JPH11506606A

JPH11506606A - インフルエンザウイルスエンドヌクレアーゼのｄｎａポリメラーゼエクステンションアッセイ

Info

Publication number: JPH11506606A
Application number: JP9500959A
Authority: JP
Inventors: コウル，ジエイムズ・エル; クオ，ローレンス・シー; オルセン，デイビツド・ビー
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 1999-06-15
Also published as: EP0832292A4; WO1996040993A1; ES2170860T3; DE69618955D1; DE69618955T2; EP0832292A1; US5660989A; EP0832292B1; ATE212675T1; CA2222753A1

Abstract

(57)【要約】標識ヌクレオチドと、反復残基から成る５′領域に結合したウイルスエンドヌクレアーゼ切断産物に相補的な３′領域を含むＤＮＡ鋳型とを用いて、ウイルスエンドヌクレアーゼ切断産物をＤＮＡポリメラーゼで触媒して伸長させることを含むインフルエンザウイルスエンドヌクレアーゼアッセイを開発した。該ＤＮＡポリメラーゼ結合アッセイは、ゲル電気泳動による分離を用いず、潜在的阻害剤の大量スクリーニングに利用し得る。該アッセイの別の主要な特徴は、該アッセイが２００アトモルの産物を検出し得るに十分な感度を有していることにある。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称インフルエンザウイルスエンドヌクレアーゼのＤＮＡポリメラーゼエクステンションアッセイ発明の分野本発明は、インフルエンザウイルスエンドヌクレアーゼ及びインフルエンザウイルスエンドヌクレアーゼ活性阻害剤の存在を検出・定量する新規な高感度アッセイに関する。発明の背景インフルエンザＡ型ウイルスのゲノムは、８つのネガティブセンス１本鎖ＲＮＡセグメントから成る。ウイルスｍＲＮＡの合成は、ウイルスがコードするＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．７．７．４８）によって触媒される。インフルエンザウイルスの転写は、宿主細胞転写体の５′キャップ構造から１０−１３ヌクレオチドを切断することによりプライマーが生成される機構により開始される。切断反応及び開始反応は、７−メチル化末端Ｇ及び２′−Ｏ−メチル化前末端プリン塩基を含むキャップ−１構造（７ｍＧｐｐｐＲｍ）を有する転写体に依存する。インフルエンザエンドヌクレアーゼは、抗ウイルス剤の開発には魅力的なターゲットであり、最近、小型分子阻害剤（Ｔｏｍａｓｓｉｎｉら，１９９４ＡｎｔｉＭｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓａｎｄＣｈｅｍｏ．３８：２８２７−２８３７）とオリゴヌクレオチド阻害剤（Ｃｈｕｎｇら，１９９４Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：２３７２−２３７６）が記載された。しかし、潜在的インフルエンザエンドヌクレアーゼ阻害剤のスクリーニングは適当なアッセイ法がないために妨げられている。理想的なアッセイ系は、（ａ）高利用効率、（ｂ）インフルエンザエンドヌクレアーゼが触媒する切断と非特異的ＲＮＡ切断とを区別する能力、及び（ｃ）高感度を有していなければならない。これまでのエンドヌクレアーゼアッセイは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて基質から産物を分離するものであった（Ｐｌｏｔｃｈら，１９８１Ｃｅｌｌ２３：８４７−８５８）が、該アッセイは大量の試料のプロセシングには不便である。エンドヌクレアーゼの阻害を検出し得る全インフルエンザ転写酵素反応アッセイも記載された（Ｐｌｏｔｃｈら，１９７７Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２１：２４−３４）。しかし、該全反応は複雑な多段階プロセスであり、切断が律速的ではなく、エンドヌクレアーゼ阻害剤を見逃す可能性がある。発明の詳細な説明本発明は、インフルエンザウイルスエンドヌクレアーゼ活性に特異的な、新規で、正確且つ高速の高感度アッセイに関する。