JPH11502862A

JPH11502862A - 腎機能障害患者における燐酸塩過剰血症予防のための１９−ノル−ビタミンｄ化合物の使用

Info

Publication number: JPH11502862A
Application number: JP9505956A
Authority: JP
Inventors: デルカ，ヘクター・エフ; スラトポルスキー，エドゥアルドー
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1995-07-13
Filing date: 1996-07-09
Publication date: 1999-03-09
Anticipated expiration: 2016-07-09
Also published as: WO1997002826A3; ES2236742T3; JP3255926B2; NZ313816A; DK0837681T3; WO1997002826A2; AU6636496A; EP0837681A2; ATE290868T1; DE69634483D1; CA2224284C; CA2224284A1; PT837681E; EP0837681B1; US5597815A; AU705895B2; MX9800342A; DE69634483T2

Abstract

(57)【要約】 19-nor-ビタミン D同族体、特に１９−ノル−１α,25-ジヒドロキシビタミンD₂はカルシウム血症及び燐酸塩血症誘導には低活性だが、同時に上皮小体ホルモン(PTH )生成を抑える能力がある。これ等 19-nor 同族体が血清カルシウム或いは血清燐を有意に変化させずにPTH分泌を抑制する効果は、これ等を腎機能障害患者における続発性上皮小体亢進症治療の理想的な道具とする。

Description

【発明の詳細な説明】腎機能障害患者における燐酸塩過剰血症予防のための19-ノル-ビタミンＤ化合物の使用発明の背景ビタミン Dは高等動物の生命に必須である。これはカルシウム及び燐の重要な制御物質の 1つであり、骨の適正な発育と維持に必要である。しかし過去10年間に、1,25-(OH)₂D₃により促進される活性のスペクトルはカルシウム恒常性への役割をはるかに越える大きなものである事が明らかになった。腸管、骨、腎臓、及び上皮小体に作用し血清カルシウムを制御する以外に、本ホルモンは細胞分化を促す重要な活性を有する事が分かった。本ホルモンに対する受容体は1,25-(OH )₂D₃に応答し広範な生物学的作用を示す多数の異なった標的細胞に見出された。これ等の新しく発見された活性は、上皮小体機能亢進症、乾癬、癌、免疫制御を含む他の治療への1,25-(OH)₂D₃適用を示唆した。慢性腎不全患者における一般的な合併症である続発性上皮小体機能亢進症。 1,25-(OH)₂D₃は上皮小体ホルモン（PTH）を抑制する働きがあるため、続発性上皮小体機能亢進症治療に効果的に使用されてきた、[Slatopolsky等、“尿毒症患者に対し1,25-ジヒドロキシコレカルシフェロール静注投与する事による続発性上皮小体機能亢進症の顕著な抑制”、J．Clin．Invest.74: 2136-2143，1984.] しかし、腸管吸収及び骨ミネラル移動に対するビタミン Dの強力な作用により惹起されるカルシウム過剰血症の発症のため、その使用はしばしば排除されている。リン酸塩過剰血症は、又、慢性血液透析患者における執拗な問題であり、治療量の1,25-(OH)₂D₃により更に悪化する事がある。[Delmez 等、“燐酸塩過剰血症: 慢性腎臓病患者におけるその成り行きと治療”、Am．J．Kidney Dis．19: 3 03-317，1992; Quarles 等、“ESRDの上皮小体機能亢進症におけるカルシトリオール静注治療と有望な断続的経口投与の比較試み”、Kidney Int．45: 1710-1 721，1994.］更に、炭酸カルシウムの大量投与による燐酸塩吸収の抑制は、[Mey rier等、“血液透析を受けつつある患者の骨の病気に対する炭酸カルシウム高摂取の影響”、Kidney Int．4: 146-153，1973; Moriniere 等、“慢性的に血液透析を受ける患者における水酸化アルミニウムの大量炭酸カルシウム投与への置換: アルミニウム過剰血症の消失と上皮小体機能亢進症の同等な抑制”、Proc． Eur．Dial．Transplant Assoc.19: 784-787，1983; Slatopolsky 等、“透析を受けつつある慢性腎不全患者における燐酸結合体としての炭酸カルシウム”、Ne w Engl．J．Med．315: 157-161，1986]、単に1,25-(OH)₂D₃治療に基づくカルシウム過剰血症の危険性を増すだけである。従って、カルシウム及び燐酸代謝にあまり影響せずに PTHを抑制しうる1,25-(OH)₂D₃の同族体は続発性上皮小体機能亢進症を抑える理想的な道具となろう。