ES2584321T3 - Promotores preferidos del cámbium/xilema y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 8 que tiene la capacidad de iniciar, en una planta, la transcripción de un gen de una manera preferida de tejido de xilema.

Description

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DESCRIPCION
Promotores preferidos del cambium/xilema y usos de los mismos Campo de la invencion
La invencion se refiere, en lmeas generales, al campo de biologfa molecular, bioqmmica y agricultura. Mas particularmente, la invencion se refiere a polinucleotidos adecuados para la regulacion de la expresion genica en plantas y la generacion de plantas transgenicas con calidad y productividad mejoradas.
Antecedentes y tecnica anterior de la invencion
La modificacion de un rasgo en plantas, a traves de modificacion por ingeniena genetica, depende de la insercion, en el genoma de la planta, de una construccion polinucleotidica que contiene el gen de interes, unido operativamente a un promotor que es funcional en la planta transgenica. Dentro del genoma de una planta, cualquier gen sencillo esta, en general, unido operativamente a un promotor, que determinara cuando y donde, debe expresarse el gen dentro de los tejidos y organos de la planta. Por lo tanto, si se quiere expresar un gen de interes en los tejidos u organos espedficos dentro de una planta transgenica y de una manera temporalmente regulada, deben usarse promotores preferidos de tejido. Por otro lado, la expresion en todos los tejidos de la planta, a lo largo del ciclo de vida de la planta, se conseguina usando promotores constitutivos.
En diversas situaciones, la expresion de genes particulares en tejidos u organos particulares, confiere a la planta un fenotipo de interes espedfico. Por ejemplo, si se quiere mejorar la calidad nutricional de semillas de cereales, se inserta un gen que confiere dicho fenotipo usando promotores espedficos de semillas, en lugar de usar promotores constitutivos, que permitinan al gen expresarse en todos los tejidos de la planta produciendo, en algunos casos, fenotipos no deseables. En otro ejemplo, si se quiere aumentar la cantidad de celulosa en los tejidos vasculares en desarrollo de un arbol forestal, en el genoma de la planta debe introducirse un promotor preferido de xilema y/o cambium unido operativamente a un gen heterologo que codifica una enzima implicada en el metabolismo de celulosa, de tal manera que podnan producirse mas moleculas de celulosa en el xilema de la planta en desarrollo. En otro ejemplo, el fenotipo deseado podna obtenerse inhibiendo la expresion de un gen endogeno dentro de un tejido espedfico de la planta. Eso podna realizarse introduciendo una construccion que comprendiese un promotor preferido de tejido unido operativamente a un polinucleotido que inhibiese la expresion del gen endogeno, bien mediante hibridacion antisentido o bien mediante silenciamiento de ARN (Matzke (ed.) et al. (2000) Plant Gene Silencing. Kluwer Academic Publishers). El documento WO 99/09188 desvela un promotor espedfico de xilema derivado del gen de la CCoAOMT del alamo.
Hasta ahora, la produccion de plantas modificadas por ingeniena genetica que expresan rasgos utiles y/o deseables requiere la disponibilidad de promotores que permitan al gen o genes de interes expresarse de una manera espedfica de tejido y sincronizacion. Por tanto, el aislamiento y la caracterizacion de promotores preferidos de tejido, particularmente preferidos de cambium/xilema, que pueden servir como regiones reguladoras para la expresion de secuencias nucleotfdicas heterologas de interes de una manera preferida de tejido, es esencial para la modificacion de plantas, mediante ingeniena genetica, que exhiben rasgos particulares.
Sumario de la invencion
Un primer objeto de la invencion se refiere a una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos como se expone en la SEQ ID NO: 8 que tiene la capacidad de iniciar, en una planta, la transcripcion de un gen de una manera preferida de tejido de xilema.
Un segundo objeto de la invencion se refiere a un vector de expresion, preferentemente un plasmido, que comprende:
i) la molecula de acido nucleico aislada, como se define anteriormente; y
ii) una molecula de acido nucleico que codifica una proteina de interes, en la que (i) y (ii) estan en union operativa, en la que (i) no regula normalmente (ii).
Un tercer objeto de la invencion se refiere a una celula de planta hospedadora recombinante, en la que dicha celula hospedadora recombinante se transforma o transfecta de manera estable con y comprende
i) la molecula de acido nucleico aislada, como se define anteriormente; y
ii) una molecula de acido nucleico que codifica una proteina de interes, en la que (i) y (ii) estan en union operativa, en la que (i) no regula normalmente (ii).
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Un cuarto objeto de la invencion se refiere a una celula hospedadora recombinante, en la que dicha celula hospedadora recombinante se transforma o transfecta de manera estable con el vector de expresion como se define anteriormente.
Otro objeto de la invencion se refiere a un metodo de preparacion de una celula de planta hospedadora recombinante, comprendiendo dicho metodo transformar o transfectar una celula con el vector de expresion como se define anteriormente.
Otro objeto de la invencion se refiere a un metodo de preparacion de una proteina codificada por el vector de expresion como se define anteriormente, que comprende transformar o transfectar una celula con dicho vector de expresion, y cultivar dicha celula en condiciones favorables para la expresion de dicha proteina.
Otro objeto de la invencion se refiere a un metodo para la preparacion de una proteina. comprendiendo dicho metodo cultivar una planta o una parte de la planta, que comprenda una celula de planta hospedadora recombinante como se define anteriormente, en condiciones que favorezcan la produccion de dicha proteina por dicha planta o parte de planta.
Otro objeto de la invencion se refiere a una planta o a una parte de la planta que comprende la celula de planta recombinante como se define anteriormente.
