニークな利点は、三元複合体にポ リヌクレオチド(特にＤＮＡ)を導入する新規な方法により得られる。この複合体 は特に式Ｉの正の荷電を有する脂質及びポリヌクレオチドとポリペプチドとから 形成された複合体から形成される。前記方法によれば、ポリヌクレオチド-カチ オン性ポリペプチドからなる第一の複合体が形成され、これはその後の段階で正 の荷電を有する式Ｉの脂質と複合化される。組成を正確に制御することにより最 終的な複合体の生物活性が決まる。 現状の技術において公知のトランスフェクション段階に対するこの方法の利 点は、例えば、この新規な方法により300倍高いトランスフェクション効率が得 られるということである。さらに、この新規な方法を使用することにより、トラ ンスフェクションの検出（例えば発現されたタンパク質の検出）は、トランスフ ェクションの開始から２時間未満で容易に記録される。さらにこの新規な方法で は細胞トランスフェクションの「微小スケール」での作業（例えば96ウェルサイ ズ）が可能となり、これは多数のサンプルのスクリーニングに要望されるもので あり全体の工程を自動化することを可能とする。 式Ｉの化合物はリポソームの製造に特に有用であるが、カチオン性脂質が用い られるその他の用途にも使用できる。例えば、工業的な用途に使用できる。特に 重要なのは、医薬製剤（クリーム、ペースト、ゲル、コロイド状分散物等）及び ／または化粧用組成物（メイクアップ、リップスティック、ポリッシュ、ボディ ローション、モイスチャライジングクリーム、シャンプー等）に許容されるカチ オン性脂質と組み合わせた前記化合物の用途である。 式Ｉの化合物を含む製剤は、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、ステ ロイド及びその他の天然あるいは合成化合物の所望の細胞内デリバリーを得るの に有利である。この細胞内デリバリーは、細胞質、核、あるいはその両方の中へ のものとし得る。この細胞内デリバリーは、組織培養中（in vitro）で得ること ができ、例えば細胞に所望のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）をトランスフェ クトすること、タンパク質のデリバリー等に使用し得る。 式Ｉの化合物を含む製剤はex vivo治療においても使用でき、その場合、生物 から単離された細胞をin vitroでトランスフェクトし、その後生物に移植する。 この用途の例は骨髄細胞のトランスフェクションである。 また細胞内デリバリーは、生物全体(in vivo)においても得ることができ、従 って、遺伝子治療、アンチセンス及びアンチ遺伝子治療のようないくつかの用途 に有用であり得る。またin vivoにおける細胞内デリバリーは、所望のタンパク 質に対する免疫反応（体液性及び／または細胞性）を誘発する目的のＤＮＡワク チン接種のために使用し得る。 式Ｉの化合物を使用する細胞内デリバリーは、抗癌及び抗ウイルス化合物、抗 生物質等のデリバリーにも有用である。 例えばベシクルの表面に抗体、細胞表面レセプターに対するリガンドのような 細胞認識化合物を導入することにより細胞選択性を得ることができる。ポリマー 及び中性あるいは負に帯電した脂質のような電荷隠蔽性の適当な天然あるいは合 成化合物でリポソームベシクルを被覆することによりさらに高い安定性と別の選 択性が得られる。 式Ｉの化合物を含むリポソームベシクルは、リポソーム中に導入した対象とす る抗原に対する特異的な免疫反応を誘発するために使用し得る。N-パルミトイル -S-(2,3-ビス(パルミトイルオキシ)-(2RS)-プロピル)-R-システイン(Pam3Cys)あ るいはN-アセチル-ミラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン(MDP)及びその誘導 体等のような付加的な化合物が特に有用であり得る。 式Ｉの化合物は、ポリマー、特にペプチドに親油性部分を導入して細胞による その取り込みを増強すること、あるいは脂質含有ベシクル等への導入を増強する ことに有用である。活性化された式Ｉの化合物はタンパク質を修飾するのにも使 用できる。 これまで示してきた本発明の構成のさらに詳細は、製造方法、脂質化合物及び その用途の例についての以下の記載から明らかであろう。各実施例の記載におい ては添付の図面を引用する。 選択された式Ｉの化合物の製造方法 当業者であれば、周知の方法を使用して、容易に付加、欠失あるいは置換を生 成し、好ましいポリペプチドアミノ酸配列を増加もしくは減少させ、あるいは単 に異なるカチオン性ポリペプチドをコードする別の配列を使用できるが、そのよ うな変形は本発明の範囲内にあるものと理解されなければならない。また以下の 実施例は説明の目的のためのみのものであって、いかなる意味においても本発明 を限定するものと解してはならない。 この反応スキームは、Zがエステル結合でありnが２である式Ｉの好ましい化合 物の合成に使用できる。この反応スキームにおいて、P1及びP2は保護基であり、 同一でも異なってもよく、Wはアミノ酸の側鎖であり、R1及びR2は同一で６〜24 の炭素原子を有するアルキルまたはアルケニルである。 式(A)の化合物は、光学的に純粋な形態のものが市販品として入手可能である 。式(B)の化合物の形成を行うために、式(A)のアミノ酸のカルボキシル基を適当 な試薬で活性化し、次いでジエタノールアミンのイミノ基と反応させる。アミノ 酸の活性化方法は当分野で知られている。例えば、ジシクロヘキシルカルボジイ ミド/N-ヒドロキシスクシンイミド法を、保護アミノ酸のエピマー化を生じない アミド化に使用できる。 式(B)のアミドは、式(A)のアミノ酸及び予め形成したN-ヒドロキシスクシン イミドの塩及びジエタノールアミンを例えばジメチルホルムアミドのような適当 な極性溶媒中に溶解することにより製造できる。混合物を0℃に冷却し、次いで ジシクロヘキシルカルボジイミドの溶液を加える。この反応は、溶液を0℃で１ 時間、室温で８時間攪拌することにより行うことができる。その後得られる式(B )のアミドは何らかの標準的な分離手段により回収する。 式(C)の化合物を形成するためには、式(B)のアミドを適当な溶媒(例えばジク ロロメタン)に溶解する。これに適当な二級アミン、例えばトリエチルアミンを 過剰モル量で加える。混合物を約0℃に冷却する。所望の鎖長と不飽和度を有す るアルキル化剤を過剰モル量、好ましくは式(B)のアミドの約３倍〜約４倍の量 で加える。