発明の概要本発明は、PTHを抑制し腸管燐吸収を最小にするビタミン D化合物を投与することによりなる、腎機能障害を有する患者における燐酸塩過剰血症を予防する方法である。そのようなビタミンＤ化合物は、好ましくは19-nor-ビタミンＤ化合物であり、最も好ましくは19-nor-1α,25-ジヒドロキシビタミンD₂である。図面の簡単な説明図 1はウシ上皮小体細胞初代培養の PTH分泌に対する1,25-(OH)₂D₃及び19-n or-1,25-(OH)₂D₂の影響を示す。図2は尿毒症ラットの血清中カルシウムに対する1,25-(OH)₂D₃及び 19-nor-1 ,25-(OH)₂D₂の影響の比較を示す。図3は尿毒症ラットのイオン化カルシウムに対する1,25-(OH)₂D₃及び 19-nor -1,25-(OH)₂D₂の影響の比較を示す。図 4は血清中の燐に対する 1,25-(OH)₂D₃及び 19-nor-1,25-(OH)₂D₂の影響の比較を示す。図 5は pre-pro PTH mRNA に対する 1,25-(OH)₂D₃の影響を示す。図 6は pre-pro PTH mRNA に対する 19-nor-1,25-(OH)₂D₂の影響を示す。図 7は血清中の PTHに対する 1,25-(OH)₂D₃の影響を示す。図 8は血清中の PTHに対する 19-nor-1,25-(OH)₂D₂の影響を示す。発明の説明本発明に有用な化合物は PTHを抑制し得るが、同時にカルシウム及び燐酸代謝には影響が最小か又は全くないビタミンＤ化合物である。この様な基準を満たすビタミンD 化合物群は 19-nor-同族体、即ち全てのビタミン D系に特異的である A環の環外メチレン基（炭素 19）が除去され、2つの水素原子により置換された化合物である。構造的に新しいこれら同族体は下に示す様な一般式Ｉを特徴とする。（式中、X¹及び X²はそれぞれ独立に水素又は水酸基の保護基を表す。）上に図示した構造式Ｉの側鎖基 Rは現在までに知られているステロイド側鎖タイプのどんなものでもよい。更に特定化すれば、R は1 から 35の炭素原子を含む飽和又は不飽和炭化水素基を表す事ができ、これは直鎖でも分岐でも環状でもよく、又、水酸基、保護された水酸基、フルオロ、カルボニル、エステル、エポキシ、アミノ、又は他のヘテロ原子の様な基を 1またはそれ以上置換として含んでいてもよい。この型の好ましい側鎖は下に示す構造によって表されるが、式中、立体化学中心（ステロイド番号付けにて C-20 に相当）は Rでも S配置でもよく（即ち、炭素 20 に関し自然な配置、或いは 20-epi 配置のどちらでもよく）、Z はY、-OY、-CH₂OY、-C≡CY、或いは -CH＝CHY から選ばれ、二重結合は cis又はtrans幾何配置のどちらでもよく、Y は水素、メチル、-CR⁵O 及び下記構造式の基より選ばれ、 m 及び nは独自に、0 から5 の整数を表し、R¹は水素、水酸基、保護された水酸基、フルオロ、トリフルオロメチル、及び C_1-5-アルキルから選ばれ、該アルキルは直鎖でも分岐でもよく、又、所望により水酸基又は保護された水酸基を置換基として有し、R²、R³及びR⁴の各々は別個に水素、フルオロ、トリフルオロメチル及び、C_1-5-アルキルから選ばれ、該アルキルは直鎖でも分岐でもよく、所望により水酸基又は保護された水酸基を置換基として有し、R¹とR²は一緒になった場合オキソ基、又はアルキリデン基、＝CR²R³、又は -(CH₂)_p- 基（ここで、p は 2から 5の整数である）を表し、R³とR⁴は一緒になった場合オキソ基又は -(C H₂)_q- 基( ここで、q は 2から5 の整数である）を表し、R⁵は水素、水酸基、保護された水酸基、又はC_1-5-アルキルを表し、側鎖の20、22及び23位のどのグループも酸素原子によって代替されてもよい。本明細書および請求の範囲中で使われる、“水酸基の保護基”という用語は次に行う反応の間、水酸基の機能を保護するため一般的に使われるどんな基にも適用され、これは例えばトリメチルシリル、トリエチルシリル、t-ブチルジメチルシリル及び同族性アルキル又はアリールシリル基のようなアシル又はアルキルシリル基であるか、メトキシメチル、エトキシメチル、メトキシエトキシメチル、テトラヒドロフラニル又はテトラヒドロピラニルのようなアルコキシアルキル基を含んでいる。“保護された水酸基”は上記水酸基の保護基の 1つによって水酸基機能が誘導体化されたものである。“アルキル”は全ての異性体を含めて、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル等のような 1から 10 個の炭素原子の直鎖又は分岐炭化水素基を表し、又、“ヒドロキシアルキル”、“フルオロアルキル”及び“デューテロアルキル”という用語は 1個又はそれ以上の水酸基、フルオロ又は重水素基によりそれぞれ置換されたアルキル基を指す。