La presente memoria descriptiva describe moleculas de acido nucleico reguladoras aisladas del genoma de Populus sp, y metodos para regular la expresion de secuencias nucleotfdicas heterologas en tejidos de plantas, tal como de una manera preferida de xilema y/o cambium. En el presente documento se describen moleculas de acido nucleico aisladas que representan promotores con capacidad para dirigir la expresion espedfica de tejido de genes de interes. Las moleculas de acido nucleico reguladoras descritas en el presente documento corresponden a secuencias promotoras de genes que se expresan preferentemente en el cambium y/o en el xilema de Populus sp. Se descubrio que, los genes que codificaban isoformas de sacarosa sintasa (SuSy), alfa-tubulina (TUB), proteina arabinogalactanica (ARAB), acido cafeico 3-O-metiltrasferasa (COMT), cinamil alcohol deshidrogenasa (CAD), cinamato 4-hidroxilasa (C4H), cinamoil CoA reductasa (CCR), ferulato-5-hidroxilasa (F5H), sinapil alcohol deshidrogenasa (SAD), UDP-D-glucuronato carboxi-liasa (UDP), proteina de transferencia de lfpidos (LTP) y ag-13 (AG13), se expresaban en el tejido del cambium/xilema de Populus sp y sus promotores se habfan aislado, clonado y validado. Cuando estos promotores se asociaban en una planta transgenica con genes distintos a aquellos con los que se uman originalmente, los genes en cuestion se expresaban preferentemente en el cambium y/o en el xilema de dicha planta transgenica. Se proporcionan metodos de uso de los promotores preferidos de cambium/xilema, desvelados en el presente documento, para la regulacion, en una planta, de la expresion de secuencias de nucleotidos heterologas, de una manera preferida de cambium y/o xilema.
Los promotores preferidos de cambium/xilema se identificaron mediante el analisis de un conjunto de etiquetas de secuencia expresada (EST, acronimo del ingles Expressed Sequence Tag) de Populus sp, que representan tejidos del brote apical, la corteza, el cambium, la semilla, el xilema, la hoja y la rafz. Basandose en el perfil de expresion de estas EST entre los diferentes tejidos, se mostro que los doce genes indicados anteriormente se expresaban de manera elevada y preferentemente en el cambium y/o xilema de Populus.
Los promotores preferidos de cambium/xilema descritos en el presente documento se exponen en las SEQ ID NOS.: 1-12. Tambien se describen fragmentos de estas secuencias de nucleotidos, es decir, los expuestos en las SEQ ID NOS.: 1-12 que comprenden al menos 20 nucleotidos consecutivos. Los fragmentos mas pequenos, aunque no necesariamente codifican promotores o protemas con actividad promotora, pueden actuar como moleculas antisentido y desactivar genes expresados y de origen natural. Las composiciones descritas comprenden adicionalmente secuencias de nucleotidos que tienen una identidad de al menos 65 % con las secuencias expuestas en las SEQ ID NOS.: 1-12 o con un fragmento de las mismas, y secuencias de nucleotidos que hibridan en condiciones de alta rigurosidad con una cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas.
“Condiciones rigurosas”, como se usa en el presente documento, se refieren a parametros con los que la tecnica esta familiarizada, tales como hibridacion en 3,5xSSC, solucion 1xDenhardt, tampon fosfato sodico 25mM (pH 7,0), SDS al 0,5 % y EDTA 2mM durante 18 horas a 65 ° C, seguido de 4 lavados del filtro a 65 ° C durante 20 minutos, en 2XSSC, SDS al 0,1 %, y un lavado final durante hasta 20 minutos en 0,5xSSC, SDS al 0,1 % o 0,3xSSC y SDS al 0,1 % para mayor rigurosidad, y 0,1xSSC, SDS al 0,1 % para incluso mayor rigurosidad. Otras condiciones pueden sustituirse, siempre que el grado de rigurosidad sea igual al proporcionado en el presente documento, usando un lavado final de 0,5xsSc.
Otras facetas de la presente invencion incluyen construcciones, tales como vectores de expresion que comprenden los promotores unidos operativamente a una secuencia de nucleotidos de interes, que codifica una proteina deseada. El promotor desvelado en el presente documento tiene la capacidad de dirigir la expresion de polinucleotidos de interes en una celula de planta y dicho promotor comprende una cualquiera de las secuencias de nucleotidos de la presente invencion.
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Tambien son una parte de la invencion plantas recombinantes o celulas de plantas que tienen, en sus genomas, incorporadas de manera estable las construcciones descritas anteriormente o el propio promotor.
Los metodos de la invencion tambien incluyen metodos para incorporar en las celulas, de manera estable, los productos de la invencion.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 ilustra esquematicamente el vector plasirndico pAPROMATG+promotor que comprende el gen indicador GUS unido operativamente a una secuencia promotora. Los promotores se clonaron en este vector plasirndico en sustitucion de la secuencia promotora representada.
La Figura 2 muestra el perfil de expresion de genes SuSy, TUB, ARAB, UDP, LTP y AG13, en un conjunto de tejidos de Populus, que estan bajo el control de los promotores descritos en el presente documento en Populus.
La Figura 3 muestra el perfil de expresion de genes COMT; CAD, C4H, CCR, F5H y SAD, en un conjunto de tejidos de Populus, que estan bajo el control de los promotores descritos en el presente documento en Populus.
La Figura 4 ilustra esquematicamente el vector plasirndico pALELLYXgi que es otro aspecto de la divulgacion.
Las Figuras 5A y 5B muestran actividad beta-glucuronidasa en el tallo en floracion de plantas de Arabidopsis transformadas de acuerdo con el Ejemplo 3.
Descripcion detallada de las realizaciones preferidas
Las composiciones descritas en el presente documento comprenden nuevas secuencias de nucleotidos para promotores de plantas, particularmente promotores preferidos de cambium/xilema para los genes de Populus (alamo lenoso) que codifican sacarosa sintasa (SuSy), alfa-tubulina (TUB); protema arabinogalactanica (ARAP), acido cafeico 3-O-metiltrasferasa (COMT), cinamil alcohol deshidrogenasa (CAD), cinamato 4-hidrolasa (C4H), cinamoil CoA reductasa (CCR), ferulato-5-hidroxilasa (F5H), sinapil alcohol deshidrogenasa (SAD), UDP-D-glucuronato carboxi-liasa (UDP), protema de transferencia de lfpidos y ag-13 (AG13). Las secuencias de nucleotidos de estos promotores se exponen en las SEQ ID NOS.: 1-12, respectivamente. Estos promotores se aislaron de la region no traducida 5' que flanquea los sitios de inicio de la transcripcion de sus genes respectivos. En la tecnica se conocen bien metodos para el aislamiento de los promotores e incluyen herramientas bioinformaticas, tales como Phred, Phrap, Consed (Gordon et al. (1998) Genome Research. 8:195-202) para el ensamblaje de genes, alineamiento de secuencias (Durbin et al. (1998) Biological sequence analysis - probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, Cambridge, UK), busqueda funcional (Altschul et al. (1997) Nucleic Acid Res: 25:33893402) y tecnicas de PCR (Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning - a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA). Algunos de estos metodos se describen en el Ejemplo 1 mas anteriormente.