例えば、オレオイルクロリドを使用して9-オクタデカノイル基の付加 を行うことができる。次いでこの混合物をN2雰囲気下に室温で約３時間攪拌する 。その後式(C)の生成物を抽出する。 次いで式(C)の化合物を、使用した保護基に応じて適当な方法で脱保護し、抽 出し、クロマトグラフィー手段によりさらに精製する。 実施例１ L−リシン−ビス（O,O'−オレオイル−βヒドロキシエチル）アミド ジヒドロク ロリド（1） Boc−Lys(Boc)−OH *DCHA（2.63g、5mmol）をエチルアセテートに懸濁し、氷温 の2M H2SO4を用いて遊離酸に転換した。エチルアセテート中のBoc−Lys(Boc)−O HをMgSO4で乾燥し、乾燥するまで蒸発させた。残りの油は1.1g（5mmol）のN-ヒ ドロキシサクシンイミドの予備的に準備された塩及びジエタノールアミド(HOSu* N(EtOH)2)を含有する約15mlのジメチルホルムアミド（DMF）に溶解され氷水中で 0℃で冷却された。かき混ぜている間に、DMF 5ml中のジシクロヘキシルカルボジ イミド(DCC)1.13g(5.5mmol)が混合物に添加され、0℃で１時間、室温で８時間継 続して攪拌された。混合物は真空乾燥により濃縮された。エチルアセテート約50 mlを残りに添加した後、ジシクロヘキシル尿素(DCU)の大部分 は沈殿され、濾過される。エチルアセテート相は0.1M NaCl中NaHCO3(5%)クエン 酸(5%)水溶液により洗浄され、MgSO4により乾燥され、乾燥蒸発により1.7gの無 色油の未精製生成物を得た。 ジクロロメタン(DCM)50ml中のBoc−Lys(Boc)−N(EtOH)2溶液1.7g(3.92mmol)、テ トラアミン1.64ml及びオレオイルクロリド3.93mol(それぞれ11.7mmol)を0℃で30 分間、N2存在下、暗室中、室温で４時間攪拌した。混合物は、メタノールにより 冷却され、真空で濃縮され、ヘキサン中で再溶解され、0℃でメタノール／水(1: 1体積)中の0.1M KOHで３回、0.1M水性NaClで１回洗浄された。ヘキサン相は真空 で濃縮され、残りは50mlのトリフロロ酢酸(TFA)／DCM(1:1体積)で40分間室温で 処理された。混合物は、繰り返しトルエンと混合され、真空で再濃縮され、その 後シリカゲル60のカラムのクロロフォルムに添加された。カラムは、クロロフォ ルム中のメタノールの上昇勾配で溶出され、純粋化合物(2.3g、収率62%)が約20% メタノールで溶出された。生成物をHClガスで飽和された乾燥エチルアセテート に溶解し、乾燥により蒸発させてヒドロクロリドを調製した。、(分析:ES−MS M ol.測定質量=762(計算値=762);エチルアセテート:酢酸:水=(4:1:1)中TLC:Rf=0.6 9; HPLC:Rt=14.19分;カラム ヌクレオシル C2 4.0 x 100mm、0.1%のTFAが入 った水のアセトニトリル30から90%の勾配を20分間で)。 同じようにして、但し出発物質を適する物質に代えて、以下の化合物を調製した : L-リシン-ビス-(O,O'-パルミトイル-β-ヒドロキシエチル)アミド ジヒドロクロ リド (2) L-リシン-ビス-(O,O'-ミリストイル-β-ヒドロキシエチル)アミド ジヒドロクロ リド (3) L-オルニチン-ビス-(O,O'-ミリストイル-β-ヒドロキシエチル)アミド ジヒドロ クロリド (4) L-オルニチン-ビス-(O,O'-オレオイル-β-ヒドロキシエチル)アミド ジヒドロク ロリド (5) L-オルニチン-ビス-(O,O'-パルミトイル-β-ヒドロキシエチル)アミド ジヒドロ クロリド (6) L-アルジニン-ビス-(O,O'-オレイル-β-ヒドロキシエチル)アミド ジヒドロクロ リド (7) L-アルジニン-ビス-(O,O'-パルミトイル-β-ヒドロキシエチル)アミド-ジヒドロ クロリド (8) L-セリン-ビス-(O,O'-オレイル-β-ヒドロキシエチル)アミド ジヒドロクロリド (9) グリシン-ビス-(O,O'-パルミトイル-β-ヒドロキシエチル)アミド ジヒドロクロ リド (10) サルコジン-ビス-(O,O'-パルミトイル-β-ヒドロキシエチル)アミド ジヒドロク ロリド (11) L-ヒスチジン-ビス-(O,O'-パルミトイル-β-ヒドロキシエチル)アミド ジヒドロ クロリド (12) L-グルタミン-ビス-(O,O'-パルミトイル-β-ヒドロキシエチル)アミド ジヒドロ クロリド (13) 実施例２ N-α-tert-ブトキシカルボニル-L-アスパラギン酸-α-N'-ビス(O,O'-パルミトイ ル-β-ヒドロキシエチル)アミド (Boc-Asp-N(EtOPalm)2(14)及び N-α-フロオレニルメチルオキシカルボニル-L-アスパラギン酸-α-N'-ビス-(O,O '-パルミトイル-β-ヒドロキシエチル)アミド (Fmoc-Asp-N(EtOPalm)2(15)の合 成。 Boc-Lys(Boc)-N(EtOH)2を調製するために、化合物Boc-Asp(OBzl)-N(EtOH)2が上 記と同様に調製された。化合物Boc-Lys(Boc)-N(EtOOL)2の小さな変性と同様にし て化合物Boc-Asp(OBzl)-N(ErOPalm)2が調製された。反応は終夜行なわれ、 混合物はエチルアセテートで希釈し、そしてNaHCO3の飽和水溶液へ注入して、残 ったパルミトイルクロリド及び沈殿パルミン酸(palmitate)ナトリウムを破壊し た。沈殿は濾過除去され、有機相は乾燥蒸発され、熱いメタノールで再溶解され た。生成物は冷たいメタノールで沈殿され、濾過により収率55%で収集された(ク ロロフォルム:メタノール=100:2中、TLC:Rf=0.64)。15mlDMF中の調製されたばか りのPdブラック(約0.1g)の存在下、NH4COOH(0.65g)で終夜処理することにより、 ベンジル-保護基は生成物(1.5g)から除去される。Pdブラックは、濾過除去され 、混合物は真空で蒸発された。残りはメタノール/水溶液により沈殿され、望む 生成物Boc-Asp-N(EtOPalm)2(14)が収率85%で得られた。(分析:ES-MS:Mol.測定質 量=796,5(計算値=796);クロロフォルム:エチルアセテート:メタノール=9:3:1中 、TLC:Rf=0.4) 0.5g(0.62mmol)のBoc-Asp-N(EtOPalm)2は、TFA/DCM=1:1の混合物で30分間室温で 処理された。混合物は再度トルエンで蒸発された。