JPH11506315A

JPH11506315A - 複製受容性標的化アデノウイルスベクターを用いる遺伝子治療

Info

Publication number: JPH11506315A
Application number: JP8533509A
Authority: JP
Inventors: グレゴリー，リチャード，ジェイ．; ファン，ウエイ−メイ
Original assignee: カンジインコーポレイテッド
Priority date: 1995-05-03
Filing date: 1996-05-02
Publication date: 1999-06-08
Also published as: US20050002906A1; AU5723696A; ZA963434B; US20070254357A1; WO1996034969A2; EP0827546A2; CA2218390A1; US20030026789A1; AR001830A1; WO1996034969A3; US20010053768A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、治療遺伝子および少なくとも１つの複製遺伝子に操作により連結された疾病特異的遺伝子調節領域を含む複製受容性アデノウイルスベクターを投与することによるガンの治療方法を提供する。複製受容性標的化アデノウイルスベクターは腫瘍細胞において優先的に複製し、続いて腫瘍特異的遺伝子調節領域を活性化し、それにより複製受容性アデノウイルスベクターにより運搬された治療遺伝子の効果を増幅する。本発明は、選択的に複製し治療投与量の治療遺伝子を伝達する少量のウイルスベクターを用いてガンを処置するために治療遺伝子の標的化を初めて可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】複製受容性標的化アデノウイルスベクターを用いる遺伝子治療本発明は、一般的には、実質的なウイルス遺伝子の上流に治療遺伝子および腫瘍特異的エンハンサー／プロモーターを含む複製受容性標的化ウイルスの投与による、疾病、そして中でも特にガンの処置のための遺伝子治療方法に関するものであり、ガン細胞は腫瘍特異的プロモーターを活性化して、ウイルスによる治療遺伝子の細胞毒性作用の複製、それによる増幅を引き起こす。ガンのような異常な病理学的状態の処置における遺伝子治療の目標は細胞増殖の正常な調節を再構築すること、または異常な増殖を行う細胞を排除することである。生体内遺伝子変性が治療上の効果を導き得る３種の初期の戦略がある。これらの戦略は異常細胞に対する免疫原性の発生、異常表現型を導く遺伝子欠陥の矯正およびその生成物が受容細胞に対して毒性であるか、または毒性となり得る遺伝子の伝達を包含する。これら３種全ての戦略の中で、最小の副作用でもって最大の効果をもたらすと考えられるものは、できるだけ多くの細胞に治療遺伝子を運び、一方では異常に増殖する細胞への治療遺伝子の機能的伝達を調節するベクターを伝達することである。遺伝子欠陥の矯正の特定の例は、例えばｐ５３仲介遺伝子治療を用いて通常の細胞増殖の制御を回復するものである。ｐ５３は細胞周期の移行において中心的な役割をしており、修復またはアポプトシスがＤＮＡ損傷に応答して生じ得るように成長を阻止する。野生型ｐ５３は照射またはいくつかの化学療法剤での処置により誘導されるアポプトシスのために必要な成分として最近同定されている（Lowe等，（1993）ＡおよびＢ）。ヒト腫瘍におけるｐ５３突然変異の高率での存在の故に、化学療法および照射処置に対し抗療性になる腫瘍が野生型ｐ５３の欠如に一部起因してそのようになり得る可能性がある。機能的ｐ５３供給することにより、これらの腫瘍は放射線および化学療法により誘導されるＤＮＡ損傷と通常関連するアポプトシスを受けやすい。ｐ５３欠損腫瘍を処置する場合のように、遺伝子治療は、腫瘍細胞の細胞周期移行を制御するために、および／または細胞死を誘導するために、単独で、または化学療法剤と組み合わせて使用され得る他の腫瘍サプレッサー遺伝子に同様に適用可能である。さらに、細胞周期調節タンパク質をコードしないが、細胞死を直接誘導する遺伝子、例えば致死遺伝子、または細胞に直接毒性である遺伝子は、遺伝子治療プロトコルに使用され得、腫瘍細胞の細胞周期移行を直接排除する。遺伝子が細胞周期移行の制御を回復するために使用されているにもかかわらず、この試みの合理的かつ実用的な適用性は同一である。すなわち、高い効率の遺伝子移送を達成することは、組換え生成物の治療量を発現することである。患者に対して最小の危険性で高い効率の遺伝子移送を可能にするために使用するベクターの選択は、それ故に、遺伝子治療処置の成功のレベルにとって重要である。ガンまたはある種の他の疾病の遺伝子治療を成功させる重要なポイントの一つは、異常細胞の顕著な部分に影響を及ぼす能力である。レトロウイルスベクターの使用は様々な腫瘍モデルにおいてこの目的のために広く探究されている。例えば、肝臓の悪性腫瘍の処置において、レトロウイルスベクターが使用されたが、ほとんど成功しなかった。これは、これらのベクターが生体内遺伝子治療に必要な遺伝子移送の高いレベルを達成することができなったことによる（Huber，B． E.等，1991; Caruso M．等，1993）。ウイルス産生のより継続される供給源を達成するために、研究者は固体腫瘍中にレトロウイルス収納細胞株の直接注入により、遺伝子移送の低レベルと関連する問題を克服することが試みられた（Caruso，M.等，1993; Ezzidine，Z．D．等，1991; Culver，K．W．等，1992）。しかしながら、これらの方法は、その方法が煩雑であり、そして患者において収納細胞株に対する炎症性応答を誘導するので、ヒトの患者への使用には満足できるものではない。レトロウイルスベクターのもう一つの欠点は、それらが当該組換え遺伝子を効率よく組み込み、そして発現するために、分割細胞を必要とすることである（Huber，B．E．1991）。実質的な宿主遺伝子中への安定な組み込みは病理学的疾病状態の進展または遺伝を導き得る。組換えアデノウイルスはレトロウイルスおよび他の遺伝子伝達法に比べ明らかな利点を有する（参考のために、Siegfried(1993)参照）。