本発明は、試料のインフルエンザエンドヌクレアーゼ活性を検出する方法を包含し、該方法は、（Ａ）インフルエンザエンドヌクレアーゼ活性をアッセイしようとする試料にインフルエンザエンドヌクレアーゼ基質を加えてＲＮＡ産物を生成させるステップ、（Ｂ）該ＲＮＡ産物とＤＮＡ鋳型（該ＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡ産物に実質的に相補的な第１セグメントと該セグメントに結合した５′鋳型伸長領域とを含み、該鋳型伸長領域は１個以上のヌクレオチドからなる）とをハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイズさせて、ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖を形成するステップ、（Ｃ）ＤＮＡ鋳型の第２セグメントに相補的な標識モノヌクレオチドを付加するステップ、（Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼが触媒する標識モノヌクレオチドのＲＮＡ産物の３′末端への付加を可能にする条件下にヘテロ二重鎖にＤＮＡポリメラーゼを付加して、標識ハイブリッドポリメラーゼ産物を生成させるステップ、及び（Ｅ）試料のインフルエンザエンドヌクレアーゼ活性の量の尺度として標識ハイブリッドポリメラーゼ産物の量を測定するステップからなる。本発明によれば、分析試料は未知量のインフルエンザエンドヌクレアーゼを含み得る。本発明のこの実施態様において、試料中に存在するインフルエンザエンドヌクレアーゼの量を定量し得る。別の好ましい実施態様において、試料は、既知量のインフルエンザエンドヌクレアーゼと、そのインフルエンザエンドヌクレアーゼ阻害活性を定量する分子とを含み得る。標識ハイブリッドポリメラーゼ産物の量と、阻害剤が存在しない対照試料により産生された標識ハイブリッドポリメラーゼ産物の量とを比較して、試料中に存在する阻害活性の程度を測定することができる。存在する標識ハイブリッドポリメラーゼ産物の量の測定には任意の検出法を用いてよい。好ましい方法は、標識ハイブリッドポリメラーゼ産物と過剰な標識モノヌクレオチドとを含む試料を標識ハイブリッドポリメラーゼ産物を捕獲するフィルターに通し、該フィルター上で捕獲された標識ハイブリッドポリメラーゼ産物の量を測定するものである。図面の簡単な説明図１は、インフルエンザウイルスエンドヌクレアーゼのＤＮＡポリメラーゼ増幅アッセイを示す流れ図である。図２は、ポリメラーゼが触媒する伸長反応に及ぼすプライマーの長さ及び温度の影響を示す２０％アクリルアミド８Ｍ尿素ポリアクリルアミドゲルのリン光イメージング装置（phosphorimager）スキャンの写真である。レーン１９は、ＡＩＭＶ基質の配列を有するキャップされていないＲＮＡプライマー（１９ｎｔ）（５′−ＧＵＵＵＵＵＡＵＵ−ＵＵＵＡＡＵＵＵＵＣ−３′）（配列番号１）に対応し、レーン１４〜６は、１９ｎｔのプライマーの３′欠失体由来の指示長のＲＮＡプライマーに対応する。レーンβは、β−グロブリンｍＲＮＡの５′末端由来の１３ｎｔのＲＮＡ（５′−ＡＣＡＣＵＵＧＣＵＵＵＵＧ−３′）（配列番号２）に対応する。レーンＤは、ＡＩＭＶプライマー配列を有する１３ｎｔのＤＮＡ（５′−ＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡ−３′）（配列番号３）に対応する。図３は、ＤＮＡポリメラーゼ伸長の線形応答を示すグラフである。反応は、実施例１に記載のように実施した。点を結んで引かれた線は、相関係数０．９９９９でデータに当てはめた線形最小二乗法である。図４は、実施例１に記載されている、ポリメラーゼが触媒するインフルエンザエンドヌクレアーゼ切断産物の伸長を示すゲルである。定義本明細書及び請求の範囲全体を通して、以下の定義が適用される：「ｎｔ」とは、ヌクレオチドの略号である。「ＡＩＭＶ」とは、アルファルファモザイクウイルスの略号である。「実質的に相補的」とは、用いられる実験条件下に、ＲＮＡプライマーの３′ 領域とＤＮＡ鋳型鎖とをハイブリダイズさせて得られたヘテロ二重鎖がＤＮＡポリメラーゼの基質としての働きをし得るに十分な相補性が存在することを意味する。「実質的に相補的」であるためには、さらに、ヘテロ二重鎖が生成し得るに十分な相補性が存在し、且つ該ヘテロ二重鎖は、その融解温度が溶媒系の凝固点より高いような十分な安定性を有することが要求される。