残りは10mlのDMFに溶解され 、ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)で中和され、1.2倍量の9-フルオレニルメ チル-サクシンイミジル-カルボネイト(Pmoc-OSu)と２時間反応させた。反応混合 物は蒸発され、メタノールで再溶解された。望む化合物のFmoc-Asp-N(EtOPalm)2 (15)は沈殿され、収率77%で0.44ｇの化合物が得られた。(分析:クロロフォルム: エチルアセテート:メタノール=9:3:1中TLC:Rf=0.4) 同様の手順を用いて、但し出発物質を適する物質に代えて、以下の化合物を調製 した: N-α-tert-ブトキシカルボニル-L-グルタミン酸-γ-N'-ビス-(O,O'-パルミトイ ル-β-ヒドロキシエチル)アミド Boc-Glu(N(EtOPalm)2)-OH (16) N-α-フルオレニルメチルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-γ-N'-ビス-(O,O'- パルミトイル-β-ヒドロキシエチル)アミド Fmoc-Glu(N(EtOPalm)2)OH (17) N-α-tert-ブトキシカルボニル-L-アスパラギン酸-β-N'-ビス-(O,O'-パルミト イル-β-ヒドロキシエチル)アミド Boc-Asp(N(EtOPalm)2)OH (18) 加えて、これらの合成のまたは上記合成の中間体はリポソームの調製に使用する ことができる: L-グルタミン酸-γ-N'-ビス-(O,O'-パルミトイル-β-ヒドロキシエチル)アミド H-Glu(N(EtOPalm)2)-OH (19) L-アスパラギン酸-β-N'-ビス-(O,O'-パルミトイル-β-ヒドロキシエチル)アミ ド H-Asp(N(EtOPalm)2)-OH (20) L-アスパラギン酸-α-N-ビス-(O,O'-パルミトイル-β-ヒドロキシエチル)アミド H-Asp(N(EtOPalm)2) (21) DNA及び化合物(1)から作られた複合体の調製及び特徴 実施例３ 蛍光研究。蛍光測定が１cmの光パッチ細胞で励起及び放射のためのスリット幅10 nmとして、アミンコ(Aminco)SPF-1000Scスペクトロフォトメーターにより行なわ れた。核酸に対する(1)の結合は、DNAベースペア間の挿入(インターカレーショ ン)において蛍光プローブの役目を果たすエチジウムボロミドの置換により観察 された。エチジウムブロミド(5μg/ml子牛の胸腺DNA、8 x 10-6 M bp(ベースペ ア);ヘペス10mM、150mM NaCl、pH7.4中、臭化エチジウム1:50bp)と複合されたDN Aに(1)の増加分量を添加後、蛍光は即座に測定された。臭化エチジウム置換は、 DNAから解離した時に起るエチジウムブロミド蛍光(励起=540nm、放射=600nm)の 低減によりモニターされた(図1)。蛍光強度は、カチオン性脂質の濃度の増加と 共に徐々に低減した。蛍光の消滅がこれ以上起らない(1)及びDNA間の比は約6:1( W/W)であった。得られた比は約3.5:1充填比に対応していた。 細胞のトランスフェクション 実施例４ 細胞培養組織及びプラズミド HeLa(CCL2、上皮癌、ヒト)、COS-7(CRL 1651、腎臓、SV-40形質転換体、アフリ カ緑猿)、HT-29(HTB38、腺癌、結腸、ヒト)、CV-1(CCL 70、腎臓、アフリカ緑猿 )、818-4(腺癌、膵臓、ヒト)、H4IIE(CRL 1548;肝細胞癌、ラット)、K562(CCL24 3;慢性骨髄白血病、ヒト)、HL-60(CCL 240;前骨髄球白血病、ヒト)、は５% CO2 で37℃で、プラスチック細胞培養フラスコ中のRPMI 1640またはの子牛血清が添 加されたDMEMで培養され、H4IIE細胞には、100単位/mlのペニシリン、100μg/ml のストレプトマイシン、２mMのグルタミン及び0.1μMのデキサメタソンが補足さ れた。 プラズミドpCMVL及びpCMVβ-galはルシファーゼ(luciferase)及びβ-ガラクトシ ダーゼの遺伝子をそれぞれコードしており、それらの発現はカイトメガロウイル ス(CMV)瞬間アーリープロモーター(immediate-early promoter)により制御され ている。プラズミドpZeoSV及びpZeoSVLacZはZeocinTM(登録商標)に対するSh-ble 抵抗タンパクをコードしており、原核及び真核細胞のどちらの選択も可能にする 。 真核発現はCMVプロモーターの制御下にある。更にpZeoSVLacZはSV40アーリー増 幅-プロモーターの制御下にあるβ-ガラクトシダーゼ遺伝子をコードしている。 プラズミドDNAsは、QIAGENTMプラズミド精製手順を用いて、QIAGENTM(登録商標) カラム上で精製された。 組織培養細胞のトランスフェクション。細胞の調製、トランスフェクションプロ トコール及びトランスフェクション効率のためのアッセイ。個々のトランスフェ クションの詳細は以下の結果部分に示されている。 a) 粘着細胞。トランスフェクションの24時間前に、ほぼ融合した細胞物単層(mo nolayer)がトリプシン化された。細胞は新鮮な培養液に再懸濁され、24-ウェ ルプレート(5 x 104細胞/ウェル)または6-ウェルプレート(2-2.5 x 104細胞/ウ ェル)のいずれかに入れられる。トランスフェクションの直前に、細胞は10% FCS が入っていない、または入っている新鮮な培養液に入れられる。一般的には、細 胞は融合性50から70%でトランスフェクトされる。トランスフェクションの24時 間後、細胞は３回PBS ２mlで洗浄され、100μl(24-ウェルプレート)または200μ l(6-ウェルプレート)の溶解バッファー(77mM K2HPO4、23mM KH2PO4、0.2%トリト ン(Triton)X-100、1mMジチオトレイトール(dithiotreitol)、pH7.8)で溶解され た。細胞破片は遠心(14000rpmで２分間)により除去された。通常は、酵素活性( 以下、参照)を細胞溶解の直後に測定する。しかし、溶解物は−20℃で活性の低 下なしに保存することが可能である。 b) 細胞懸濁液。トランスフェクションの24時間前に、細胞は新鮮な完全成長培 養液に入れられる。トランスフェクションの直前に、細胞は回収され、10% PCS の入らないまたは入った新鮮な培養液に0.25 x 106細胞/mlで再懸濁され、24-ウ ェルプレートに２mlづつ入れられた。 