アデノウイルスがヒトにおいて腫瘍を誘導することは決して示されておらず、そして生ワクチンとして安全に使用されてきた（Straus（1984））。複製欠損組換え組換えアデノウイルスは複製に必要なＥ１領域を標的遺伝子で置換することにより製造され得る。アデノウイルスは感染の通常の結果としてヒトゲノム中に組み込まれない。これにより、レトロウイルスまたはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの場合に可能性のある挿入突然変異誘導の危険性を大きく低下させている。安定な組み込みのこの欠如はまた、染色体外ＤＮＡが通常細胞の連続する分割と共に徐々に失われるので、移送された遺伝子の作用が一時的であるというさらに安全な態様を導く。安定な高い力価の組換えアデノウイルスはレトロウイルスまたはＡＡＶでは依然として達成できないレベルで産生され得、大量の患者数を処置するために十分な材料の産生を可能にする。さらに、アデノウイルスベクターは広範囲の組織および腫瘍細胞タイプ中に効率よく生体内遺伝子移送することができる。例えば、その他のものは、アデノウイルス仲介遺伝子伝達が疾病、例えば嚢胞性繊維症の遺伝子治療（Rosenfeld 等，(1992); Rich等，(1993)）およびα₁−アンチトリプシン欠損症（Lemarchand等，(1992)）のために高い可能性を有することが示されている。遺伝子伝達のための他の方法、例えばカチオンリポソーム／ＤＮＡ複合体もまた現在研究されているけれども、アデノウイルス仲介遺伝子伝達ほど有効であるものは未だ出現していない。遺伝子治療用途のために現在試験されているアデノウイルスベクターは、それらを複製不全にするようにＡｄ２またはＡｄ５が典型的には欠失されている。アデノウイルスベクターは遺伝子伝達ビヒクルの他の態様に比べいくつかの利点を提示するけれども、それらは、生体内での有効な使用に制限を課すいくつかの特徴を依然として示す。これらの制限は腫瘍集合体に治療遺伝子を効率よく伝達および標的化するために、ベクターの限定された能力を主に結果的に導く。大量の伝達薬剤を腫瘍環境に投与することにより、研究者は上記の問題を回避することを試みたが、これは分散した移転性疾病を処置する場合には実行可能とは思われない。上記の問題に対する解決は、腫瘍組織において複製し、そしてそれによりウイルスが持っていたあらゆる治療遺伝子の効果を増幅する能力を保持するウイルスベクターの使用にあるということが最近提案されている（S．J．Russel l.，1994，European Journal of Cancer 8，1165-1171）。ガンの処置における複製するウイルスの可能な使用は長い歴史を有し（Ｉｄ．）、そして非常に多くのウイルスタイプがガン治療剤として実験的試行において顕著な成功をみることなく使用されてきた。従って、治療遺伝子を異常に増殖している細胞に特異的に標的化し、そしてまた、治療遺伝子の非常に多くのコピー数が疾病組織の効率のよい通過を可能にすることにより、より高い効率を達成することを可能にする方法に対する要求がある。本発明はこの要求を満足し、そして関連する利点をさらに提供する。発明の要約本発明は、治療遺伝子および少なくとも１つの複製遺伝子に操作により（操作可能に）連結された疾病特異的遺伝子調節領域を含む複製受容性アデノウイルスベクターを投与することによるガンの治療方法を提供する。複製受容性標的化アデノウイルスベクターは腫瘍細胞において優先的に複製し、続いて腫瘍特異的遺伝子調節領域を活性化し、それにより複製受容性アデノウイルスベクターにより運搬された治療遺伝子の効果を増幅する。本発明は、選択的に複製し治療投与量の治療遺伝子を伝達する少量のウイルスベクターを用いてガンを処置するために治療遺伝子の標的化を初めて可能にする。図面の簡単な説明図１はｒＡｄ／ＡＦＰ−Ｅ１ａ／ＴＫの模式図である。ヌクレオチド３５５と４８３の間にＥ１ａプロモーターを含むアデノウイルス５型配列は欠失され、そしてアルファ−フェトプロテインエンハンサー／プロモーターを含む１．７ｋｂ断片で置換されている。また、２８５８３と３０４７０に相当するＡｄ５の間のＥ３領域におけるアデノウイルス５型配列は欠失され、そしてその場所にはＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子に対応する１１３０塩基対の断片が挿入されている。図２は肝細胞がん腫（ＨＣＣ）細胞株におけるｒＡｄ／ＡＦＰ−Ｅ１ａ／ＴＫの複製を示す。ｒＡｄ／ＡＦＰ−Ｅ１ａ／ＴＫおよび複製受容性対照ウイルスｄ１３２７が、２種のＨＣＣ細胞株を感染するために使用された。ｄ１３２７はｒＡｄ／ＡＦＰ−Ｅ１ａ／ＴＫにおいて欠失されたＥ３の同じ領域が欠失されているが、通常のＥ１ａプロモーター領域を含む。このＨｅｐ３Ｄ細胞株はアルファ −フェトプロテインを産生するが、ＨＬＥ細胞株は産生しない。複製はウイルスＤＮＡを単離し、そして示された時点でサザンブロット分析を行うことにより評価された。放射活性なプローブにより評価されるような複製はモレキャラー・ダイナミクス・ホスホリメジャーを用いて計測された。結果はこれらの細胞株において対照ウイルスｄ１３２７の複製に対して標準化される。Ａ）Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるｒＡｄ／ＡＦＰ−Ｅ１ａ／ＴＫの複製。Ｂ）ＨＬＥ細胞におけるｒＡｄ／ＡＦＰ−Ｅ１ａ／ＴＫの複製。図３は、各々の時点でのｄ１３２７ウイルスの複製に対して標準化されたＨｅｐ−３Ｂ（ＡＦＰ陽性）対ＨＬＥ（ＡＦＰ）陰性細胞株におけるＡｄ／ＡＦＰ− Ｅ１ａ／ＴＫ複製の比較。ｒＡｄ／ＡＦＰ−Ｅ１ａ／ＴＫはＡＦＰ陽性ＨＣＣ細胞において優先的に複製する。本発明の詳細な説明本発明は、遺伝子治療および該当する特定の部位、すなわちガン細胞内に治療遺伝子を選択的に発現するための疾病特異的複製受容性アデノウイルスベクターの使用に関するものである。複製受容性ベクターの使用は、治療遺伝子が、ウイルス複製により増幅され、そして近傍の細胞への移送が可能となる少数の腫瘍細胞に最初に伝達され得るという利点がある。従って、複製は遺伝子伝達段階の全体の効率を高め、それによって、遺伝子治療プロトコルの効果を高める。