“アシル”基は全ての異性体を含めて 1から 6炭素数のアルカノイル基であるか、ベンゾイルのようなアロイル基、又はハロ-、ニトロ-、アルキル-置換ベンゾイル基、或いはメトキカルボニル、エトキシカルボニル、プロピルオキシカルボニル等のようなアルキル-O-CO-型のアルコキシカルボニル基か、或いはオキサリル、マロニル、サクシノイル、グルタロイル、又はアジオポイルのようなジカルボン酸アシル基である。用語“アリール”はフェニル-、又はアルキル、ニトロ- 又はハロ- 置換フェニル基を意味する。用語アルコキシはアルキル-O- 基を意味する。側鎖の特に重要な例は下に図示する（a）、（b）、（c）、（d）及び（e）の構造を有するもので、それらの側鎖は25-ヒドロキシビタミン D₃（a）；ビタミン D₃（b）； 25-ヒドロキシビタミン D₂（c）；ビタミン D₂（d）； 25-ヒドロキシビタミン D₂のC-24-エピマー（e）、に見られる。更に特定すれば、本発明に使用されるに好ましい化合物は 19-nor-１α,25- ジヒドロキシビタミン D₂であり、即ち、式Ｉ中 X¹とX²は両者とも水素であると共に、上に示した側鎖（c）を有する。 19-nor-ビタミン D化合物の合成法は Perlman等、Tetrahedron Letters 13 ，1823（1990）に報告されている。この方法は存在するビタミン D化合物の C-1 9-メチレン基の除去を含み、米国特許 5,237,110及び 5.246,925にも開示されている。他の方法は 19-nor-ビタミン D化合物の集中包囲的合成(convergent synt hesys)を含み、米国特許 5,281,731に開示されている。更に他の方法は、二環状ケトンとホスフィンオキシド誘導体との縮合反応を含み、米国特許 5,086,191に開示されている。治療目的には、本発明の活性化合物は無害の溶媒に溶液として、或いは適当な無害の溶媒又は担体に乳濁液、縣濁液、分散液として、或いは当業に知られる従来法に従い固形担体に丸薬、錠剤、カプセルとして含有させて、処方できる。局所投与には、クリーム又は軟膏又は局所投与に適した同様な担体中に都合よく処方される。このような処方はどれでも、安定剤、抗酸化剤、結合剤、賦色剤、又は乳化剤、又は味覚調整剤等、他の製薬学的に受容しうる無毒の賦形剤を含んでもよい。化合物は注射、或いは適当な無菌溶液として静脈注入、或いは消化管経由の経口薬の形で、局所的には軟膏とか外用水薬の形で、或いは適当な経皮貼付剤として都合よく投与される。上皮小体亢進症の治療には、上皮小体ホルモン濃度が正常範囲になるよう、化合物が上皮小体活性を抑えるに充分な量を投与する。適した投与量は 1日あたり化合物 1から 500μg であり、当業でよく理解されているように治療される病気、その重軽度、投与患者の反応又は状態により調整する。本発明を次の例示により、更に具体的に記載する。材料と方法培養又はウシ上皮小体細胞における PTH分泌ウシの上皮小体の初代単層培養細胞は MacGregor等の方法を少し改変して調製した。[MacGregor等、“ウシ上皮小体の初代単層細胞培養：カルシウム・イソプロテレノール及び成長因子の影響”、Endocrinology 30:313-328，1983] 簡単に述べると、ウシ上皮小体から付着した他組織を取り除き、Stadie-Riggs組織切片器（Thomas Scientific，Swedesboro，NJ）で約0.5 mm厚さの切片とし、2.5 mg/ml のコラゲナーゼ（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）と 0.5 mM の総カルシウムを含む DEM（HG）Ham's F-12培養液（50/50）に入れた。縣濁液（1 g 組織/10 ml培地）は37℃の振盪水槽で 90 分間、撹拌し、60 ml 注射筒に取り付けたエッペンドルフ・ピペットチップの大口径切り口を用い定期的に吸引した。消化された組織をガーゼで濾過後、再縣濁し、DME(HG)/Ham's F12培地（5 0/50）、1 mM総カルシウム、4 % ウシ新生児血清、15 mM Hepes、100 IU/ml ペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシン、5 μg/mlインシュリン、2 mMグルタミン、1 % 非必須アミノ酸を含む培養液で 3回洗った。細胞は 80,000 細胞/cm² に撒いた。24時間後、血清を 1 mg/mlウシ血清アルブミンと 5μg/mlのホロトランスフェリンに置換した以外は上記と同じ組成の培養液と交換した。この培養液は 24 から 48 時間毎に新鮮なものに交換した。PTH 分泌実験種々な濃度の1,25-(OH)₂D₃又は19-nor-1,25-(OH)₂D₂を含む試験用培養液は培養液にこれ等の化合物のエタノール溶液を加える事により調製した。最終エタノール濃度 0.1 %。培養後、培養液を集め遠心分離し、PTH を分析する時まで - 20℃に保管した。PTH の分析には、完全なPTH、PTH中間領域、及びPTHカルボキシ末端フラグメントを認識する抗体 CH9を用いた。