Se describen moleculas de acido nucleico aisladas que abarcan 0,1 kb, 0,5 kb, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb o 5 kb que comienzan en el codon de inicio ATG para la region codificante de los genes en cuestion. En el presente documento, las moleculas de acido nucleico aisladas reciben el nombre de promotores. Los promotores corresponden a las moleculas de acido nucleico cuya funcion es regular la expresion de un gen. Un promotor generalmente comprende secuencias de senalizacion espedficas denominadas cajas, que se disponen a lo largo de la secuencia promotora, de tal manera que su composicion determina la expresion temporal y espacial de un gen que esta bajo su control regulador. “Promotor” o “region de inicio de la transcripcion” significa una region reguladora de ADN que normalmente comprende una caja TATA que tiene la capacidad de dirigir la ARN polimerasa 2 para iniciar la smtesis de ARN en el sitio de inicio de la transcripcion apropiado para una secuencia codificante particular. Un promotor puede comprender adicionalmente otras secuencias de reconocimiento, generalmente ubicadas cadena arriba o en direccion 5' hacia la caja TATA, denominadas elementos promotores cadena arriba, que influyen en la velocidad de inicio de la transcripcion. Se reconoce que, habiendo identificado las secuencias de nucleotidos para las regiones promotoras desveladas en el presente documento, el aislar e identificar elementos reguladores adicionales en la region no traducida 5', cadena arriba desde las regiones promotoras particulares identificadas en el presente documento, se encuentra dentro de la ultima tecnologfa.
Por tanto, las regiones promotoras desveladas en el presente documento, en general, tambien se definen por elementos reguladores cadena arriba adicionales, tales como los responsables de la expresion temporal y tisular de la secuencia codificante, potenciadores y similares. De la misma manera, los elementos promotores, que facilitan la expresion en el tejido deseado, tal como xilema y/o cambium, pueden identificarse, aislarse y utilizarse con otro promotor principal para conferir expresion preferida en el cambium/xilema.
En el presente documento se describen promotores que se identificaron y se aislaron de Populus sp, que regulaban la expresion de genes espedficamente en el cambium y/o xilema.
El gen SuSy codifica una isoforma de sacarosa sintasa, una enzima implicada en la transformacion de sacarosa en UDP-glucosa en el xilema en desarrollo. La UDP-glucosa es el bloque funcional de la celulosa que se sintetiza y deposita en la pared celular de la planta. El gen SuSy desvelado en el presente documento se expresa
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preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 2).
El gen TUB codifica una isoforma de alfa-tubulina, una protema globular estructural implicada en la formacion de microtubulos, que forman parte del citoesqueleto. El gen TUB desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium y/o xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 2).
El gen ARAB codifica una isoforma de protema arabinogalactanica, miembro de una gran familia de glucoprotemas asociadas a la pared celular de las plantas de funcion desconocida. El gen ARAB desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 2).
El gen COMT codifica una isoforma de acido cafeico 3-O-metiltransferasa implicado en la metilacion tanto del acido cafeico como del acido 5-hidroxiferulico. Estos son compuestos intermedios de la biosmtesis de lignina. El gen COMT desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 3).
El gen CAD codifica una isoforma de cinamil alcohol deshidrogenasa, una enzima que cataliza la etapa final en la smtesis de monolignoles, transformando de este modo los cinamaldehndos en sus alcoholes correspondientes. El gen CAD desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 3).
The C4H gene codifica una isoforma de cinamato 4-hidroxilasa, un miembro de la superfamilia de monooxigenasas del citocromo P450 implicado en la catalisis de la primera reaccion oxidativa en el metabolismo de los fenilpropanoides, en concreto, en la transformacion del acido trans-cinamico en acido p-coumarico. El gen C4H desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 3).
El gen CCR codifica una isoforma de cinamoil CoA reductasa, que cataliza la transformacion de esteres de cinamoil CoA en sus cinamaldetndos correspondientes, la primera etapa espedfica en la smtesis de monomeros de lignina. El gen CCR desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 3).
El gen F5H codifica una monooxigenasa dependiente de P450 que cataliza la hidroxilacion de acido ferulico en una biosmtesis dirigida hacia acido sinapico y siringil lignina. El gen F5H desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 3).
El gen SAD codifica una sinapil alcohol deshidrogenasa que actua como mediadora en la reduccion de sinapaldehndo en siringil monolignoles en angiospermas. El gen SAD gene desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 3).
El gen UDP codifica la enzima UDP-D-glucuronato carboxi-liasa implicada en la degradacion de UDP-D- glucuronato en UDP-D-xilosa y CO2. El gen UDP desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 3).
El gen LTP codifica una isoforma de protema de transferencia de lfpidos, un miembro de una familia que se piensa que participa en la formacion de cutina, embriogenesis, reacciones de defensa contra fitopatogenos, simbiosis, y en la adaptacion de las plantas a diversas condiciones ambientales. El gen LTP desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 3).
El gen AG13 codifica una protema ag-13 de funcion desconocida, cuya expresion se ha asociado con el proceso de maduracion en diversas especies de plantas. El gen AG13 desvelado en el presente documento se expresa preferentemente en el cambium/xilema de Populus sp, aunque en otros tejidos pueden observarse niveles de expresion bajos (FIG. 3).