宿主の通常の免疫系は体全体にウイルスの拡散を防止する。一つの態様において、本発明は、本発明の方法を用いて治療物質の標的化された伝達を可能にするユニーク因子物質がある、ガンおよび他の過剰増殖疾患または疾病を処置するために、操作された複製受容性組換えアデノウイルスの治療的使用に関する。ウイルスは通常の細胞において複製するそれらの能力が低下するように変性され、特定の腫瘍タイプにおいて効率よく複製する能力を保持する。アデノウイルスベクターは治療遺伝子、例えば致死的であるか、またはガンを非悪性にする細胞毒性遺伝子または腫瘍サプレッサー遺伝子、またはある種のウイルス、例えば肝炎ウイルスまたはサイトメガロウイルスに対するアンチセンス化合物、または抗ウイルス化合物、例えばインターフェロン−アルファを包含する。腫瘍特異的複製受容性ベクターは、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子のプロモーターが腫瘍特異的プロモーター／エンハンサーで置き換えられるように操作されている。これらの組換えウイルスと遺伝子治療に典型的に使用されるものとの重要な相違は、複製遺伝子、例えばＥ１遺伝子自身が得られる組換えアデノウイルスに保持されていることである。ウイルスＥ１遺伝子は多くの他の重要なウイルス遺伝子の転写を制御するので（Horowitz，1990）、この変性はＥ１ａプロモーターの代わりに挿入された腫瘍特異的プロモーター／エンハンサーを利用する腫瘍にウイルス複製を制限する。細胞毒性遺伝子の一例は、それ自身が薬剤ガンシクロビルの存在下で複製細胞に選択的毒性を有するヘルペスシンプレックス（単純ヘルペス）１型チミジンキナーゼ遺伝子である（F．L．Moolten，1986）。腫瘍塊内の組換えアデノウイルスの複製はウイルスに運搬された細胞毒性遺伝子の効果を増幅する。本明細書において使用される際に、用語「治療遺伝子」は治療に利益となる効果、例えば細胞周期の制御または細胞死の誘導を有するタンパク質をコードする核酸配列を意味する。細胞周期を制御する遺伝子の例はｐ５３、ＲＢおよびミトシンを包含し、一方、細胞死を誘導する遺伝子は条件つき致死遺伝子チミジンキナーゼを包含する。エフェクター細胞の免疫学的機能を高めるサイトカインはまた、本明細書で定義されたような用語内に包含される。治療遺伝子は、本発明の方法において使用される複製受容性アデノウイルスベクターから発現される実質的に外来遺伝子である。これらの外来遺伝子はそれ故に、野生型アデノウイルスに見られる対応ＤＮＡ分子とは同じ配向および位置には存在しないＤＮＡ分子である。外来遺伝子は約４．５キロベースまでのＤＮＡ分子であってよい。そのような遺伝子の治療上有効な作用は作用の直接または間接の様式のいずれかにより付与され得る。例えば、直接作用する治療遺伝子は細胞増殖のために必要である遺伝子を包含し得る。そのような直接作用遺伝子の例は腫瘍サプレッサー遺伝子および細胞周期調節遺伝子である。作用の間接様式により有用である治療遺伝子の例は、細胞毒性特徴を示す遺伝子および免疫モジュレーター（イムノモジュレーター，免疫制御）遺伝子である。細胞毒性遺伝子は単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用される場合に、治療上有効であり得る。本発明の治療遺伝子の定義内に包含されるのは、それらの活性な断片および遺伝子産物の意図された機能に顕著に影響を与えないわずかな変性（修飾）を含む遺伝子である。従って、治療遺伝子の「活性断片」は治療上の効果を有するタンパク質をコードする能力を保持する遺伝子のより小さい部分を包含する。下により十分に記載されているｐ５６^RBは腫瘍サプレッサー遺伝子である治療遺伝子の活性断片の一例にすぎない。考慮される治療遺伝子の変性は、未変性遺伝子の機能的活性が保持される限り、ヌクレオチド追加（付加）、欠失または置換を包含する。従って、そのような変性は天然のタンパク質またはポリペプチドの線状配列から外れるが、その生物学的活性を変更しないアミノ酸置換を有する同等の遺伝子産物を生じる。これらの同等物は１またはそれ以上のアミノ酸の関連アミノ酸、例えば類似の荷電アミノ酸への置換、または側鎖もしくは官能基の置換もしくは変性により天然の配列とは異なり得る。本明細書において使用される際に、用語「操作して（操作可能に）連結」は所望のポリペプチドの生物学的産生を結果として生じる発現要素（発現エレメント）へのあるコード性核酸配列の結合を意味する。それ故に、「発現要素」は本明細書において使用される際に、コード性核酸からの遺伝子産物の適当な転写、プロセシング、翻訳およびソーティングを導く全ての核酸要素を意味する。そのような要素は、例えばプロモーターおよび調節要素、例として本明細書で上記したような腫瘍特異的プロモーター／エンハンサー、スプライシング配列、翻訳開始および終結配列およびシグナル配列を包含し得る。本明細書において使用される際に、用語「複製受容性アデノウイルスベクター」または「アデノウイルスベクター」はガン細胞において優先的に複製し、そして従ってウイルスにより運搬された治療遺伝子の効果を増幅するアデノウイルスゲノムから誘導されるベクターを意味する。ベクターの複製は疾病組織の特徴的な因子の存在に依存する。該因子はベクターの複製を誘発し、そして次に治療効果の増幅を誘発する。本発明のアデノウイルスベクターは通常の細胞において複製するそれらの能力が低下または消失するように本明細書に記載のように操作され、特定の腫瘍疾病細胞タイプにおいて効率よく複製する能力を保持する。本明細書において使用される際に、用語「腫瘍特異的遺伝子調節領域」または「腫瘍特異的調節領域」または「腫瘍特異的プロモーター」または「腫瘍特異的プロモーター／エンハンサー」は特異的腫瘍細胞タイプにおいて選択的または優先的に機能する転写および／または翻訳調節領域を意味する。選択的または優先的機能は、治療遺伝子が標的化または特異的腫瘍細胞タイプにおいて主として発現されるので、遺伝子治療処置に特異性を付与する。腫瘍特異的調節領域は、腫瘍細胞タイプ特異的である転写、ｍＲＮＡ成熟シグナルおよび翻訳調節領域を包含する。転写調節領域は、例えばプロモーター、エンハンサーおよびサイレンサーを包含する。