「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド２個以上の長さである。「実質的に反復された」とは、オリゴヌクレオチドが、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上同一塩基から成ることを意味する。「ＡＩＭＶ由来」とは、オリゴヌクレオチドがＡＩＭＶ４ＲＮＡの５′末端と８０％以上相同であり、インフルエンザエンドヌクレアーゼの基質として作用し得ること、即ちインフルエンザエンドヌクレアーゼにより切断され得ることを意味する。基質は、インフルエンザエンドヌクレアーゼによって切断される、５′がキャップされたいずれのＲＮＡであってもよい。エンドヌクレアーゼの基質は、インフルエンザエンドヌクレアーゼの基質であることが既に証明されており且つヌクレオチドＡ１３で切断されるＡＩＭＶ４ＲＮＡの５′末端由来であるのが好ましい。本発明の好ましい実施態様において、インフルエンザエンドヌクレアーゼの基質は、インフルエンザエンドヌクレアーゼにより切断されて１３ｎｔの産物を生成する、５′がキャップされた１９ｎｔのＲＮＡ基質である。５′がキャップされた１９ｎｔのＲＮＡ基質は、５′−三リン酸を含む１９ｎｔのＲＮＡをグアニリルトランスフェラーゼで処理して製造し得る。キャップされたＲＮＡ基質は、本発明と共に出願された同時係属Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．（ＡｔｔｏｒｎｅｙＤｏｃｋｅｔＮｏ．１９４０６）及びＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．（ＡｔｔｏｒｎｅｙＤｏｃｋｅｔＮｏ．１９３９８）（いずれも本明細書に参照として組み込むものとする）に従って得ることができる。グアニリルトランスフェラーゼは周知であり、市販物から得ることができる。例えば、ワクシニアウイルスグアニリルトランスフェラーゼは、ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから購入し得る。次いで、１９ｎｔの産物をインフルエンザエンドヌクレアーゼで切断して得られたこの１３ｎｔのＲＮＡ産物をＤＮＡポリメラーゼ触媒伸長反応のプライマーとして用いる。ポリメラーゼ伸長反応を進めるためにはＤＮＡ鋳型が必要である。ＤＮＡ鋳型は２部型分子であり、鋳型の５′伸長領域に結合した、１３ｎｔのＲＮＡプライマーと実質的に相補的な３′領域を含む。５′伸長領域は、理論的には任意の所望のヌクレオチドから形成し得るが、正しい位置で切断される産物の特異性を得るには、該ヌクレオチドが実質的に反復されたヌクレオチドであり且つ該ヌクレオチドがＤＮＡの伸長領域には存在するが３′相補領域には存在しないことが好ましい。最も好ましい実施態様において、５′伸長領域は反復ヌクレオチドから成る。５′伸長領域が実質的に反復ヌクレオチドから構成されない場合、該伸長領域が非特異的産物よりも正しい位置で切断された産物のシグナルを増幅させるのに十分な長さを有していない限り、アッセイには特異性問題が生じ得る。伸長領域の長さには特に制限はない。伸長領域はヌクレオチド１個程度の短いものでも、現行の合成法が許容する限りの長いもの（ヌクレオチド５０個以上）であってもよい。好ましい実施態様において、５′伸長領域はヌクレオチド残基１個以上の長さ、より好ましくは残基約１０個以上の長さである。従って、鋳型の伸長領域は、ｐｏｌｙ−ｄＣ、ｐｏｌｙ−ｄＧ、ｐｏｌｙ−ｄＡ又はｐｏｌｙ −ｄＴ領域であるのが好ましい。本発明の１つの好ましい実施態様において、鋳型の伸長領域はｐｏｌｙ−ｄＣ残基１０ｎｔの長さである。ＤＮＡポリメラーゼが触媒する伸長反応において、ＤＮＡ鋳型伸長領域に存在するヌクレオチドに相補的な標識モノヌクレオチドで１３ｎｔのＲＮＡ産物を伸長させる。例えば、鋳型伸長領域が１０残基のｐｏｌｙ−Ｃの場合、１３ｎｔのＲＮＡ産物は標識ｐｏｌｙ−Ｇ配列により塩基１０個分伸長する。ＲＮＡ産物伸長領域中に取り込まれるヌクレオチドを標識するには、蛍光又は吸収性標識のようなヌクレオチドアッセイ法に慣用的に用いられているいずれのタイプの標識を用いてもよいが、放射性標識を用いるのが好ましい。好ましい実施態様において、産物伸長領域は、（図１に示されているような）ｐｏｌｙ−α−³²Ｐ標識ｄＧＭＰである。さらに、ポリメラーゼが触媒する伸長が鋳型の３′−ＯＨ末端上で生じるのを防ぐために、プライマーの３′−ＯＨをブロックするのが好ましい。