JPH11276181A - フェニルプロパノイド生合成経路を制御する転写因子 - Google Patents
フェニルプロパノイド生合成経路を制御する転写因子Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 植物のフェニルプロパノイド生合成経路に関
与する特定の遺伝子の発現を、的確に促進・抑制する。 【解決手段】 シナミルアルコールデヒドロゲナーゼ遺
伝子、カルコン酸シンセターゼ遺伝子、４−クマル酸Ｃ
ｏＡリガーゼ遺伝子、フェニルアラニンアンモニアリア
ーゼ遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子等が有する５′上
流非翻訳領域の共通配列に結合し、その発現を促進する
転写因子をコードするＤＮＡを、センス又はアンチセン
ス方向に植物細胞に導入する。
与する特定の遺伝子の発現を、的確に促進・抑制する。 【解決手段】 シナミルアルコールデヒドロゲナーゼ遺
伝子、カルコン酸シンセターゼ遺伝子、４−クマル酸Ｃ
ｏＡリガーゼ遺伝子、フェニルアラニンアンモニアリア
ーゼ遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子等が有する５′上
流非翻訳領域の共通配列に結合し、その発現を促進する
転写因子をコードするＤＮＡを、センス又はアンチセン
ス方向に植物細胞に導入する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、フェニルプロパノ
イド生合成に関与する遺伝子群の発現を制御する技術に
関する。
イド生合成に関与する遺伝子群の発現を制御する技術に
関する。
【０００２】
【従来の技術】近年の植物分子生物学の発展に伴い、セ
ンス遺伝子やアンチセンス遺伝子を利用し、病虫害抵抗
性や除草剤耐性などの有用形質を備えた植物品種等を育
種することが可能となってきた。即ち、目的の形質の発
現に関与する遺伝子を、植物で発現可能なプロモーター
にセンス方向又はアンチセンス方向に連結してキメラ遺
伝子を作成し、これをベクターとして植物に導入するこ
とにより、その目的形質の発現を促進、抑制するのであ
る。現在既に、かかる手法を応用して、例えば、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ由来の殺虫性Ｂ
Ｔ毒素遺伝子をセンス方向に導入した病虫害抵抗性植物
（Ｄ．Ａ．Ｆｉｓｃｈｈｏｆｆ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．２３２、ｐ．７３８−７４３、１
９８７）や、トマト果実の過熟に関するポリガラクツロ
ナーゼ遺伝子をアンチセンス方向に導入した日持ち良好
なトマト（Ｃ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ等、Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏ
ｌ．３３４、ｐ．７２４−７２７、９８８）等が作出さ
れている。
ンス遺伝子やアンチセンス遺伝子を利用し、病虫害抵抗
性や除草剤耐性などの有用形質を備えた植物品種等を育
種することが可能となってきた。即ち、目的の形質の発
現に関与する遺伝子を、植物で発現可能なプロモーター
にセンス方向又はアンチセンス方向に連結してキメラ遺
伝子を作成し、これをベクターとして植物に導入するこ
とにより、その目的形質の発現を促進、抑制するのであ
る。現在既に、かかる手法を応用して、例えば、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ由来の殺虫性Ｂ
Ｔ毒素遺伝子をセンス方向に導入した病虫害抵抗性植物
（Ｄ．Ａ．Ｆｉｓｃｈｈｏｆｆ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．２３２、ｐ．７３８−７４３、１
９８７）や、トマト果実の過熟に関するポリガラクツロ
ナーゼ遺伝子をアンチセンス方向に導入した日持ち良好
なトマト（Ｃ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ等、Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏ
ｌ．３３４、ｐ．７２４−７２７、９８８）等が作出さ
れている。
【０００３】こうした手法を用いた場合、通常、センス
遺伝子（目的形質を発現する遺伝子であって、プロモー
ターにセンス方向に連結された遺伝子）が導入された植
物体では、その目的とする形質の発現が促進され、アン
チセンス遺伝子（センス遺伝子と同じ遺伝子であるが、
これがプロモーターにアンチセンス方向に連結された遺
伝子）が導入された植物体では目的形質の発現の抑制が
起こる。アンチセンス遺伝子の導入により目的形質の発
現が抑制されるのは、植物細胞において、この遺伝子を
鋳型として作られるＲＮＡが、目的形質の発現に関与す
るその植物本来の遺伝子に由来するｍＲＮＡと相補的に
結合し、以後のタンパク質合成を阻害するためである。
遺伝子（目的形質を発現する遺伝子であって、プロモー
ターにセンス方向に連結された遺伝子）が導入された植
物体では、その目的とする形質の発現が促進され、アン
チセンス遺伝子（センス遺伝子と同じ遺伝子であるが、
これがプロモーターにアンチセンス方向に連結された遺
伝子）が導入された植物体では目的形質の発現の抑制が
起こる。アンチセンス遺伝子の導入により目的形質の発
現が抑制されるのは、植物細胞において、この遺伝子を
鋳型として作られるＲＮＡが、目的形質の発現に関与す
るその植物本来の遺伝子に由来するｍＲＮＡと相補的に
結合し、以後のタンパク質合成を阻害するためである。
【０００４】しかし、植物の多くの遺伝子は小多重遺伝
子族（ｍｕｌｔｉ−ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ）を形成し
ており、こうした族を形成する遺伝子は、それぞれ互い
に、非常に高いヌクレオチド配列の相同性を示す。従っ
て、かかる遺伝子の発現をアンチセンス法を用いて抑制
しようとしても、アンチセンス遺伝子のＲＮＡは、この
小多重遺伝子族を形成する他の多くの遺伝子のｍＲＮＡ
ともランダムに結合してしまってその発現を抑制するた
め、目的とする遺伝子の発現のみを抑制することができ
ずに様々なパターンの形質発現抑制が引起こされ、期待
したものとは全く異なる結果を生ずることがあった。
子族（ｍｕｌｔｉ−ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ）を形成し
ており、こうした族を形成する遺伝子は、それぞれ互い
に、非常に高いヌクレオチド配列の相同性を示す。従っ
て、かかる遺伝子の発現をアンチセンス法を用いて抑制
しようとしても、アンチセンス遺伝子のＲＮＡは、この
小多重遺伝子族を形成する他の多くの遺伝子のｍＲＮＡ
ともランダムに結合してしまってその発現を抑制するた
め、目的とする遺伝子の発現のみを抑制することができ
ずに様々なパターンの形質発現抑制が引起こされ、期待
したものとは全く異なる結果を生ずることがあった。
【０００５】一方、フェニルプロパノイド生合成経路
は、植物に特異的に存在する複雑に枝分かれした反応系
であり、リグニンやスベリンなどの細胞壁の構成成分、
花の色素、抗菌活性物質の生合成等に関わっている。ま
た、かかる生合成経路を経て得られるフェニルプロパノ
イドの誘導体は、ＵＶ保護剤、防虫剤等にも利用し得
る。従って、このフェニルプロパノイド生合成経路に関
与する遺伝子の発現を的確に促進・抑制できれば、この
生合成経路をコントロールし、リグニン低含量樹木の作
出や有用物質の大量生産等も可能となるが、この場合も
また、上記した遺伝子間の相同性の問題から、アンチセ
ンス法によるそのコントロールは困難であった。例え
ば、フェニルプロパノイド生合成経路にて働く酵素であ
る、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）や
ペルオキシダーゼ（ＰＲＸ）の遺伝子をアンチセンス方
向に導入した形質転換植物は、生長阻害などの多面的な
抑制効果を示し（Ｍ．Ｍ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ ａｎｄ
Ｒ．Ｒ．Ｓｅｄｅｒｏｆｆ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．、ｖｏｌ．１１０，．ｐ．３−１３、１９９６）、
また、カフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子
をアンチセンス方向に導入したタバコにおいては、期待
したリグニン含量の変化が検出されなかったことが報告
されている（Ｗ．Ｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒａｎｓｇｅ
ｎ．Ｒｅｓ．、ｖｏｌ．３、ｐ．１２０−１２６、１９
９４）。
は、植物に特異的に存在する複雑に枝分かれした反応系
であり、リグニンやスベリンなどの細胞壁の構成成分、
花の色素、抗菌活性物質の生合成等に関わっている。ま
た、かかる生合成経路を経て得られるフェニルプロパノ
イドの誘導体は、ＵＶ保護剤、防虫剤等にも利用し得
る。従って、このフェニルプロパノイド生合成経路に関
与する遺伝子の発現を的確に促進・抑制できれば、この
生合成経路をコントロールし、リグニン低含量樹木の作
出や有用物質の大量生産等も可能となるが、この場合も
また、上記した遺伝子間の相同性の問題から、アンチセ
ンス法によるそのコントロールは困難であった。例え
ば、フェニルプロパノイド生合成経路にて働く酵素であ
る、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）や
ペルオキシダーゼ（ＰＲＸ）の遺伝子をアンチセンス方
向に導入した形質転換植物は、生長阻害などの多面的な
抑制効果を示し（Ｍ．Ｍ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ ａｎｄ