そのような転写調節領域の特定の例は、アルファ−フェトプロテイン、ガン胚抗原および前立腺特異的抗原のためのプロモーター／エンハンサーを包含する。ＲＮＡプロセシングシグナルは、例えば組織特異的イントロンスプライシングシグナルを包含し、一方、翻訳調節シグナルは、例えばｍＲＮＡ安定シグナルおよび翻訳開始シグナルを包含し得る。従って、腫瘍特異的調節領域は特異的腫瘍細胞タイプにおける成熟遺伝子産物の産生に必須である全ての要素を包含する。本明細書において使用される際に、用語「腫瘍サプレッサー遺伝子」は細胞が腫瘍細胞としてふるまうのを有効に阻害するタンパク質をコードする遺伝子を意味する。腫瘍サプレッサー遺伝子の特定の例は網膜芽腫（ＲＢ）遺伝子である。完全なＲＢｃＤＮＡヌクレオチド配列および得られるＲＢタンパク質（ｐ１１０^RB と表記される）の予測アミノ酸配列はLee等（1987）に示されている。ｐ１１０^RBの先端切除体はｐ５６^RBと呼ばれ、これもまた、腫瘍サプレッサー遺伝子として機能し、そしてそれ故に治療遺伝子として有用である。ｐ５６^RBの配列はHu ang等（1991）に記載されている。ＲＢ以外の腫瘍サプレッサー遺伝子は例えばｐ１６タンパク質（Kamb等（1994））、ｐ２１タンパク質、ウイルムス腫瘍ＷＴ１タンパク質、または結腸ガン腫ＤＤＣタンパク質または関連分子、例えばミトシンおよびＨ−ＮＵＣを包含する。ミトシンは１９９３年１０月２２日出願のZh uおよびLee,米国出願第０８／１４１２３９号および１９９４年１０月２４日出願のそれに続く同じ発明者による一部継続出願、代理人証書番号Ｐ−ＣＪ１１９１（両方の文献は参照により本明細書に編入される）に記載されている。同様に、Ｈ−ＮＵＣは参照により本明細書に編入される１９９３年１２月２０日出願の W-H LeeおよびP-L Chen，米国出願第０８／１７０５８６号に記載されている。腫瘍サプレッサータンパク質の定義内に包含されるのはまた、その存在が宿主細胞の腫瘍形成性、悪性度または過剰増殖表現型を低下または解消することにより新生物表現型を抑制するあらゆるタンパク質である。新生物表現型は変更された形態、促進された成長速度、より高い飽和密度、柔らかい寒天中での増殖および腫瘍形成性による特徴づけられる。上記の治療遺伝子はこの活性を示すタンパク質をコードする。「腫瘍形成性」は腫瘍を形成するか、または腫瘍形成を引き起こす能力を有することを意味することが意図されており、そして新生物成長と同意語である。「悪性度」は転移し、そして宿主生物の生命を危険にさらす能力を有する腫瘍形成性細胞を記載することが意図される。「過剰増殖表現型」は細胞タイプに対する成長の通常の限界を越える速度で成長し、そして分裂する細胞を記載することが意図される。「新生物」もまた、内因性機能的腫瘍サプレッサータンパク質を欠如する細胞または細胞がある機能的腫瘍サプレッサータンパク質をコードする内因性核酸を発現する能力を欠如することを包含する。本明細書において使用される際に、用語「細胞周期調節遺伝子」は細胞周期内の１またはそれ以上の調節段階を直接的または間接的に制御するタンパク質をコードする遺伝子を意味する。そのような細胞周期調節段階は、例えば増殖表現型への休止の制御、例としてＧ₀Ｇ₁移行ならびにアポプトシスへの進行を包含する。細胞周期調節遺伝子の例はサイクリンおよびサイクリン依存キナーゼを包含する。本明細書において使用される際に、用語「免疫モジュレーター遺伝子」は、増殖する腫瘍細胞に対する宿主固有の応答を増大する免疫系に直接的または間接的に影響を及ぼすタンパク質をコードする遺伝子を意味する。そのような免疫制御遺伝子は、例えば免疫系のエフェクター細胞により認識されるサイトカイン、例としてインターロイキンおよびインターフェロンを包含する。本明細書において使用される際に、用語「細胞毒性遺伝子」は、単独または他の薬剤と組み合わせて、細胞生命を死に到らしめるタンパク質をコードする遺伝子を意味する。単独で致死的である細胞毒性遺伝子の例は毒素、例えば百日咳毒素、ジフテリア毒素等を包含する。他の薬剤と組み合わせて使用されて細胞死に到らしめる細胞毒性遺伝子の例は、例えばヘルペスシンプレックス−１チミジンキナーゼおよびシトシンデアミナーゼを包含する。対象はこの際、抗腫瘍遺伝子の存在下で細胞に対して毒性である治療剤を有効量投与される。チミジンキナーゼの特定例において、治療剤はチミジンキナーゼ基質、例えばガンシクロビル（ＧＣＶ）、６−メトキシプリンアラビノヌクレオシド（ａｒａＭ）またはそれらの機能的同等物である。チミジンキナーゼ遺伝子およびチミジンキナーゼ代謝物の両方は宿主細胞に毒性であるように同時に使用されなければならない。しかしながら、その存在において、ＧＣＶはホスホリル化されており、そしてＤＮＡ合成の潜在的阻害剤になり、ａｒａＭは細胞毒性アナボライトａｒａＡＴＰに変換される。他の抗腫瘍遺伝子は同様に、腫瘍細胞の増殖を低減するために、相当する治療剤と組み合わせて使用され得る。そのような他の遺伝子および治療剤の組合せは当業者により知られている。別の例は酵素シトシンデアミナーゼを発現する本発明のベクターである。そのようなベクターは薬剤５−フルオロウラシルの投与と組み合わせて使用されており（ AustinおよびHuber，1993）、また最近の報告では大腸菌ＤｅｏΔ遺伝子が６− メチル−プリン−２’−デオスリボヌクレオシドと組み合わせて使用されている（Sorscher等，1994）。本発明は哺乳類ガン細胞を処置する方法を提供する。該方法は治療遺伝子および少なくとも１つの複製遺伝子に操作により（操作可能に）連結された疾病特異的遺伝子調節領域を含む複製受容性標的化アデノウイルスベクターを投与することからなり、疾病細胞は疾病特異的遺伝子調節領域を活性化する。当業界で公知であったものとは異なり、本発明は、選択された部位で選択的に複製する複製受容性組換えアデノウイルスの使用を特許請求している。感染に続いてウイルスゲノムは細胞核に局在化する。アデノウイルス複製は次いでＥ１ａ遺伝子の初期転写により進行する。Ｅ１ａ遺伝子の生成物は次に他の初期転写ユニット、Ｅ１ｂ，Ｅ２，Ｅ３およびＥ４の転写を活性化する。