種々のブロッキング物質が公知且つ適当であり、該物質には、コルジセピン（３′−デオキシアデノシン）や３′−ＯＨ部分を持たない他の３′−塩基、及び他のブロッキング部分が含まれる。本発明の１つの実施態様において、（３−アミノ−２−ヒドロキシ）−プロポキシホスホリル部分で３′− ＯＨをブロックする。本発明の別の実施態様では、３′−３′−Ａ−５′結合を導入して３′−ＯＨをブロックする。プライマーの３′−ＯＨをブロックせずに本発明のアッセイを実施することは可能ではあるが、３′−ＯＨ末端をブロックすれば、バックグラウンドシグナルを防止する助けとなり、従って、アッセイの感度を向上させる一助ともなる。多くのＤＮＡポリメラーゼ酵素が公知であり、該酵素を本発明のＤＮＡポリメラーゼ反応ステップに用いることができる。好ましい実施態様において、ＤＮＡポリメラーゼは、ｉｎｖｉｔｒｏ突然変異誘発により３′→５′エンドヌクレアーゼ活性が除去されたバクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼの突然変異体であるＳｅｑｕｅｎｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏから入手）である。このポリメラーゼは、プライマーとしてオリゴリボヌクレオチドを用いることができ、高忠実度で複製され且つ３′→５′「プルーフリーディング」活性を有していないので好ましい。標識ハイブリッドポリメラーゼ産物の検出は、用いられる標識のタイプに応じて任意の適切な手段により行い得る。一般に検出は標識ハイブリッドポリメラーゼ産物から標識モノヌクレオチドを分離するステップを含み得る。好ましい実施態様において、検出は、試料混合物（該アッセイ法において、この時点では標識ハイブリッドポリメラーゼ産物と過剰な標識モノヌクレオチドを含む）をナイロン膜を通して濾過して行う。取り込まれなかった過剰な標識モノヌクレオチドは膜を通って流れるが、標識ハイブリッドポリメラーゼ反応産物は捕獲される。標識が放射性標識の場合、フィルターに結合した放射能の量は、リン光イメージング装置を用いるか、プレート読み取りシンチレーションカウンターにより測定し得る。本発明のアッセイは、電気泳動ステップを用いず、９６ウエルマイクロタイタープレートフォーマットで実施し得るという点で従来のアッセイ法とは異なる利点を有している。本発明のアッセイの他の主要な利点は、該アッセイにより、配列中の正しい位置においてのみ基質の切断反応が測定され、それによって非特異的ＲＮＡ切断産物が排除されることにある。本発明のアッセイが典型的な切断反応で生成される２００アトモル（２×１０^-16モル）の産物を検出するのに十分な感度を有していることも重要な点である。ＤＮＡ鋳型及び忠実度の高いＴ７ＤＮＡＳｅｑｕｅの特異性が得られる。典型的な反応条件下では９０％以上の基質は切断されないが、これは該アッセイの特異性の妨げにはならない。何故ならば、３′末端が鋳型との塩基対とはなり得ないので、切断されなかったＲＮＡ基質が重合用のプライマーとしての働きをしないからである。さらに、Ａ１３以外の３′末端を有する非特異的切断産物は伸長しない。これらの短い配列は鋳型とハイブリダイズし得るがＤＮＡポリメラーゼによって伸長されない。というのは、この反応は、鋳型の伸長領域がｐｏｌｙ−ｄＣから構成されている場合には反応混合物中に存在しないｄＡＰＴ又はｄＴＴＰを要求するからである。ポリメラーゼ伸長反応は、ＲＮＡプライマーとＤＮＡ鋳型とのハイブリダイゼーションに依存する。従って、ＲＮＡプライマーをＤＮＡ鋳型に効率的にハイブリダイズさせるためには、ポリメラーゼ伸長反応を１０℃以上ＤＮＡ：ＲＮＡ複合体の融解温度以下の温度で実施するのが好ましい。融解温度が１４℃のプライマー：鋳型複合体の場合、典型的な好ましい反応温度は０℃である。特異性及び温度の影響を示している。長さ及び配列が異なる、キャップされていない合成ＲＮＡ及びＤＮＡプライマーをＤＮＡ鋳型とハイブリダイズさせ、Ｓｅｑｕｅｎａう場合、効率よく伸長するプライマーは１３ｎｔのＡＩＭＶＲＮＡ及びＤＮＡ中の対応配列のみである。ゲル上に不完全に伸長した産物が見られるが、反応条件は、最も鮮明なバンドがプライマーの完全伸長に対応するように最適化されている。最も鮮明なバンド上の鮮明度の低いバンドは塩基１個の付加に対応する。数種のＤＮＡポリメラーゼが平滑末端ＤＮＡの３′−ＯＨ末端への塩基１個の付加を触媒することが知られている（Ｃｌａｒｋ，１９８８Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：９６７７−９６８６られる。