Las secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema descritas en el presente documento dirigen la expresion de secuencias de nucleotidos unidas operativamente de una manera preferida de cambium/xilema. El Ejemplo 4 ilustra la expresion del gen indicador GUS en el complejo de vasos/fibras del cambium/xilema de Arabidopsis thaliana transformado con una construccion que contiene el gen indicador GUS unido operativamente a dos promotores preferidos de cambium/xilema de la invencion, es decir, los promotores TUB (sEq ID NO.: 2) y C4H (SEQ ID NO.: 6). El ejemplo 4 tambien resume resultados que muestran la expresion del gen indicador GUS en plantas de Arabidopsis transformadas con construcciones que contienen el gen indicador GUS unido operativamente
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a cada una de las secuencias promotoras desveladas en el presente documento. Por tanto, las secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema desveladas en el presente documento pueden usarse para expresar una secuencia de interes unida operativamente en el cambium y/o en el xilema. Por tanto, pueden usarse promotores preferidos de cambium/xilema para mejorar la calidad de la madera de los arboles, bien aumentado la smtesis de celulosa o disminuyendo la smtesis de lignina. “Disminuyendo la smtesis de lignina” significa disminuir el contenido total de lignina de los arboles lenosos de entre cualquiera de 1-90 %, preferentemente entre aproximadamente 8090 % con respecto al contenido de lignina en plantas normales cultivadas en campos. “Aumentando la smtesis de celulosa” significa aumentar el contenido total de celulosa de arboles lenosos en 1,90%, preferentemente entre aproximadamente 80-90 %, en comparacion con plantas normales cultivadas en campos.
Ademas, los promotores preferidos de cambium/xilema pueden usarse para inhibir la expresion de genes implicados en el metabolismo del xilema en desarrollo. La inhibicion de dichos geles disminuye la concentracion de lignina y/o cambia la relacion entre guayacilo y siringilo, los bloques funcionales de las ligninas. La composicion monomerica de las ligninas es una caractenstica importante desde el punto de vista industrial, porque las ligninas ricas en unidades siringilo se degradan mas facilmente durante el proceso de pulpeo, ya que contienen enlaces de carbono 5-5' menos fuertes. Por tanto, la determinacion de la proporcion de siringilo con respecto a guayacilo (S/G) es util en la evaluacion de la calidad de la madera para la produccion de celulosa y la fabricacion de papel (Boudet et al., 1998). “El cambio de la relacion entre siringilo y guayacilo” se refiere a aumentar la proporcion de siringilo/guayacilo en 190 %, preferentemente de aproximadamente 80-90 % en comparacion con plantas normales cultivadas en campos.
Otras moleculas de acido nucleico descritas en el presente documento son variantes y/o fragmentos de las secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema, tales como las que codifican fragmentos, analogos o derivados de secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema nativas desveladas en el presente documento. Dichas variantes y/o fragmentos pueden ser, por ejemplo, variantes de origen natural de secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema, o variantes de origen no natural de secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema. Por ejemplo, la secuencia de nucleotidos de dichas variantes y/o fragmentos puede incluir deleciones, adiciones y/o sustituciones de uno o mas nucleotidos en comparacion con las secuencias promotoras nativas preferidas de cambium/xilema. Dichas variantes y/o fragmentos puede conservar la actividad biologica y por tanto conducir, de una manera preferida de cambium/xilema, la expresion de secuencias de nucleotidos unidas operativamente. Los fragmentos de secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema comprenden de aproximadamente 10, a aproximadamente 4.000 nucleotidos o hasta el numero de nucleotidos en las secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema de longitud completa desveladas en el presente documento, tal como los 700-3.500 nucleotidos de las SEQ ID NOS.: 1-12.
Por “variantes” se entiende la inclusion de secuencias sustancialmente similares. Las “variantes” de origen natural y no natural de secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema son moleculas de acido nucleico que tienen una identidad de secuencia de al menos 65 % con las secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema nativas desveladas en el presente documento, es decir, SEQ ID NOS.: 1-12. Las “variantes” tambien incluyen moleculas de acido nucleico que hibridan en condiciones rigurosas, como se define en el presente documento, con las secuencias de acido nucleico promotoras preferidas de cambium/xilema de SEQ ID NOS.: 1-12 o con el complemento de las secuencias de SEQ ID NOS.: 1-12. Por ejemplo, dichas “variantes” pueden ser moleculas de acido nucleico que hibridan con la secuencia de SEQ ID NOS.: 1-12 o con el complemento de las secuencias de SEQ ID NOS.: 1-12 en condiciones de rigurosidad baja, en condiciones de rigurosidad moderada, o en condiciones de rigurosidad alta. Como alternativa, dichos acidos nucleicos son los que tienen una secuencia de nucleotidos que es el complemento de la longitud completa o de partes de las secuencias de SEQ ID NOS.: 1-12. Otras variantes de secuencias promotoras preferidas de cambium/xilema descritas en el presente documento son polinucleotidos que comparten una identidad de secuencia de al menos 65 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 90 %, y lo mas preferentemente al menos 95 %, con las secuencias de SEQ ID NOS.: 1-12 o el complemento de las secuencias de SeQ ID NOS.: 1-12.
Las “condiciones rigurosas”, como las usadas en el presente documento, se refieren a los parametros expuestos anteriormente.
Para los fines de la presente invencion, la identidad de secuencia de cualquiera de las secuencias promotoras desveladas en el presente documento se realiza preferentemente usando metodologfas conocidas en la tecnica tales como el programa BLAST, o cualquier programa de alineamiento de secuencias que permita el alineamiento de nucleotidos identicos y la verificacion de emparejamientos erroneos entre nucleotidos no identicos de manera que pueda calcularse el porcentaje de identidad de las secuencias comparadas.
Los promotores preferidos de cambium/xilema descritos en el presente documento pueden usarse para expresar un gen de interes. Por ejemplo, usando promotores preferidos de cambium/xilema, la expresion de genes nativos y/o no nativos podna regularse en los tejidos del cambium y/o xilema de una planta, alterando de este modo el contenido de celulosa, el contenido lignina, la resistencia a patogenos o a insectos, el desarrollo y calidad de la madera, y similares, de la planta:
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Los genes nativos y/o no nativos incluyen aquellas enzimas codificantes, transportadores; cofactores, factores de la trascripcion y diversos otros genes que afectanan a la deposicion de celulosa y/o lignina en la planta o a la resistencia a patogenos o a insectos.