これらの生成物は、主要な後期転写ユニットが活性化されて主要なウイルス構造タンパク質およびウイルスアッセンブリーの核内での合成を誘導する点でＤＮＡ合成を開始する。本発明の複製受容性ベクターは、標的化腫瘍細胞タイプにおいて優先的に複製するということにおいて疾病特異的である。この腫瘍特異的複製受容能は腫瘍特異的遺伝子調節領域に複製のための少なくとも１つの遺伝子を操作により連結することにより達成される。複製に必要な遺伝子は上記のあらゆるもの、例えばＥ１ａ遺伝子である。他の遺伝子、例えばＥ２，Ｅ４および主要な後期転写ユニットは腫瘍特異的複製受容能を達成することができるが、増殖に必要な他のアデノウイルス遺伝子の発現を制御することにおいてＥ１ａの使用が有利である。従って、本発明はＥ１遺伝子を保持するアデノウイルスベクターおよびＥ１ａ遺伝子を保持するものを提供する。本発明の方法において有用な複製受容性アデノウイルスベクターは特定の用途のための所望の機能を達成するように変性され得る。そのような変性は、治療遺伝子の伝達および効果を高めるようなアデノウイルスまたは外因性配列の付加、欠失または置換を包含する。さらに、Ｃウイルス、セロタイプ１，２，５および６のあらゆる群に基づいたアデノウイルスベクターならびにベクター、例えばアデノウイルスベクターに基づいたＡｄ２／Ａｄ５が本発明の方法において使用され得る。本発明は細胞毒性遺伝子、例えば条件つきで致死的なヘルペスシンプレックスチミジンキナーゼ遺伝子である治療遺伝子を提供する。本発明はまた、腫瘍サプレッサー遺伝子である治療遺伝子を提供する。腫瘍サプレッサー遺伝子の例は例えばｐ５３、ＲＢ、ＲＢ突然変異体、ｐ２１、ｐ５３突然変異体またはミトシンを包含する。そのような治療遺伝子の発現は細胞周期移行の制御の回復を結果的に生じる。治療遺伝子は、優先的組織特異的発現が実質的な複製遺伝子の腫瘍特異的発現によるように、誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。また、治療遺伝子は同様に、腫瘍特異的遺伝子調節領域の制御下にあってもよい。複製遺伝子と治療遺伝子の両方の組み合わされた腫瘍特異的発現は、より高い特異性が達成され、それ故に本方法のより優れた効果が得られる点において有利である。細胞毒性である治療遺伝子は直接致死的であり、標的化された腫瘍細胞の細胞死を遂げるものであっても、また、それらは例えば条件に応じて致死的である、例えば致死遺伝子により代謝される場合に毒性となることができる薬剤と組み合わせて使用される致死遺伝子であってもよい。そのような致死遺伝子の特定の例はヘルペスシンプレックスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子である。特定の用途に必要な種々の遺伝子でベクターを変更して、より高い柔軟性を与えるために、発現カセットが本発明の複製受容性ベクター中に含有され得る。発現カセットはそれ故に、当該の治療遺伝子の組換え産生を達成するベクターの能力を記載する機能的用語である。本発明は、遺伝子調節領域がアルファ−フェトプロテインプロモーター／エンハンサー、ガン胚抗原プロモーター／エンハンサー、チロシナーゼプロモーター／エンハンサーおよび前立腺特異的抗原プロモーター／エンハンサーからなる群から選択される腫瘍特異的複製受容性ベクターを提供する。他の疾病、例えば炎症状態のために、インデューサーはＴＮＦ−αおよび応答調節要素のインターロイキン−６（ＩＬ−６）プロモーターであってよい。治療遺伝子はインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）または別の抗炎症性サイトカインをコードし得る。本発明の方法において有用なベクターは特異的腫瘍細胞において特異的に複製する。腫瘍特異性は複製に必須である１またはそれ以上の遺伝子の発現を誘導する腫瘍特異的遺伝子調節領域の含有に起因する。そのような要素は例えばアルファ−フェトプロテインプロモーター／エンハンサー、ガン胚抗原プロモーター／エンハンサー、チロシンプロモーター／エンハンサーおよび前立腺特異的抗原プロモーター／エンハンサーを包含する。これらの遺伝子調節領域の各々は特異的腫瘍細胞タイプにおいて優先的に機能する。例えばアルファ−フェトプロテインプロモーター／エンハンサーは肝細胞性ガン腫瘍細胞において優先的に機能する。ガン胚抗原プロモーター／エンハンサーは結腸ガンおよび乳腫瘍細胞において優先的に機能し、一方、前立腺特異的抗原プロモーター／エンハンサーは前立腺腫瘍細胞において優先的に機能する。最後にチロシンプロモーター／エンハンサーは黒色腫腫瘍細胞において優先的に機能する。従って、本発明は、例えば乳ガン、結腸直腸ガン、肝細胞性ガン腫および黒色腫ガンを包含するガンの処置を提供する。複製受容性ベクターの投与は当業者に十分に公知の方法により行われる。そのような投与は単独でも、許容し得る薬学的媒体中であってもよい。薬学的に許容し得る担体は、例えば組成物を安定化するか、または薬剤の吸収を向上させるか、もしくは低下させるように作用する生理学的に許容し得る化合物を含有し得る。生理学的に許容し得る化合物は、例えば炭水化物、例としてグルコース、ショ糖またはデキストラン、酸化防止剤、例としてアスコルビン酸またはグルタチオン、キレート剤、低分子量タンパク質または他の安定剤もしくは賦形剤を包含し得る。他の生理学的に許容し得る化合物は湿潤剤、乳化剤、分散剤または保存剤を包含し、それらは微生物の増殖または作用を防止するために特に有用である。種々の保存剤が十分に公知であり、そして例えばフェノールおよびアスコルビン酸を包含する。当業者は生理学的に許容し得る化合物を包含する薬学的に許容し得る担体の選択が、例えばポリペプチドの投与の経路および特定のポリペプチドの特別な生理−化学的特徴に依存することを知悉している。例えば、生理学的に許容し得る化合物、例えばアルミニウムモノステアレートまたはゼラチンが遅延剤として特に有用であり、対象に投与される薬剤組成物の吸収率を延長する。担体、安定剤または助剤のその他の例は参照により本明細書に編入されるMartin，Remington's Pharm．Sci.，１５版（Mack Publ ．Co.，Easton，1975）に見出され得る。