細胞は通常トランスフェクションの24時間後に収集され(収集する時間は重要な 変性因子であり、効果的に利用するべきである)、遠心で回収され、そしてPBS 1 0mlに再懸濁され、細胞ペレットは1.5mlのエッペンドルフチューブにPBS 1mlと 共に移動される。細胞はエッペンドルフ遠心(14000rpmで20秒間)で遠心され、得 られた細胞は100μlの溶解バッファー(上記に記載)に溶解された。サンプルはそ の後遠心(14000rpmで２分間)され、上清が注意深く新鮮な遠心チューブに移動さ れた。 c) トランスフェクションの手順 化合物(1)を用いた細胞のトランスフェクション。プラズミドDNA(濃度約１mg/ml のストック溶液から)及びカチオン性脂質(濃度１から2mg/mlのストック溶液から )は、1.5mlエッペンドルフチューブ中の10mM Hepes、0.9% NaClバッファー、pH7 .4、により最終体積が100μlになるように別々に希釈された。カチ オン性脂質の量は０から20μg/100μlの間で変化した。２つの溶液はDNA脂質溶 液を形成するために混合された。室温で10分間インキュベートした後、得られた DNA脂質溶液は細胞培養物に添加され、上記のとうりに培養され、ゆるやかに混 合された。代わりに、DNA脂質溶液を適当な培養液(＋/−FCS)800μl(24-から6- ウェルプレート)で希釈し混合した。希釈溶液はその後、細胞の上に塗抹され、 適する培養液で濯がれた。複合体は、１から２４時間細胞と共にインキュベイト された。血清を含まない場合、慣例のインキュベイション時間は４時間である。 トランスフェクション培養液はその後、完全成長培養液に置換された。血清が存 在する場合、トランスフェクション培養液は通常置換されず、細胞は実験が終了 するまで複合体Gaの存在下で培養が継続される（１段階トランスフェクション） 。２４時間後、細胞は上記のとうりに処理される。 (1)の三元複合体を用いた細胞のトランスフェクション プラズミドDNAは、適当なペプチドを含有する(例えば、請求項23)10mM Hepes、0 .9% NaClバッファー(pH7.4)により、最終体積が100μlになるように希釈された 。ペプチドの量は、０から20μg／100μlの間で変化した。慣例の濃度は、ペプ チド２から５μg／バッファー100μlであった。10分間のインキュベイションの 後、得られた溶液は100μlのカチオン性脂質溶液と混合され、全ての手順が上記 のとうりに継続された。 d) 酵素アッセイ ルシフェラーゼアッセイ。細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性はベルソルド ル ーマット機器(Berthold Lumat)(LB 9501)を用いてアッセイされた。ルシフェラ ーゼアッセイは、５から10μlの細胞抽出物を添加して行われた。サンプルは、L B 9501に設置され、機器は自動的にサンプルに100μlのインジェクションバッフ ァー(20mMトリシン、1.07mM(MgCO3)4Mg(OH)2、2.67mM MgSO4、0.1mM EDTA、33.3 mM DTT、270μMコエンザイムA、470μMルシフェリン、530μM ATP、pH7.8)を塗 布し、光放射を測定し、その最初の10秒間の光生成物についての積分値を表示し た。 β-ガラクトシダーゼアッセイ。細胞抽出物のβ-ガラクトシダーゼ活性が96-ウ ェルプレート上で測定された。細胞抽出物10μlが、「β-Gal」バッファー(33mM NaH2PO4、66mM Na2HPO4、２mM MgSO4、40mM β-メカプトエタノール)70μl及び ONPG溶液(β-Galバッファー中、o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド４m g/ml)25μlで希釈された。混合物は、37℃で30分間から１時間保存され、１Mナ トリウムバイカルボネイト150μlの添加により反応を終了した。 吸収は405nmで測定された。 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(X-Gal)による細胞 の染色。濯がれた細胞は、0.1Mリン酸ナトリウム、１mM MgCl2バッファー(pH7.0 )中の１%のグルタルアルデヒド溶液により15分間室温で固定された。固定用溶液 は除去され、細胞は３回PBSで洗浄され、染色溶液(0.2% X-Gal、10mMリン酸ナト リウム、150mM NaCl、１mM MgCl2、3.3mM K4Fe(CN)6及び3.3mM K3Fe(CN)6、pH7. 0)が細胞に塗抹され、１から８時間37℃でインキュベイトされた。培養容器又は カバーガラスの染色された細胞は、それぞれ転化(Inverted)又は相コントラスト 顕微鏡を用いて視覚化された。 タンパク質の測定。上清のタンパク質成分はローリー法(Bio-Radタンパク質分析 キット)の技術を用いてアッセイされた。 サイトトキシンの測定は、MTT(3-(4,5-ジメチルジアゾ-2-リル)-2,5-ジフェニル -テトラゾリウムブロミド)アッセイにより行なわれた。 結果 吸着細胞 a)化合物(1)。血清の存在下または無しで、化合物(1)のトランスフェクションの Hela細胞の効率は、DOTAPと比較された。完全RPMI 1640 １ml中の5 x 104細胞/ ウェル(24-ウェルプレート)の細胞がトランスフェクションの１日前に塗抹さ れた。トランスフェクションの直前に培養液は除去され、細胞は１mlの血清の入 ったまたは入らない新鮮な培養液を与えられた。カチオン性脂質及びDNA間の光 学比を得るために、トランスフェクションバッファー中の両方の脂質の多様な分 量が100μlの１μgのpCMVL含有DNA溶液と混合された(最終体積100μl)。10分間 室温でインキュベイションの後、0.5μgのブラズミド及び標記分量の脂質を含有 するこの混合物100μlがそれぞれのウェルに添加された。血清の存在下では、プ レートは培養液の置換無しに24時間インキュベイトされた。血清無しでは、４時 間後にトランスフェクション培養液を除去し、細胞に１mlの新鮮な血清補足培養 液を与えた。 細胞は、ルシフェラーゼアッセイのために24時間のトランスフェクションの後、 上記のように収集された。結果は、１μg pCMVLごとのカチオン性脂質の合計量 として、図２に示されている。血清存在下で細胞がトランスフェクトされた場合 、ルシフェラーゼ活性の光学評価は、10:1(W/W)のDOTAP/DNA比及び化合物(1)/DN Aの5:1(W/W)比を用いてそれぞれ得られた。