Para la presente invencion, los “genes de interes” incluyen aquellos que estan implicados en el metabolismo de la celulosa y de la lignina. Se reconoce que cualquier gen de interes puede estar unido operativamente al promotor de la invencion y expresarse en los tejidos del cambium y/o xilema de la planta.
Cuando los promotores preferidos de cambium/xilema de la presente invencion estan unidos operativamente a un gen de interes e incorporados de manera estable en el genoma de una planta, dirigen la expresion preferida de cambium y/o xilema de dicho gen de interes. Se entiende que, la expresion preferida de cambium y/o xilema significa que la expresion del gen de interes es mas abundante en el cambium y/o en el xilema, aunque en otros tejidos de la planta puede aparecer algun nivel de expresion del gen de interes. El cambium incluye cualquier parte del tejido del cambium o procambium en cualquier organo de la planta, incluyendo, pero sin limitacion, la rafz, brote, tallo, madera, hoja, peciolo y similares. Xilema significa cualquier parte del tejido del xilema, incluyendo pero sin limitacion, traqueidas, elementos traqueales, vasos, fibras anastomosadas y medula. Algunos de los promotores desvelados en el presente documento pueden dirigir, de forma perceptible, la expresion de genes, al xilema secundario en lugar de al xilema primario.
Las construcciones que contienen los promotores preferidos de cambium/xilema desvelados en la presente invencion y un gen de interes unido operativamente, pueden proporcionarse en casetes de expresion como se representa en las figuras. Dichos casetes de expresion comprenden los promotores preferidos de cambium/xilema de la presente invencion, o variantes o fragmentos de los mismos, unidos operativamente a un gen de interes cuya expresion se dirige al cambium y/o xilema. Dicho casete de expresion puede contener sitios de restriccion para la insercion del gen de interes bajo el control transcripcional de los promotores preferidos de cambium/xilema. El casete de expresion puede contener adicionalmente diversas otras secuencias de acido nucleico, incluyendo genes marcadores de seleccion; secuencias de inicio de la transcripcion y de la traduccion y una secuencia de terminacion de la transcripcion y la traduccion de la planta. La region de terminacion puede ser nativa con la secuencia de ADN de interes o puede ser la del plasmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones terminadoras de la octopina sintasa y de la nopalina sintasa (Gielen et al., EMBO J., 3:835-846 (1984), Depicker et al., Mol. y Appl. Genet., 1:561-573 81982))
En los casetes de expresion pueden incluirse genes indicadores o genes marcadores de seleccion. Pueden encontrarse ejemplos de genes indicadores adecuados conocidos en la tecnica, por ejemplo, en Jefferson et al. (1991) en Plant Molecular Biology Manual, ed. Gelvin et al. (Kluwer Academic Publishers), pag. 1-33. Los genes marcadores de seleccion para la seleccion de celulas o tejidos transformados pueden incluir genes que confieren resistencia a herbicidas. Los ejemplos de genes marcadores de seleccion adecuados incluyen, pero sin limitacion, genes que codifican resistencia a sulfonamida (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136), bromoxinil (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423), glifosato (Shaw et al. (1986) Science 233:478-481) y a fosfinotricina (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518).
Los casetes de expresion de la presente invencion, unidos operativamente a un gen de interes, son utiles para la transformacion de diversas plantas. Dichas plantas, incluyen, pero sin limitacion, especies de Eucaliptus (E. alba, E. albens, E. amygdalina, E. aromaphloia, E. baileyana, E. balladoniensis, E. bicostata, E. botryoides, E. brachyandra, E. brassiana, E. brevistylis, E. brockwayi, E. camaldulensis, E. ceracea, E. cloeziana, E. coccifera, E. cordata, E. cornuta, E. corticosa, E. crebra, E: croajingolensis, E. curtisii, E. dalrympleana, E. deglupta, E. delegatensis, E. delicata, E. diversicolor, E.diversifolia, E. dives, E. dolichocarpa, E. dundasii, E. dunnii, E. elata, E. erythrocorys, E. erythrophloia, E. eudesmoides, E. falcata, E. gamophylla, E. glaucina, E. globulus, E. globulus subsp. bicostata, E. globulus subsp. globulus, E. gongylocarpa, E. grandis, E. grandis x urophylla, E. guilfoylei, E. gunnii, E. hallii, E. houseana, E. jacksonii, E. lansdowneana, E. latisinensis, E. leucophloia, E. leucoxylon, E. lockyeri, E. lucasii, E. maidenii, E. marginata, E. megacarpa, E. melliodora, E. michaeliana, E. microcorys, E. microtheca, E. muelleriana, E. nitens, E. nitida, E. obliqua, E. obtusiflora, E. occidentalis, E. optima, E. ovata, E. pachyphylla, E. pauciflora, E. pellita, E. perriniana, E. petiolaris, E. pilularis, E. piperita, E. platyphylla, E. polyanthemos, E. populnea, E. preissiana, E. pseudoglobulus, E. pulchella, E. radiata, E. radiata subsp. radiata, E. regnans, E. risdonii, E. robertsonii, E. rodwayi, E. rubida, E. rubiginosa, E. saligna, E. salmonophloia, E. scoparia, E. sieberi, E. spathulata, E. staeri, E. stoatei, E. tenuipes, E. tenuiramis, E. tereticornis, E. tetragona, E. tetrodonta, E. tindaliae, E. torquata, E. umbra, E. urophylla, E. vernicosa, E. viminalis, E. wandoo, E. wetarensis, E. willisii, E. willisii subsp. falciformis, E. willisii subsp. willisii, E. woodwardii), especies de Populus (P. alba, P. alba x P. grandidentata, P. alba x P. tremula, P. alba x P. tremula var. glandulosa, P. alba x P. tremuloides, P. balsam^fera, P. balsam^fera subsp. trichocarpa, P. balsam^fera subsp. trichocarpa x P. deltoides, P. ciliata, P. deltoides, P. euphratica, P. euramericana, P. kitakamiensis, P. lasiocarpa, P. laurifolia, P. maximowiczii, P. maximowiczii x P: balsam^fera subsp. trichocarpa, P. nigra, P. sieboldiix P. grandidentata, P. suaveolens, P. szechuanica, P. tomentosa, P. tremula, P. tremula x P. tremuloides, P. tremuloides, P. wilsonii, P. canadensis, P. yunnanensis) y comferas, tales como, por ejemplo, pino del lodazal (Pinus taeda), pino del incienso (Pinus elliotii), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino lodgepole (Pinus contorta) y pino Monterey (Pinus radiata); abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesii); cicuta occidental (Tsuga canadensis); abeto Sitka (Picea glauca); secuoya (Sequoia sempervirens); abeto verdadero, tal como abeto de navidad (Abies amabilis)
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y abeto balsamico (Abies balsamea); y cedros tales como cedro rojo occidental (Thuja plicata) y Alaska (Chamaecyparis nootkatensis).