Ｒ．Ｒ．Ｓｅｄｅｒｏｆｆ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．、ｖｏｌ．１１０，．ｐ．３−１３、１９９６）、
また、カフェー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子
をアンチセンス方向に導入したタバコにおいては、期待
したリグニン含量の変化が検出されなかったことが報告
されている（Ｗ．Ｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒａｎｓｇｅ
ｎ．Ｒｅｓ．、ｖｏｌ．３、ｐ．１２０−１２６、１９
９４）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記、従来
技術の有する問題点に鑑み、植物のフェニルプロパノイ
ド生合成経路に関与する特定の遺伝子の発現を、的確に
促進・抑制することのできるＤＮＡ及びベクターを提供
することを目的とするものである。
技術の有する問題点に鑑み、植物のフェニルプロパノイ
ド生合成経路に関与する特定の遺伝子の発現を、的確に
促進・抑制することのできるＤＮＡ及びベクターを提供
することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意検討を行った結果、フェニルプロパノ
イド生合成経路に関与する特定の遺伝子群、即ち、シナ
ミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）遺伝子、カ
ルコン酸シンセターゼ（ＣＨＳ）遺伝子、４−クマル酸
ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）遺伝子、ＰＡＬ遺伝子、ＰＲ
Ｘ遺伝子等において、５′上流非翻訳領域に、その発現
を制御する配列が存在すること、そしてその配列が、こ
れらの異なる遺伝子間で極めて高い相同性を有している
ことに着目し、この共通配列に結合してこれらの遺伝子
の転写を促進する因子（以下、単に転写因子と言う。）
を単離し、これをコードするＤＮＡをセンス遺伝子、あ
るいはアンチセンス遺伝子として植物体に導入すること
により、これらの遺伝子群の発現が確実に促進・抑制さ
れることを見出し、本発明を完成した。
を解決すべく鋭意検討を行った結果、フェニルプロパノ
イド生合成経路に関与する特定の遺伝子群、即ち、シナ
ミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）遺伝子、カ
ルコン酸シンセターゼ（ＣＨＳ）遺伝子、４−クマル酸
ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）遺伝子、ＰＡＬ遺伝子、ＰＲ
Ｘ遺伝子等において、５′上流非翻訳領域に、その発現
を制御する配列が存在すること、そしてその配列が、こ
れらの異なる遺伝子間で極めて高い相同性を有している
ことに着目し、この共通配列に結合してこれらの遺伝子
の転写を促進する因子（以下、単に転写因子と言う。）
を単離し、これをコードするＤＮＡをセンス遺伝子、あ
るいはアンチセンス遺伝子として植物体に導入すること
により、これらの遺伝子群の発現が確実に促進・抑制さ
れることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】即ち、本発明の上記課題は、この転写因子
をコードするＤＮＡ、具体的には配列番号１に示す塩基
配列からなるＤＮＡ、このＤＮＡとストリンジェントな
条件でハイブリダイズし、かつフェニルプロパノイド生
合成経路を制御する転写因子をコードするＤＮＡ、及び
これらのＤＮＡを有する組替えベクターにより解決され
る。なお、ここでストリンジェントな条件としては、緩
衝液として６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０９
Ｍ クエン酸ナトリウム）、温度５５℃を採用する。
をコードするＤＮＡ、具体的には配列番号１に示す塩基
配列からなるＤＮＡ、このＤＮＡとストリンジェントな
条件でハイブリダイズし、かつフェニルプロパノイド生
合成経路を制御する転写因子をコードするＤＮＡ、及び
これらのＤＮＡを有する組替えベクターにより解決され
る。なお、ここでストリンジェントな条件としては、緩
衝液として６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０９
Ｍ クエン酸ナトリウム）、温度５５℃を採用する。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。
る。
【００１０】フェニルプロパノイド生合成経路は広く植
物界に共通して保存されているため、これに関与する遺
伝子であるＣＡＤ遺伝子等の遺伝子、そして、これらの
遺伝子の発現を制御する転写因子も多くの植物が共通し
て有している。従って、本発明のＤＮＡは、草本・木本
を問わず、定法に従い、多くの植物から単離することが
できる。また、本発明のＤＮＡは、ホスファイトトリエ
ステル法（Ｈ．Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒ
ｅ、ｖｏｌ．３１０、ｐ．１０５−１１１、１９８４）
等の一般的な方法により、化学合成して得ることもでき
る。
物界に共通して保存されているため、これに関与する遺
伝子であるＣＡＤ遺伝子等の遺伝子、そして、これらの
遺伝子の発現を制御する転写因子も多くの植物が共通し
て有している。従って、本発明のＤＮＡは、草本・木本
を問わず、定法に従い、多くの植物から単離することが
できる。また、本発明のＤＮＡは、ホスファイトトリエ
ステル法（Ｈ．Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒ
ｅ、ｖｏｌ．３１０、ｐ．１０５−１１１、１９８４）
等の一般的な方法により、化学合成して得ることもでき
る。
【００１１】得られたＤＮＡは、植物にて発現可能なプ
ロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウィルスの
３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）、
ノパリンシンセターゼのプロモーター、リブロース２リ
ン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼの小サブユニッ
トのプロモーター等の下流域にセンス方向、あるいはア
ンチセンス方向に連結して使用する。なお、目的遺伝子
（本発明において、発現の促進あるいは発現の抑制を図
る対象となる遺伝子）の発現を促進するためには本発明
のＤＮＡをセンス方向にプロモーターに連結し、逆に、
目的遺伝子の発現を抑制するためには本発明のＤＮＡを
アンチセンス方向にプロモーターに連結する。また、目
的遺伝子の発現促進を図る場合には、プロモーターにセ
ンス方向に連結した本発明のＤＮＡと共に、その目的遺
伝子を他のプロモーターの下流域に連結したものを、一
つのベクターに組込み、あるいは、別個のベクターとし
て植物細胞に導入してもよい。
ロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウィルスの
３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）、
ノパリンシンセターゼのプロモーター、リブロース２リ
ン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼの小サブユニッ
トのプロモーター等の下流域にセンス方向、あるいはア
ンチセンス方向に連結して使用する。なお、目的遺伝子
（本発明において、発現の促進あるいは発現の抑制を図
る対象となる遺伝子）の発現を促進するためには本発明
のＤＮＡをセンス方向にプロモーターに連結し、逆に、
目的遺伝子の発現を抑制するためには本発明のＤＮＡを
アンチセンス方向にプロモーターに連結する。また、目
的遺伝子の発現促進を図る場合には、プロモーターにセ
ンス方向に連結した本発明のＤＮＡと共に、その目的遺
伝子を他のプロモーターの下流域に連結したものを、一
つのベクターに組込み、あるいは、別個のベクターとし
て植物細胞に導入してもよい。
【００１２】プロモーターに連結されたＤＮＡは、マイ
クロインジェクション法、エレクトロポレーション法、
ポリエチレングリコール法、融合法、高速バリスティッ
クベネトレーション法等を用いて、そのまま植物細胞に
直接導入することもできるが、植物への遺伝子導入用プ
ラスミドに組込み、これをベクターとして、植物感染能
のあるウィルスや細菌を介して間接的に植物細胞に導入
することもできる。かかるウィルスとしては、例えば、
カリフラワーモザイクウィルス、ジェミニウィルス、タ
バコモザイクウィルス、ブロムモザイクウィルス等が使
用でき、また、細菌としては、アグロバクテリウム・ツ
メファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ 以下、Ａ．ツメファシエンスと略
す。）、アグロバクテリウム・リゾジェネス（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）等を使用
することができる。Ａ．ツメファシエンスを用いるアグ
ロバクテリウム法により、植物への遺伝子導入を行う場
合には、かかるプラスミドとして、例えばｐＢＩ１０
１、ｐＢＩ１２１（いずれもＣｌｏｎｔｅｃｈ社）等を
用いることができる。
クロインジェクション法、エレクトロポレーション法、
ポリエチレングリコール法、融合法、高速バリスティッ
クベネトレーション法等を用いて、そのまま植物細胞に
直接導入することもできるが、植物への遺伝子導入用プ
ラスミドに組込み、これをベクターとして、植物感染能
のあるウィルスや細菌を介して間接的に植物細胞に導入
することもできる。かかるウィルスとしては、例えば、
カリフラワーモザイクウィルス、ジェミニウィルス、タ
バコモザイクウィルス、ブロムモザイクウィルス等が使
用でき、また、細菌としては、アグロバクテリウム・ツ
メファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ 以下、Ａ．ツメファシエンスと略
す。）、アグロバクテリウム・リゾジェネス（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）等を使用
することができる。Ａ．ツメファシエンスを用いるアグ
ロバクテリウム法により、植物への遺伝子導入を行う場
合には、かかるプラスミドとして、例えばｐＢＩ１０
１、ｐＢＩ１２１（いずれもＣｌｏｎｔｅｃｈ社）等を
用いることができる。
【００１３】本発明において、目的遺伝子の発現が促進
・抑制された植物体は、上記のような方法により本発明
のＤＮＡが導入された植物細胞を、増殖・再分化させる
ことにより得ることができる。かかる植物細胞の増殖・
再分化のための条件は、植物の種類等に応じて適当に選
択してやればよい。
・抑制された植物体は、上記のような方法により本発明
のＤＮＡが導入された植物細胞を、増殖・再分化させる
ことにより得ることができる。かかる植物細胞の増殖・
再分化のための条件は、植物の種類等に応じて適当に選
択してやればよい。
【００１４】本発明のＤＮＡ及びこれを組込んだベクタ
ーは、ＣＡＤ遺伝子、ＣＨＳ遺伝子、４ＣＬ遺伝子、Ｐ
ＡＬ遺伝子、ＰＲＸ遺伝子等の発現を促進・抑制するこ
とができる。さらに、これらの遺伝子に限らず、これら
が有する前記共通配列がその転写調節領域に存在してい
る遺伝子であれば、いずれも、本発明のＤＮＡ及びベク
ターによりその発現を制御することができる。
ーは、ＣＡＤ遺伝子、ＣＨＳ遺伝子、４ＣＬ遺伝子、Ｐ
ＡＬ遺伝子、ＰＲＸ遺伝子等の発現を促進・抑制するこ
とができる。さらに、これらの遺伝子に限らず、これら
が有する前記共通配列がその転写調節領域に存在してい
る遺伝子であれば、いずれも、本発明のＤＮＡ及びベク
ターによりその発現を制御することができる。
【００１５】また、本発明により遺伝子の発現を促進・
抑制できる植物も、特に限定されない。基本的に、フェ
ニルプロパノイド生合成経路を有する植物であれば、本
発明の効果を得ることができると考えられる。例えば、
タバコを始め、イネ、アラビドプシス、ペチュニア等の
草本植物、ポプラ、ユーカリ、アカシア、スギ、マツ等
の木本植物に本発明は適用することができる。
抑制できる植物も、特に限定されない。基本的に、フェ
ニルプロパノイド生合成経路を有する植物であれば、本
発明の効果を得ることができると考えられる。例えば、
タバコを始め、イネ、アラビドプシス、ペチュニア等の
草本植物、ポプラ、ユーカリ、アカシア、スギ、マツ等
の木本植物に本発明は適用することができる。
【００１６】
【作用】フェニルプロパノイド生合成経路に関与する遺
伝子に関しては、種々の植物種において、表１に示すよ
うな共通配列が見出されている（なお、表中、共通配列
の欄に記載された数字は、転写開始点からの距離（単位
はｂｐ）を示す。）。
伝子に関しては、種々の植物種において、表１に示すよ
うな共通配列が見出されている（なお、表中、共通配列
の欄に記載された数字は、転写開始点からの距離（単位
はｂｐ）を示す。）。
【００１７】
【表１】
【００１８】従って、この共通配列に結合する転写因子
は、これらの遺伝子群においてほぼ同様の構造をしてお
り、加えて、かかる転写因子をコードするＤＮＡもま
た、互いに相同性の高い塩基配列を有していると考えら
れる。それゆえ、本発明のＤＮＡは、植物やその転写因
子が働く遺伝子の種類を問わず、この共通配列を有する
ＣＡＤ遺伝子、ＣＨＳ遺伝子、４ＣＬ遺伝子、ＰＡＬ遺
伝子、ＰＲＸ遺伝子等の全てについて特異的に、その発
現を促進し、あるいは抑制することができるのである。
は、これらの遺伝子群においてほぼ同様の構造をしてお
り、加えて、かかる転写因子をコードするＤＮＡもま
た、互いに相同性の高い塩基配列を有していると考えら
れる。それゆえ、本発明のＤＮＡは、植物やその転写因
子が働く遺伝子の種類を問わず、この共通配列を有する
ＣＡＤ遺伝子、ＣＨＳ遺伝子、４ＣＬ遺伝子、ＰＡＬ遺
伝子、ＰＲＸ遺伝子等の全てについて特異的に、その発
現を促進し、あるいは抑制することができるのである。
【００１９】即ち、本発明のＤＮＡをセンス遺伝子とし
て植物体に導入した場合、その植物本来の転写因子に加
え、この遺伝子からも、その植物において上記共通配列
に結合し得る転写因子が合成される。これは、この遺伝
子が導入された植物の種類に関わらない。この結果、そ
の植物体内において、転写因子の発現量が全体として増
大し、より高い頻度でこれらの転写因子が共通配列に結
合するため、この配列を転写調節領域に有する遺伝子の
発現は促進されることとなるのである。
て植物体に導入した場合、その植物本来の転写因子に加
え、この遺伝子からも、その植物において上記共通配列
に結合し得る転写因子が合成される。これは、この遺伝
子が導入された植物の種類に関わらない。この結果、そ
の植物体内において、転写因子の発現量が全体として増
大し、より高い頻度でこれらの転写因子が共通配列に結
合するため、この配列を転写調節領域に有する遺伝子の
発現は促進されることとなるのである。
【００２０】一方、本発明のＤＮＡをアンチセンス遺伝
子として植物体に導入した場合は、植物体内において、
この遺伝子を鋳型として作られるＲＮＡが、その植物が
本来有する転写因子の遺伝子に由来するｍＲＮＡと相補
的に結合し、転写因子の合成を阻害する。この結果、転
写因子の発現量が減少し、上記共通配列へのその結合が
起こり難くなるため、この配列を転写調節領域に有する
遺伝子の発現は抑制されることとなるのである。
子として植物体に導入した場合は、植物体内において、
この遺伝子を鋳型として作られるＲＮＡが、その植物が
本来有する転写因子の遺伝子に由来するｍＲＮＡと相補
的に結合し、転写因子の合成を阻害する。この結果、転
写因子の発現量が減少し、上記共通配列へのその結合が
起こり難くなるため、この配列を転写調節領域に有する
遺伝子の発現は抑制されることとなるのである。
【００２１】
【実施例】以下に、本発明を実施例に基づいて説明す
る。
る。
【００２２】［実施例１］１．タバコｍＲＮＡの単離、精製 種子発芽後、温室にて約１ヵ月間生育させたタバコの葉
約１０ｇを、液体窒素存在下で粉砕し、その全ＲＮＡを
Ｃｈｏｍｃｚｎｓｋｉらの方法で抽出した。
約１０ｇを、液体窒素存在下で粉砕し、その全ＲＮＡを
Ｃｈｏｍｃｚｎｓｋｉらの方法で抽出した。
【００２３】得られた全ＲＮＡは、二炭酸ジエチル０．
２％を含む滅菌水に溶解し、温度６５℃で５分間保温し
た後、当量の２倍量のローディング緩衝液（２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ７．６、０．１Ｍ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）を加えて希釈し、
予め活性化させておいたオリゴｄＴセルロースカラムに
アプライした。次いで、このカラムを、カラム容量の５
〜１０倍量のローディング緩衝液、さらに、５倍量の洗
浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ７．６、
０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｓ
ＤＳ）を用いて洗浄した。溶出は、カラム容量に対して
２〜３倍量の溶出緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌ、
ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ＳＤＳ）
をこのカラムに流すことにより行い、精製されたｍＲＮ
Ａ１０ｍｇを得た。
２％を含む滅菌水に溶解し、温度６５℃で５分間保温し
た後、当量の２倍量のローディング緩衝液（２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ７．６、０．１Ｍ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）を加えて希釈し、
予め活性化させておいたオリゴｄＴセルロースカラムに
アプライした。次いで、このカラムを、カラム容量の５
〜１０倍量のローディング緩衝液、さらに、５倍量の洗
浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ７．６、
０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｓ
ＤＳ）を用いて洗浄した。溶出は、カラム容量に対して
２〜３倍量の溶出緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌ、
ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ＳＤＳ）
をこのカラムに流すことにより行い、精製されたｍＲＮ
Ａ１０ｍｇを得た。
【００２４】２．ｃＤＮＡライブラリーの作成 １で得られたｍＲＮＡより、Ｇｕｂｌｅｒ ＆ Ｈｏｆ
ｆｍａｎの方法（Ｇｕｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、ｖｏ
ｌ．２５、ｐ２６３−２６９、１９８３）に従い、オリ
ゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。このｃ
ＤＮＡをファージＤＮＡλｇｔ１１のＥｃｏＲＩ部位に
挿入した後、ラムダファージ外被タンパク（Ｇｉｇａｐ
ａｃｋ ＩＩ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔ
ｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社より市販。）を用いてｉｎ
ｖｉｔｒｏパッケージングを行い、組換えラムダファ
ージを得た。
ｆｍａｎの方法（Ｇｕｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、ｖｏ
ｌ．２５、ｐ２６３−２６９、１９８３）に従い、オリ
ゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。このｃ