薬剤組成物はまた、所望するならば、リポソーム、ミクロスフェアまたは他のポリマー材中に含有され得る（参照により本明細書に編入されるGregoriadis，Liposome Technology，Vol．１(CRC Pres s，Boca Raton，Florida 1984)）。リポソームは、例えばリン脂質または他の脂質からなり、無毒性で生理学的に許容し得る、そして代謝可能な担体であり、製造および投与が比較的容易である。複製受容性ベクターは、上記薬学的に許容し得る担体１種またはそれ以上と組み合わせた上記のベクターを包含する薬剤組成物として投与され得る。該組成物は次いで治療のため、または予防のために投与され得る。本発明のベクターを含有する薬剤を投与する方法は当業者に十分に公知であり、そして経口投与、腫瘍内投与、静脈内投与、筋肉内投与または腹膜内投与を包含するが、それに限定されない。投与は連続的にまたは断続的に行われ得、そして対象および処置されるべき状態、例えば他の治療組成物との併用の場合によって変わる（Landmann 等(1992); Aulitzky等(1991); Lantz等(1990); Supersaxo等(1988); Demtri等(1 989);およびLeMaistre等(1991)）。本発明の種々の態様の活性に実質的に影響を与えない変更は本明細書に記載の本発明の定義内に包含される。従って、以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、限定するものではない。実施例１野生型アデノウイルス５型とは２つの様式で異なっている組換えアデノウイルスベクターが構築された。第１に、３５５と４８３に相当するＡｄ５の間に含有するＥ１ａプロモーターが切除され、そしてアルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）エンハンサー／プロモーターをコードする１．７ｋｂ断片で置き換えた。第２に、２８５８３と３０４７０に相当するＡｄ５の間のＥ３領域が切除され、そしてその代わりにＨＳＶ−１ＴＫ遺伝子を挿入した。Ｅ３において切除されたＤＮＡはウイルス複製には必須のものではない。組換えウイルスベクターはそのＡＦＰ制御要素の故に、ＡＦＰガン細胞において優先的に複製する。これは、Ｅ３において含有される治療遺伝子、本実施例においてはＨＳＶ−１ＴＫの効果が、腫瘍特異的プロモーターが活性化される細胞中で優先的に増幅されるのを可能にする。ＡＦＰプロモーターは肝細胞性ガン腫ならびに他のガンにおいて活性化され、そしてこの組換え複製受容性アデノウイルスベクターはこれらのガンを処置する手段を提供する。同時に、腫瘍特異的プロモーターが、他の腫瘍タイプにおいてウイルスを増幅するためにＡＦＰエンハンサー／プロモーターの代わりに挿入され得る。このウイルスは浸透によるか、または腫瘍内注入のいずれかにより投与され得る。それは自己複製性であるので、少量のみのウイルスのみが腫瘍細胞の治療を開始するために必要とされる。方法−全てのプラスミドおよびウイルス構築物は標準的方法（Sambrook等1989 ，GrahamおよびPrevec，1991）を用いて構築された。組換えプラスミド構築物−Ｅ１領域。腫瘍特異的プロモーターの制御下にＥ１ａ遺伝子を置くために、プラスミドが標準的方法を用いて構築された。プラスミドｐｃＤＮＡ３Ａｄ２Ｅ１はアデノウイルス２型Ｅ１ａ遺伝子を市販されて利用可能なベクターｐｃＤＮＡ３（Invitrogen Corp.）中にクローニングすることにより構築された。Ｅ１ａ遺伝子は下記のプライマーを用い純粋なＡｄ２ＤＮＡ（Gibco/BRL）に対してポリメラーゼ連鎖反応により単離された：１１８９ｂｐＥ１ａＰＣＲ生成物は１％アガロースゲル上を走行され、そしてバンドがカミソリ刃により切り出され、そしてGeneclean II(Bio101 Inc.)により寒天から精製された。精製されたＰＣＲ生成物は次にXhoIおよびHindIIIで消化され、そしてｐｃＤＮＡ３のHindIIIおよびXhoI部位中にクローニングされ、ｐｃＤＮＡ３Ａｄ２Ｅ１ａが生成された。プラスミドｐＡｄ／ＡＦＰ／Ｂはアデノウイルス移送ベクターｐ１ＴＲＢのＸおよびＹ部位間にアルファ−フェトプロテインエンハンサー／プロモーターをクローニングすることにより構築された。このベクターは下に記載されるｐＡＡＮＴＫに対して同様に構築された。ｐＡｄ／ＡＦＰ／Ｅ１ａを構築するために、Ａｄ２Ｅ１ａ遺伝子がｐｃＤＮＡ３からHindIII（クレノウポリメラーゼでブラント化）／Nco1制限断片として単離され、そしてXbaI（クレノウポリメラーゼでブラント化）とNco1部位との間のｐＡｄ／ＡＦＢ／Ｂ内のＡＦＰプロモーターに隣接して挿入された。組換えプラスミド構築物−Ｅ３領域。アデノウイルスＥ３領域に細胞毒性遺伝子のような治療遺伝子を挿入するために、下に記載されるようにプラスミドｐＳＥ２８０−Ｅ３デルタを構築した。構築物はｐＳＥ２８０（Invitrogen Corp.）のEcoRIとSmaI部位との間の２６０４５ないし３８７１１に相当するＡｄ５ヌクレオチドに対応するＡｄ５制限断片（Mun1／Dra1）をクローニングすることにより生成された。得られるプラスミドｐＳＥ２８０Ｅ３５’は次に制限酵素Nh e1およびSnaB1で切断され、そしてＡｄ５ヌクレオチド３０４７１−３３７５６に相当するアデノウイルスＤＮＡ（XbaI／EcoRV）の第２の制限断片が挿入された。得られたプラスミドｐＳＥ２８０Ｅ３デルタは２８７１１−３０４７１に相当するアデノウイルスに対応する欠失を除くアデノウイルスＥ３領域を含有する。これらの配列はアデノウイルス複製には必須でなく、そして外来遺伝子はその領域に挿入され得る。この領域にＴＫ遺伝子を挿入するために、ＴＫ遺伝子のＰＣＲにより単離され、そしてXbaIおよびBamHI制限部位によりフランキングされたＴＫ遺伝子断片がｐＡＡＮＴＫに対するポリメラーゼ連鎖反応により単離され、そしてｐＳＥ２８０−Ｅ３デルタのXbaIおよびBamHI部位中にクローニングされてｐＳＥ２８０／Ｅ３デルタ／ＴＫが生成された。ｐＡＡＮＴＫに類似しているプラスミドｐＡＣＮＴＫはｐＭＬＢＫＴＫ（ＡＴＣＣ番号３９３６９）からのＨＳＶ−ＴＫ遺伝子をクローニングベクターのポリリンカー中にサブクローニングし、次にｐＡＣＮベクター中へのクローニングのための所望の末端部でＴＫ遺伝子の単離を行うことにより構築された。