１４ｎｔのＲＮＡプライマーを含むレーンの非常に不鮮明なバンドは、１４ｎｔのリボヌクレオチド中に存在する１３ｎｔのＲＮＡのわずかな汚染に帰因する。全長の１９ｎｔプライマー、１３ｎｔより短いＡＩＭＶプライマー、又はβ−グロブリン転写体の５′末端由来の異種１３ｎｔＲＮＡ（５′−ＡＣＡＣＵＵＧＣＵＵＵＵＧ−３′）（配列番号２）を用いた場合には伸長産物は認められｎｔプライマーが選択的に伸長され、切断されなかったＡＩＭＶ基質又は短い非特異的切断産物に対応する配列は伸個程度のわずかな長さしか違わないＡＩＭＶプライマーを誤って伸長させることが阻止されることは注目に値する。本発明により、ポリメラーゼ伸長反応はナイロン膜を通して濾過することにより都合よく測定し得ることが知見された。記載されている条件下では、ナイロン膜上に伸長産物の定量的結合が認められるが、取り込まれなかったα−³²Ｐ−ｄＧＴＰは極く少量（０．０００３％未満）しか保持されていない。大量のスクリーニングを行う場合、濾過プロセスは９６ウエルマニホールドを用いて実施し得、フィルターに結合した放射能はリン光イメージング装置又はマイクロプレートシンチレーションカウンターで測定し得る。図３は、ナイロン膜濾過及びリン光イメージング装置検出を用いる１３ｎｔのＡＩＭＶＲＮＡプライマーの伸長に関する感受性及び線形応答を示している。２０ｍｌの反応容中最大２００ｐＭのプライマーという優れた線形性が認められる。典型的なアッセイ条件下では、４０ｐＭの産物に対応する約１０％の基質がハイブリッドポリメラーゼ伸長反応産物に変換されるが、この量は、アッセイの線形範囲及び検出限界の範囲内に十分含まれることに留意されたい。図２の全てのレーンにわたって主要伸長産物上を走行する不鮮明なバンド及び図３のゼロ以外のｙ線分として示されているバックグラウンドプライマー非依存性反応が認められる。鋳型が存在しないと、前者のバックグラウンドシグナルは存在せず、また後者は劇的に減少するが、これは、両者が相関していることを示唆している。バックグラウンドシグナルは、インフルエンザコアタンパク質の存在にる１本鎖鋳型へのα−³²Ｐ−ｄＧＴＰの付加により生じる。３′−ＯＨ基をアミノリンカー部分でブロックしていない鋳型を用いた場合には、より高度のバックグラウンドシグナルが認められ、これは、該反応が遊離３′−ＯＨを要求することを示唆している。アミノリンカーでブロックした鋳型をｄｄＡＴＰ及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼで処理してバックグラウンドシグナルをさらに減少させることができるが、これは、鋳型中に不純物を含む遊離３′−ＯＨの存在を示唆している。結合したインフルエンザエンドヌクレアーゼ／ポリメラーゼ伸長プロセスを明確に特性決定するために、ｍ⁷Ｇ³²ｐで標識したＡＩＭＶ基質及び標識していないｄＧＴＰを用いて一連の反応を実施し、ゲル電気泳動で分析した。図４は、コアタンパク質が存在しないと、ＡＩＭＶ基質が１９ｎｔの長さに対応する単一のバンドとして移動することを示している。基質をインフルエンザコアタンパク質と共にインキュベートすると、主要切断産物とそれより短い微量産物が生成する。主要産物はＡ１３での切断に対応し、該産物はＧＴＰと共にインキュベートすると伸長する。同様な結果が全長のＡＩＭＶＲＮＡ４を用いて既に報告されている（Ｐｌｏｔｃｈら，１９８９，Ｃｅｌｌ２３：８４７−８５８）。１０倍過剰のキャップされていない非標識ＡＩＭＶ基質を加えても切断の程度には影響がない。コアタンパク質の不在下には、基質をポリメラーゼ、鋳型及びｄＧＴＰと共にインキュベートしても伸長は生じない。コアタンパク質で基質を切断し、その後でポリメラーゼで伸長させると、基質バンド上に不鮮明なバンドが現れる。このバンドは１３ｎｔ産物への１０ｄＧ残基の付加に対応する。この試料では、大半の切断産物がポリメラーゼによって伸長されないことに留意されたい。それに反し、８０℃で１分間インキュベートし、その後で切断した試料では、ほぼ定量的な伸長が認められる。切断産物の解離は極めて緩慢なようであり、加熱ステップは、インフルエンザエンドヌクレアーゼ複合体を変性させることにより結合した産物を遊離させる働きをし得る。図２に見られるように、ポリメラーゼ伸長産物の上に認められ不鮮明なバンドは、平滑末端を有する伸長プライマー／鋳型二重鎖への追加のｄＧ残基の付加に対応すると思われる。