ＤＮＡをファージＤＮＡλｇｔ１１のＥｃｏＲＩ部位に
挿入した後、ラムダファージ外被タンパク（Ｇｉｇａｐ
ａｃｋ ＩＩ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔ
ｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社より市販。）を用いてｉｎ
ｖｉｔｒｏパッケージングを行い、組換えラムダファ
ージを得た。
【００２５】一方、大腸菌Ｙ−１０９０株を１０ｍｌの
ＬＢＭＭ培地（トリプトン１％、食塩１％、酵母エキス
０．５％、硫酸マグネシウム１０ｍＭ及びマルトース
０．４％）に接種し、３７℃で１２時間振とうして前培
養した。前培養後、遠心分離により菌体を集め、これを
予め４℃に冷却された１０ｍＭの硫酸マグネシウム１０
ｍｌに懸濁し、ラムダファージを感染しやすくしておい
た。
ＬＢＭＭ培地（トリプトン１％、食塩１％、酵母エキス
０．５％、硫酸マグネシウム１０ｍＭ及びマルトース
０．４％）に接種し、３７℃で１２時間振とうして前培
養した。前培養後、遠心分離により菌体を集め、これを
予め４℃に冷却された１０ｍＭの硫酸マグネシウム１０
ｍｌに懸濁し、ラムダファージを感染しやすくしておい
た。
【００２６】感染は、こうして得られた大腸菌に上記組
換えラムダファージを混和し、３７℃、１５分間放置す
ることにより行った。
換えラムダファージを混和し、３７℃、１５分間放置す
ることにより行った。
【００２７】３．転写因子のスクリーニング 組換えラムダファージを感染させた大腸菌Ｙ−１０９０
は、１．５％寒天を含むＬＢＭＭ培地上にて３７℃で培
養した。そして約４時間後、プラークの発生が観察され
たところで、この培養プレート上に、予め１０ｍＭイソ
プロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）に浸して風乾し
ておいたナイロンメンブランフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ
−Ｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社））を載置し、３７℃、一晩
放置後、これを取り除けた。次いで、このナイロンメン
ブランフィルターを、５％スキムミルクを含む結合緩衝
液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、 １ｍＭ ＥＤＴＡ）中に４℃、１時間浸漬し
てブロッキングし、さらに、同じ結合緩衝液にスクリー
ニングのためのプローブを加えたものに再度浸漬して、
４℃で２時間、このプローブと転写因子との結合反応を
行った。
は、１．５％寒天を含むＬＢＭＭ培地上にて３７℃で培
養した。そして約４時間後、プラークの発生が観察され
たところで、この培養プレート上に、予め１０ｍＭイソ
プロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）に浸して風乾し
ておいたナイロンメンブランフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ
−Ｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社））を載置し、３７℃、一晩
放置後、これを取り除けた。次いで、このナイロンメン
ブランフィルターを、５％スキムミルクを含む結合緩衝
液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、 １ｍＭ ＥＤＴＡ）中に４℃、１時間浸漬し
てブロッキングし、さらに、同じ結合緩衝液にスクリー
ニングのためのプローブを加えたものに再度浸漬して、
４℃で２時間、このプローブと転写因子との結合反応を
行った。
【００２８】ここでスクリーニングのためのプローブと
しては、インゲンの４ＣＬ遺伝子やＰＡＬ遺伝子、西洋
ワサビのＰＲＸ遺伝子等の５′上流非翻訳領域に存在し
ている共通配列（Ｐ−ＢＯＸ配列：−ＣＣＡＣＴＴＧＡ
ＧＴＡＣ−）を用いた。即ち、このＰ−ＢＯＸ配列を有
する二本鎖オリゴヌクレオチドを合成により作成し、こ
れをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）でラベルして使用した。
しては、インゲンの４ＣＬ遺伝子やＰＡＬ遺伝子、西洋
ワサビのＰＲＸ遺伝子等の５′上流非翻訳領域に存在し
ている共通配列（Ｐ−ＢＯＸ配列：−ＣＣＡＣＴＴＧＡ
ＧＴＡＣ−）を用いた。即ち、このＰ−ＢＯＸ配列を有
する二本鎖オリゴヌクレオチドを合成により作成し、こ
れをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）でラベルして使用した。
【００２９】結合反応後のナイロンメンブランフィルタ
ーは、結合緩衝液で３０分間３回、室温にて浸漬するこ
とにより洗浄し、次いで、化学発光検出による一次スク
リーニング及び二次スクリーニングを行った。その結
果、１．０×１０６個のプラークから、上記共通配列に
結合するタンパクを産生している陽性プラーク１個が検
出された。なお、本実験において、二本鎖合成オリゴヌ
クレオチドのＤＩＧラベルから化学発光検出によるスク
リニーングに至る操作は、主にノンラジオアイソトープ
ＤＩＧ−核酸検出法に従い、市販キット（ベーリンガー
マンハイム社製）を用いて行った。
ーは、結合緩衝液で３０分間３回、室温にて浸漬するこ
とにより洗浄し、次いで、化学発光検出による一次スク
リーニング及び二次スクリーニングを行った。その結
果、１．０×１０６個のプラークから、上記共通配列に
結合するタンパクを産生している陽性プラーク１個が検
出された。なお、本実験において、二本鎖合成オリゴヌ
クレオチドのＤＩＧラベルから化学発光検出によるスク
リニーングに至る操作は、主にノンラジオアイソトープ
ＤＩＧ−核酸検出法に従い、市販キット（ベーリンガー
マンハイム社製）を用いて行った。
【００３０】４．共通配列結合タンパクをコードするＤ
ＮＡの塩基配列の決定 上記陽性プラークを形成するファージから定法に従いＤ
ＮＡを抽出した。得られたファージＤＮＡのインサート
部分（２において、タバコから得られたｃＤＮＡを挿入
した部分。）を、λｇｔ１１のクローニングサイトを含
むプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅し、アガロースゲ
ル電気泳動を行った結果、約１ｋｂｐのＤＮＡ断片の存
在が確認された。そこで、この１ｋｂｐＤＮＡ断片の末
端をリン酸化した後、プラスミドｐＮｏＴＡ／Ｔ７に組
込み（ＰＲＩＭＥ ＰＣＲ ＣＬＯＮＥＲＴＭ ＣＬＯ
ＮＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ（５ｐｒｉｍｅ、３ｐｒｉｍ
ｅ、Ｉｎｃ．）を使用。）、この組換えプラスミドＤＮ
Ａについて、ＤＮＡシークエンサー（ＤＮＡシークエン
サーＭｏｄｅｌ３７３Ｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社
製））を用い、ダイデオキシ法により塩基配列を決定す
ることで、標記タンパクをコードするＤＮＡの塩基配列
を決定した。
ＮＡの塩基配列の決定 上記陽性プラークを形成するファージから定法に従いＤ
ＮＡを抽出した。得られたファージＤＮＡのインサート
部分（２において、タバコから得られたｃＤＮＡを挿入
した部分。）を、λｇｔ１１のクローニングサイトを含
むプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅し、アガロースゲ
ル電気泳動を行った結果、約１ｋｂｐのＤＮＡ断片の存
在が確認された。そこで、この１ｋｂｐＤＮＡ断片の末
端をリン酸化した後、プラスミドｐＮｏＴＡ／Ｔ７に組
込み（ＰＲＩＭＥ ＰＣＲ ＣＬＯＮＥＲＴＭ ＣＬＯ
ＮＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ（５ｐｒｉｍｅ、３ｐｒｉｍ
ｅ、Ｉｎｃ．）を使用。）、この組換えプラスミドＤＮ
Ａについて、ＤＮＡシークエンサー（ＤＮＡシークエン
サーＭｏｄｅｌ３７３Ｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社
製））を用い、ダイデオキシ法により塩基配列を決定す
ることで、標記タンパクをコードするＤＮＡの塩基配列
を決定した。
【００３１】その配列を配列番号１に示すが、これよ
り、このタンパクは約２００個のアミノ酸からなるもの
と考えられる。質量は約２５ｋＤａである。また、この
タンパクのホモロジー検索から（データベースとして、
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ Ｒｅｌ．３４を使用。）、この
タンパクは、ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｍｏｔｉｆの一
種であるＬＩＭドメイン２単位から構成されていること
が推測される。そうであるとすれば、この転写因子は、
ＬＩＭドメインがＤＮＡに結合することを示した最初の
例である。そこで、このタンパクをＮｔｌｉｍ１と命名
した。
り、このタンパクは約２００個のアミノ酸からなるもの
と考えられる。質量は約２５ｋＤａである。また、この
タンパクのホモロジー検索から（データベースとして、
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ Ｒｅｌ．３４を使用。）、この
タンパクは、ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｍｏｔｉｆの一
種であるＬＩＭドメイン２単位から構成されていること
が推測される。そうであるとすれば、この転写因子は、
ＬＩＭドメインがＤＮＡに結合することを示した最初の
例である。そこで、このタンパクをＮｔｌｉｍ１と命名
した。
【００３２】５．ＤＮＡ結合活性確認のためのＮｔｌｉ
ｍ１の取得 以上のようにしてスクリーニングしたタンパク、Ｎｔｌ