抗血清による認識の性質及びラジオ・イムノアッセイ（RIA）の方法は先に Hruska 等により記載されている、［“犬における免疫反応性の上皮小体ホルモンの代謝．腎臓の役割と慢性腎疾患の影響”、J．Clin．Invest.56: 39-48，1975。］各試料の細胞内蛋白は、1 m M NaOH 中に細胞を入れて超音波をかけ、その一部について蛋白定量キット（Bio -Rad Laboratories，Richmond，CA）を用い定量した。全ての PTH値は細胞蛋白あたりに換算した。逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR) 1 匹の動物から得た 1対の上皮小体を 250μl の RNAzol（Cinna Biotech, Houston，TX）中にてホモゲナイズし、25μl のクロロホルムと混ぜ、かき回した後、微量遠心分離にかけ層を分けた。上の水層（125μl ）を20 μl の１ mg/ mlグリコーゲン、145 μl の 2-プロパノールと混ぜ、-20℃に 1晩置いた。共沈した全 RNAとグリコーゲンを遠心分離（微量遠心）にて集め、70 %のエタノールにて 2回洗った。オリゴ dT により先導した cDNA は全 RNAの 40 % を用い、Pr omega（Madison．WI）より得たキットの介助により調製した。各 cDNA 調製物の 6分の 1について、ラット pre-pro PTH mRNA の -30から -23のアミノ酸を表すオリゴヌクレオチド・プライマー・センス 5'(ATG TCT GCA AGC ACC ATG GCT AA G)3'、及び 77 から 84 のアミノ酸を表すアンチセンス 5'(CTG AGA TTT AGC CT T AAC TAA TAC)3'を用い PCRにより増幅した。PCR の条件は変性 94 ℃× 1分間、アニーリング 60℃× 1分間、伸長 72℃× 2分間で、18サイクル行なった。該 cDNA からのβ-アクチン mRNA の増幅は同じ条件下、プライマー・センス5'(GA T GAT ATC GCC GCG CTC GTC GTC GAC)3'、及びアンチセンス5'(AGC CAG GTC CAG ACG CAG GAT GGC ATG)3’を用い、計 26 サイクルにて達成した。PCR 産物は臭化エチジウムを含む TAE緩衝液中、1.2 % アガロース・ゲルを媒体として分離した。ゲルは紫外光線箱にて、Polaroid 665型フイルムを用い陰画として撮影した。各ゲルの Polaroid 陰画は走査し（Omni Media 6cx/csx，X-ray Scanner 社， Torrance,CA）、Sepra Scan 2001 ソフトウエア（Integrated Separation System s，Natwick，MA）を使い解析した。32匹に上る異なった動物からのpre-pro PTH 及びβ-アクチン mRNA が同時に処理でき、その総量は潜在的な解析間偏差を除外できる。PCR 産物を含むプラスミド（pCRII、Invitrogen）の配列分析から、これ等がラットpre-pro PTH 及びラットβ-アクチンとして確定することができた。1,25-(OH)₂D₃ 及び19-nor-1,25-(OH)₂D₂に対するカルシウム血症反応 150 匹の Sprague-Dawley 雌ラット群に 5/6腎切除をほどこし、腎不全を惹起した。操作は左腎動脈の殆どの支脈を結紮し、右腎を切除した。ラットには0. 6%カルシウム及び 0.7 %燐を含む飼料を 8週間与えた。この期間の終わりには、全てのラットは殆ど同じ体重になった（260 から 280 gの範囲）。 1,25-(OH)₂D₃又は19-nor-1,25-(OH)₂D₂に対する血清カルシウムの反応を調べるため、尿毒症ラットに 10 日間毎日、担体（プロピレングリコール 100μl ）、1,25-(OH)₂D₃ 10 ng/ラット、或いは19-nor-1,25-(OH)₂D₂（10、100、又は 1.000 ng/ラット）を腹腔内(IP)注射した。 1,25-(OH)₂D₃又は19-nor-1,25-(OH)₂D₂に対する上皮小体の反応を調べるため、慢性腎不全ラットを 3つの主グループに分け: 1）担体、2）1,25-(OH)₂D₃ （2.0、4.0、又は8.0 ng/ラット）、及び 3）19-nor-1,25-(OH)₂D₂（8.0、25、又は75 ng/ラット）を 1日置きに 8日間IP投与した。更に、正常動物でも実験を行なった。定量分析総カルシウムは原子吸光分析（Perkin Elmer、1100B 型、Norwalk、CT）にて、ICa はイオン化カルシウム-特異電極（ICA-1 型、Radiometer、Copenhagen ）にて定量した。血漿内燐及びクレアチニンは自動分析器（COBAS MIRA Plus、B ranchburg、NJ）により定量した。正常 PTHはNichols研究所（San Capistrano、 CA）から得た正常ラット PTHに特異的な IRMAにより測定した。