血清なしの場合、両方の脂質のルシ フェラーゼ活性の光学評価は、脂質/DNAの5:1(W/W)比を用いて得られた。化合物 (1)を媒介したトランスフェクションは、DOTAPトランスフェクションと比較して 、血清の存在下またはなしで、それぞれ12倍及び６倍高かった。 b)三元複合化合物(1)。完全RPMI 1640の１ml中の5 x 104細胞/ウェルはトランス フェクションの１日前に塗抹された。トランスフェクションの直前に、培養液は 除去され、細胞は血清入りまたは無しの新鮮な培養液１mlで満たされた。HBVペ プチドの影響をHeLa細胞において評価するため、多様な量のペプチドは１μgのp CMVLに混合され、最終体積100μlにされ、10分間インキュベイトされた。そして 、7.5μgの化合物(1)を含有する溶液100μlが攪拌しながら添加された。10分間 の更なるインキュベイションの後、トランスフェクション溶液100μl(0.5μgのD NA及び3.75μgの化合物(1)を含有する)が細胞に添加された。４時間後、トラン スフェクション培養液は１mlの新鮮な完全成長培養液に置換された。 トランスフェクション細胞が溶解された24時間後、細胞抽出物は上記の様に遺伝 子発現の為に分析された。トランスフェクションレベルは(血清存在下でのトラ ンスフェクションにより)DOTAPトランスフェクションにより得られたパーセント 値として図３に示されている。結果は、これらの実験のペプチドの光学的分量は ５μgであり、ルシフェラーゼ活性の発現は化合物(1)及びDOTAPトランスフェク ションにより達成されたものよりもそれぞれ14倍及び200倍であることが示され た。血清なしの条件でトランスフェクションが行なわれた場合、ペプチドの光学 的分量は同じであり、それぞれルシフェラーゼ活性の発現は化合物(1)により達 成されたものよりも約10倍高かく、DOTAPトランスフェクションによるよりも150 倍高かった(データーは示されていない)。 c)時間依存。１mlの完全RPMI1640中のウェルごとの5 x 104 HeLa細胞はトランス フェクションの１日前に塗抹された。トランスフェクションの直前に、培養液は 除去され、細胞は１mlの新鮮な培養液で満たされた。0.25μgのpCMVLuc、0.5μg のHBV-ペプチド、1.87μgの化合物(1)を含有する50μlのトランスフェクション 溶液を攪拌しながらそれぞれのウェルに添加した。トランスフェクションの２時 間後、培養液は１mlの新鮮な完全成長培養液により置換された。上記に示された 表示時間においてルシフェラーゼアッセイのために細胞は収集された。結果はウ ェルごとの合計ルシフェラーゼ活性として図2cに示されている。示されたとおり 、ルシフェラーゼ活性は急激に増加し、12から16時間で最大に達した。２時間後 に既に、4.5 x 104光単位が得られた。化合物(1)を介したトランスフェクション では同じルシフェラーゼ活性は３時間後に観察され、DOTAPを介したトランスフ ェクションの５から６時間のみ後であった。 細胞の懸濁 α)化合物(1)。血清存在下でのK562細胞における化合物(1)のトランスフェクシ ョン効率がDOTAPと比較された。カチオン性脂質とDNA間の最適比を評価するため に、多様な値で両方の脂質は一定量のpCMVL(ウェルごとに１μg、または完 全RPMI 1640の２ml中0.5 x 106細胞、24ウェルプレート)に添加された。200μl のトランスフェクション混合物はそれぞれのウェルに添加され、プレートは24時 間37℃でインキュベイトされた(1段階トランスフェクション)。上記のとおりに 細胞は溶解された。結果は、１μg DNAごとのカチオン性脂質の量に対するウェ ルごとの合計ルシフェラーゼ活性として図４に示されている。ルシフェラーゼ活 性の最高発現は、DOTAP/DNA比5:1(W/W)、化合物(1)/DNA比7.5:1(W/W)を使用した 時に得られた。得られた比は、それぞれの脂質DNAにおける充填比約2:1及びDOTA Pと化合物(1)において5:1であった。(1μgのDNAが3.1nmリン酸アニオン充填を含 有すると推定した場合)。化合物(1)を介したトランスフェクションはDOTAPを介 して得られるよりも10倍高いかった。 β)化合物(1)の三元複合体 K562細胞のトランスフェクションにおけるペプチド濃度の影響を評価するため、 多様な値のHBV-ペプチドが最終体積100μlになるように１μgのpCN4VLに添加さ れ、10分間インキュベイトされた。そして10μgの化合物(1)を含有する溶液100 μlが攪拌しながら添加された。更に10分間インキュベイトした後、トランスフ ェクション溶液(200μl)は、細胞に塗布された。他の全ての条件は前実験とまっ たく同じである。結果は、図５に添加されたペプチドの(1μg DNAごとの)量に対 するウールごとの合計ルシフェラーゼ活性として示されている。結果はペプチド の最適量は２μgであると示しており、ルシフェラーゼ活性の発現は、それぞれ 化合物(1)により達するものよりも３倍殻４倍高く、DOTAPによるトランスフェク ションよりも30倍から40倍高かった。 γ)分量依存 保存溶液が、最終体積が200μlになるように１μgのpCNVL、２μgのHBV-ペプチ ド及び10μgの化合物(1)から作られた。DNA分量依存は、この溶液５から200μl を細胞に添加することによる１段階トランスフェクションにより確認された。こ の実験の結果が図６に示されている。ルシフェラーゼ活性の発現は添加されたDN Aの量に依存しており、０から0.25μgのDNAの範囲では正比例の関 係にあった。理論的には、これらの条件下では、0.5ng程の小さいレセプターDNA (キャリアDNAなしで)を検出することができる。得られた結果は、更に一度形成 されたらこれらの三元複合体はとても安定であり、希釈によっても分離しないこ とを示している。 オリゴヌクレオチドの細胞内導入 実施例５ フルオレセイン(fluorescein)標識されたフォスフォチオエート(phosphotioate) オリゴヌクレオチド(5'ACT TGG ATA CGC ACG-フルオレセイン-3')は、化合物(1) の存在下及び無しでの、細胞内でのデリバリー及びオリゴヌクレオチドの分布を 評価するために使用された。 HeLa細胞(実験の１日前に、ウェルごとに2 x 105細胞、6-ウェルプレート)が、 ガラス顕微鏡スライド上の10% FCSで補足された２mlのRPMI 1640において培養さ れた。