ｐＡＣＮベクターは生体内組換えのために必要なアデノウイルス配列を含有し、組換えアデノウイルスの形成を生じる。プラスミドｐＡＡＮＴＫの構築は、ＡＦＰエンハンサーおよびプロモーターがＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の上流にあり、組換えアデノウイルスの形成を生じるために生体内組換えに必要なアデノウイルス２型配列がそれに続いている最終プラスミド中にいくつかの段階によりサブクローニングされたα−フェトプロテインエンハンサー（ＡＦＰ−Ｅ）およびプロモーター（ＡＦＰ−Ｐ）領域をコードする断片のＰＣＲ増幅を必要とした。組換えアデノウイルスの構築−Ｅ１ａプロモーターが腫瘍特異的プロモーターにより置換された組換えアデノウイルスを生成するために、プラスミドｐＡｄ／ＡＦＰ／Ｅ１ａは制限酵素Cla1で切断され、そして次いでこれもまたCla1で切断されたアデノウイルスｄ１３０９（JonesおよびShenk，1979）に連結された。この連結されたＤＮＡは２９３の細胞をトランスフェクションするために使用され、そして得られたウイルスプラークはＡＦＰプロモーターの挿入のための制限分析によりスクリーニングされた。得られたウイルスはｒＡｄ−ＡＦＰ−Ｅ１ａ／３０９と呼ばれる。ＨＳＶ−１ＴＫ遺伝子は次に、このウイルスのＤＮＡを制限酵素EcoRIおよびSrf1で切断し、そして次にウイルスＤＮＡをBstE11およびKpn 1で切断されたｐＳＥ２８０−Ｅ３デルタ／ＴＫＤＮＡを有する２９３の細胞中に共トランスフェクションすることにより、Ａｄ−ＡＦＰ−Ｅ１ａ／３０９のＥ３領域中に置換された。生体内組換えから得られた組換えウイルスプラークは単離され、そしてＥ３領域中に挿入されたＴＫ遺伝子の存在に対して制限分析によりスクリーニングされた。ウイルス複製の分析Ｈｅｐ３Ｂ（ＡＦＰ陽性ＨＣＣ細胞株）およびＨＬＥ（ＡＦＰ陰性細胞株）の１×１０Ｅ＋６が１０ｃｍ組織培養皿中に播種された。２４時間後、細胞をｒＡｄ／ＡＦＰ−Ｅ１ａ−ＴＫまたはｄ１３２７にＭＯＩ１で感染させた。ウイルスＤＮＡは２４時間、４８時間および５日の後感染後に感染細胞から集められた。ウイルスＤＮＡは以下のように分析のために調製された：１．細胞媒体を除去し、そしてＨＢＳＳ緩衝液で１回洗浄する。２．１×トリプシン−ＥＤＴＡで細胞をトリプシン処理する。３．ベックマンＴＪ−６卓上遠心分離機内、速度６で５分間細胞をペレット化する。４．氷冷ＰＢＳで細胞ペレットを２回再懸濁する。５．Ｈｉｒｔ溶菌緩衝液〔１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５），１０ｍＭＥＤＴＡ，０．６％ＳＤＳ〕６５０μｌおよび５ＭＮａＣｌ１６３μｌを各細胞ペレットに対して添加する。−２０℃で１時間保温する。６．微量遠心分離機内で３０分間室温で試料を回転する。上澄みを微量遠心分離管に移す。７．プロテイナーゼＫを２００μｇ／ｍｌまで添加し、そして管を３７℃で１時間保温する。８．ウイルスＤＮＡを等容量のフェノール：クロロホルム／イソアミルアルコール（４９：１）で１回、次に等容量のクロロホルムで１回抽出する。９．ウイルスＤＮＡを２容量の１００％エタノールで沈澱させ、そしてペレットを７０％エタノールで洗浄する。１０．ＴＥ（ｐＨ８．０）２９マイクロリットル中にペレットを再懸濁する。各ウイルスＤＮＡ試料１０マイクロリットルが制限エンドヌクレアーゼXhoIで３７℃にて消化された。消化されたＤＮＡ試料は０．８％アガロースゲル上を２０ｖで一晩走行された。消化されたＤＮＡはゲルからナイロン膜へストラタジーン・ポジブロット・プレッシャー・ブロッターを用いて移された。アデノウイルス複製を検定するために、膜は、Ａｄ２の１７１１−２２６６に相当する配列を含有する３２−Ｐプローブで探針された。ブロットはホスホイメージャースクリーンに１時間暴露され、そしてオートラジオグラフ画像が得られ、そしてモレキュラー・ダイナミクス・ホスホリメジャーを用いて定量された。各細胞株に対する複製データは当該細胞株中の野生型ウイルスｄ１３２７の複製に対して比較された。結果ｒＡｄ／ＡＦＰ−Ｅ１ａ−ＴＫの複製能力を評価するために、ウイルスはＡＦＰプロモーターを利用する（Ｈｅｐ−３Ｂ）か、またはこのプロモーターを利用しない（ＨＬＥ）細胞株に感染させるために使用された。１の感染多重度での初期感染の後、ウイルスＤＮＡは１、２または５日後に集められ、そしてサザンブロット分析により分析され、そしてモレキュラー・ダイナミクス・ホスホリメジャーを用いて定量された。対照および標準として、細胞はまた、複製受容性アデノウイルスｄ１３２７に感染させた。ｄ１３２７はｒＡｄ／ＡＦＰ−Ｅ１ａ−ＴＫにおいて欠失されていたＥ３の同じ非必須断片が欠失されている野生型アデノウイルスであり、そしてそれ故にウイルス複製の適当な対照として作用する。各々２つの細胞株においてｒＡｄ／ＡＦＰ−Ｅ１ａ−ＴＫの複製をｄ１３２７のものと比較することにより、ウイルスＥ１ａプロモーターをＡＦＰプロセーター／エンハンサーで置換することによる効果を評価することが可能である。これらの実験は、この置換が、ＡＦＰ陰性ＨＬＥ細胞株中のｄ１３２７に比べ、ｒＡｄ／ＡＦＰ−Ｅ１ａ−ＴＫを複製不利にすることを示した。一方、ｒＡｄ／ＡＦＰ−Ｅ１ａ−ＴＫはＡＦＰ陽性腫瘍細胞株において、はるかに効率よく複製した。調節は絶対的ではないけれども、ＡＦＰ陽性細胞株において、陰性細胞株におけるより、４ないし５倍複製が有利であった。本発明は開示された態様を参照して記載されてきたが、当業者は述べられた特定の実験が本発明を説明するためのみのものであることを容易に理解する。種々の変形が本発明の精神を逸脱することなしになされ得ることは理解されるべきである。従って、本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定される。