ｉｍ１のＤＮＡ結合能を確認するため、大腸菌でこれを
必要量産生させることを試みた。
ｍ１の取得 以上のようにしてスクリーニングしたタンパク、Ｎｔｌ
ｉｍ１のＤＮＡ結合能を確認するため、大腸菌でこれを
必要量産生させることを試みた。
【００３３】まず、配列番号１に示す塩基配列を有する
ＤＮＡ断片（Ｎｔｌｉｍ１遺伝子）を、Ｎｔｌｉｍ１翻
訳開始コドン領域又は翻訳停止コドン領域に結合し、制
限酵素ＢａｍＨＩサイトを含むプライマーを用いてＰＣ
Ｒ法により増幅させた。このＤＮＡ断片を制限酵素Ｂａ
ｍＨＩで消化後、これを発現プラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ
Ｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）のＢａｍ
ＨＩサイトに挿入し、さらに、そのジャンクション部位
の塩基配列を調査することにより、インサートＤＮＡの
方向とフレームの正確さを確認した。かかるベクターを
用いてＮｔｌｉｍ１を産生させた場合、Ｎｔｌｉｍ１は
ｔａｃプロモーターの制御下でＧＳＴ融合タンパクとし
て得られることとなる。
ＤＮＡ断片（Ｎｔｌｉｍ１遺伝子）を、Ｎｔｌｉｍ１翻
訳開始コドン領域又は翻訳停止コドン領域に結合し、制
限酵素ＢａｍＨＩサイトを含むプライマーを用いてＰＣ
Ｒ法により増幅させた。このＤＮＡ断片を制限酵素Ｂａ
ｍＨＩで消化後、これを発現プラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ
Ｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）のＢａｍ
ＨＩサイトに挿入し、さらに、そのジャンクション部位
の塩基配列を調査することにより、インサートＤＮＡの
方向とフレームの正確さを確認した。かかるベクターを
用いてＮｔｌｉｍ１を産生させた場合、Ｎｔｌｉｍ１は
ｔａｃプロモーターの制御下でＧＳＴ融合タンパクとし
て得られることとなる。
【００３４】次いで、作成した発現プラスミドを大腸菌
ＪＭ１０９のコンピテントセル（東洋紡績製）に導入
し、この大腸菌を、抗生物質としてアンピシリン１００
ｍｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地（トリプトン１％、食塩
０．５％及び酵母エキス０．５％）で培養することによ
り、Ｎｔｌｉｍ１遺伝子が導入された形質転換体を選択
した。この形質転換体をＬＢ培地１ｍｌに植菌し、３７
℃、２００ｒｐｍで一晩前培養後、アンピシリン含有Ｌ
Ｂ培地（アンピシリン濃度１００ｍｇ／ｌ）３０ｍｌ
で、３７℃、２００ｒｐｍにて振とう培養した。そし
て、ＯＤ６００が約１．０になった時点で、培地中に、
ＩＰＴＧを終濃度が２ｍＭになるように加え、さらに３
７℃、１００ｒｐｍにて振とう培養を続けた。５時間
後、菌体を遠心分離により集菌してＰＢＳ緩衝液（１４
０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ Ｋｃｌ、１０．１ｍＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ
７．３）に懸濁し、再び遠心分離を行って菌体を回収し
た。
ＪＭ１０９のコンピテントセル（東洋紡績製）に導入
し、この大腸菌を、抗生物質としてアンピシリン１００
ｍｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地（トリプトン１％、食塩
０．５％及び酵母エキス０．５％）で培養することによ
り、Ｎｔｌｉｍ１遺伝子が導入された形質転換体を選択
した。この形質転換体をＬＢ培地１ｍｌに植菌し、３７
℃、２００ｒｐｍで一晩前培養後、アンピシリン含有Ｌ
Ｂ培地（アンピシリン濃度１００ｍｇ／ｌ）３０ｍｌ
で、３７℃、２００ｒｐｍにて振とう培養した。そし
て、ＯＤ６００が約１．０になった時点で、培地中に、
ＩＰＴＧを終濃度が２ｍＭになるように加え、さらに３
７℃、１００ｒｐｍにて振とう培養を続けた。５時間
後、菌体を遠心分離により集菌してＰＢＳ緩衝液（１４
０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ Ｋｃｌ、１０．１ｍＭ
Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ
７．３）に懸濁し、再び遠心分離を行って菌体を回収し
た。
【００３５】得られた菌体は２ｍｌのＰＢＳ緩衝液に懸
濁し、この懸濁液ごと超音波処理に付してこれを破砕
し、遠心分離（１５０００ｇ、１５分）によって上清
（可溶性画分）を分離した。この可溶性画分についてＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、目的のタン
パク、即ちＮｔｌｉｍ１−ＧＳＴ融合タンパクが誘導発
現していることを確認した後、この画分を対象に以下の
操作を行った。
濁し、この懸濁液ごと超音波処理に付してこれを破砕
し、遠心分離（１５０００ｇ、１５分）によって上清
（可溶性画分）を分離した。この可溶性画分についてＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、目的のタン
パク、即ちＮｔｌｉｍ１−ＧＳＴ融合タンパクが誘導発
現していることを確認した後、この画分を対象に以下の
操作を行った。
【００３６】まず、グルタチオンセファロース４Ｂ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）５０％スラリー
１０μｌをこの画分に加えて撹拌し、室温で３０分間放
置することによりＮｔｌｉｍ１−ＧＳＴ融合タンパクを
このグルタチオンセファロース４Ｂに吸着させた。こう
して目的タンパクを吸着させたグルタチオンセファロー
ス４Ｂは遠心分離（５００ｇ、５分）により回収し、Ｐ
ＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、Ｎｔｌｉｍ１のみをここ
から溶出させ、単離した。即ち、回収・洗浄したグルタ
チオンセファロース４ＢにＰＢＳ緩衝液１９μｌとトロ
ンビンプロテアーゼ（１ｃｌｅａｖａｇｅ ｕｎｉｔ：
ＰＢＳ中、ＧＳＴ融合タンパク１００μｇを１６時間で
９０％分解することのできる酵素量。）１μｌを加えて
懸濁し、室温下で２時間放置後、遠心分離（５００ｇ、
５分）により上清を分離した。そして、この上清につい
てＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行うことによ
り、Ｎｔｌｉｍ１を単離した。
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）５０％スラリー
１０μｌをこの画分に加えて撹拌し、室温で３０分間放
置することによりＮｔｌｉｍ１−ＧＳＴ融合タンパクを
このグルタチオンセファロース４Ｂに吸着させた。こう
して目的タンパクを吸着させたグルタチオンセファロー
ス４Ｂは遠心分離（５００ｇ、５分）により回収し、Ｐ
ＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、Ｎｔｌｉｍ１のみをここ
から溶出させ、単離した。即ち、回収・洗浄したグルタ
チオンセファロース４ＢにＰＢＳ緩衝液１９μｌとトロ
ンビンプロテアーゼ（１ｃｌｅａｖａｇｅ ｕｎｉｔ：
ＰＢＳ中、ＧＳＴ融合タンパク１００μｇを１６時間で
９０％分解することのできる酵素量。）１μｌを加えて
懸濁し、室温下で２時間放置後、遠心分離（５００ｇ、
５分）により上清を分離した。そして、この上清につい
てＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行うことによ
り、Ｎｔｌｉｍ１を単離した。
【００３７】６．Ｎｔｌｉｍ１のＤＮＡ結合活性の確認 ５にて単離されたＮｔｌｉｍ１を用い、ゲル移動度シフ
ト法により、そのＤＮＡ結合活性を確認した。
ト法により、そのＤＮＡ結合活性を確認した。
【００３８】精製Ｎｔｌｉｍ１ ２μｇを結合緩衝液
（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）１０μｌに溶解し、これに、
プローブとして３にて使用したＰ−ＢＯＸ領域を含むＤ
ＩＧ標識二本鎖合成オリゴヌクレオチド１０ｎｍｏｌ、
キャリアーＤＮＡとしてサケ精子ＤＮＡ２μｇを加え、
室温で２０分間放置した。
（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）１０μｌに溶解し、これに、
プローブとして３にて使用したＰ−ＢＯＸ領域を含むＤ
ＩＧ標識二本鎖合成オリゴヌクレオチド１０ｎｍｏｌ、
キャリアーＤＮＡとしてサケ精子ＤＮＡ２μｇを加え、
室温で２０分間放置した。
【００３９】この結合反応液について、１×ＴＡＥ
（６．７ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ７．９、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、３．３ｍＭ 酢酸ナトリウム）を含む５％
ポリアクリルアミドゲルを用いて１００Ｖで電気泳動を
行い、遊離プローブがゲルから流れ出る前にこれを終了
させた。そして、その泳動パターンをゲルからナイロン
メンブランフィルターに転写し、３と同様にして化学発
光検出を行った結果、Ｎｔｌｉｍ１が本来示す泳動バン
ドとは異なる位置にシフトしたバンドが観察され、ＤＮ
Ａ−タンパク複合体の存在が確認された。また、このシ
フトバンドは、上記結合反応液に非標識プローブ（ＤＩ
Ｇ標識をしていない他は、シフトバンドの検出に用いた
ものと全く同じプローブ。）１μｍｏｌをさらに添加
し、同様の条件で電気泳動を行ったものでは消失してい
た。従って、Ｎｔｌｉｍ１タンパクとＰ−ＢＯＸ配列と
の結合は特異的であることがわかる。
（６．７ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ７．９、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、３．３ｍＭ 酢酸ナトリウム）を含む５％