飼料は DYETS社（Bethlehem、PA）より購入した。1,25-(OH)₂D₃は Milan Uskokovic博士（Hoffm an La Roche研究所、Nutley、New Jersey、USA）から、19-nor-1,25-(OH)₂D₂は Abbott研究所、Abbott Park Illinois、USA から供与された。統計解析全てのデータは平均値± SEMにて表す。群間の比較には一方向分散分析（AN OVA）を用いた。結果 X¹及び X²が共に水素であり、R が側鎖（c）である化学式Ｉは 19-nor-1,25 -(OH)₂D₂の化学構造を示す。この同族体はビタミンD₂化合物の特徴である炭素数 28を有し、炭素原子 22 のところに二重結合があるが、全ての天然ビタミン D代謝物に見出される炭素原子 19 と環外二重結合を欠いている。ウシ上皮小体の初代培養細胞のPTH分泌に対する1,25-(OH)₂D₃と19-nor-1,25 -(OH)₂D₂の効果を図 1に記載した。全ての群共、培養の最終日（72時間）の同じ時間に測定したところ PTHを分泌していた。両化合物共、PTH 分泌に濃度依存性の有意な抑制効果を有する（p<0.001）。最大抑制効果は両化合物共 10^-7M濃度にて得られた。In vitroにおける PTH分泌に対する抑制効果は2 つの化合物間で有意な差異は無かった。総血清カルシウムに対する1,25-(OH)₂D₃と19-nor-1,25-(OH)₂D₂の比較効果を図 2に示した。ラットに 10 日間、毎日、担体（プロピレングリコール100μl ）、1,25-(OH)₂D₃（10 ng/ラット）、又は19-nor-1,25-(OH)₂D₂（10、100、又は 1,000 ng/ラット）を腹腔内に注射した。毎日の注射（腹腔）又は19-nor-1,25-( OH)₂D₂（10 ng/ラット）は有意には血清カルシウムを増加させなかった。19-nor -1,25-(OH)₂D₂投与量を 100 ng/ラットに増加させた場合、血清カルシウムの増加は10 ng/ラットの1,25-(OH)₂D₃により誘導されるのと同じであった。屠殺時（腎不全から2ケ月）に測定した全ての生化学的パラメータを表 1、図 3、4 に示した。血清クレアチニンは正常ラットでは 0.64 ± 0.02 だが、尿毒症ラットは 1 .15 ± 0.05 mg/dl に増加していた（p<0.001）。1,25-(OH)₂D₃及び19-nor-1,25 -(OH)₂D₂のどちらも尿毒症ラットの血清クレアチニンを変化させなかった。図 3に示したように 1日置きに8 ngの1,25-(OH)₂D₃を 8日間投与された尿毒症ラットではイオン化した血清カルシウムが増加した（5.08± 0.06 vs対照尿毒症ラット 4.81 ± 0.8 mg/dl、p<0.02）。19-nor-1,25-(OH)₂D₂はもっと多い投与量でも（75 ng/ラット× 4回）、血清のイオン化カルシウムを増加させなかった。図 4に示したように、1,25-(OH)₂D₃（8 ng投与量）は血清燐を 5.57 ± 0.5 （対照尿毒症）から 8.64 ± 1.15 mg/dl（p<0.01）に増加させた。19-nor-1,25 -(OH)₂D₂は如何なる投与量でも血清燐を増加させなかった（表 1、図 4）。上皮小体ホルモンは正常ラットでは 40± 8.6 pg/mlであり、尿毒症ラットでは243± 83 pg/ml に増加した。PTH 濃度を統計的に有意（p<0.01）まで減少させた1,25 -(OH)₂D₃投与量は 8 ng 投与量だけであった。PTH は 202± 31から 90 ± 20 p g/ml に減少した。（しかし、ICa は 4.81 ± 0.08 から 5.08± 0.06 mg/dl に増加した（p<0.02）（図５）。）19-nor-1,25-(OH)₂D₂はどの投与量（8、25、75）でも循環PTH の濃度を有意に減少させた。より大きな効果は 75 n g投与量で観察された。PTH は 225± 60 から 53 ± 16 pg/ml に減少した（図 6）（7.5 % 減少）が、19-nor-1,25-(OH)₂D₂は如何なる投与量でもイオン化したカルシウムを増加させなかった。 pre-pro PTH mRNAに対する逆転写酵素PCR の結果は図 7と 8に示したように、1,25-(OH)₂D₃は投与量依存的に pre-pro PTH mRNA を抑制した（図 7）。同様な結果は19-nor-1,25-(OH)₂D₂でも得られた（図 8）。考察慢性腎不全はミネラル恒常性（ホメオスタシス）の変化を特徴とし、腎不全初期段階においてさえ続発性上皮小体亢進症が現れ、腎性骨異栄養症の発症に導く。1,25-(OH)₂D₃及び燐酸塩保持の両方が低いレベルにある事が続発性上皮小体亢進症発症の原因である。初期腎不全患者では血清燐は普通正常であるが、燐酸塩制限により続発性上皮小体亢進症を低減できる。