【手続補正書】【提出日】１９９８年１０月２日【補正内容】「請求の範囲１．少なくとも１つのアデノウイルス複製遺伝子に操作可能に連結された疾病特異的遺伝子調節領域を含む複製受容性アデノウイルスベクターを哺乳類の疾病細胞に投与することからなる該細胞中にアデノウイルスベクターを優先的に複製する方法であって、該疾病細胞は疾病特異的遺伝子調節領域を活性化しアデノウイルスベクターの複製を引き起こす、上記方法。２．上記細胞が哺乳類に存在する請求項１記載の方法。３．疾病特異的遺伝子調節領域がアルファ−フェトプロテインプロモーター／エンハンサーである請求項１記載の方法。４．疾病細胞が肝細胞性ガン腫細胞である請求項２記載の方法。５．疾病特異的遺伝子調節領域がガン胚抗原プロモーター／エンハンサーである請求項１記載の方法。６．哺乳類の疾病細胞が乳ガン細胞である請求項５記載の方法。７．哺乳類の疾病細胞が結腸直腸ガン細胞である請求項５記載の方法。８．疾病特異的調節領域が前立腺特異的抗原プロモーター／エンハンサーである請求項１記載の方法。９．哺乳類の疾病細胞が前立腺ガン細胞である請求項８記載の方法。１０．疾病特異的遺伝子調節領域がチロシナーゼプロモーター／エンハンサーである請求項１記載の方法。１１．哺乳類の疾病細胞が黒色腫ガン細胞である請求項１０記載の方法。１２．アデノウイルスベクターが治療遺伝子をさらに含有する請求項１記載の方法。１３．治療遺伝子が致死遺伝子である請求項１２記載の方法。１４．治療遺伝子が腫瘍サプレッサー遺伝子である請求項１２記載の方法。１５．上記腫瘍サプレッサー遺伝子がｐ５３、ｐ２１、ｐ５３突然変異体、ｐ１６およびウイルムス腫瘍ＷＴ１タンパク質からなる群から選択される請求項１４記載の方法。１６．複製遺伝子がアデノウイルスＥ１遺伝子である請求項１記載の方法。１７．複製遺伝子がＥ１ａ遺伝子である請求項１６記載の方法。１８．複製遺伝子がアデノウイルスＥ２遺伝子である請求項１記載の方法。１９．複製遺伝子がアデノウイルスＥ４遺伝子である請求項１記載の方法。２０．少なくとも１つのアデノウイルス複製遺伝子に操作可能に連結された疾病特異的遺伝子調節領域を含む複製受容性アデノウイルスベクターであって、該アデノウイルスベクターは、前記疾病特異的遺伝子調節領域が活性である疾病細胞中に存在する場合に誘導されて複製する上記複製受容性アデノウイルスベクター。２１．疾病特異的遺伝子調節領域がアルファ−フェトプロテインプロモーター／エンハンサーである請求項２０記載の複製受容性アデノウイルスベクター。２２．疾病特異的遺伝子調節領域がガン胚抗原プロモーター／エンハンサーである請求項２０記載の複製受容性アデノウイルスベクター。２３．疾病細胞がガン細胞である請求項２０記載の複製受容性アデノウイルスベクター。２４．ガン細胞が肝細胞性ガン腫細胞、乳ガン細胞、結腸直腸ガン細胞、前立腺ガン細胞および黒色腫ガン細胞からなる群から選択される請求項２３記載の複製受容性アデノウイルスベクター。２５．疾病特異的調節領域が前立腺特異的抗原ブロモーター／エンハンサーである請求項２０記載の複製受容性アデノウイルスベクター。２６．疾病特異的遺伝子調節領域がチロシナーゼプロモーター／エンハンサーである請求項２０記載の複製受容性アデノウイルスベクター。２７．ベクターが治療遺伝子をさらに含有する請求項２０記載の複製受容性アデノウイルスベクター。２８．治療遺伝子が致死遺伝子である請求項２７記載の複製受容性アデノウイルスベクター。２９．致死遺伝子がチミジンキナーゼ遺伝子である請求項２８記載の複製受容性アデノウイルスベクター。３０．治療遺伝子が腫瘍サプレッサー遺伝子である請求項２７記載の複製受容性アデノウイルスベクター。３１．腫瘍サプレッサー遺伝子がｐ５３、ｐ２１、ｐ５３突然変異体、ｐ１６およびウイルムス腫瘍ＷＴ１タンパク質からなる群から選択される請求項３０記載の複製受容性アデノウイルスベクター。３２．複製遺伝子がアデノウイルスＥ１遺伝子である請求項２０記載の複製受容性アデノウイルスベクター。３３．複製遺伝子がＥ１ａ遺伝子である請求項３２記載の複製受容性アデノウイルスベクター。３４．複製遺伝子がアデノウイルスＥ２遺伝子である請求項２０記載の複製受容性アデノウイルスベクター。３５．複製遺伝子がアデノウイルスＥ４遺伝子である請求項２０記載の複製受容性アデノウイルスベクター。３６．治療遺伝子が免疫モジュレーター遺伝子である請求項２７記載の複製受容性アデノウイルスベクター。３７．免疫モジュレーター遺伝子がサイトカインをコードする請求項３６記載の複製受容性アデノウイルスベクター。」

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．治療遺伝子および少なくとも１つの複製遺伝子に操作により連結された疾病特異的遺伝子調節領域を含む複製受容性アデノウイルスベクターを投与することからなる哺乳類のガン細胞を処置する方法であって、該ガン細胞は腫瘍特異的遺伝子調節領域を活性化しアデノウイルスベクターの複製を引き起こす、上記方法。２．疾病特異的遺伝子調節領域がアルファ−フェトプロテインプロモーター／エンハンサーである請求項１記載の方法。３．ガン細胞が肝細胞性ガン腫である請求項２記載の方法。４．疾病特異的遺伝子調節領域がガン胚抗原プロモーター／エンハンサーである請求項１記載の方法。５．哺乳類のガン細胞が乳ガン細胞である請求項４記載の方法。６．哺乳類のガン細胞が結腸直腸ガン細胞である請求項４記載の方法。７．疾病特異的遺伝子調節領域が前立腺特異的抗原プロモーター／エンハンサーである請求項１記載の方法。８．哺乳類のガン細胞が前立腺ガン細胞である請求項７記載の方法。９．疾病特異的遺伝子調節領域がチロシナーゼプロモーター／エンハンサーである請求項１記載の方法。１０．哺乳類のガン細胞が黒色腫ガン細胞である請求項９記載の方法。１１．外来遺伝子が致死遺伝子である請求項１記載の方法。１２．致死遺伝子がヘルペス−シンプレックスチミジンキナーゼ遺伝子である請求項１１記載の方法。１３．治療遺伝子が腫瘍サプレッサー遺伝子である請求項１記載の方法。１４．上記腫瘍サプレッサー遺伝子がｐ５３、ＲＢ、ＲＢ突然変異体、ｐ２１、ｐ５３突然変異体からなる群から選択される請求項１３記載の方法。１５．複製遺伝子がＥ１ａ遺伝子である請求項１記載の方法。１６．複製遺伝子がウイルスＥ１遺伝子の１種である請求項１５記載の方法。１７．複製遺伝子がウイルスＥ２遺伝子である請求項１記載の方法。１８．複製遺伝子がウイルスＥ４遺伝子である請求項１記載の方法。