実験の前に、培養液は血清を含まないRPMI 1640により置換された。 オリゴヌクレオチド-化合物(1)複合体の形成は、以下のとおりに行なわれた。10 μgのフォスフォチオネイト オリゴヌクレオチドを90μlのトランスフェクショ ンバッファーに溶解した。16μg及び50μgの化合物(1)はトランスフェクション バッファーにより希釈され、最終体積100μlとされた。２つの溶液は混合され、 10分間インキュベイトされた。化合物(1)を含まないオリゴヌクレオチド溶液は 、100μlのトランスフェクションバッファーで希釈された。得られた溶液(ウェ ルごとに200μl)は、培養細胞に添加された(オリゴヌクレオチドの最終濃度は約 １μM、化合物(1)は８μM及び25μM)。複合体は細胞と共に４時間インキュベイ トされた。培養液はその後、完全成長培養液に置換された。 ４から24時間後、細胞は３回PBSにより洗浄され、15分間１%グルタルアルデ ヒド溶液により固定された。固定の後、細胞は３回PBSにより洗浄され、グリセ ロール固定(mount)溶液(10mMリン酸、150mM NaCl、70%グリセロール、pH7.5)に より固定された。フルオレセイン標識されたフォスフォチオネート オリゴヌク レオチドは、ゼイス(Zeiss)フルオレセイン顕微鏡を用いて、フルオレセイン顕 微鏡で観察された。 １μMのフルオロセイン標識オリゴヌクレオチドによる細胞のインキュベイショ ンによって、４及び24時間の両方で、弱い蛍光を結果として得た。比較として、 化合物(1)の存在下、１μMフルオロセイン標識オリゴヌクレオチドと共にインキ ュベイトされた全ての細胞は、細胞質でとても明るい弱い(punktate)蛍光を有し ていた。24時間後、細胞はとてもはっきりした弱い蛍光を細胞質で示した。蛍光 強度は25μM化合物(1)の存在下で高かった。 血清存在下で行なわれた実験では、総合蛍光及びフルオロセイン標識オリゴヌク レオチドの分布は変化しなかった。 アニオンポリペプチドの細胞内導入 実施例６ フルオロセイン標識アニオンポリペプチド(フルオロセイン-ポリ Glu)21)は化合 物(1)の存在下及びなしで、アニオンポリペプチドの細胞内デリバリー及び分布 を評価するために使用された。実験の条件は前実験と全く同じである。 １μMのフルオロセイン標識ポリ-(Glu)21と細胞のインキュベイションでは、４ 時間または24時間いずれにおいても蛍光を結果として得ることができなかった。 比較として、化合物(1)25μMの存在下、１μMのフルオロセイン標識オリゴヌク レオチドと共にインキュベイトされた全ての細胞は、45分後既に明るい細胞質の 弱い蛍光を有していた。蛍光粒子の分布はフルオロセイン標識オリゴヌク レオチドにおいて観察されたものと異なっていた。24時間後、細胞はとても明る い弱い蛍光を細胞質に有し、同じ構造内に適当に分布していた。 実施例７ リポソーム処方 以下の部分は、生物活性試薬からなる処方における本発明の化合物の使用を説明 している: 7.1 慣例の処方は、酢酸プレドニソロン0.25mg(21-アセトキシ-1,4-プレグナジ エン-11β,17a-ジオール-3,20-ジオン)及び50mgのL-リシン-ビス-(O,O'-オレイ ル-β-ヒドロキシエチル)アミドジヒドロクロリドをジクロロメタン:エタノール (1:1)溶液２mlに溶解することにより調製された。溶媒は窒素流下で蒸発された 。フィルム混合物は終夜真空下に置かれ、残りの溶媒を完全に蒸発させた。乾燥 フィルムは、その後0.9% NaCl溶液２mlに懸濁された。 7.2 (＋)-α-トコフェノール(5,7,8-トリメチルトコ,ビタミンE)及びL-リシン- ビス-(O,O'-オレイル-β-ヒドロキシエチル)アミドジヒドロクロリド100mgがジ クロロメタン:エタノール(1:1)溶液５mlに溶解された。溶媒は窒素流下で蒸発さ れ、残りは真空下で蒸発された。乾燥フィルムはその後10mM Hepes、0.9% NaCl 、pH7.4、４mlで懸濁され、視覚的に透明になるまで超音波処理された。 7.3 レチノール(3,7-ジメチル-9-(2,6,6-トリメチル-1-シクロヘキシル)-2,4,6 ,8-ノンアテトレイン(nonnatetraen)-1-オール)20mg及びL-リシン-ビス-(O,O'- ミストイル-β-ヒドロキシエチル)アミドジヒドロクロリド80mgがジクロロメタ ン:エタノール(1:1)溶液５mlに溶解された。溶媒は蒸発され、乾燥フィルムは終 夜、真空下に置かれた。フィルムはその後10mM Tris、0.9% NaCl、pH7.4、５ml に懸濁された。 7.4 N-パルミトイル-S(2,3-ビス(パルミトイル-オキシ)-(2RS)-プロピル-R-シ ステイン３mg及びL-(O,O'-パルミトイル-β-ヒドロキシエチル)アミドジヒドロ クロリド25mgがジクロロメタン:エタノール(1:1)溶液５mlに溶解され、真空下で 乾燥するまで蒸発された。得られたフィルムは蒸留水１mlに懸濁され、超音波で 透明になるまで処理された。 これまでに説明されたものに加えて、本発明は、これらの方法で製造されたペプ チド及びリポペプチドへの、本発明の脂質化合物の親油性部分の導入に於ける使 用も含んでいる。更なる詳細は以下に説明される。: ペプチドの合成 一般的方法: 自動化ペプチド合成機ABI 350または多ペプチド合成機を用いた、C-末端またはN -末端、またはその両方、または鎖の中に親油性変性を有するペプチドの合成は 全-段階ごとの(all-stepwise)固相Fmocに基づく合成方法によりなし遂げられる 。 ペプチドは通常リンク(Rink)アミドMBHAレジン(4-(2',4'-ジメトキシフェニル-F moc-アミノメチル)フェノキシアセトアミド-ノルロイシル-メチルベンゾヒドリ ルアミン レジン、ノババイオケム(Novabiochem))またはトリチルレジン(2-クロ ロトリチルクロリド レジン、ノババイオケム)上に集められる。 Fmoc-アミノ酸(過剰10モル)のカップリングは、DMF中のN-N'-ジイソプロピルカ ルボジイミド(DIC)及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HoBt)を用いて１時間 行なわれた。親油性アミノ酸-ビス-ヒドロキシエチルアミドのカップリングはそ れらの３つの過剰モルを用いてDIC/HOBt活性法と同じ方法で達成され、カップリ ングに必要な時間は約３時間である。