飲食物からの燐酸塩制限により1,25-(OH)₂D₃レベルを上げ、[Portale等、“中程度腎不全の小児における 1.2 5-ジヒドロキビタミン D及び免疫反応性の上皮小体ホルモンの血液循環濃度に対する食事由来燐酸塩の効果”、J．Clin．Invest.73: 1580-1589，1984]、それが次に PTH遺伝子転写を直接抑制し、そして腸管カルシウム吸収を上げる事により、PTHを少なくする。腎不全の後期には、上皮小体亢進症の程度及び1,25-(OH)₂D₃ 欠乏が増し、燐酸塩制限は1,25-(OH)₂D₃レベルには殆ど効果が無く、[Lopez-Hi lker等、“カルシウム及びカルシトリオールの変化に無関係の尿毒症における燐制限は上皮小体亢進症を逆転する”、Am．J．Physiol．259: F432-F437，1990] 、多分、1,25-(OH)₂D₃合成に使われる腎臓量の減少によるものであろう。ウシ上皮小体培養細胞によるPTH分泌を抑えるのに、1,25-(OH)₂D₃と殆ど同じ位効果がある、カルシウム血症活性の低い幾つかのビタミン D同族体が見出された。これは 22-オキサカルシトリオール（OCT）[Brown等、“非カルシウム血症性ビタミン Dの同族体、22-オキサカルシトリオール（OCT）は上皮小体ホルモンの合成と分泌を抑制する”、J．Clin．Invest.84: 728-732，1989]とともに、 1,25-(OH)₂-16-エン-23-イン-D₃、1,25-(OH)₂-24-ジホモ-D₃、及び1,25-(OH)₂-2 4-トリホモ-22-エン-D₃も含む（未発表データ）。今日まで、22-オキサカルシトリオールだけが in vivoでの本作用について詳細に調べられている。Brown と共同研究者は[Brown等、“選択的ビタミン D同族体とそれ等の治療へ適用”、Sem. Nephrol．14: 156-174，1994]、22-オキサカルシトリオールは in vivoで速やかに排出されるにも拘わらず、PTH mRNAを抑制し得ることを報告した。最高に達しない低い投与量のカルシトリオール及びOCTは、比肩しうる阻害を示した。OCT は又、尿毒症ラットと犬で血清 PTHを抑制する事も示された。最近の研究で、我々は1,25-(OH)₂D₃の同族体で低カルシウム血症及び低燐酸塩血症作用を有する19 -nor-(OH)₂D₂を使用した。このカルシトリオールの同族体はビタミンD₂化合物に特徴的な炭素数 28 と、炭素 22 における二重結合を有するが、全ての自然ビタミン D化合物に見られる炭素 19と環外二重結合を欠失している。我々は最初にウシ上皮小体の初代培養細胞を使い、in vitro実験を行なった。19-nor-1,25-(O H)₂D₂はPTHに対し、1,25-(OH)₂D₃と同様の抑制効果を有した。PTH 遊離の 52 % の抑制が10^-7Mの19-nor-1,25-(OH)₂D₂で得られた。2つの化合物間に、PTH分泌の抑制効果の顕著な差異は無かった。それ以後、19-nor-1,25-(OH)₂D₂の低カルシウム血症活性を調べるため、in vivo 予備実験を行なった。1,25-(OH)₂D₃（10 n g/ラット/10 日間）は19-nor-1,25-(OH)₂D₂（100 ng/ラット/10 日間）と同程度に血清カルシウムを増加させた。この理由により、慢性病実験には 3通りの異なった投与量の1,25-(OH)₂D₃（2、4、及び 8 ng）と19-nor-1,25-(OH)₂D₂（8、25 、及び75 ng）を選んだ。腎不全 2ケ月後のラットに、上記 3通りの量で2 化合物を 8日間 4回投与した。予期した通り、1,25-(OH)₂D₃は pre-pro PTH mRNA 及び PTH分泌を抑えた。しかし、この減少は 8 ng 投与でのみ統計的に有意であった。この投与量はカルシウム過剰血症と燐酸過剰血症を招いた。一方、19-nor-1,2 5-(OH)₂D₂は如何なる投与量でも、血清中のイオン化カルシウム或いは血清燐に統計的に有意な変化をもたらさなかった。しかしながら、19-nor-1,25-(OH)₂D₂ はすべての投与量において pre-pro PTH mRNA 及び PTH分泌の両方を抑制する効果があった。これらの研究の間に放射性19-nor-1,25-(OH)₂D₂が入手できなかったゆえ、我々は本同族体の蛋白への結合及び半減期を測定できなかった。しかし DeLucaによる先の研究から、1,25-(OH)₂D₃と比較すると、19-nor-1,25 -(OH)₂D₂は1,25-(OH)₂D₃の約 1/3、ブタ腸ビタミン D受容体に結合する事を示した（未発表結果）。臨床的な観点から見ると、血液透析患者で最も正し難い生化学的変調の 1つは燐酸塩過剰血症である。透析をする患者は通常 1日あたり約 1.0から 1.4 gの燐を摂取する。1 回の透析で除去される燐の最大量は約 800から 1,000 mg ゆえ [Hou等、“低カルシウム透析液を用いる血液透析中のカルシウム及び燐流出”、 Am．J．Kidney Dis．