切断反応のみの場合におけるように、結合アッセイは、１０倍過剰のキャップされていない非標識ＡＩＭＶ基質の存在には影響を受けない。最終レーンでは、１３ｎｔの相補鋳型の代わりに１４ｎｔの相補領域を含む２４ｎｔの鋳型を付加した。この試料では特異的切断産物は伸長せず、これは、主要産物がＡ１４ではなく、Ａ１３での切断に対応することを証明している。本発明者が既にゲルベースアッセイを用いて同定した阻害剤（４−［Ｎ−ベンゼン−スルホニル−３−（４−クロロベンジル）ピペリジン−３−イル］−２，４−ジオキソブタン酸）を用いて、インフルエンザエンドヌクレアーゼ阻害剤を検出するＤＮＡポリメラーゼ結合アッセイを実施した。この化合物は、最近インフルエンザエンドヌクレアーゼ阻害剤として記載された４置換２，４−ジオキソブタン酸（Ｔｏｍａｓｓｉｎｉｉら，１９９４ＡｎｔｉＭｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８：２８２７−２８３７）と類似の化合物である。該化合物によるエンドヌクレアーゼ阻害の滴定を、ゲルベースアッセイ及び本発明のＤＮＡポリメラーゼ結合アッセイを用いて同一実験条件下に実施した。３ｎＭ〜１０ｍＭの範囲で得られたデータを単純双極線形阻害モデルに当てはめて決定したＩＣ₅₀値は、ゲルアッセイでは２６０±６０ｎＭであり、ＤＮＡポリメラーゼ結合アッセイでは２２０±５０ｎＭである。誤差範囲内ではどちらのアッセイにおいても該化合物の効力は同じであり、これは、ＤＮＡポリメラーゼ結合アッセイがインフルエンザエンドヌクレアーゼの阻害を正確に測定することを示している。本発明の別の態様では、ＤＮＡポリメラーゼ結合アッセイは、キャップされた基質の切断位置を決定するのに好都合な方法を提供する。これまでは、インフルエンザエンドヌクレアーゼによる切断部位は、アルカリ消化による配列ラダーの生成又はＲＮＡアーゼによる消化及び電気泳動によって決定された。前者の方法はアルカリ加水分解に対するキャップ構造内のｍ７Ｇ残基の不安定性に起因する不正確さという欠点を有し、後者の方法はＲＮアーゼにより生成される３′−リン酸化配列の電気泳動移動度の方がインフルエンザエンドヌクレアーゼにより生成される非リン酸化３′−ＯＨ末端の移動度より速いという欠点を有する。それに反し、本発明のＤＮＡポリメラーゼ結合アッセイを用い、予想される切断産物に対応する相補領域を有する鋳型を用いて触媒される伸長反応を比較することにより切断部位を正確に限定することができる。図４は、本発明のこの態様を示しており、該態様において、１３ｎｔの相補領域を有する鋳型は基質としての役割を果たすが、１４ｎｔの相補領域を有する鋳型はそのような役割を果たさない。現行の方法に対する本発明の結合アッセイの別の主要な利点は、検出対象であるオリゴヌクレオチド産物が他の配列（但し、該配列は重合を開始させる働きはしない）の存在下に検出可能であるということにある。従って、複合不純調製物中でさえ対象反応を正確に測定することができる。以下の非限定的実施例は、本発明をより良く説明するために提示されている。実施例一般的実験法：オリゴデオキシリボヌクレオチド及びキャップされていないオリゴリボヌクレオチドをＭｉｄｌａｎｄＣｅｒｔｉｆｉｅｄＲｅａｇｅｎｔＣｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ）に従って合成し、アニオン交換ＨＰＬＣにより精製した。三リン酸化オリゴヌクレオチドを合成し、同時係属特許出願（本出願と一緒に出願した、ＡｔｔｏｒｎｅｙＤｏｃｋｅｔＮｏ．１９４０６）（本明細書に参照として組み込むものとする）に記載の方法によりキャップした。１９ｎｔの基質オリゴリボヌクレオチドの配列は、５′−ＧＵＵＵＵＵＡＵＵＵＵＵＡ−ＡＵＵＵＵＣ−３′（配列番号１）である。該基質の５′領域に対応する長さ１４、１３、１２、１０及び６ｎｔの、３ ′がトランケイトされたリボヌクレオチドも合成した。特に断りのない限り、全ての実験に、配列：５′−ビオチン−ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣ−アミノ−３′（配列番号４）（ここで、５′−ビオチンはＮ−ビオチニル−６−アミノヘキシル−オキシホスホリル部分であり、３′−アミノは３− アミノ−２−ヒドロキシ−プロポキシ−ホスホリルである）を有する２３ｎｔの鋳型を用いた。一部の実験には、配列：５′−ビオチン−ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣ−アミノ−３′（配列番号５）を有する２４ｎｔの鋳型を用いた。