カップリングの完了は、ニヒドリン試験に より検出された。Fmoc群は、ピペリジン:DMF=1:2で15以内に除去された。 切断及び最終脱保護はn-クレゾール:ジメチルスルフィド:エタンジオール:TFA=3 :3:3:91の混合物により２時間室温で行なわれた。濾過した後、ペプチドは混合 物から沈殿され、数回ジエチルエーテルにより洗浄された。生成ペプチドはセミ プレバラティブ(半準備型)ヌクレオシル(Nucleosil)C2カラム(8 x 250mm)及びそ れぞれ0.1%のTFAを含有する水中のアセトニトリルの上昇勾配により精製された 。精製ペプチドは、tert-ブチルアルコール:水=4:1の混合物から親油化され、− 4℃で保存された。それらの均一性がアミノ酸分析、分析的HPLC及びエレクトロ スプレイ-イオン化質量計により測定された。 この手順により、リポペプチドは調製された: 更に本発明は、この方法で製造されたペプチド及びグリコ-リポペプチドへのグ リコ-親油性部分の導入のための本発明の脂質化合物の使用を含んでいる。更な る詳細は以下に示されている: グリコ-リポペプチドの合成 D(＋)-ラクトースモノヒドレート1.8g(5mmol)wo飽和NH4HCO3 40mlと６日間30℃ で反応させた。過剰NH4HCO3を除去するために、反応混合物は、水(20ml)で希釈 され、真空で前体積の半分まで濃縮された。この手順が６階繰り返された。最終 的に、水は親油化により除去された。得られたそのままのアミノラクトースは、 更なる精製なしにFmoc-Asn(ラクトース)-OtBu誘導体の合成に使用された。Fmoc- Asp-OtBu 480mg(1.17mmol)及びHOBt 228mg(1.52mmol)は、DMF(5ml)に溶解され、 4℃に冷却された後、DIC 205mg(1.63mmol)が添加された。15分間4℃で、20分間2 5℃で攪拌した後、1-アミノラクトース5.85mmolはDMF:H2O=2:1、６ml中の活性化 エステルに添加された。６時間攪拌した後、溶媒は真空で蒸発され、ジエチルエ ーテルが添加された。沈殿された精製物は濾過され、冷たいエーテル及び冷たい 水により洗浄された。TBu保護基は水中の70% TPAにより(20分間室温で)切断され た。TFA/水混合物を真空下で蒸発した後、精製物はtert-ブチルアルコール:水=4 :1に溶解され、親油化された。そのままのFmoc-Asn(ラクトース)-OHは逆相クロ マトグラフィー(リクロプレップ(Lichroprep)C18カラム25 x 310mm、アセトニト リル30%/-水/TFA 0.1%でイソクラテック(Isocratic)溶出)で精製され、280mg HP LC純Fmoc-Asn(ラクトース)-OHを得た(Fmoc-Asp-AtBuから計算して収率35%、分析 :＋FAB-MS(MH＋)=679(計算値=679)、ヌクレオシルC18 4 x 150mmでRt=6.59分、 勾配30から100%のアセトニトリル/水中0.1% TFA/0.1% TFA 30分)。 Fmoc-Asn(ラクトース)-OH 32.5mg(0.048mmol)及びHOBt 7.25mg(0.05mmol)がDMF 200μlに溶解され、DIC 6.31mg(0.05mmol)が添加された。30分間攪拌した後、形 成された活性化エステルは終夜、Boc-(Lys(NH2))4-Lys2-Lys-Acx-bAla-Acx E(N( EtOPalm)2)-ペプチジル レジン30mg(0.016mmol)とカップリングされた。レジン は注意深く洗浄され、Fmoc群は20%ピペリジン処理により除去された。グリコペ プチドは切断され、脱保護化され、同じ条件下で上記のとおり用意された。用意 したものはセミプレパラティブHPLCにより精製し、N-ラクトシル化リポペプチド 10.6mgを得た。 図１の付随する図解は、添加された化合物(1)の量の機能としての蛍光強度を示 している。 図２は、HeLa細胞のトランスフェクションへのDOTAP/DNA比及び化合物(1)/DNA比 の影響を示している。トランスフェクション化合物(1)は、血清の存在下(■)及 び無しで(□)示されている。DOTAPトランスフェクションは、血清の存在下(●) 及び無しで(○)示されている。トランスフェクション レベルは50000細胞ごとの 全光単位として示されている。それぞれの点は、３段階トランスフェクションの 平均±SDを示すものである。 図３は、HeLa細胞へのペプチド強化遺伝子輸送を示している。トランスフェクシ ョン レベルはDOTAPトランスフェクションにより得られた値の%で示され、３段 階トランスフェクションの平均を表している。 図４は、K562細胞におけるDOTAP(●)/DNA比及び化合物(1)(■)/DNA比の影響を示 している。トランスフェクション レベルは、500000細胞ごとの全光単位として 表されている。それぞれの点は、３段階トランスフェクションの平均±SDを表し ている。 図５はK562細胞におけるペプチド強化遺伝子輸送を示している。トランスフェク ション レベルは500000細胞ごとの全光単位として示され、３段階トランスフェ クションの平均±SDを示している。 図６は、添加されたDNA量に対するトランスフェクションレベルを示している。 トランスフェクション レベルは500000細胞ごとの全光単位として示され、３段 階トランスフェクションの平均±SDを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １． 式 (式中、R1及びR2は同一であるかあるいは異なってもよく、6〜24個の炭素原子を 含むアルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、 R3、R4及びR5は同一であるかあるいは異なってもよく、水素、それぞれ1〜8個 の炭素原子を含むアルキル基、もしくはアルキルアミン、またはアミノ酸、アミ ノ酸誘導体、ペプチド、あるいはペプチド誘導体であり、 Wは水素、カルボキシル基、またはアミノ酸、アミノ酸誘導体、ペプチドもし くはペプチド誘導体の側鎖であり、 Yは少なくとも一個の水素以外の原子を有する連結基、特に-CO-、-(CH2)mCO- 、-(CH2-)m、-(CHOHCH2-)m(mは1〜20である）、-CH2-S-CH2-、-CH2-SO-CH2-、-C H2-SO2-CH2-、-CH2-SO2-または-SO2-であり、 Zは、エステル、エーテル、またはアミド結合であり、 nは、1〜8であり、 Xは、アニオン、特に医薬上許容されるアニオンである)によって示される化合 物またはその光学異性体。 ２． Yがカルボニル基、すなわち-CO-である請求項１に記載の化合物。 ３． Zがエステル結合である請求項１または２に記載の化合物。 ４． R1及びR2が、10〜20個の炭素原子、好ましくは12〜18個の炭素原子を有 するアルキルまたはアルケニル基であり、特に基R1及びR2が同一である請求項1 〜３のいずれかに記載の化合物。 ５． R1及びR2がアルケニル基である請求項1〜４のいずれかに記載の化合物 。 ６． nが２である請求項1〜５のいずれかに記載の化合物。 ７． Wが塩基性アミノ酸、特にリシンまたはオルニチンの側鎖である請求項1 〜６のいずれかに記載の化合物。 ８． R3、R4、及びR5が水素である請求項1〜７のいずれかに記載の化合物。 ９． Xがクロリドアニオンである請求項1〜８のいずれかに記載の化合物。 10． 化合物が L-リシン-ビス-(O,O'-シス-9-オクタデセノイル-β-ヒドロキシエチル)アミドジ ヒドロクロリドあるいはその光学異性体、 L-リシン-ビス-(O,O'-ヘキサデカノイル-β-ヒドロキシエチル)アミドジヒドロ クロリドあるいはその光学異性体、 L-オルニチン-ビス-(O,O'-シス-9-オクタデセノイル-β-ヒドロキシエチル)アミ ドジヒドロクロリドあるいはその光学異性体、 L-オルニチン-ビス-(O,O'-ヘキサデカノイル-β-ヒドロキシエチル)アミドジヒ ドロクロリドあるいはその光学異性体、 L-リシン-ビス-(O,O'-テトラデセノイル-β-ヒドロキシエチル)アミドジヒドロ クロリドあるいはその光学異性体、 L-オルニチン-ビス-(O,O'-テトラデセノイル-β-ヒドロキシエチル)アミドジヒ ドロクロリドあるいはその光学異性体から選択される請求項1〜９のいずれかに 記載の化合物。 11． 化合物がL-リシン-ビス-(O,O'-シス-9-オクタデセノイル-β-ヒドロキ シエチル)アミドジヒドロクロリドあるいはその光学異性体である請求項1〜10の いずれかに記載の化合物。 12． ポリアニオン及び少なくとも一種の請求項1〜11のいずれかに記載の化 合物からなるポリアニオン-脂質複合体。 13． 正の全電荷あるいは正味の電荷を有する請求項12に記載の複合体。 14． ポリアニオンがポリヌクレオチドである請求項12または13に記載の複合 体。 15． ポリアニオンがDNAまたはRNAである請求項14に記載の複合体。 16． ポリアニオンがポリペプチドである請求項12または13に記載の複合体。 17． 脂質が請求項11に記載の化合物あるいはその光学異性体である請求項12 〜16のいずれかに記載の複合体。 18． ポリアニオン、ポリカチオン及び少なくとも一種の請求項1〜11のいず れかに記載の化合物からなるポリアニオン-ポリカチオン性脂質三元複合体。 19． 正の全電荷あるいは正味の電荷を有する請求項18に記載の複合体。 20． ポリアニオンがポリヌクレオチドである請求項18または19に記載の複合 体。 21． ポリアニオンがDNAまたはRNAである請求項19に記載の複合体。 22． ポリカチオンがポリペプチドである請求項18〜21のいずれかに記載の複 合体。 23． ポリペプチドが以下のアミノ酸配列 プロタミン配列、 ヒストン配列 の少なくとも一種を含む請求項22に記載の複合体。 24． 脂質が請求項11に記載の化合物あるいはその光学異性体である請求項18 〜23のいずれかに記載の複合体。 25． 少なくとも一種の正の荷電を有する請求項1〜11のいずれかに記載の化 合物あるいはそのような化合物の少なくとも一種を含む組成物をポリアニオンと 接触させる、請求項12〜17のいずれかに記載の複合体の製造方法。 26． ポリアニオンをポリカチオンと接触させ、生成するポリアニオン-ポリ カチオン性複合体を少なくとも一種の正の荷電を有する請求項1〜11のいずれか に記載の化合物あるいはその化合物を含む組成物と接触させる、請求項18〜24の いずれかに記載の複合体の製造方法。 27． 少なくとも一種の請求項1〜11のいずれかに記載の化合物あるいはその ような化合物の少なくとも一種を含む組成物を使用して製造されたリポソーム。 28． 少なくとも一種の生物活性物質、及び 少なくとも一種の請求項1〜11のいずれかに記載の化合物を含む脂質成 分を含むリポソーム製剤。 29． 生物活性物質が10重量%までの量で存在する請求項28に記載のリポソー ム製剤。 30． 脂質成分が1〜20重量%までの量で存在する請求項28または29に記載のリ ポソーム製剤。 31． 脂質成分中の前記化合物が前記成分の1%〜100%を構成する請求項28〜30 のいずれかに記載のリポソーム製剤。 32． 生物活性物質が薬剤である請求項28〜31のいずれかに記載のリポソーム 製剤。 33． 特にポリアニオンまたはポリカチオンを細胞中に導入するための、ポリ アニオンまたはポリカチオンを生物膜を通して輸送する方法であって、少なくと も一種の請求項1〜11のいずれかに記載の化合物を使用してポリアニオンまたは ポリカチオンを複合化し、形成された複合体を前記膜と接触させ、特に細胞を複 合体とインキュベートする前記方法。 34． 複合体が正の全電荷あるいは正味の電荷を有する請求項33に記載の方法 。 35． 複合体が請求項12〜17のいずれかに従って形成された複合体である請求 項33または34に記載の方法。 36． 複合体が請求項18〜24のいずれかに従って形成された複合体である請求 項33または34に記載の方法。 37． 接触、特にインキュベートがin vitroで行われる請求項33〜36のいずれ かに記載の方法。 38． 接触、特にインキュベートがin vivoで行われる請求項33〜36のいずれ かに記載の方法。 39． 特に生物活性物質を細胞中に導入するための、生物活性物質を生物膜を 通して輸送する方法であって、少なくとも一種の請求項1〜11のいずれかに記載 の化合物及び生物活性物質からリポソームを形成し、このリポソームを前記膜と 接触させ、特に細胞をリポソームとインキュベートする前記方法。 40． 生物活性物質が薬剤である請求項39に記載の方法。 41． 接触、特にインキュベートがin vitroで行われる請求項39または40に記 載の方法。 42． 接触、特にインキュベートがin vivoで行われる請求項39または40に記 載の方法。
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