Los casetes de expresion pueden incorporarse de manera estable en los genomas de las transformacion mediada por Agrobacterium (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. mediante el metodo biobalfstico (Klein et al. (l987) Nature. 327:70-73).
Todos los terminos tecnicos que se utilizan en el presente documento son terminos comunmente usados en bioqmmica, biolog^a molecular y agricultura, y un experto habitual en la materia, a la cual pertenece la presente invencion, los conoce. Estos terminos tecnicos pueden encontrarse en: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., vol. 1-3, ed. Sambrook y Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001; Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing Associates y Wiley-Interscience, Nueva York, 1988 (con actualizaciones periodicas); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 5th ed., vol. 1-2, ed. Ausubel et al., John Wiley y Sons, Inc., 2002; Genome Analysis: A Laboratory Manual, vol. 1-2, ed. Green et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997. En el presente documento se describen metodos que implican tecnicas de biologfa vegetal y se describen con detalle en tratados de metodologfa, tales como Methods in Plant Molecular Biology: A Laboratory Course Manual, ed. Maliga et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1995. Se describen diversas tecnicas que usan PCR, por ejemplo, en Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, 1990 y en Dieffenbach y Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2003. Los pares de cebadores de PCR pueden proceder de secuencias conocidas usando programas informaticos disenados para ese proposito (por ejemplo, Primer, version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). Se analizan metodos de smtesis qmmica de acidos nucleicos, por ejemplo, en Beaucage y Caruthers (1981) Tetra. Lett. 22:1895-1862 y en Matteucci y Caruthers (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185.
La presente invencion se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos espedficos. Los ejemplos se proporcionan unicamente como ilustracion y no debe considerarse que limitan, de ningun modo, el ambito o contenido de la invencion.
EJEMPLO 1
Perfil de expresion de genes que se expresan preferentemente en el Cambium/Xilema
Las etiquetas de secuencia expresada (EST) de Populus sp se agruparon usando el programa CAP3 (Huang and Madan (1999) Genome Res. 9:868-877). Dichas EST se obtuvieron de bibliotecas que representaban los siguientes tejidos: brote apical, corteza, cambium, semilla, xilema, hoja y rafz. El conjunto de grupos asf generados se investigo para los grupos compuestos por al menos el 90 % de las EST de bibliotecas que representaban tejidos de xilema y cambium de Populus. Se seleccionaron 12 grupos basandose en su nivel de expresion alto y preferido en el cambium y/o xilema de Populus. Despues, se realizo una busqueda con BLASTX frente a la base de datos del GenBank no redundante con cada uno de los doce grupos, y se llego a la conclusion de que representaban secuencias expresadas de los siguientes genes: sacarosa sintasa (SuSy), alfatubulina (TUB), protema arabinogalactanica (ARAB), acido cafeico 3-O-metiltrasferasa (COMT), cinamil alcohol deshidrogenasa (CAD), cinamato 4-hidroxilasa (C4H), cinamoil CoA reductasa (CCR), ferulato-5-hidroxilasa (F5H), sinapil alcohol deshidrogenasa (SAD), UDP-D-glucuronato carboxi-liasa (UDP), protema de transferencia de lfpidos (LTP) y ag-13 (AG13). Las Figuras 2 y 3 muestran el perfil de expresion en diversos tejidos de Populus para cada uno de los grupos que representan los genes cuyos promotores se desvelan en el presente documento. La serie de histogramas en las Figuras 2 y 3 representan finalmente la abundancia relativa de cada gen en genotecas de ADNc que representan los tejidos anteriormente mencionados (brote apical, corteza; cambium, semilla, xilema, hoja y rafz). Por tanto, los histogramas componen un conjunto de datos de expresion digitales que es una aproximacion del nivel de expresion relativa de los doce genes cuyos promotores se desvelan en el presente documento.
EJEMPLO 2
Aislamiento de secuencias promotoras
Se realizo BLASTN para cada uno de los doce grupos frente a las secuencias genomicas de Populus trichocarpa disponibles en el Joint Genome Institute US Department of Energy como parte del "Proyecto de Secuenciacion del Genoma de Populus" (
http://genome.jgi-psf.org/poplar0/poplar0.info.html). Las regiones de nucleotidos
seleccionadas de cada grupo, correspondientes a supuestos exones, se usaron como secuencias conductoras en la recuperacion de lecturas de secuencia genomica que comprendfan la region de inicio de la transcripcion y secuencias promotoras aguas arriba adyacentes. Estas lecturas genomicas se ensamblaron usando el programa PHRAP (Gordon et al. (1998) Genome Res. 8:195-202) para obtener un contigo que inclma aproximadamente de 700 a 3.500 nucleotidos de la supuesta region promotora aguas arriba desde el punto de inicio de la transcripcion (+1 nucleotido, que correspondfa al inicio del ARNm respectivo). Se llego a la conclusion de que estos contigos, que conteman las regiones promotoras de cada uno de los genes que codifican los ARNm representados por los doce
cedro amarillo de
plantas mediante 80:4803-4807) o
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grupos, se expresaban preferentemente en los tejidos del cambium y/o xilema de Populus. Estas doce regiones promotoras corresponden a las secuencias desveladas en el presente documento como SEQ ID NOS: 1-12.