18: 217-224，1991]、１週間あたり摂取される燐の残り 2. 5から 3.5グラムは他の方法で除去されねばならない。このため、炭酸カルシウムや酢酸カルシウムのような燐酸結合物質が、燐酸塩過剰血症を正すため通常使用されている[Emmett 等、“血液透析患者における血清燐の酢酸カルシウムによる制御”、Am．J．Kidney Dis.27: 544-550，1991; Schaefer等、“酢酸カルシウム及び炭酸カルシウムを用いる尿毒症における燐酸塩過剰血症の治療: 比較研究”、Nephrol．Dial．Transplant 6: 170-175，1991; Delmez等、“血液透析患者における燐結合物としての酢酸カルシウム”、J．Am．Soc．Nephrol.3: 96- 102．1992]。残念な事に1,25-(OH)₂D₃はカルシウム吸収のみでなく燐の吸収も増し、燐酸塩過剰血症の治療をもっと難しくしている。このように一部 1,25-(OH)₂ D₃の作用により誘導された燐酸塩過剰血症は炭酸カルシウムもしくは酢酸カルシウムの更なる増量を要し、これが血清中イオン化カルシウムの濃度を大きく上げるようになる。患者が生成しうる多量のカルシウム-燐酸化合物により、転移性石灰化を発症する恐ろしい危険性を生じる。[Arora等、“進行した腎不全における石灰性心筋病”、Arch．Intern．Med.1335: 603-605，1975; Rostand 等、 “慢性腎不全における心筋石灰化と心臓機能障害”、Am．J．Med.85: 651-657， 1988; Gipstein等、“ヒトにおけるカルシフィラキシス．慢性腎不全11患者における組織壊死と血管石灰化症候”、136: 1273-1280，176; Milliner 等、“ 腎臓病終期の小児患者における軟組織の石灰化”、Kidney Int．38: 931-936，1 990]。そのため、治療では患者に投与する 1,25-(OH)₂D₃量を減らす事が要求され、よって、PTH 分泌を制御する 1,25-(OH)₂D₃の効果が減少する。カルシウムや燐に対して最小の効果しか無い19-nor-1,25-(OH)₂D₂のような1 ,25-(OH)₂D₃同族体の開発は続発性上皮小体亢進症や腎性骨異栄養症の治療に理想的な道具である。この同族体（19-nor-1,25-(OH)₂D₂）は in vitro 及び慢性腎不全のラットにおいて 1,25-(OH)₂D₃と同じように効果的に PTHを抑制する事が示された。加うるに、カルシウム及び燐に対する影響は最小なので、続発性上皮小体亢進症を抑制するよう多量の本化合物投与が可能である。現時点まで、ヒトに対する研究はなされてないが、19-nor-1,25-(OH)₂D₂が 3投与量全てで PTH 分泌抑制に有効であったという事実は本化合物の治療への望みが大きい事を示す。要約すると、我々はカルシウム血症及び燐酸塩血症効果の低いカルシトリオールの新規同族体19-nor-1,25-(OH)₂D₂が、続発性上皮小体亢進症を有する尿毒症ラットの上皮小体ホルモンを抑制するに効果的である事を示した。

【手続補正書】【提出日】１９９８年４月８日【補正内容】 (1)請求の範囲を次のとおり補正する。『１．下記構造式を有する19-nor-ビタミンＤ化合物から選択される、血清中のリンに対して最低限の影響しか及ぼさないビタミンＤ化合物を含有してなる、燐酸塩過剰血症をひきおこすことなく腎性骨異栄養症患者を治療するための医薬組成物：式中 X¹及びX²はそれぞれ別個に水素又は水酸基保護基を表し、且つR は下記構造式で表される：式中の立体化学中心は R又は S配置のどちらでもよく、Z はY、-OY、-CH₂OY、-C ≡CY、或いは -CH＝CHY から選ばれ、二重結合はcis又はtrans 幾何配置のどちらでもよく、Y は水素、メチル、-CR⁵O 及び下記構造式の基より選ばれ、 m 及び nは独自に、0 から5 の整数を表し、R¹は水素、水酸基、保護された水酸基、フルオロ、トリフルオロメチル、及び C_1-5-アルキル（直鎖でも分岐でもよく、所望により水酸基又は保護された水酸基を置換基として有してよい）から選ばれ、R²、R³及びR⁴の各々は別個に水素、フルオロ、トリフルオロメチル及び、 C_1-5-アルキル（直鎖でも分岐でもよく、所望により水酸基又は保護された水酸基を置換基として有してよい）から選ばれ、及びR¹とR²は一緒になった場合、オキソ基、又はアルキリデン基、＝CR²R³、又は -(CH₂)_p- 基を表し、p は2から 5 の整数であり、及びR³とR⁴は一緒になった場合、オキソ基又は -(CH₂)_q- 基を表し、q は 2から5 の整数であり、R⁵は水素、水酸基、保護された水酸基、又は C_1-5 -アルキルを表し、そして側鎖の20、22及び23位のいずれの基もそれぞれ酸素原子によって置換されてもよい。２．薬学的に許容される助剤も含有する、請求項１の組成物。３．患者が摂取可能で、且つ患者に対して非毒性の固体または液体担体中に前記ビタミンＤ化合物を含有してなる、請求項１または２の組成物。