α−³²Ｐ−ｄＧＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）はＤｕｐｏｎｔＮＥＮから入手した。非標識ｄＧＴＰはＰｈａｒｍａｃｉａから入手した。ＳｅｑｕｅｎａｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）から入手した。特に断りのない限り、ポリメラーゼ伸長反応は、１ｎＭのプライマー、５０ｎＭの鋳型、５００ｎＭのＳｅｑｕｅ２時間実施した。反応を２０％ポリアクリルアミド８Ｍ尿素ゲル上で分析した。実施例１切断反応及びＤＮＡポリメラーゼ反応ＤＥＰＣ処理した水中１００ｍＭのトリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン（Ｔｒｉｓ）ｐＨ８．０、５０ｍＭのＫＣｌ、０．２５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、４％（ｖ／ｖ）ジチメルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む緩衝液中２５℃でインフルエンザ切断反応を実施した。ポリメラーゼ伸長反応も同一緩衝液中で行ったが、但し、ＭｇＣｌ₂の濃度を１０ｍＭに、ＤＭＳＯの濃度を９％に増大させた。末端標識したプライマーを用いる伸長反応には５００ｎＭのｄＧＴＰを用い、標識していないプライマーを用いる伸長反応には５０ｎＭのα−³²Ｐ−ｄＧＴＰと４５０ｎＭの非標識ｄＧＴＰの混合物を用いた。特に断りのない限り、伸長反応は０℃で実施した。阻害を測定するために、化合物（４−［Ｎ−ベンゼンスルホニル−３−（４−クロロベンジル）ピペリジン−３−イル］−２，４−ジオキソブタン酸）をインフルエンザコアタンパク質と共に１０分間予備インキュベートした。０．７５ｍｌのインフルエンザコアタンパク質を含む１５ｍｌ容の反応混合物中０．４ｎＭの標識していない（ゲルアッセイ）基質又は末端標識した（ポリメラーゼ伸長アッセイ）基質を加えて切断反応を開始し、２５℃ で１０分間反応させた。ポリメラーゼ伸長アッセイの場合、５５０ｎＭの鋳型を含む２０ｍｌ容中０℃で１８時間伸長反応を実施した。８Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動又は９６ウエルマニホールド中でポアサイズ０．２を分析した（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）。濾過するために、試料を２５０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（２００ｍｌ）で稀釈し、２００ｍｌを、５ＸＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で平衡にした膜上に充填し、直ちに濾過した。各ウエルを２００ｍｌの５ＸＳＳＣで５回洗浄し、フィルターをマニホールドから取り出し、１００ｍｌの５ＸＳＳＣで３回洗浄した。ゲルを視覚化し、製造業者により提供されたＩｍａｇｅ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いてフィルターを定量ｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）マイクロプレートシンチレーションカウンターを用いてＮｙｔｒａｎ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者クオ，ローレンス・シーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者オルセン，デイビツド・ビーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．