Para el aislamiento de regiones promotoras espedficas, se disenaron pares de promotores espedficos de genes (normalmente de una longitud de 30 nt) de las secuencias de los contigos promotores descritos anteriormente, para ampliar por PCR un fragmento de 700 a 3.500 nucleotidos desde la region promotora de cada uno de los doce genes cuyas secuencias promotoras se desvelan en el presente documento. La primera ronda de PCR se realizo sobre una muestra de aDn genomico de Populus deltoides o P. trichocarpa, que se preparo de hojas usando el metodo de extraccion del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) (Aldrich y Cullis (1993) Plant Mol. Biol. Report. 11:128-141). Los cebadores se disenaron para amplificar la region aguas arriba de la region codificante, es decir, la region no traducida 5' y la region promotora del gen seleccionado. A continuacion se ofrecen las secuencias de los cebadores usados para cada promotor:
sacarosa sintasa (SuSy)
5’- GCCATAGCTCCTTAAGAGAAACAGAAAGCAA -3’ 5’- CAATATAGAATCAATGAACAGCACTAGTTTGC -3’ 5’- TCATGTCCTATCCAACGGCG - 3’
(SEQ ID NO: 13) (SEQ ID NO: 14) (SEQ ID NO: 15)
alfatubulina (TUB)
5’- CTCATTTTCTCTCAAAGCTCAAAG -3’
5’- G AC AACT AGT CT AAAGTTAAAACTT AG ACC -3’ 5’- CCCTGGAGGTTGGGGTGAGT - 3’
(SEQ ID NO: 16) (SEQ ID NO: 17) (SEQ ID NO: 18)
proteina arabinogalactanica (ARAB)
5’- GCGTTCATCTACAAAACCCTCCTCC -3’ 5’- TTC ATC CTTATTTTTTTGGG AT A -3’
5’- CAAAGGATCATGGAGTTGGA - 3’
(SEQ ID NO: 19) (SEQ ID NO: 20) (SEQ ID NO : 21)
acido cafeico 3-O-metiltrasferasa (COMT)
5’- T ATACT AATAT G ACCTAAT AACTT AG AAGT GTGG -3’ 5’- CATCTTGATCAAGATTGAATTC -3’
5’- CAT AAT AT C AAAACTTAAG C - 3’
(SEQ ID NO: 22) (SEQ ID NO: 23) (SEQ ID NO: 24)
cinamil alcohol deshidrogenasa (CAD)
5’- T G AATT GAT G ACGTAG G AAAC AT GATAAAC AT G -3’ (SEQ ID NO: 25) 5’- C ATTTT CTT G AAAC AAT G AGGCT AAG AG -3’ (SEQ ID NO: 26)
cinamato 4-hidroxilasa (C4H)
5’- GACATGAGAAACTAACGTTGCTTGAATTC -3’ (SEQ ID NO: 27)
5’- CAT AAT ATT G G AACTGGTTT CTTT GT C AG AAAG -3’ (SEQ ID NO: 28)
cinamoil CoA reductasa (CCR)
5’- GCGCTCGGGTTGTCACCATAGTTTC -3’ 5’- CAT GTTGTT ATATTT AG AT AAAT GTA -3’
(SEQ ID NO: 29) (SEQ ID NO: 30)
ferulato-5-hidroxilasa (F5H)
5’- TTCATCAAGCAATAATAATAAGGTGAGGC -3’ 5’- CATGGATGCAGATTTTTGTGTTTGTG -3’
5’- TTCAGTGAACATGCTGCCACAATGAC - 3’
(SEQ ID NO: 31) (SEQ ID NO: 32) (SEQ ID NO: 33)
sinapil alcohol deshidrogenasa (SAD)
5’- AATCGAAACCGATCGATTTGAACTGG -3’ (SEQ ID NO: 34)
5’ CATGGTGCTTGCTTCAGATAG -3’ (SEQ ID NO: 35)
UDP-D-glucuronato-carboxi-liasa (UDP)
5’- GGAAATGTCAACACTTGTGTGACCACAC -3’ (SEQ ID NO: 36)
5’- GACATTCTTGTCCAATTTCTGAA -3’ (SEQ ID NO: 37)
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proteina de transferencia de lipidos (LTP)
5’ GGAGCCTCCATATTTCTGTATCTC -3'
5’- CAAGACGATGAAATGAAGAACTGATAGC -3’
(SEQ ID NO: 38) (SEQ ID NO: 39)
ag-13 (AG13)
5’- GACATTCCTTGACTTAATATGATGCT -3’ (SEQ ID NO: 40)
5’ GAATTCGCATCCATGCGGTGAGTTCG -3’ (SEQ ID NO: 41)
La PCR se realizo usando reactivos disponibles en el comercio y los parametros de ciclo de 5 minutos a 94 °C seguido de 35 ciclos de 94 °C durante 1 minuto, despues una temperatura de hibridacion modificada, como se describe mas adelante durante un minuto, despues 72 °C durante 3 minutos. La temperatura (T) de hibridacion se ajusto para cada par de cebadores y vario de 50 °C a 59 °C. Finalmente, las muestras se mantuvieron a 72 °C durante 7 minutos, despues a 4 °C hasta analisis posterior. Diez pl de cada uno de los fragmentos de ADN amplificados resultantes se procesaron en un gel de agarosa al 0,8 %, se purificaron usando el kit de Purificacion de gel GFX (Amersham), se subclonaron en el vector pGEM-T-Easy (Promega) y despues en sitios EcoRI y BgIII del vector pAPROM-ATG. Las secuencias finales se determinaron en los plasmidos resultantes. La Figura 1 ilustra esquematicamente el casete de expresion pAPROM-ATG que comprende el gen GUS unido operativamente a un promotor desvelado en el presente documento. La Figura 4 ilustra esquematicamente el vector plasmfdico que comprende un gen de interes unido operativamente a un promotor de la invencion.