ポリアクリルアミドゲルを用いて１００Ｖで電気泳動を
行い、遊離プローブがゲルから流れ出る前にこれを終了
させた。そして、その泳動パターンをゲルからナイロン
メンブランフィルターに転写し、３と同様にして化学発
光検出を行った結果、Ｎｔｌｉｍ１が本来示す泳動バン
ドとは異なる位置にシフトしたバンドが観察され、ＤＮ
Ａ−タンパク複合体の存在が確認された。また、このシ
フトバンドは、上記結合反応液に非標識プローブ（ＤＩ
Ｇ標識をしていない他は、シフトバンドの検出に用いた
ものと全く同じプローブ。）１μｍｏｌをさらに添加
し、同様の条件で電気泳動を行ったものでは消失してい
た。従って、Ｎｔｌｉｍ１タンパクとＰ−ＢＯＸ配列と
の結合は特異的であることがわかる。
【００４０】７．Ｎｔｌｉｍ１による発現調節活性の検
討 まず、Ｎｔｌｉｍ１遺伝子を植物で発現させるため、プ
ラスミドｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のβ−グ
ルクロニダーゼ遺伝子の位置に、Ｎｔｌｉｍ１遺伝子を
含むＤＮＡ断片をセンス方向に組込み、このプラスミド
をエフェクターとして使用した。このエフェクターにお
いて、Ｎｔｌｉｍ１遺伝子が組込まれた部分の模式図
を、図１として示す。また、これとは別に、Ｐ−ＢＯＸ
配列を３回繰返した二本鎖オリゴＤＮＡと、Ｐ−ＢＯＸ
配列と同様、ＣＡＤ遺伝子等の５′非翻訳領域に共通し
て存在するいわゆるＧ−ＢＯＸ配列（−ＣＣＡＣＧＴＧ
Ｇ−）を３回繰返した二本鎖オリゴＤＮＡとを、Ｇ−Ｂ
ＯＸ配列が上流となるよう直列に連結し、これをさら
に、予めＣａＭＶ３５ＳプロモーターのＥｃｏＲＶサイ
ト（−９０ｂｐ）に挿入しておいたβ−グルクロニダー
ゼ（ＧＵＳ）遺伝子の上流側に連結して融合遺伝子を作
成した。そして、この融合遺伝子をｐＵＣ１９に組込
み、このプラスミドをレポーターとして使用した。即
ち、本実施例では、Ｎｔｌｉｍ１の機能をより簡便に明
らかにするため、これが作用するＰ−ＢＯＸ配列の下流
域には、本来存在するはずのＣＡＤ遺伝子等ではなく、
その発現の検出が極めて容易なＧＵＳ遺伝子をモデル的
に配置した。なお、この場合、Ｇ−ＢＯＸ配列はエンハ
ンサーとして働くものと考えられる。このレポーターに
おいて、融合遺伝子が組込まれた部分の模式図を、図２
として示す。
討 まず、Ｎｔｌｉｍ１遺伝子を植物で発現させるため、プ
ラスミドｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のβ−グ
ルクロニダーゼ遺伝子の位置に、Ｎｔｌｉｍ１遺伝子を
含むＤＮＡ断片をセンス方向に組込み、このプラスミド
をエフェクターとして使用した。このエフェクターにお
いて、Ｎｔｌｉｍ１遺伝子が組込まれた部分の模式図
を、図１として示す。また、これとは別に、Ｐ−ＢＯＸ
配列を３回繰返した二本鎖オリゴＤＮＡと、Ｐ−ＢＯＸ
配列と同様、ＣＡＤ遺伝子等の５′非翻訳領域に共通し
て存在するいわゆるＧ−ＢＯＸ配列（−ＣＣＡＣＧＴＧ
Ｇ−）を３回繰返した二本鎖オリゴＤＮＡとを、Ｇ−Ｂ
ＯＸ配列が上流となるよう直列に連結し、これをさら
に、予めＣａＭＶ３５ＳプロモーターのＥｃｏＲＶサイ
ト（−９０ｂｐ）に挿入しておいたβ−グルクロニダー
ゼ（ＧＵＳ）遺伝子の上流側に連結して融合遺伝子を作
成した。そして、この融合遺伝子をｐＵＣ１９に組込
み、このプラスミドをレポーターとして使用した。即
ち、本実施例では、Ｎｔｌｉｍ１の機能をより簡便に明
らかにするため、これが作用するＰ−ＢＯＸ配列の下流
域には、本来存在するはずのＣＡＤ遺伝子等ではなく、
その発現の検出が極めて容易なＧＵＳ遺伝子をモデル的
に配置した。なお、この場合、Ｇ−ＢＯＸ配列はエンハ
ンサーとして働くものと考えられる。このレポーターに
おいて、融合遺伝子が組込まれた部分の模式図を、図２
として示す。
【００４１】なお、上記のようにして作成した２種の組
換えプラスミドは、いったん大腸菌ＪＭ１０９のコンピ
テントセルに導入し、この大腸菌を培養することにより
増幅させて、最終的にはそれぞれ約１ｍｇのプラスミド
ＤＮＡを取得した。このときの大腸菌の培養はＬＢ培地
を用い、温度３７℃、振とう速度２００ｒｐｍで行っ
た。また、大腸菌からのプラスミドＤＮＡの単離・精製
は定法に従って行った。
換えプラスミドは、いったん大腸菌ＪＭ１０９のコンピ
テントセルに導入し、この大腸菌を培養することにより
増幅させて、最終的にはそれぞれ約１ｍｇのプラスミド
ＤＮＡを取得した。このときの大腸菌の培養はＬＢ培地
を用い、温度３７℃、振とう速度２００ｒｐｍで行っ
た。また、大腸菌からのプラスミドＤＮＡの単離・精製
は定法に従って行った。
【００４２】一方、岡田らの方法（Ｋ．Ｏｋａｄａ ｅ
ｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．、
Ｖｏｌ．２７、６１９、１９８６）に従って、タバコ培
養細胞ＢＹ−２よりプロトプラストを調製した。次い
で、エレクトロポレーション緩衝液（５ｍＭ ＭＥＳ、
３０ｍＭ Ｋｃｌ、０．３Ｍマンニトール、ｐＨ５．
８）１ｍｌに懸濁したこのプロトプラスト約３×１０６
個に電気パルス（２００Ｖ、２５０μＦ）を与え、エレ
クトロポレーション法にてレポーター１０μｇ又はレポ
ーターとエフェクター各１０μｇを導入した（遺伝子導
入装置ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（バイオラッド社製）を使
用。）。こうして遺伝子導入処理を行ったプロトプラス
トは０．４Ｍマンニトールで洗浄し、プロトプラスト用
培地（ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（日本新薬
製）に０．４Ｍマンニトールを添加）にて温度２５℃で
２４時間培養した後、破砕し、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎらの
方法（Ｒ．Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ｅｌ．、ＥＭＢ
Ｏ Ｊ．、ｖｏｌ．６、ｐ．３９０１−３９０７、１９
９７）によりＧＵＳ活性を測定した。その結果、レポー
ターとエフェクターを同時に導入したプロトプラストで
は、レポーターのみを導入したものに比べ、約３倍も高
いＧＵＳ遺伝子の発現が検出された。これは、エフェク
ターのＮｔｌｉｍ１遺伝子に由来するタンパク、Ｎｔｌ
ｉｍ１の効果により、レポーターにおいてＰ−ＢＯＸ配
列の下流域に連結されたＧＵＳ遺伝子の発現が大きく促
進されたこと、即ち、このＮｔｌｉｍ１がＰ−ＢＯＸ配
列に結合してその下流域に存在する遺伝子の発現を促進
する転写因子であり、また、これをコードするＮｔｌｉ
ｍ１遺伝子をセンス遺伝子として植物体に導入してやる
ことにより、このＮｔｌｉｍ１が制御している遺伝子の
発現が促進されることを示すものである。
ｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．、
Ｖｏｌ．２７、６１９、１９８６）に従って、タバコ培
養細胞ＢＹ−２よりプロトプラストを調製した。次い
で、エレクトロポレーション緩衝液（５ｍＭ ＭＥＳ、
３０ｍＭ Ｋｃｌ、０．３Ｍマンニトール、ｐＨ５．
８）１ｍｌに懸濁したこのプロトプラスト約３×１０６
個に電気パルス（２００Ｖ、２５０μＦ）を与え、エレ
クトロポレーション法にてレポーター１０μｇ又はレポ
ーターとエフェクター各１０μｇを導入した（遺伝子導
入装置ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（バイオラッド社製）を使
用。）。こうして遺伝子導入処理を行ったプロトプラス
トは０．４Ｍマンニトールで洗浄し、プロトプラスト用
培地（ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（日本新薬
製）に０．４Ｍマンニトールを添加）にて温度２５℃で
２４時間培養した後、破砕し、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎらの
方法（Ｒ．Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ｅｌ．、ＥＭＢ
Ｏ Ｊ．、ｖｏｌ．６、ｐ．３９０１−３９０７、１９
９７）によりＧＵＳ活性を測定した。その結果、レポー
ターとエフェクターを同時に導入したプロトプラストで
は、レポーターのみを導入したものに比べ、約３倍も高
いＧＵＳ遺伝子の発現が検出された。これは、エフェク
ターのＮｔｌｉｍ１遺伝子に由来するタンパク、Ｎｔｌ
ｉｍ１の効果により、レポーターにおいてＰ−ＢＯＸ配
列の下流域に連結されたＧＵＳ遺伝子の発現が大きく促
進されたこと、即ち、このＮｔｌｉｍ１がＰ−ＢＯＸ配
列に結合してその下流域に存在する遺伝子の発現を促進
する転写因子であり、また、これをコードするＮｔｌｉ
ｍ１遺伝子をセンス遺伝子として植物体に導入してやる
ことにより、このＮｔｌｉｍ１が制御している遺伝子の
発現が促進されることを示すものである。
【００４３】［実施例２］１．タバコへのセンス及びアンチセンスＮｔｌｉｍ１遺
伝子の導入 Ｎｔｌｉｍ１遺伝子を植物に導入するためのベクターと
してプラスミドｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を
用い、実施例１の７で作成したエフェクターの場合と同
様の位置に、このプラスミドにＮｔｌｉｍ１遺伝子を、
センス又はアンチセンス方向に組込んだ。得られた組換
えプラスミドについて、挿入したＮｔｌｉｍ１遺伝子の
方向を制限酵素消化実験によって決定した後、これをエ
レクトロポレーション法によりＡ．ツメファシエンスＥ
ＨＡ１０５に導入した（１０％グリセロール中、電気パ
ルスとして２５００Ｖ、２５μＦを与える。）。続い
て、このＡ．ツメファシエンスをカナマイシン１００ｍ
ｇ／ｌを含むＬＢ培地で２８℃、２日間培養することに
より選抜して、組換えプラスミドが導入された個体のみ
を得た。
伝子の導入 Ｎｔｌｉｍ１遺伝子を植物に導入するためのベクターと
してプラスミドｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を
用い、実施例１の７で作成したエフェクターの場合と同
様の位置に、このプラスミドにＮｔｌｉｍ１遺伝子を、
センス又はアンチセンス方向に組込んだ。得られた組換
えプラスミドについて、挿入したＮｔｌｉｍ１遺伝子の
方向を制限酵素消化実験によって決定した後、これをエ
レクトロポレーション法によりＡ．ツメファシエンスＥ
ＨＡ１０５に導入した（１０％グリセロール中、電気パ
ルスとして２５００Ｖ、２５μＦを与える。）。続い
て、このＡ．ツメファシエンスをカナマイシン１００ｍ
ｇ／ｌを含むＬＢ培地で２８℃、２日間培養することに
より選抜して、組換えプラスミドが導入された個体のみ
を得た。
【００４４】一方、Ｎｔｌｉｍ１遺伝子を導入する植物
としては、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕ
ｍＬ ｃｖ．ＳＲ−１）を材料として使用した。即ち、
無菌状態で育成した実生苗（発芽後、約４週間経過。）
の葉を５ｍｍ角に切断し、得られた葉片を、組替えプラ
スミド導入Ａ．ツメファシエンスの培養液に、その葉の
表皮を下にして１〜３分間浸漬することにより、この
Ａ．ツメファシエンスに感染させてＮｔｌｉｍ１遺伝子
を導入した。感染処理後の葉片は、滅菌した紙タオル等
により付着している培養液を除去してから、カルス誘導
培地（ムラシゲ・スクーグ基本培地、３％しょ糖、０．
２５％ゲランガム、１ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、０．１
ｍｇ／ｌベンジルアデニン）に置床し、２５℃連続照明
下で３日間培養、次いで、シュート形成用培地（ムラシ
ゲ・スクーグ基本培地、３％しょ糖、０．２５％ゲラン
ガム、０．１ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、１ｍｇ／ｌベン
ジルアデニン、１００ｍｇ／ｌカナマイシン、５００ｍ
ｇ／ｌカルベニシリン）に移植し、同じ温度・光条件下
で培養を続け、茎葉を分化させた。
としては、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕ
ｍＬ ｃｖ．ＳＲ−１）を材料として使用した。即ち、
無菌状態で育成した実生苗（発芽後、約４週間経過。）
の葉を５ｍｍ角に切断し、得られた葉片を、組替えプラ
スミド導入Ａ．ツメファシエンスの培養液に、その葉の
表皮を下にして１〜３分間浸漬することにより、この
Ａ．ツメファシエンスに感染させてＮｔｌｉｍ１遺伝子
を導入した。感染処理後の葉片は、滅菌した紙タオル等
により付着している培養液を除去してから、カルス誘導
培地（ムラシゲ・スクーグ基本培地、３％しょ糖、０．
２５％ゲランガム、１ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、０．１
ｍｇ／ｌベンジルアデニン）に置床し、２５℃連続照明
下で３日間培養、次いで、シュート形成用培地（ムラシ
ゲ・スクーグ基本培地、３％しょ糖、０．２５％ゲラン
ガム、０．１ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、１ｍｇ／ｌベン
ジルアデニン、１００ｍｇ／ｌカナマイシン、５００ｍ
ｇ／ｌカルベニシリン）に移植し、同じ温度・光条件下
で培養を続け、茎葉を分化させた。
【００４５】分化した茎葉は、シュート形成用培地での
培養から約４週間後に切取り、カナマイシン１００ｍｇ
／ｌとカルベニシリン５００ｍｇ／ｌを含むムラシゲ・
スクーグ基本培地（しょ糖３％、寒天０．８％又はゲラ
ンガム０．２５％も添加。）に移植して、さらに同じ温
度・光条件下で約４週間培養することにより発根させ
た。発根した個体は、メトロミックス３５０（Ｓｃｏｔ
ｔｓ−ＳｉｅｒｒｅａＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ社）を培養土として２５℃の温室で生育させ
た。
培養から約４週間後に切取り、カナマイシン１００ｍｇ
／ｌとカルベニシリン５００ｍｇ／ｌを含むムラシゲ・
スクーグ基本培地（しょ糖３％、寒天０．８％又はゲラ
ンガム０．２５％も添加。）に移植して、さらに同じ温
度・光条件下で約４週間培養することにより発根させ
た。発根した個体は、メトロミックス３５０（Ｓｃｏｔ
ｔｓ−ＳｉｅｒｒｅａＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ社）を培養土として２５℃の温室で生育させ
た。
【００４６】２．Ｎｔｌｉｍ１遺伝子が導入されたタバ
コの解析 ２−１．ＰＣＲ法による解析 １で生育した形質転換タバコの葉から、定法によりゲノ
ムＤＮＡを抽出し、カナマイシン耐性酵素遺伝子中の塩
基配列に対応したオリゴヌクレオチドをプローブとし
て、ＰＣＲを行なった。その結果、すべてのＰＣＲサン
プルにおいてＮｔｌｉｍ１遺伝子の増幅が検出され、分
析に供した形質転換体２５個体全てが、センス又はアン
チセンスＮｔｌｉｍ１遺伝子を有していることが確認さ
れた（センス形質転換体１３個体。アンチセンス形質転
換体１２個体。）。
コの解析 ２−１．ＰＣＲ法による解析 １で生育した形質転換タバコの葉から、定法によりゲノ
ムＤＮＡを抽出し、カナマイシン耐性酵素遺伝子中の塩
基配列に対応したオリゴヌクレオチドをプローブとし
て、ＰＣＲを行なった。その結果、すべてのＰＣＲサン
プルにおいてＮｔｌｉｍ１遺伝子の増幅が検出され、分
析に供した形質転換体２５個体全てが、センス又はアン
チセンスＮｔｌｉｍ１遺伝子を有していることが確認さ
れた（センス形質転換体１３個体。アンチセンス形質転
換体１２個体。）。
【００４７】２−２．ノーザンハイブリダイゼーション
法による解析 ２−１においてＮｔｌｉｍ１遺伝子の存在が確認された
形質転換タバコ（８週齢）から、センス形質転換体（セ
ンス方向にＮｔｌｉｍ１遺伝子が導入されたもの。）と
アンチセンス形質転換体（アンチセンス方向にＮｔｌｉ
ｍ１遺伝子が導入されたもの。）それぞれ２個体を選択
し、その茎から、酸グアニジンフェノールクロロホルム
法により全ＲＮＡを抽出した。また同時に、コントロー
ルとして、形質転換されていないタバコからも全ＲＮＡ
を抽出した。
法による解析 ２−１においてＮｔｌｉｍ１遺伝子の存在が確認された
形質転換タバコ（８週齢）から、センス形質転換体（セ
ンス方向にＮｔｌｉｍ１遺伝子が導入されたもの。）と
アンチセンス形質転換体（アンチセンス方向にＮｔｌｉ
ｍ１遺伝子が導入されたもの。）それぞれ２個体を選択
し、その茎から、酸グアニジンフェノールクロロホルム
法により全ＲＮＡを抽出した。また同時に、コントロー
ルとして、形質転換されていないタバコからも全ＲＮＡ
を抽出した。
【００４８】抽出した全ＲＮＡは、その１０μｇについ
て、終濃度０．６６Ｍホルムアルデヒドを含む１．２％
アガロースゲルと１×ＭＯＰＳ緩衝液（２０ｍＭ ＭＯ
ＰＳ／ｐＨ７．０、５ｍＭ酢酸ナトリウム、０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ）を用い、６０Ｖで２時間電気泳動を行って
分画した。泳動後、その泳動パターンをゲルからナイロ
ンメンブランフィルターに転写し、このナイロンメンブ
ランフィルターについてノーザンハイブリダイゼーショ
ンを行った。
て、終濃度０．６６Ｍホルムアルデヒドを含む１．２％
アガロースゲルと１×ＭＯＰＳ緩衝液（２０ｍＭ ＭＯ
ＰＳ／ｐＨ７．０、５ｍＭ酢酸ナトリウム、０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ）を用い、６０Ｖで２時間電気泳動を行って
分画した。泳動後、その泳動パターンをゲルからナイロ
ンメンブランフィルターに転写し、このナイロンメンブ
ランフィルターについてノーザンハイブリダイゼーショ
ンを行った。
【００４９】ノーザンハイブリダイゼーションは、Ｎｔ
ｌｉｍ１遺伝子の他、タバコのゲノムＤＮＡからＰＣＲ
法により増幅して得られたＰＡＬ遺伝子（８２０ｂｐ）
と４ＣＬ遺伝子（６１０ｂｐ）をプローブとして用い、
実施例１の３と同様、ノンラジオアイソトープＤＩＧ−
核酸検出法に従って行った。図３に、ノーザンハイブリ
ダイゼーション後の上記ナイロンメンブランフィルター
について、化学発光させた結果を示す。
ｌｉｍ１遺伝子の他、タバコのゲノムＤＮＡからＰＣＲ
法により増幅して得られたＰＡＬ遺伝子（８２０ｂｐ）
と４ＣＬ遺伝子（６１０ｂｐ）をプローブとして用い、
実施例１の３と同様、ノンラジオアイソトープＤＩＧ−
核酸検出法に従って行った。図３に、ノーザンハイブリ
ダイゼーション後の上記ナイロンメンブランフィルター
について、化学発光させた結果を示す。
【００５０】図３より、形質転換体におけるＮｔｌｉｍ
１遺伝子の発現は、非形質転換体Ｃ（ｌａｎｅ５）と比
較して、センス形質転換体ＯＰ１、ＯＰ２（ｌａｎｅ
１、２）では強く、逆にアンチセンス形質転換体ＵＰ
１、ＵＰ２（ｌａｎｅ３、４）では弱いことが分かる。
また、センス形質転換体ＯＰ１とＯＰ２では、ＰＡＬ遺
伝子、４ＣＬ遺伝子についても非形質転換体Ｃより強い
発現が認められ、特にこの傾向はＯＰ２において顕著で
あった。一方、アンチセンス形質転換体ＵＰ２では、Ｐ
ＡＬ遺伝子と４ＣＬ遺伝子の発現が殆ど完全に抑制され
ていた。なお、アンチセンス形質転換体ＵＰ１におい
て、ＰＡＬ遺伝子や４ＣＬ遺伝子の発現がそれほど抑制
されなかったのは、この個体におけるアンチセンス遺伝
子の導入量（ＰＡＬ遺伝子、４ＣＬ遺伝子の発現が殆ど
完全に抑制されたアンチセンス形質転換体ＵＰ２では、
Ｎｔｌｉｍ１のアンチセンス遺伝子が植物ゲノム中に多
コピー導入されているものと考えられる。）や、これが
導入された植物ゲノム中の位置による効果が影響を与え
ているものと考えられる。
１遺伝子の発現は、非形質転換体Ｃ（ｌａｎｅ５）と比
較して、センス形質転換体ＯＰ１、ＯＰ２（ｌａｎｅ
１、２）では強く、逆にアンチセンス形質転換体ＵＰ
１、ＵＰ２（ｌａｎｅ３、４）では弱いことが分かる。
また、センス形質転換体ＯＰ１とＯＰ２では、ＰＡＬ遺
伝子、４ＣＬ遺伝子についても非形質転換体Ｃより強い