試料のインフルエンザエンドヌクレアーゼ活性を検出する方法であって、（Ａ）インフルエンザエンドヌクレアーゼ活性をアッセイしようとする試料にインフルエンザエンドヌクレアーゼ基質を加えてＲＮＡ産物を生成させるステップ、（Ｂ）該ＲＮＡ産物とＤＮＡ鋳型（該ＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡ産物に実質的に相補的な第１セグメントと該セグメントの５′末端に結合した５′伸長領域とを含み、該伸長領域は１個以上のヌクレオチドからなる）とをハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイズさせて、ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖を形成するステップ、（Ｃ）前記ＤＮＡ鋳型の第２セグメントに相補的な標識モノヌクレオチドを加えるステップ、（Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼが触媒する標識モノヌクレオチドのＲＮＡ産物の３′ 末端への付加を可能にする条件下に前記ヘテロ二重鎖構造にＤＮＡポリメラーゼを加えて、標識ハイブリッドポリメラーゼ産物を生成させるステップ、及び（Ｅ）試料のインフルエンザエンドヌクレアーゼ活性の量の尺度として標識ハイブリッドポリメラーゼ産物の量を測定するステップからなる前記方法。２．ＤＮＡ鋳型の伸長領域が該ＤＮＡ鋳型の第１セグメントには存在しないヌクレオチドからなる、請求項１に記載の方法。３．ＤＮＡ鋳型の伸長領域が実質的に反復されたヌクレオチドからなる、請求項２に記載の方法。４．伸長領域がヌクレオチド１０個以上の長さである、請求項３に記載の方法。５．インフルエンザエンドヌクレアーゼ基質がアルファルファモザイクウイルス４ＲＮＡの５′末端由来である、請求項１に記載の方法。６．基質が（配列番号１）である、請求項５に記載の方法。７．ＤＮＡ鋳型の第２セグメントがｐｏｌｙ−Ｃ残基を含む、請求項４に記載の方法。８．標識モノヌクレオチドが放射性標識されている、請求項１に記載の方法。９．標識ハイブリッドポリメラーゼ産物と過剰の標識モノヌクレオチドを含む試料をフィルターに通して標識ハイブリッドポリメラーゼ産物をフィルターで捕獲し、フィルター上に存在する標識の量を測定することにより、標識ハイブリッドポリメラーゼ産物の量を測定する、請求項１に記載の方法。１０．フィルターがナイロンフィルターである、請求項９に記載の方法。１１．標識が放射性標識である、請求項１０に記載の方法。１２．アッセイしようとする試料がインフルエンザエンドヌクレアーゼ活性の推定阻害剤である、請求項１に記載の方法。１３．試料のインフルエンザエンドヌクレアーゼ活性の量と、推定阻害剤の不在下のインフルエンザエンドヌクレアーゼを含む対照試料について測定した活性とを比較するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。１４．試料のインフルエンザエンドヌクレアーゼ活性を検出する方法であって、（Ａ）活性をアッセイしようとするインフルエンザエンドヌクレアーゼ阻害剤を含むと推定される試料に、実質的にアルファルファモザイクウイルスＲＮＡの５′末端由来の５′末端がキャップされた１９ヌクレオチドのインフルエンザエンドヌクレアーゼ基質を加えて、１３ヌクレオチドのＲＮＡ産物を生成させるステップ：（Ｂ）１３ヌクレオチドのＲＮＡ産物と、ＤＮＡ鋳型（該ＤＮＡ鋳型は、該１３ヌクレオチドのＲＮＡ産物に実質的に相補的な第１の３′セグメント及び該第１のセグメントの５′末端に結合した５′伸長領域を含み、該伸長領域は、第１のセグメントには存在しないヌクレオチドを１０個以上含む）とをハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイズさせて、ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖構造を形成するステップ；（Ｃ）標識モノヌクレオチドを加えるステップ、（Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼが触媒するＲＮＡ産物の３′末端への標識モノヌクレオチドの付加を可能にする条件下にヘテロ二重鎖にＤＮＡポリメラーゼを加えて、放射性標識ハイブリッドポリメラーゼ産物を生成させるステップ；（Ｅ）標識ハイブリッドポリメラーゼ産物と過剰の標識モノヌクレオチドを含む試料をナイロンフィルターに通して放射性標識ハイブリッドポリメラーゼ産物をフィルターで捕獲することにより該試料を濾過するステップ；及び（Ｆ）フィルター上で捕獲された標識ハイブリッドポリメラーゼ産物の量を測定し、該量と、対照試料中に推定インフルエンザエンドヌクレアーゼ阻害剤が存在しないときに得られた量とを比較するステップからなる前記方法。１５．ＤＮＡ鋳型の伸長領域が１０個以上の実質的に反復されたシトシンヌクレオチドからなる、請求項１４に記載の方法。１６．標識ヌクレオチドが放射性標識ｄＧＴＰである、請求項１５に記載の方法。