EJEMPLO 3
Transformacion de plantas de Arabidopsis
Usando un protocolo de transformacion mediado por Agrobacterium tumefaciens (Bechtold et al., (1993) C. R. Acad. Sci. Paris 316:1194-1199; Bent et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 204:383-396) se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana Columbia con construcciones individuales que conteman uno cualquiera de los promotores de la invencion unido operativamente a un gen de interes. Las construcciones tambien conteman el gen marcador de seleccion Bar que confiere resistencia a analogos de fosfinotricina herbicida como glufosinato de amonio (Thompson et al. (1987) EMBO J. 9:2519-2523). En este ejemplo, el gen de interes unido operativamente a los promotores preferidos de cambium/xilema de la invencion es el gen indicador GUS que codifica la enzima beta-glucuronidasa (GUS) (Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405) que posibilita la inspeccion visual del fenotipo deseable, es decir, la expresion de GUS de una manera preferida de cambium/xilema.
Se sembraron semillas de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia en macetas que conteman vermiculita. Las plantas se cultivaron en un regimen de oscuridad/luz de 16/8 horas a 22 °C. Despues de 4-5 semanas, las plantas se transformaron con la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens de acuerdo con Bent et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 204:383-396; que lleva el vector plasmfdico que comprende el gen de interes unido operativamente a cada uno de los promotores descritos en el presente documento.
Para la transformacion de la planta, 1 litro de medio LB que contema rifampicina, gentamicina y kanamicina se inoculo con una alfcuota de cultivo iniciador de Agrobacterium durante una noche. Despues, el cultivo se dejo crecer durante una noche a 28 °C en un agitador rotativo, hasta que la DO600 fue > 8,0. La Agrobacterium se precipito por centrifugacion y el sedimento bacteriano se resuspendio en ~300 ml de sacarosa al 5 % y Silwet L-77 al 0,03 %. Esta suspension de Agrobacterium se pulverizo sobre las plantas. Las macetas se colocaron en una bandeja que se cubrio con una envoltura de plastico para mantener la humedad y las plantas se dejaron crecer bajo el regimen anterior para madurar y asentar las semillas.
Las semillas se recogieron y la superficie se esterilizo con una solucion que contema lejia 50 % y Triton X-100 al 0,02 % durante 7 minutos. Despues, las semillas se lavaron 3 veces con agua destilada esteril y se sembraron en placas en medio MS que contema 6 mg/l de Finale como agente de seleccion. Despues de 5 a 7 dfas, los transformantes eran visibles como plantas verdes. Las plantas transformadas se transfirieron sobre nuevas placas de seleccion y despues de 6-10 dfas se transfirieron a macetas que conteman vermiculita y se cultivaron en condiciones de 16 horas de luz/ 8 horas de oscuridad a 22 °C.
EJEMPLO 4
Ensayo de expresion de GUS en plantas de Arabidopsis
Tallos con inflorescencias de las plantas transformadas descritas en el Ejemplo 3 se cortaron y se tineron histologicamente para determinar la actividad GUS. Esquejes posteriores indujeron la formacion de xilema secundario en la base de plantas que tambien pudieron tenirse histologicamente para determinar la actividad GUS.
En las Figuras 5A y 5B, se muestra la actividad de la beta-glucuronidasa en tallos en floracion de plantas transgenicas de Arabidopsis. Estas plantas transgenicas de Arabidopsis se transformaron con una construccion que

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos como se expone en la SEQ ID NO: 8 que tiene la capacidad de iniciar, en una planta, la transcripcion de un gen de una manera preferida de tejido de xilema.
  2. 2. Un vector de expresion, preferentemente un plasmido, que comprende:
    i) la molecula de acido nucleico aislada de la reivindicacion 1; o
    ii) una molecula de acido nucleico que codifica una protema de interes, en la que (i) y (ii) estan en union operativa, en la que (i) no regula normalmente (ii).
  3. 3. Una celula de planta hospedadora recombinante, en la que dicha celula hospedadora recombinante se transforma o transfecta de manera estable con
    i) la molecula de acido nucleico aislada de la reivindicacion 1; y
    ii) una molecula de acido nucleico que codifica una protema de interes, en la que (i) y (ii) estan en union operativa, en la que (i) no regula normalmente (ii).
  4. 4. Una celula hospedadora recombinante, en la que dicha celula hospedadora recombinante se transforma o transfecta de manera estable con el vector de expresion de la reivindicacion 2.
  5. 5. Un metodo de fabricacion de una celula de planta hospedadora recombinante, comprendiendo dicho metodo transformar o transfectar una celula con el vector de expresion de la reivindicacion 2.
  6. 6. Un metodo de fabricacion de una protema codificada por el vector de expresion de la reivindicacion 2, que comprende transformar o transfectar una celula con dicho vector de expresion y cultivar dicha celula en condiciones favorables para la expresion de dicha protema.
  7. 7. Un metodo de fabricacion de una protema, comprendiendo dicho metodo cultivar una planta o una parte de planta que comprende una celula hospedadora de planta recombinante de la reivindicacion 3, en condiciones que favorezcan la produccion de dicha protema por dicha planta o parte de planta.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 7, en el que dicha planta es una dicotiledonea, una monocotiledonea o una gimnosperma.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, en el que dicha planta es Eucaliptus, Populus o Pinus.
  10. 10. Una planta o parte de planta que comprende la celula de planta recombinante de la reivindicacion 3.
  11. 11. La planta de la reivindicacion 10, en la que dicha planta es una monocotiledonea, una dicotiledonea o una gimnosperma.
  12. 12. La planta de la reivindicacion 11, en la que dicha dicotiledonea es Eucaliptus, Populus o Pinus.
  13. 13. La parte de planta de la reivindicacion 10, en la que dicha parte de planta es una semilla.
  14. 14. La celula hospedadora recombinante de la reivindicacion 3, en la que dicha celula hospedadora recombinante es una celula de polen.
  15. 15. El metodo de la reivindicacion 7, en la que dicha parte de planta se selecciona del grupo que consiste en una rafz, un tallo, una hoja, una flor y un fruto.
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