発現が認められ、特にこの傾向はＯＰ２において顕著で
あった。一方、アンチセンス形質転換体ＵＰ２では、Ｐ
ＡＬ遺伝子と４ＣＬ遺伝子の発現が殆ど完全に抑制され
ていた。なお、アンチセンス形質転換体ＵＰ１におい
て、ＰＡＬ遺伝子や４ＣＬ遺伝子の発現がそれほど抑制
されなかったのは、この個体におけるアンチセンス遺伝
子の導入量（ＰＡＬ遺伝子、４ＣＬ遺伝子の発現が殆ど
完全に抑制されたアンチセンス形質転換体ＵＰ２では、
Ｎｔｌｉｍ１のアンチセンス遺伝子が植物ゲノム中に多
コピー導入されているものと考えられる。）や、これが
導入された植物ゲノム中の位置による効果が影響を与え
ているものと考えられる。
【００５１】これらの結果より、Ｎｔｌｉｍ１遺伝子、
即ち、本発明に係るＤＮＡは、ＰＡＬ遺伝子、４ＣＬ遺
伝子の発現を促進・抑制できることが明らかとなった。
また、本発明は、本発明に係るＤＮＡから合成される転
写因子が、これらの遺伝子のＰ−ＢＯＸ、あるいはこれ
に類似の５′非翻訳領域共通配列に結合して働くもので
あることをその基本原理としているため、これによる遺
伝子の発現・促進効果は、上記ＰＡＬ遺伝子や４ＣＬ遺
伝子に限らず、このような共通配列を有する遺伝子であ
れば、その種類を問わず発揮できるものである
即ち、本発明に係るＤＮＡは、ＰＡＬ遺伝子、４ＣＬ遺
伝子の発現を促進・抑制できることが明らかとなった。
また、本発明は、本発明に係るＤＮＡから合成される転
写因子が、これらの遺伝子のＰ−ＢＯＸ、あるいはこれ
に類似の５′非翻訳領域共通配列に結合して働くもので
あることをその基本原理としているため、これによる遺
伝子の発現・促進効果は、上記ＰＡＬ遺伝子や４ＣＬ遺
伝子に限らず、このような共通配列を有する遺伝子であ
れば、その種類を問わず発揮できるものである
【００５２】
【発明の効果】本発明により、その５′非翻訳領域に所
定の共通配列を有する遺伝子の発現を、特異的に促進・
抑制することが可能となった。
定の共通配列を有する遺伝子の発現を、特異的に促進・
抑制することが可能となった。
【００５３】即ち、本発明によれば、かかる共通配列を
有するＣＡＤ遺伝子、４ＣＬ遺伝子、ＰＡＬ遺伝子、Ｐ
ＲＸ遺伝子等の植物のフェニルプロパノイド生合成経路
に関与する遺伝子の制御が可能である。
有するＣＡＤ遺伝子、４ＣＬ遺伝子、ＰＡＬ遺伝子、Ｐ
ＲＸ遺伝子等の植物のフェニルプロパノイド生合成経路
に関与する遺伝子の制御が可能である。
【００５４】また、上記のＣＡＤ等は、フェニルプロパ
ノイド生合成経路のなかでも、特にリグニン生合成経路
に深く関わっている酵素であるため、これらの遺伝子の
発現を制御できる本発明によれば、低リグニン性樹木の
作出等、紙・パルプの原料として有望な樹木の開発が可
能となる。
ノイド生合成経路のなかでも、特にリグニン生合成経路
に深く関わっている酵素であるため、これらの遺伝子の
発現を制御できる本発明によれば、低リグニン性樹木の
作出等、紙・パルプの原料として有望な樹木の開発が可
能となる。
配列番号：１ 配列の長さ：９８８ 配列の型：核酸 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
ｔｏｂａｃｕｍ） 組織の種類：葉 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１００．．７０２ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｄｏｍａｉｎ 存在位置：１２７．．２８２ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ｚｉｎｇ ｆｉｎｇｅｒ ｍｏｔｉｆの一種
であるＬＩＭ ｄｏｍａｉｎ 特徴を表す記号：ｄｏｍａｉｎ 存在位置：４２７．．５８２ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ｚｉｎｇ ｆｉｎｇｅｒ ｍｏｔｉｆの一種
であるＬＩＭ ｄｏｍａｉｎ 配列
ｔｏｂａｃｕｍ） 組織の種類：葉 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１００．．７０２ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｄｏｍａｉｎ 存在位置：１２７．．２８２ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ｚｉｎｇ ｆｉｎｇｅｒ ｍｏｔｉｆの一種
であるＬＩＭ ｄｏｍａｉｎ 特徴を表す記号：ｄｏｍａｉｎ 存在位置：４２７．．５８２ 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：ｚｉｎｇ ｆｉｎｇｅｒ ｍｏｔｉｆの一種
であるＬＩＭ ｄｏｍａｉｎ 配列
【図１】実施例１で使用したエフェクターにおいて、Ｎ
ｔｌｉｍ１遺伝子が組込まれた部分を示す模式図であ
る。
ｔｌｉｍ１遺伝子が組込まれた部分を示す模式図であ
る。
【図２】実施例１で使用したレポーターにおいて、Ｐ−
ＢＯＸ配列を有する融合遺伝子が組込まれた部分を示す
模式図である。
ＢＯＸ配列を有する融合遺伝子が組込まれた部分を示す
模式図である。
【図３】Ｎｔｌｉｍ１遺伝子がセンス又はアンチセンス
方向に導入されたタバコにおける、各種遺伝子の発現状
況を示した図である。
方向に導入されたタバコにおける、各種遺伝子の発現状
況を示した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (8)
- 【請求項１】 配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮ
Ａ。 - 【請求項２】 配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮ
Ａとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ
フェニルプロパノイド生合成経路を制御する転写因子を
コードするＤＮＡ。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載のＤＮＡを有する
組替えベクター。 - 【請求項４】 請求項１又は２に記載のＤＮＡをセンス
方向に有する組替えベクター。 - 【請求項５】 請求項１又は２に記載のＤＮＡをアンチ
センス方向に有する組替えベクター。 - 【請求項６】 請求項１又は２に記載のＤＮＡが導入さ
れた植物細胞。 - 【請求項７】 請求項６に記載の植物細胞から再生され
た植物体。 - 【請求項８】 請求項１又は２に記載のＤＮＡによりコ
ードされるタンパク質。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12517198A JP3444191B2 (ja) | 1998-03-31 | 1998-03-31 | フェニルプロパノイド生合成経路を制御する転写因子 |
| ES99106556T ES2241202T3 (es) | 1998-03-31 | 1999-03-30 | Factor de transcripcion para el control de la via de biosintesis de fenilpropanoide. |
| CA002264962A CA2264962C (en) | 1998-03-31 | 1999-03-30 | Transcription factor controlling phenylpropanoid biosynthesis pathway |
| EP99106556A EP0953645B1 (en) | 1998-03-31 | 1999-03-30 | Transcription factor controlling phenylpropanoid biosynthesis pathway |
| DE69925778T DE69925778T2 (de) | 1998-03-31 | 1999-03-30 | Transcriptionsfaktor zur Steuerung des Phenylpropanoid Biosyntheseweges |
| CNB991049047A CN1152961C (zh) | 1998-03-31 | 1999-03-31 | 控制苯丙醇生物合成通路的转录因子 |
| AU22570/99A AU747692B2 (en) | 1998-03-31 | 1999-03-31 | Transcription factor controlling phenylpropanoid biosynthesis pathway |
| US09/282,146 US6303847B1 (en) | 1998-03-31 | 1999-03-31 | DNA encoding a transcription factor controlling phenylpropanoid biosynthesis pathway |
| US09/928,412 US20020123623A1 (en) | 1998-03-31 | 2001-08-14 | Transcription factor controlling phenylpropanoid biosynthesis pathway |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12517198A JP3444191B2 (ja) | 1998-03-31 | 1998-03-31 | フェニルプロパノイド生合成経路を制御する転写因子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11276181A true JPH11276181A (ja) | 1999-10-12 |
| JP3444191B2 JP3444191B2 (ja) | 2003-09-08 |
Family
ID=14903654
Family Applications (1)
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