４．前記ビタミンＤ化合物が１α,25-ジヒドロキシ-19-nor-ビタミンＤ₃である請求項１ないし３のいずれか１項の組成物。５．前記ビタミンＤ化合物が１α-ヒドロキシ-19-nor-ビタミンＤ₃である請求項１ないし３のいずれか１項の組成物。６．前記ビタミンＤ化合物が１α,25-ジヒドロキシ-19-nor-ビタミンＤ₂である請求項１ないし３のいずれか１項の組成物。７．前記ビタミンＤ化合物が１α-ヒドロキシ-19-nor-ビタミンＤ₂である請求項１ないし３のいずれか１項の組成物。８．前記ビタミンＤ化合物が１α-ヒドロキシ-19-nor-24-epi-ビタミンＤ₂ である請求項１ないし３のいずれか１項の組成物。９．前記ビタミンＤ化合物が１α,25-ジヒドロキシ-19-nor-24-epi-ビタミンＤ₂である請求項１ないし３のいずれか１項の組成物。１０．経口投与剤である請求項１ないし９のいずれか１項の組成物。１１．非経口投与剤である請求項１ないし９のいずれか１項の組成物。１２．局所投与剤である請求項１ないし９のいずれか１項の組成物。１３．前記ビタミンＤ化合物を患者に１日当たり１μg から約５００μg 投与する量で含む、請求項１ないし１２のいずれか１項の組成物。１４．燐酸塩過剰血症をひきおこすことなく腎性骨異栄養症患者を治療するための、請求項１において定義された構造式を有する19-nor-ビタミンＤ化合物の使用。』 (2)明細書第１３頁末行の「腎性骨異栄養症」を『腎性骨異栄養症（renal osteodystrophy）』と補正する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者スラトポルスキー，エドゥアルドーアメリカ合衆国ミズーリ州63131，セント・ルイス，フォンテナック・ウッズ 1670

Claims

【特許請求の範囲】 1. 腎機能障害を有する患者に、該患者の血清燐に最小の効果を持つビタミン D化合物を投与し治療する一方で、燐酸塩過剰血症は避け得る方法。 2. 腎機能障害が尿毒症である請求項１の方法。 3. 腎機能障害が腎不全である請求項１の方法。 4. 前記ビタミン D化合物が薬学的に受け入れられる担体と共に投与される請求項１の方法。 5. 前記ビタミン D化合物は、患者に摂取可能であり且つ無毒である固体或いは液体の担体中にある請求項１の方法。 6. 前記ビタミン D化合物は 19-nor-ビタミン D化合物である請求項１の方法。 7. 前記19-nor-ビタミン D化合物が下記構造式を有する請求項６の方法：式中 X¹及びX²はそれぞれ別個に水素又は水酸基保護基を表し、且つR は下記構造式で表される：式中の立体化学中心は R又は S配置のどちらでもよく、Z はY、-OY、-CH₂OY、-C ≡CY、或いは -CH＝CHY から選ばれ、二重結合はcis又はtrans 幾何配置のどちらでもよく、Y は水素、メチル、-CR⁵O 及び下記構造式の基より選ばれ、 m 及び nは独自に、0 から5 の整数を表し、R¹は水素、水酸基、保護された水酸基、フルオロ、トリフルオロメチル、及びC_1-5-アルキルから選ばれ、直鎖でも分岐でもよく、又、所望により水酸基又は保護された水酸基を置換基として有し、R²、R³及びR⁴の各々は別個に水素、フルオロ、トリフルオロメチル及び、C_1-5 -アルキルから選ばれ、それらは直鎖でも分岐でもよく、所望により水酸基又は保護された水酸基を置換基として有し、及びR¹とR²は一緒になった場合、オキソ基、又はアルキリデン基、＝CR²R³、又は-(CH₂)_p- 基を表し、p は 2から5の整数であり、及びR³とR⁴は一緒になった場合、オキソ基又は -(CH₂)_q- 基を表し、 q は 2から5 の整数であり、R⁵は水素、水酸基、保護された水酸基、又は C_1-5- アルキルを表し、そして側鎖の20、22及び23位の基はそれぞれ酸素原子によって置換されてもよい。 8. 前記ビタミン D化合物が１α,25-ジヒドロキシ-19-nor-ビタミンD₃である請求項１の方法。 9. 前記ビタミン D化合物が１α-ヒドロキシ-19-nor-ビタミンD₃である請求項１の方法。 10. 前記ビタミン D化合物が１α,25-ジヒドロキシ-19-nor-ビタミンD₂である請求項１の方法。 11. 前記ビタミン D化合物が１α-ヒドロキシ-19-nor-ビタミンD₂である請求項１の方法。 12. 前記ビタミン D化合物が１α-ヒドロキシ-19-nor-24-epi-ビタミンD₂である請求項１の方法。 13. 前記ビタミン D化合物が１α,25-ジヒドロキシ-19-nor-24-epi-ビタミンD₂である請求項１の方法。 14. 前記ビタミン D化合物が経口投与される請求項１の方法。 15. 前記ビタミン D化合物が非経口投与される請求項１の方法。 16. 前記ビタミン D化合物が局所投与される請求項１の方法。 17. 前記ビタミン D化合物が 1日あたり 1μg から約 500μg患者に投与される請求項１の方法。